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UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJALa Universidad Católica de Loja

CENTRO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR CBCMMOLECULAR CBCM

Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de Rotavirus en niños menores de cinco años en el Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares

Paula Torres BailónPaula Torres Bailón

Orígenes de ROTAVIRUS RVOrígenes de ROTAVIRUS RVEn 1973 En 1973 Ruth BishopRuth Bishop y colaboradores descubren RV en y colaboradores descubren RV en Australia.Australia.Biopsias de Biopsias de intestino delgado de niñosintestino delgado de niños que tenían que tenían diarrea severadiarrea severa de origen de origen no no bacteriano.bacteriano.

Microscopía electrónicaMicroscopía electrónica, , dichos virus presentaron dichos virus presentaron apariencia de una ruedaapariencia de una ruedade carreta antigua. de carreta antigua.

Bautizados con el Bautizados con el nombre nombre de rotavirusde rotavirus, del latín , del latín rotarota, , que quiere decir que quiere decir ruedarueda..Desde entonces reconocidosDesde entonces reconocidosDesde entonces reconocidos Desde entonces reconocidos como el como el principal agente principal agente etiológico de las gastroenteritis etiológico de las gastroenteritis viralesvirales en las crías de un gran en las crías de un gran número de número de mamíferos y de avesmamíferos y de aves..

Surge gran cantidad de Surge gran cantidad de información información sobre las sobre las propiedades biológicas y propiedades biológicas y epidemiológicas.epidemiológicas.

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ROTAVIRUS RVROTAVIRUS RV

• 440,000 de muertes440,000 de muertes•• 82% en países en vías de desarrollo82% en países en vías de desarrollo

Fuente: Parashar et al. Emerging Infectious Diseases 9(5): 565-72.

RV principal causa dediarrea deshidratantesevera en niños

Rotavirus causa GastroenteritisRotavirus causa GastroenteritisCaracterísticas Clínicas:Características Clínicas:

Periodo de incubación de Periodo de incubación de 1 a 3 días1 a 3 díase odo de cubac ó dee odo de cubac ó de a 3 d asa 3 d asFiebre (en algunos casos)Fiebre (en algunos casos)VómitoVómitoDiarreaDiarrea (hasta 8 evacuaciones/día)(hasta 8 evacuaciones/día)

•• Heces: Heces: •• AcuosasAcuosas•• No sanguinolentasNo sanguinolentas•• Ausencia de leucocitosAusencia de leucocitos

•• Duración: 3Duración: 3––9 días.9 días.

Deshidratación moderada a severa Deshidratación moderada a severa Acidosis metabólicaAcidosis metabólica

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Rotavirus causa GastroenteritisRotavirus causa Gastroenteritis

Características Clínicas:Características Clínicas:Los síntomas de la enfermedad ocurren comunmenteLos síntomas de la enfermedad ocurren comunmenteLos síntomas de la enfermedad ocurren comunmente Los síntomas de la enfermedad ocurren comunmente en niños de en niños de 3 meses a 2 años de edad. (Población de 3 meses a 2 años de edad. (Población de alto riesgo)alto riesgo)La mayoría de La mayoría de infeccionesinfecciones por rotavirus pueden por rotavirus pueden ser ser asintomáticasasintomáticas, constituyendo , constituyendo reservoriosreservorios para para transmisióntransmisión a individuos susceptibles. a individuos susceptibles. (Adultos)(Adultos)

Rotavirus causa GastroenteritisRotavirus causa Gastroenteritis

TransmisiónTransmisiónOro Oro –– fecal.fecal.

Superficies inanimadas.Superficies inanimadas.

Agua contaminada.Agua contaminada.

Excresiones asintomáticas. Excresiones asintomáticas.

Excresiones sintomáticas.Excresiones sintomáticas.

Posiblemente por secreciones respiratorias ???Posiblemente por secreciones respiratorias ???

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Rotavirus causa GastroenteritisRotavirus causa GastroenteritisGrandes brotesGrandes brotes

Exposición Exposición rápida y uniforme.rápida y uniforme.La La mayoría de los niños durante su primera etapa de vida han mayoría de los niños durante su primera etapa de vida han sufrido infección por RV.sufrido infección por RV.

Cierto patrón estacional durante otoño invierno principalmente en Cierto patrón estacional durante otoño invierno principalmente en países de clima templado. países de clima templado.

Dosis infecciosas:Dosis infecciosas:Niños contaminados Niños contaminados excretan 100 billones de partículas excretan 100 billones de partículas pprotavirales por mL de heces.rotavirales por mL de heces.De De 101044 a 10a 1077 de partículas de partículas virales sonvirales son suficientes para causar suficientes para causar infección clínica. infección clínica. Los Los niños podrían eliminar virus y presentarse asintomáticosniños podrían eliminar virus y presentarse asintomáticos, , antes de llegar a estar enfermos.antes de llegar a estar enfermos.Los Los rotavirusrotavirus presentes en presentes en materias fecalesmaterias fecales, podrían , podrían sobrevivirsobrevivirpor por días o semanasdías o semanas sobre superficies expuestas al ambiente. sobre superficies expuestas al ambiente.

Patofisiología de la Gastroenteritis Patofisiología de la Gastroenteritis RotaviralRotaviral

Ingestion of asfew as 10,000viral particles

Infection and destruction of absorptive Intestinal villus cells, secretory (Crypt)

cells sparedNSP4,

an enterotoxin?

Decreasedabsorption of

Diminisheddisaccharidase

Net fluid excretion

salt and water activity

Net fluid secretionCarbohydratemalabsorption

Osmotic diarrhea Metabolic acidosis Ischemia

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Rotavirus (RV)

Familia: Familia: Reoviridae

GéneroGénero::

Interés

GéneroGénero: : Rotavirus

Tamaño:Tamaño:60-85 nm

Genoma:Genoma:• ds RNA• Proteínas Estructurales VP:

VP1,VP2,VP3,VP4,VP6,VP7• Proteínas No Estructurales NSP:

NSP1, NSP2,NSP3,NSP4,NSP5

Estructura:Estructura:Icosaédrica

Clasificación de RVClasificación de RVCorrelación poco definidade Genotipo y Serotipo

Grupos: A,B,C,D,E,F,GSubgrupos: I,II,I+II,no I, no II

P: 13 serotipos

G: 15 serotipos

Correlación Clara de Genotipo y Serotipo

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NOMENCLATURANOMENCLATURA

Cepa Wa RV Humano: G1P1A[8]

G 1 P 1 A [8]G TipoG Tipo

##

P TipoP Tipo

##

GrupoGrupo

### # G TipoG Tipo

##SerotipoSerotipo

##GenotipoGenotipo

GenomaGenoma11 segmentos dsRNA11 segmentos dsRNA0.6 y 3.3 Kb0.6 y 3.3 Kb

Patrón Corto

yyPatrones Electroforéticos de Patrones Electroforéticos de migración en PAGEmigración en PAGE

Patrón LargoPatrón LargoPatrón CortoPatrón CortoPatrón Super cortoPatrón Super corto

Método detección de RVMétodo detección de RV

11223344

5566

778899Método detección de RVMétodo detección de RV

Patrón LargoLaemmliLaemmli, 1970, 1970Pereira et alPereira et al., 1983., 1983

99

1010

1111

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PROTEÍNAS DE ROTAVIRUS

Segmento Genómico

Producto Proteico

Localización Características y función

1 VP1 Core RNa polimerasa, unión al ssRNA, unión a VP3

2 VP2 Core Unión al dsRNA, requerida para la actividad replicasa de VP1

3 VP3 Core Guaniltransferasa, metiltransferasa, unión a ssRNA, unión con VP1

4 VP4 Cápside externa Hemaglutinina, antígeno neutralizante, potenciación infectividad p g g ppor proteasa, virulencia, putativa región de fusión, adhesión a la célula, induce protección

5 NSP1 No estructural Básica, anillo de zinc, unión al ssRNA

6 VP6 Cápside Interna Hidrofóbica, trimérica, antígeno de subgrupo

7 NSP3 No estructural Ácida, dimérica, unión extreme 3`del mRNA viral, interacción con el F4G1, inhibe traducción del huésped

8 NSP2 No estructural Básica, oligomérica, unión al ssRNA, NTPasa

9 VP7 Cápside externa Glicoproteína integrada en la membrana del RER, trimérica, antígeno neutralizante, 2 regiones hidrofóbicas NH2 terminales, unión al Ca2+, induce protección

10 NSP4 No estructural Glicoproteína transmembrana del RER, participa en morfogénesis, enterotoxina, induce protección

11 NSP5 No estructural Básica, fosfoproteían, unión al ssRNA, proteína quinasa, interacción con NSP2 y NSP6

NSP6 No estructural Interacción con NSP5, presente en viroplasmas y en la mayoría de cepas

Villena C, Vigilancia Ambiental Molecular de Rotavirus Grupo A HumanoVillena C, Vigilancia Ambiental Molecular de Rotavirus Grupo A Humano

GenomaGenoma

VP4VP4

VP7

P

GGenotipos ComunesGenotipos Comunes

G P

1 [8]

2 [4]

3

4

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Vigilancia Vigilancia Hospital Isidro Ayora

Áreas

Consulta Externa Emergencia Pediatría Laboratorio

Registro de Datos Prueba diagnósticode RV

Toma de muestrasde RV

Negativa Positiva

Estudios Moleculares

Toma de muestra

Kit Inmucroma

tográficoIdentificación

RV +

RV -

Caracterización Caracterización

Estudios Moleculares

Extracción RNA Kit para extracción RNA

Tinción con plata

Electroforesis en PAGE

1 R

+

Estudios Moleculares

1ra. Fase

Electroferotipos

RT - PCR

Para P

Para G

2. Amplificación

1. Reverso transcripción

Positivas para G y P

Agarosa - Tinción

Comprobación genotipoSECUENCIACIÓN

Análisis Epidemiológico Molecular

2da. Fase

3ra. Fase

G1,G2,G3,G4,G9

P[4],P[6],P[8],P[9],P[10]

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Resultados Preliminares: Vigilancia Resultados Preliminares: Vigilancia

ROTAVIRUS FRECUENCIA PORCENTAJE 78.7% Negativo

Negativo 303 78.7%

Positivo 82 21.3%

TOTAL 385 100%

21.3% Positivo

F 47.5 % E-P EDA

M 52.5%

CE14.63%

E P59.76%

P25.61%

EDA79.3%

Otro Dx20.7%

Importancia de los datos de Importancia de los datos de VigilanciaVigilancia

Enfermedad Diarreica Aguda EDA en la ciudad de LojaMinisterio de Salud PublicaMinisterio de Salud Publica

Causa Periodo Casos por Edades (años)

<1 1 a 4 5 a 14

No definida Enero-Diciembre 2005 4368 8692 1949

Enfermedad Diarreica Aguda EDA Hospital Regional Isidro AyoraVigilancia de Rotavirus

Causa Periodo Casos por Edades (años)

< 5

Rotavirus Julio-Octubre 2005 82

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Resultados Preliminares: Resultados Preliminares: CaracterizaciónCaracterización

MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101234

56789

1011

Alto Peso Molecular

Tamaño MedianoTriplete Característico

Más Pequeños

MP: Marcador de Peso Molecular 100 pb2,3,4,8,9,10: Electroferotipos Patrón Largo

Casos Positivos Rotavirus

Electroferotipo: Patrón Largo

82 31

GraciasGracias

Público Presente.Público Presente.Mi E i d T b j d l CBCMMi E i d T b j d l CBCM UTPLUTPLMi Equipo de Trabajo del CBCMMi Equipo de Trabajo del CBCM--UTPL.UTPL.

AutoridadesAutoridadesCompañerosCompañerosEstudiantes EBQFEstudiantes EBQF--UTPLUTPL

Diana VillacisDiana VillacisJeimy RuizJeimy RuizJeimy RuizJeimy RuizAndrea GonzálezAndrea GonzálezDoris MacasDoris MacasGabriela CevallosGabriela CevallosMa. Isabel VivancoMa. Isabel Vivanco