04_introducciy³n_a_la_cromatografya

7/24/2019 04_Introducciyn_a_la_cromatografya

1/46

Qumica Analtica III

Dr. Edgar F. Morn Palacio

Introduccin a la cromatografa. Historia, Principios

bsicos, Tipos de cromatografa


2/46

Se utiliza con los fluidos, que pueden ser gases o lquidos, seempuja a circular la mezcla por un slido o un lquido quepermanece estacionario (fase estacionaria). Los distintoscomponentes de la mezcla circulan a velocidades diferentes por lafase estacionaria, y por lo tanto unos componentes estn ms

tiempo retenidos en ella que otros, emergiendo despusExisten varios tipos de cromatografa que son:

1. Cromatografa en papel

2. Cromatografa en capa fina

3. Cromatografa en columna

4. Cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC)

5. Cromatografa de gases (CG)

Cromatografa


3/46

La cromatografa es una tcnica analtica y cuantitativa que haalcanzado un alto grado de desarrollo y modalidades en loslaboratorios de qumica y bioqumica. En sus diversasaplicaciones, la cromatografa sirve para separar compuestosqumicos y molculas diferentes a partir de mezclas

multicomponentes, las cuales pueden contener varios centenaresde sustancias diferentes

Principios bsicos


4/46

Es el mtodo ms comn para realizar separaciones analticas y tiene

aplicacin a todas las ramas de la ciencia. La importancia de lacromatografa en la ciencia ha hecho que se hayan otorgado 12 premiosNobel entre 1937 y 1972, a trabajos donde esta tcnica fue esencial


5/46

Cromatografa

El botnico ruso Mikhail S. Tswett formaliz el uso de la cromatografa enlos estudios cientficos por el ao 1910, dio ese nombre a la tcnica y laaplic a la separacin de los pigmentos naturales que se encuentran enlas plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas).


6/46

En general, la cromatografa consiste en hacer pasar una fase mvil conun determinado disolvente (o eluyente), en este caso una mezcla de aguay etanol -misma que contiene disuelta la mezcla de molculas que se

desea separar-, a travs de una fase fija que actuar como tamiz o filtroselectivo, en este caso algodn. A su paso, la separacin de molculas seproduce debido a sus diferencias de tamao, geometra y distribucin decarga elctrica


7/46

En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se disuelve en unafase mvil:

1. Gas

2. Lquido3. Fluido supercrtico (Sustancia que se encuentre en condiciones de

presin y temperatura superiores a su punto crtico. Es un cuasiestadocon propiedades intermedias entre lquidos y gases)

La fase mvil se hace pasar por una fase estacionaria inmiscible, la cual

se mantiene fija en la columna o sobre una superficie slida

Fase mvil


8/46

Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestrase distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y estacionaria

a) Elementos que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria semueven lentamente con el flujo de la fase mvil

b) Elementos que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se muevencon rapidez

Debido a estas diferencias los componentes se separan de manera

discriminada de manera que pueden ser analizados cualitativa ycuantitativamente

Fase estacionaria


9/46


10/46

Segn el estado fsico del eluyentecromatografa de gases

cromatografa de lquidos

Segn el estado fsico del lecho

lquido-lquidoslido-lquido

Segn las caractersticas del lecho cromatogrfico

abierto: en papel, en capa fina

cerrado: en columna

Segn la presin del eluyente

Baja presin

Alta presin

Tipos de Cromatografa


11/46

Segn la composicin del eluyenteIsocrtica

De gradiente

Segn la polaridad de la fase estacionaria

Fase normalFase reversa

Segn el mecanismo de retencin

De reparto

De filtracin en gel o de exclusin molecular

De adsorcin

De intercambio inico

De afinidad

Tipos de Cromatografa


12/46

Cromatografa en papel

Pertenece al tipo Cromatografadeparticinse fundamenta en

que las sustancia problema, puedan tener diferentescoeficientes de reparto en dos disolventes de inmisibilidadlimitada, uno permanece fijo en la superficie del papel faseestacionaria

Es la ms sencilla de las cromatogrficas, y a la vez muy similara la cromatografa en capa fina o Thin Layer Chromatography(TLC).

Se utiliza solamente con un propsito analtico, en situacionesdonde los compuestos a ser identificados son fcilmenteadsorbidos en papel y no en slica gel de la TLC


13/46

Cromatografa en papel

Descendente: Se trata de una caja saturada de vapor de agua,atravesada por una cajetn semicilndrico lleno con el solventeorgnico. En el se deposita, como muestra la figura el papel con labanda de muestra justo al salir el papel del cajetn. Para sujetar el

papel introducimos una varilla a lo largo de la caja. El solventecomenzar ascendiendo por el papel por capilaridad y continuarbajando al salir de la cajetilla, pasando por la zona de muestra yarrastrndola, consiguindose as la separacin

Ascendente: El solvente se encuentra en la parte inferior de la cubeta

y asciende por el papel haciendo que se separe la muestra. Laresolucin de la cromatografa en papel descendente es mayor


14/46


15/46

En este tipo de experimento puede se aplicado para diferenciarmuestras y componentes de una mezcla caracterizada. Secontrolan tres variables durante esta tcnica:

1. El solvente

2. El papel

3. Distancia recorrida por el solvente


16/46

Rf o Fraccin representativa

La distancia recorrida por el solvente es la variable masdifcil de controlar y comparar los radios de las muestrasde diferentes experimentos, a los cuales se les llama Rf(Del ingls: retention factor)

La Rf, es definida por la ecuacin:

Rf = Distancia del centro de la muestra al punto inicial

Distancia final del solvente al punto de inicio


17/46

El Rf para un compuesto es una constante de unexperimento a otro solamente si las siguientes

condiciones de la cromatografa son tambin constantes:

Sistema de solventesAdsorbenteGrosor del adsorbente

Cantidad de muestraTemperatura

Al comparar dos compuestos bajo condicionescromatogrficas idnticas, el compuesto con el Rf ms

grande es menos polar porque interacciona con menosfuerza con el adsorbente polar en la placa del TLC


18/46

Revelado y clculo de Rf

Una vez corrido eldisolvente se retira elpapel y se deja secar,se trata con un reactivoqumico con el fin depoder revelar las

manchas

Esta cromatografa seusa para unaidentificacin

cualitativa. En un papelfiltro se coloca un pocode muestra y despusse revela y se midenlas distintas

velocidades


19/46

Cromatografa en Capa Fina

Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio paracolocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaronextractos vegetales, dando as la primera forma de

Cromatografa de Capa FinaEgon Stahl (1956) di el nombre de Cromatografa de

Capa Fina. Estandariz los procedimientos, equipos yadsorbentes dando un auge a la tcnica simple, a bajocosto y eficiente


20/46

Proceso de Adsorcin

La muestra aplicada en la capa es adsorbida en lasuperficie del material por la accin de fuerzaselectrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de

Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando lacapa es expuesta a un flujo por accin capilar, se iniciauna competencia de enlaces entre los sitios activos deladsorbente y la sustancia con el solvente


21/46

Adsorbentes

Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)

Tierra Silcea Kieselguhr

Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

Poliamidas


22/46

Adsorbentes y preparacin

Tamao de PartculaVolmen de Poro

Dimetro de Pororea Superficial

Homogeneidad

Pureza

Se usan como soporte deladsorbente lminas de:Vidrio, Plstico Metlicos

Los tamaos de la placa para

TLC convencional son : 20cm x 20 cm; 10 cm x 20 cm y5 cm x 2 cm

Hay placas que contienen un

indicador de Fluorescencia:F254 F366. El nmero queapararece como subndicenos indica la longitud de ondade excitacin del indicador

utilizado


23/46

Desarrollo y revelado de la placa

Es un proceso mediante el cual son transportados atravs de la fase estacionaria por la fase mvil

Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere demtodos que nos permitan visualizar el(los)

componente(s) presentes. Tambin se conoce esteprocedimiento como Revelado

Mtodos de revelado:Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen

derivados coloreados o fluorescentes

Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacinUV


24/46

Evaluacin de un Cromatogramade Capa Fina

Anlisis Cualitativo

Medida de RfComparacin Visual de Color/IntensidadPropiedades UV/IR/MS/NMR

Anlisis Cuantitativo

Semi-cuantitativoComparacin visual del dimetro y la intensidad delcolor de la mancha contra una serie de manchaspatrones de concentracin conocida


25/46

Evaluacin de un Cromatogramade Capa Fina

Cuantitativo

IndirectaDirecta

Densitometra

Medida de Transmisin. Medida de luztransmitida a travs de la sustanciaMedida de Emisin. Medida de luzreflejada desde la sustancia

Espectrofotometra

FluorescenciaFluorescencia con "quenching"


26/46

Proceso en pasos

Primera etapa: Aplicacin de las muestras a analizar

La primera precaucin que hay que tener en el manejo dela placa es la de procurar no tocar con los dedos la capade celulosa. La placa fina se coge siempre por los bordes

de la misma


27/46

Se coloca la placa encima de la mesa, y con un lpiz setraza una lnea muy dbil a unos 1,5 cm del borde inferiorde la placa, procurando daar lo mnimo posible la capa

En la lnea se sealan dbilmente cinco puntos,distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa


28/46

En cada punto de ellos se aplica cada uno de los patronesy la muestra problema

La segunda precaucin a considerar es la de nocontaminar las disoluciones de los patrones y la muestraproblema


29/46

Se aplica en la placa una gotade la muestra, procurando que

se extienda lo menos posible yno dae la capa. Se seca acontinuacin con el secador deaire. Se aplica una segundagota y se vuelve a secar. Esta

operacin se repite para cadaunas de las muestras

Una vez realizada la aplicacinde cada muestra es importante

anotar en el cuaderno delaboratorio las posiciones enlas que se ha colocado cadapatrn y el problema


30/46

Segunda etapa: Elucin de las muestras

La cromatografa se realiza en la cubeta o cmara dedesarrollo. La cubeta contiene un volumen de fase mvil,cuya altura de lquido debe de estar siempre por debajode la lnea de aplicacin de las muestras.


31/46

La placa que contiene las muestras se introduce en lacubeta. Se coloca la tapa de la cubeta y se espera que la

fase mvil ascienda por la capa hasta que alcance unaaltura de hasta unos 2-3 cm del extremo opuesto a laparte sumergida. Una vez realizada la elusin, se abre latapa de la cubeta y se saca la placa


32/46

Tercera etapa: Secado y visualizacin de la muestra

Inmediatamente que se ha sacado la placa, con el lpizse marca en un borde el nivel alcanzado. Se introduce enla estufa durante unos 5 min para que se seque


33/46

A continuacin, mediante unas pinzas de madera sesumerge en la cubeta que contiene la solucin de

ninhidrina. Una vez que toda la placa se ha impregnado,se saca inmediatamente de la cubeta, dejando queescurra el exceso de solucin de ninhidrina, y se vuelve aintroducir en la estufa durante 3 min para que se realice lareaccin de color


34/46

TLC

En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria esuna delgada capa de un soporte slido granulado, la faseestacionaria est hidratada, por lo que se le consideracomola fase polar

La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase

mvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla desolventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestosque se desea separar

Como slo la base de la placa queda sumergida, el

solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciendepor capilaridad. Al recorrer la placa la fase mvil vaarrastrando a las substancias apolares y aquellas mspolares son retenidas por la fase estacionario dando lugara la separacin


35/46

Revelado en 1 dimensin

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.


36/46

Revelado en 2 dimensiones




37/46

Migracin segn el solvente




38/46

TLC cuantitativa



Para poder utilizar la TLC como un mtodo cuantitativo deanlisis, hace falta poder cuantificar las manchas (figura5.1 y 5.5). En este caso, la placa a examinar se desplazabajo la luz de un densitmetro (o escner) que mide laabsorcin o la fluorescencia, a una o varias longitudes de

onda. Este aparato realiza un diagrama que es un pseudocromatograma con picos donde es posible medir reas. Setrata, de hecho, de una imagen isocrnica de la separacinen el instante final


39/46




40/46




41/46



Cuando se deben revelar compuestos marcados por unradioistopo -, se dispone entonces de densitometros

particulares equipados de una cmara de vdeo que dauna imagen de la distribucin radioactiva de la placa. Elantiguo procedimiento de la radiografa por contacto sobreuna placa fotogrfica tiene el defecto de ser lento (puedensuperarse las 48 h de exposicin) y muy poco sensible.Estos nuevos aparatos, conocidos bajo el nombre demquinas de Charpak son utilizados igualmente enelectroforesis en gel. La sensibilidad es suficiente comopara descubrir actividades de algunos Becquerel por mm2

TLC vs HPLC


42/46



Para muchas aplicaciones, la TLC permite evitar recurrir ala HPLC. Aunque actualmente la TLC requiere todava una

mayor intervencin humana que la HPLC, el uso denuevos dispositivos ms perfeccionados para la aplicacin,desarrollo empleando gradientes de elusin, revelado ylectura de la placa, le confiere la reproducibilidad necesaria

Los resultados obtenidos con esta tcnica vienen a sercomparables a los de HPLC

En comparacin con esta ltima, se considera que la TLCes adecuada para tratar, en un mismo tiempo, un nmero

de muestras cuatro veces superior. Una misma placapermite realizar numerosos anlisis simultneos, enparalelo, en condiciones idnticas

TLC vs HPLC

L l d TLC d l it


43/46



Las placas de TLC de un solo uso permiten unapreparacin ms rpida de la muestra, con un menorriesgo de prdida o de contaminacin del compuesto aanalizar

Existe la posibilidad de elegir entre diversas fasesestacionarias enlazadas, de polaridad media, de las cualesalgunas de ellas estn destinadas a realizar separacionesde enantimeros

La placa de TLC puede ser considerada como un medio,provisional, de conservar muestras muy pequeas, quedespus de la extraccin, pueden servir para otros anlisis

(espectrometra de masas)Sin embargo, la TLC queda an lejos de ser una

tcnica de apoyo para la mayora de los qumicos


44/46



La TLC pone en juego fenmenos fsico-qumicos mscomplejos que la HPLC. Comprende un sistema dondeestn presentes tres fases distintas: una fase estacionariaslida, una fase mvil lquida, una fase vapor en equilibrio

La fase estacionaria slo est parcialmente equilibrada porla fase lquida antes del paso de los compuestos

La capacidad de absorcin de la superficie disminuye amedida que una parte de los sitios de absorcin son

ocupados, lo que da como resultado el ensanchar lalongitud de las manchas

Particularidades asociadas a la TLC


45/46



El Rf de un compuesto en estado puro o presente en unamezcla es ligeramente diferente

No es posible hacer variar el flujo de la fase mvil paramejorar la separacin

La velocidad de migracin del frente del disolvente no es

constante. Es una funcin compleja donde interviene, entreotros, la dimensin de las partculas de la fase estacionaria

La resolucin entre dos manchas depende ms del Rf quedel compuesto


46/46

A,B y C quien sale primero en la placa?. Hexano:Acetona. 80:20

04_introducciy³n_a_la_cromatografya

Documents