VIRUS

Microbiología II

FMVZDra. Virginia Bolaños de Corzo

Métodos de propagación

Para fines diagnósticos la inoculación de animales es un medio para detectar virus en muestras clínicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes.

Actualmente el uso de animales experimentales como hospederos para propagación viral está limitado por razones éticas.

Huevos embrionados.

Este sistema se usa para propagación viral con fines diagnósticos y de investigación.

Cuando se usa huevos embrionados, se debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos en el saco vitelino del huevo. Por lo que, frecuentemente es preferible obtener huevos embrionados de parvadas

libres de patógenos específicos (spf)

Cultivo de explantes

Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del hospedero animal.

Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral.

Se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostración de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigémino).

Cultivos celulares primarios Estos se derivan de tejidos frescos que

han sido digeridos enzimáticamente con tripsina u otras proteasas, para liberar células individuales. En condiciones in vitro las células de los cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja.

A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven más allá del vigésimo pase in vitro.

Cultivos semi-continuos

Son por lo general de fibroblastos.

Los cultivos semi-continuos tienden a morir entre el 30° y el 50° pase in vitro.

Son útiles en la propagación de una gran variedad de virus.

Cultivos celulares continuos

Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplásicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. Las líneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagación viral;

Facilitan la propagación a gran escala de algunos virus para vacunas e investigación. Muchas líneas continuas están disponibles de proveedores como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)

La mayoría de los laboratorios de virología almacenan en congelación alícuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las líneas celulares que están continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus características celulares.

Ej. Contaminación con otros virus.

Concentración y purificación de virus

Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las células hospederas y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran: centrifugación diferencial (a diferentes velocidades), diálisis, precipitación, cromatografía y gradientes de densidad.

Infectividad

La infectividad es la habilidad de la partícula viral para infectar una célula hospedera. La temperatura en el exterior de la célula hospedera afecta fácilmente la capacidad del virus para conservar su infectividad

Infectividad vrs temperatura

A 60°C: disminuirá rápidamente, en segundos.

A 37°C: disminuirá dramáticamente, en minutos.

A 20°C: disminuirá, en cuestión de horas. La infectividad en las temperaturas antes

mencionadas influyen en la transmisión del virus por contacto directo (a 37°C) y por fomites (a 20°C).

A 4°C: se pierde en cuestión de días.

Almacenamiento

Los tres métodos principales son: Congelación a -70°C, con o sin

criopreservante. Congelamiento en nitrógeno líquido (-196°C). Para almacenamiento por

largos periodos: Liofilización, en congelación o a

temperatura ambiente.

Visualización de los virus

Los dos métodos principales usados para visualizar la estructura / morfología de los virus son: la microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. Otros tipos de microscopía se usan para observar cambios inducidos por la replicación viral en las células infectadas

Microscopia electronica

La microscopía electrónica proporciona imágenes tridimensionales de viriones y de su localización (nuclear o citoplasmática) dentro de la célula hospedera en un momento dado durante la infección. La observación de viriones en células vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados.

Microscopia de fuerza atómica

Los electrones son capaces de "atravesar por túnel" entre los átomos, provocando una fuerza pequeña pero cuantificable. El resultado de estas mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura.La ventaja de la microscopía de fuerza atómica es que la preparación de la muestra es mínima y pueden usarse especímenes vivos.

Microscopia óptica.

Es útil para observar los efectos de la infección viral en la célula hospedera. El daño celular o la destrucción causada por el virus es conocida como efecto citopático (CPE por sus siglas en inglés). Los efectos citopáticos que pueden observarse incluyen:

Células redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus.

Células redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa con los enterovirus.

Células agrandadas y redondeadas en áreas focales, como los herpesvirus.

Fusión de células que se convierten en células multinucleadas (sinsitios) como en el caso de paramyxovirus.

Además es posible observar cuerpos de inclusión, característicos de algunos virus

Microscopia de fluorescencia

Puede ser usada para visualizar células o tejidos infectados por virus, usando anticuerpos antígeno-específicos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une específicamente a los antígenos virales presentes dentro de las células o tejidos y los marca con la molécula fluorescente (generalmente fluoresceína)

Enumeración indirecta de virus

Los métodos indirectos de cuantificación viral son aquellos que usan factores asociados con la infectividad (actividad biológica). Los tres métodos principales usados para determinar indirectamente concentraciones virales son:

ensayos de hemoaglutinación, ensayos de formación de placas el método de la dilución limitante.

Hemoaglutinacion

Esta prueba se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar glóbulos rojos.Se realiza en una microplaca, añadiendo glóbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando posteriormente la hemoaglutinación.

La hemoaglutinación es útil en la concentración y purificación de algunos virus, y como prueba presuntiva rápida para la presencia de este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo.

Formacion de placas

la inoculación de células hospederas susceptibles con un virus, y usar su actividad biológica para estimar el número de viriones presentes.En este procedimiento se usan diluciones decimales seriadas del virus para inocular monocapas de células hospederas

Con los virus citopaticos la destrucción de las células lleva a la formación de zonas desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72 horas de incubación.

El método de dilución limitante

Basado en titulación, mide un efecto in vitro sobre las células, como el CPE, cuando éstas se expone a varias diluciones de la solución que contiene el virus. Dependiendo del virus, se hacen diluciones seriadas dobles o diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las células.

. El título infectivo (el recíproco de la dilución más alta que provoca el 50% de CPE en el cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo puede usarse con células en cultivo, embriones de pollo o incluso con animales de laboratorio.

Metodos Inmunologicos

Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos específicos. La detección y cuantificación de estos anticuerpos, reflejan el estado de la enfermedad.