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TRABAJO PRCTICO N 1 MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS a) Distinguir las partes del microscopio. b) Aprender a usar el microscopio. c) Conocer la forma de entrega de informes de prctico

La evolucin de una ciencia generalmente se desarrolla paralela a la invencin de instrumentos que extiendan los sentidos humanos hasta nuevos lmites. Desde la invencin del microscopio en el siglo 17 hasta nuestros tiempos se ha logrado progresar enormemente en el estudio de la clula. Los primeros microscopios usados por cientficos renacentistas eran MICROSCOPIOS DE LUZ. Sin embargo, los microscopios de aquella poca eran considerados simples, debido a que tenan un solo lente, como en las lupas; en los actuales se alcanza una mayor magnificacin con un sistema de dos lentes, y por ello se denominan compuestos. En estos microscopios de luz, la luz visible pasa a travs de lentes de vidrio. Las lentes refractan (cambian de direccin) la luz de tal modo que la imagen del espcimen se magnifica al llegar al ojo humano. En esta actividad de laboratorio, usted se familiarizar con el microscopio, y luego observar diversos organismos mientras aprende el uso apropiado de este instrumento bsico y esencial para un bilogo celular, histlogo, o patlogo. Existen dos factores importantes en microscopa y son: MAGNIFICACION y RESOLUCION. MAGNIFICACION (o aumento) se define como las veces que un objeto se agranda en relacin a su tamao real. RESOLUCION es una medida de la distancia mnima que existe entre dos puntos para ser distinguidos como dos puntos separados. Por ejemplo, lo que pareciera ser una estrella cuando se mira al cielo puede ser en realidad dos estrellas con ayuda de un telescopio. Por lo tanto, el telescopio tiene mayor capacidad de resolucin. Sin embargo, as como el ojo humano es limitado, el poder de resolucin de un microscopio o telescopio tambin es limitado. Los microscopios pueden disearse para magnificar objetos tanto como sea posible, pero la luz del microscopio nunca podr resolver detalles ms finos que 0.2 m, el tamao de una pequea bacteria o de una mitocondria. Esta resolucin no se puede mejorar, est limitada por la LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ VISIBLE usada para iluminar el espcimen. Los microscopios de luz slo pueden magnificar objetos efectivamente hasta 1500 veces, ms magnificacin implicara que el objeto se viera borroso. Lo que se ha ido mejorando en microscopa de luz es el CONTRASTE de aquellos objetos que puedan ser resueltos por el microscopio en uso. La mayora de las estructuras subcelulares, u organelos, son muy pequeos para ser resueltos con el microscopio de luz. La biologa celular avanz rpidamente desde la dcada del 50 con la introduccin del microscopio electrnico. En vez de usar luz visible, el MICROSCOPIO ELECTRONICO enfoca un haz de electrones a travs del espcimen. Microscopios electrnicos modernos pueden alcanzar una resolucin de aproximadamente 0.2 nanmetros (nm), mil veces mejor que el microscopio de luz. Los

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bilogos usan el trmino ULTRAESTRUCTURA CELULAR para referirse a la anatoma celular resuelta por un microscopio electrnico. Una foto obtenida con un microscopio de luz a veces se llama FOTOMICROGRAFIA, y una foto que resulte del microscopio electrnico se llama MICROGRAFIA ELECTRONICA DE TRANSMISION o de BARRIDO segn sea el microscopio electrnico que se use. Existen dos tipos de microscopio electrnico: el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION (TEM) y el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM). El TEM dirige un haz de electrones a travs de una seccin muy delgada del espcimen, similar a lo que sucede en un microscopio de luz. Sin embargo, en vez de usar lentes de vidrios, los cuales son opacos a los electrones, el TEM usa electroimanes. Los electroimanes actan como lentes que enfocan y magnifican la imagen cambiando la direccin de los electrones cargados. La imagen ltimamente se enfoca en una pantalla para examinarla o en un film fotogrfico para tener un registro permanente. Para aumentar el contraste en la imagen, secciones muy delgadas del espcimen se tien con tomos pesados de metales, los cuales se adhieren a ciertos lugares en las clulas. Los bilogos celulares usan el TEM principalmente para estudiar la ultraestructura interna de las clulas. El SEM es especialmente til para el estudio detallado de la superficie del espcimen. El haz de electrones cubre (o barre) la superficie de la muestra, la cual generalmente est recubierta con una pequea lmina de oro. El haz de electrones excita electrones sobre la superficie de la muestra, y estos electrones secundarios se colectan y se enfocan en una pantalla, formando una imagen de la topografa del espcimen. Un atributo importante del SEM es su gran profundidad de penetracin, la cual resulta en una imagen tridimensional. El microscopio electrnico revela muchos organelos, imposible de resolver con el microscopio de luz. Sin embargo, el microscopio de luz ofrece muchas ventajas, especialmente para el estudio de clulas vivas. Una desventaja del microscopio electrnico es que los mtodos qumicos y fsicos usados para preparar el espcimen no slo mata clulas, sino que tambin introduce artefactos, estructuras fsicas que se ven en la micrografa que no existen en la clula viva. En este laboratorio usaremos el microscopio compuesto. Las principales partes de un microscopio compuesto son: Sistema Mecnico a. Pi: es la base de sustentacin. b. Columna: regin articulada del pi. c. Platina: plataforma horizontal que sustenta al espcimen o preparacin. d. Tubo: lleva en su extremo superior la lente ocular y en el inferior el objetivo. e. Revlver o tambor: pieza giratoria que lleva los objetivos. f. Tornillos de focalizacin: al rotarlos cambian el enfoque del microscopio, lo cual lo logran variando la distancia entre el objetivo y la platina. Existen dos movimientos, macromtrico (enfoque aproximado y grueso), micromtrico (enfoque de precisin).

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Sistema de iluminacin a. Fuente luminosa: puede ser natural o artificial. Si es natural se utiliza un espejo de cara plana. Si es artificial puede o no haber espejo, si hay espejo se utiliza por el lado cncavo. b. Condensador: dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra los rayos luminosos en el espcimen. Su mayor utilidad la presta cuando se encuentra a una distancia de ~2 cm del espcimen. Ubique el mejor punto por ensayo y error. c. Diafragma: est ubicado en el condensador y sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparacin. Su dimetro se puede variar por medio de una placa horizontal que se cierra o abre a voluntad del operador. d. Anillo porta filtro: generalmente se utiliza un filtro de color verde pues as descansa ms la vista. La longitud de onda modificada con el uso del filtro influye en la resolucin del microscopio (ver resolucin ms adelante). Sistema de amplificacin a. Lentes oculares: son sistemas pticos ubicados en la parte superior del tubo, prximo al ojo del observador. Los oculares estn formados por dos lentes planas, convexas, simples o compuestas separadas por un diafragma interno. El lente inferior se llama lente de campo, su propsito no es aumentar la imagen sino recoger la mayor cantidad de rayos divergentes que vienen del objetivo. Este tiene su foco en el diafragma y ah la imagen es aumentada por la parte superior. Los oculares ms usados tienen un aumento de 6X, 8X, 10X, 16X, 20X. b. Lentes objetivos: sistemas de lentes acomodadas en el revlver. En el objetivo est inscrita la magnificacin y la apertura numrica. Capacidades del microscopio compuesto 1.- El microscopio compuesto tiene la capacidad de magnificar una imagen. El aumento total es: Aumento total= aumento objetivo * aumento ocular Pregunta 1. Calcule el aumento de su microscopio usando todos los objetivos. 2. La resolucin de un microscopio viene dada por la siguiente frmula: R= (0,61* longitud de onda) / AN 0,61 es una constante, la longitud de onda es la correspondiente al haz de luz que pasa a travs del espcimen, y AN es la apertura numrica que est dada por: AN= n (sen alpha) Donde, n es el ndice de refraccin del medio que atraviesa la luz para llegar al espcimen y alpha es el ngulo del haz de la luz refractada ms externa que es captada por el objetivo.

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Ondas electromagnticas

gamma

rayos x

U.V.

luz

visible

I.R.

microondas

radio

Luz Visible

violeta (400 nm)

azul

verde (500 nm)

amarillo

naranjo (600 nm)

rojo (700 nm)

El ndice de refraccin de algunos materiales (con una longitud de onda de aprox. 550 nm)

Material n

Aire 1 atm, 0C 1,00029

Aire 1 atm, 15C 1,00028

Aire 1 atm, 30C 1,00026

Alcohol etlico 1,36

Aceite castor 1,48

Agua 1,33

Pregunta 2 Cul de los dos medios [aire o aceite] resultar en un mejoramiento de la imagen dada por el microscopio? Pregunta 3 Cul de todos los componentes de la luz visible resultar en una mejor resolucin? Pregunta 4 Cul sistema tendr mejor resolucin: uno con un R=600 nm o uno con un R=300 nm? 3. El microscopio tambin tiene la capacidad o poder de definicin, es decir de proporcionar imgenes ntidas, contornos definidos. 4. Y finalmente, tiene poder de penetracin o de visualizacin de los diferentes planos de una preparacin. Tipos de microscopios 1. Microscopio simple o de lupa: lente biconvexa capaz de formar una imagen aumentada de un objeto colocado en su distancia focal. Los rayos luminosos reflejados en el objeto atraviesan la lente y forman una imagen aumentada, virtual, derecha del objeto. Aumento lineal= longitud de la imagen/longitud del objeto.

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2. Microscopio compuesto: definido anteriormente. 3. Microscopio de luz polarizada: microscopio utilizado en el estudio de membranas, fibras, cristales, ya que puede proporcionar antecedentes de su estructura fsico-qumica. 4. Microscopio de luz ultravioleta: utiliza luz UV (300 -400 nm), y el poder de resolucin aumenta. Los lentes pticos deben ser de cuarzo o fluorita y se debe recibir la imagen en placas fotogrficas o pantallas. 5. Microscopio de fluorescencia: utiliza luz ultravioleta y se basa en la emisin de radiacin con diferente longitud de onda a la luz que caus la excitacin. 6. Microscopio de contraste de fase: es capaz de diferenciar contornos basado en los diferentes ndices de refraccin del espcimen. 7. Microscopio de interferencia: es igual que el anterior pero se puede variar el contraste y seleccionar el ms til para un objeto dado. 8. Microscopio de rayos X: Los rayos X tambin pueden ser usados en la iluminacin para el estudio de la estructura molecular. 9. Microscopio electrnico: anteriormente explicado. TCNICA DEL MICROSCOPIO Todos los microscopios modernos son parafocales y paracentrales. El trmino parafocal significa que el foco no cambia apreciablemente cuando se cambia el objetivo; slo se requiere un toque del tornillo micromtrico para volver a ajustar el foco del espcimen. El trmino paracentral indica que el centro del campo no cambia cuando se cambia el objetivo. Antes que el objetivo cambie, el objeto debe ser ubicado en el centro. Siempre comience con el objetivo de menor poder, cuidando que el cubreobjeto se encuentre en la superficie de arriba del portaobjeto, de esa manera los objetivos de mayor poder no chocarn con el portaobjeto. Para obtener una mejor imagen, se debe usar un cubreobjeto, el cual no debe sobrepasar de 0.17-0.18 mm de espesor. Los objetivos que utilizan aceite de inmersin no son tan sensibles y pueden ser usados sin el cubreobjeto. Este objetivo trabaja a una distancia menor y pueden impactar el portaobjeto. Luego de usar el objetivo de aceite de inmersin (el cual nunca debe usarse sin aceite de inmersin) se debe limpiar el lente cuidadosamente para retirar restos del aceite. Debido a que la ptica del microscopio corrige defectos de la visin humana, los lentes pticos no necesitan ser utilizados a menos que exista un severo astigmatismo. El lente ocular puede limpiarse con un papel suave o pao suave que no deje pelusas, humedecido con agua destilada. PROCEDIMIENTOS 1. Familiarcese con el microscopio que se le asigne. El microscopio siempre se debe manipular tomndolo con una mano por el tubo y sosteniendo el pi con la palma de la otra mano. Coloque el microscopio en el mesn de modo que exista una distancia de al menos 3 cm entre el borde del pi del microscopio y el borde del mesn. Cul es la magnificacin de cada objetivo y ocular en su microscopio? Calcule la magnificacin total con cada objetivo. Cul es la A.N. de cada objetivo?

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2. Distinga las partes del microscopio. ACTIVIDADES I

1. Enfoque hilos entrecruzados de colores. Con cul objetivo se logra un mayor poder de penetracin? RECUERDE QUE EL REVLVER SLO SE GIRA EN UNA DIRECCIN DESDE MENOR A MAYOR OBJETIVO.

2. Enfoque una muestra de mucosa bucal. Qu es lo que puede distinguir?Cmo es la resolucin del instrumento?