PATOLOGIA I: METODOS DE ESTUDIO EN PATOLOGA

1. Macroscopa 2. Citologa. 3. Histologa bsica. 4. Histoqumica y tcnicas especiales. 5. Inmunohistoqumica 6. Inmunofluorescencia 7. Microscopia electrnica 8. Citofotometra 9. Citometra de flujo 10. Patologa molecular 11. Telepatologa.

1.- MACROSCOPA La tcnica bsica del examen antomo patolgico es la macroscopa. Permite orientar el diagnstico, la

toma de muestras para el proceso y elegir las tcnicas para el diagnstico Consisten en un examen visual bsico de las muestras e incluye descripcin de las siguientes

caracteristicas: - Organo - Tamao - Relaciones - Color - Consistencia - Corte - Alteraciones

2.- CITOLOGA Estudio de la morfologa celular Permite examinar las caractersticas especialmente nucleares y citoplasmticas que diferencian unas

clulas de otras en especial las de tipo neoplsicas.

TIPOS DE CITOLOGIA EJ. ESTUDIO Exfoliativa cuello uterino Aspirativa o por puncin mama, tiroides Fluidos lquidos o lavados de cavidades Pleura Raspado impronta o aposicin de tejidos

lceras

Fijadores utilizados: Spray, alcohol de 96 , Mezcla de alcohol - citrato Muy importante la fijacin inmediata

3.- HISTOLOGIA BASICA

El conocimiento de la estructura normal de clulas y tejidos es imprescindible para comprender eficientemente los cambios patolgicos que en ellos ocurren y que representan el fundamento de la enfermedad

4.- HISTOQUIMICA Y TECNICAS ESPECIALES

HISTOQUIMICA: Tcnica histolgica y citolgica que a travs de las afinidades tintoriales de los tejidos hacia ciertas

sustancias qumicas (colorantes), denotan o hacen ms evidentes las caractersticas especficas de las clulas, las cuales pueden observarse a travs del contraste de colores.

TINCION DE RUTINA Hematoxilina Eosina

La tincin de Hematoxilina Eosina, H/E o tincin corriente, es la tcnica de tincin ms usada. La hematoxilina es un colorante natural con propiedades similares a las anilinas bsicas. Tie

principalmente el ncleo (histonas). La eosina es un colorante cido y su accin es la de una anilina, tiendo principalmente el citoplasma

celular. Tincin HE:

o Ncleos azules o Citoplasma rosado o Colgeno y fibras musculares rosado plido

TINCIONES (Tcnicas) ESPECIALES.

Existen un sinnmero de tinciones especiales, destinadas a certificar la presencia o ausencia de determinados elementos. Suelen solicitarse una vez que la tcnica de H/E se ha realizado, teniendo ya un diagnstico presuntivo.

PRINCIPALES TINCIONES ESPECIALES:

TRICRMICO DE MASSON Principal Uso: Colgeno. Tie:

o Colgeno Verde. o Ncleo, msculo y nervios Rojo oscuro. o Citoplasma amarillo

VAN GIESON Principal Uso: Tejido Fibroso Tambin se considera una tincin tricromica Tie:

o Colgeno rojo. o Ncleo azul negro o Msculos, nervios amarillos o (+Verhoeff) fibras elsticas negro

FONTANA MASSON Principal Uso: Melanina

Tie: o Melanina Negro.

PLATA METENAMINA (GROCOTT) Principales Usos: Hongos. Tie:

o Paredes micticas Negros.

PAS Principales Usos: Glucgeno, MPS neutros y Hongos, Membrana basal. Tie:

o PAS Reaccin positiva para glucgeno y polisacridos neutros. Glucgeno Diastasa lbil.

o PAS diastasa (PAS D) Reaccin positiva slo para polisacridos neutros. MPS neutros y Paredes micticas Diastasa resistentes.

AZUL ALCIN Principal Uso: Mucopolisacridos cidos

Uso en deteccin presencia clulas caliciformes Tie

o Mucopolisacridos cidos (mucina) Azul.

AZUL DE TOLUIDINA Principal Uso: Mucopolisacridos cidos Tie

o Mucopolisacridos cidos Prpura metacrmico

GIEMSA Principales usos: Grnulos mastocitarios, MPS cidos, eosinfilos, leishmanias, mdula sea Tie:

o Grnulos mastocitarios, Mucopolisacaridos cidos Prpura. o Eosinfilos, leishmanias Rojo.

FERROCIANURO DE POTASIO DE PERLS (AZUL DE PRUSIA) Principal Uso: Hemosiderina

Tie: o Hemosiderina Azul

ROJO CONGO Principal Uso: Amiloide. Tie

o Sustancia amiloide Roja con luz, Verde con luz polarizada

VON KOSSA Principal Uso: Calcio Tie:

o Calcio Negro.

ORCENA Principal Uso: Fibras elsticas.

Tie: o Fibras elsticas Pardo oscuro.

(*) VISUALIZACION PIGMENTOS

Dentro de los pigmentos endgenos destacan:

Lipofucsina: corresponde polmeros de lpidos, fosfolpidos y protenas que se acumulan en los citoplasmas de las clulas, presenta color amarillo-pardo y se asocia generalmente al envejecimiento de los tejidos.

La melanina es el nico pigmento endgeno de color negro, en granular fino y se produce en los melanocitos. Se puede acumular en melanocitos, queratinocitos y macrfagos.

La hemosiderina corresponde a la forma de almacenamiento del fierro en el organismo. Puede aumentar en trastornos primarios de su metabolismo (hemocromatosis) o en condiciones de sobrecarga como politransfundidos , anemias hemolticas o inflamacin con hemorragia intensa. Se acumula en macrfagos, u otras clulas parenquimatosas, presenta color amarillo-pardo, de grnulos gruesos, birrefringentes con luz polarizada. Se puede teir con tcnica de Azul de Prusia.

5.- INMUNOHISTOQUIMICA Tecnologa inmunolgica ha permitido producir anticuerpos monoclonales especficos contra antgenos o

sustancias tisulares determinadas. Se requiere tejido muy bien conservado. El diagnstico siempre es basado en la morfologa evaluada con tcnicas de rutina (HE), ya que la

inmunohistoqumica y la patologa molecular solo sirven para confirmar un diagnstico. Lo ms importante en este estudio es la seleccin apropiada de los anticuerpos utilizados, su correcta

interpretacin y la calidad tcnica. Existen cientos de anticuerpos disponibles que reconocen marcadores tumorales, sustancias tejido

especfica, diferentes componentes celulares epiteliales, estromales etc.

Los grupos de marcadores ms comnmente usados son: - Marcadores epiteliales: queratinas de bajo peso molecular, AE1-AE3 coctl de citoqueratinas,

CK7, CK20, CEA, EMA. - Marcadores melanocticos: S100 (tambin es un marcador mesenquimal), HMB45,

MelanA/Mart1.

- Marcadores mesenquimales: vimentina, Factor XIIIa, Factor VIII, CD31, CD34, HHF35, Actina Msculo Especfica, desmina.

- Marcadores linfoides: CD3, CD20, CD15, CD30. - Marcadores histiocticos: CD68, lisozima, CD1a (clulas de Langerhans). - Marcadores neuroendocrinos: Enolasa Neuroespecfica, sinaptofisina. - Marcadores de proliferacin celular: Ki-67, bcl2.

Indicaciones de IHQ: Tipificacin de estirpe celular Dg. Diferencial de neoplasias de clulas grandes o pequeas. Tipificacin de neoplasias hematolgicas Factores pronsticos

Tipos de tecnicas inmumohistoquimicas: Tecnicas inmunoenzimaticas Tecnicas de inmunofluorescencia

Tcnicas inmunoenzimticas utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A.

6.- INMUNOFLUORESCENCIA Se considera como un tipo de tecnica inmunohistoquimica

Utiliza como marcadores compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en formalina. La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin.

7.- MICROSCOPIA ELECTRONICA: - Tcnica de gran costo y sofisticacin, Actualmente restringida al estudio renal y de algunos tumores

- La Fijacin se realiza en glutaraldehido, los cortes son semifinos, se montan en grillas metlicas y se somete a un haz de rayos catdicos

- Los aumentos utilizados son:

M corriente: 4x 10x 40x 1000x

Melectronica: 10000x 40000x

- Se pueden observar: Grnulos de neurosecrecin, Grnulos de Birbeck, Cuerpos de Weibel Paladem Melanosomas

8.- CITOFOTOMETRIA o Es la combinacin de la microscopa ptica y la tecnologa computacional.

o La imagen de un corte histolgico en el microscopio es captada por una cmara de video que entrega informacin a un computador, que mediante un programa determinado analiza los diferentes componentes que existen en imagen, pudiendo con esta tcnica contar ncleos, medir tamaos de diferentes estructuras, analizar densidad de tincin, lo que nos permite indirectamente cuantificar diferentes componentes

9.- CITOMETRIA DE FLUJO Las clulas en suspensin en un flujo de hileras de una sola clula que han sido previamente marcadas

con sustancias fluorescentes son estimuladas con un rayo lser y diferentes detectores que captan la reflexin o intensidad de la fluorescencia, permitiendo as medir o cuantificar las clulas que han sido marcadas. Esta tecnologa tiene dos grandes aplicaciones:

Se analizan 5000 a 10000 clulas por seg. Pasando por haces de luz en dos direcciones Un computador hace un histograma integrando la informacin

10.- PATOLOGIA MOLECULAR Hibridacin in situ: complementacin de pares de bases entre dos hebras sencillas mediante sondas (DNA

RNA) reveladas con cromgeno FISH es una tcnica de hibridacin con sonda fluorescente

PCR: (1984) Mtodo de amplificacin de DNA usando una DNA polimerasa altas concentraciones de desoxirribonucletidos

11.- TELEPATOLOGIA Permite el anlisis de lminas histolgicas a distancia gracias al procesamiento de imgenes

microscpicas por un ordenador.