vibrio harveyi, una amenaza para las piscifactorías del sur de la península ibérica:...
DESCRIPTION
ResumenEspecímenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactoría delsur de España, los cuales mostraron diversos síntomas tales como úlceras en la partesuperior del cuerpo y mayor producción de mucus epitelial. En el presente estudio dellevó a cabo el aislamiento y caracterización del microrganismo responsable. Entre losfactores que se analizaron se encuentran la actividad hemolítica, dado que este factor devirulencia es empleado de forma habitual en la industria piscícola de diversas regionescomo marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte delmicroorganismo, dado que los crustáceos han sido demostrados con anterioridad comoimportantes reservorios de organismos potencialmente patógenos. Además, dado elcreciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos yagentes quimioterapéuticos, se analizó de la capacidad para producir compuestosbioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en lacosta de Málaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieronconfirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de laactividad hemolítica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentalesdel presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en elcaso de los probióticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos deinhibición.SummarySolea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, whichshowed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in theproduction of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation andcharacterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed arethe hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry ofvarious regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since thecrustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenicorganisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use ofantimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactivecompounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eightbacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated,whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimentalconditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, inwhich five of the strains resulted in inhibition halos.TRANSCRIPT
Prácticas de M.T.E. en Microbiología
Interacción Pez – Bacteria
C. Gallardo, D.L. Márquez, J. Almagro, L. Cerón, A. Cruz, F. Codes, D. López, A. Alves, N. Perea, R. Gómez, J. Moreno,
M. Fontiveros e I. Pla.
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Universidad de Málaga 29071
Introducción
Solea senegalensis
Introducción
Vibrio harveyi
Análisis de la capacidad hemolítica Introducción
Evidencias experimentales sugieren que las hemolisinas podrían ser uno de los factores de mayor importancia en el desarrollo de
las enfermedades .
Análisis de la capacidad hemolítica Metodología
y 24 h adicionales a 37º C
Análisis de la capacidad hemolítica Resultados
No aparecieron indicios de degradación
Análisis de la capacidad hemolítica Discusión
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Introducción
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Introducción
Ocho especies de algas fueron recolectadas:
Jania rubens
Faro de Calaburra 36°30'23.03"N, 4°38'39.78"W
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Introducción
Procedimiento experimental
Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Efecto de extractos de macroalgas
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Introducción Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Resuspensión de V. harveyi en solución
salina a concentración aproximada de 108
UFC/mL
Standards de McFarland (0.5, 1 y 2)
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
0,2 mL de solución bacteriana
+ 200 mL de agua de mar
+ 4 g del alga
0,2 mL de solución bacteriana
+ 200 mL de agua de mar
Muestra problema
Muestra control
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Estimación de bacterias cultivables
mediante titulación en placa
Toma de muestras de dilución a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Resultados Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Discusión Co-cultivo de Dyctiota dichotoma
Descenso del 85,47% en el número de vibrios en el co-cultivo frente al descenso del 30% registrado en el control
Incorporación al medio de cultivo de vibrios exógenos algunos de los cuales podrían corresponder a V. alginolíticus
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Introducción Efecto de extractos de macroalgas
Corallina officinalis Jania rubens Halopteris filicina Ulva rigida
Cladophora dalmática Cystoseira tamariscifolia Osmundea pinnatifida
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Metodología Efecto de extractos de macroalgas
Estimación de bacterias cultivables
mediante titulación en placa
Toma de muestras de dilución a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas
Obtención de extractos hidrofóbicos e hidrofílicos
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Metodología Efecto de extractos de macroalgas
Obtención de extractos hidrofóbicos e hidrofílicos
Los extractos hidrofóbicos se obtuvieron macerando 0,2 g de alga en 10 mL de acetona
Los extractos hidrofílicos se obtuvieron macerando
0,2 g de alga en 10 mL de solución salina
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Resultados Efecto de extractos de macroalgas
Extractos hidrofóbicos
Extractos hidrofílicos
En ningún
caso se apreció halo de inhibición
Producción de antimicrobianos por macroalgas
Discusión Efecto de extractos de macroalgas
De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, ninguno de las especies analizadas presenta compuestos con actividad antimicrobiana frente a V. harveyi
La actividad antibacteriana se encuentre enmascarada por la presencia de algunos compuestos inhibidores en los extractos
El método de extracción también puede haber afectado al grado de susceptibilidad
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Introducción
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Metodología
Estimación de la concentración de Chlorella
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Metodología
Sembrado de V.harveyi en césped
Realización de perforaciones (técnica well-in agar)
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Metodología
Lisado de Chlorella por ultrasonido
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Metodología
Chlorella intacta Chlorella lisada
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Resultados
Los resultados obtenidos fueron negativos en ambos tratamientos
Chlorella sonicada Chlorella no sonicada
Capacidad antimicrobiana de Chlorella
Discusión
La cepa de Chlorella empleada no produce
sustancias antimicrobianas frente a V. harveyi Es posible que ejerza su acción beneficiosa a través
de otros mecanismos
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Introducción
Copépodos Rotíferos
Artémias
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Cocción durante 10 minutos
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Exoesqueletos limpios
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas
Exoesqueletos limpios
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas
Desproteinización Incubación en NaOH 15% a 65ºC durante 3 horas
Lavado con dH2O y filtrado
Exoesqueletos limpios
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas
Desproteinización Incubación en NaOH 15% a 65ºC durante 3 horas
Quitina purificada
Lavado con dH2O y filtrado
Lavado con dH2O y filtrado
Exoesqueletos limpios
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Quitina purificada
Resuspensión en dH2O
Centrifugado
Liofilización
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Tabla 2. Componentes del agar para la
quitina
Componente Concentración
Sulfato amónico 1 g/L
Dihidrofosfato potásico 0,2 g/L
Monohidrofosfato potásico 1,6 g/L
Sulfato magnésico heptahidratado 0,2 g/L
Cloruro sódico 0,1 g/L
Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/L
Cloruro cálcico dihidratado 0,02 g/L
Peptonas 15 g/L
Preparación del medio base de acuerdo con Furukawa et al. (1978)
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
0,3 g de quitina en 10 mL de medio base
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs
0,3 g de quitina en 10 mL de medio base
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs
0,3 g de quitina en 10 mL de medio base
Esterilización en autoclave 121º C durante 15 min
Adición del agar 1,5 % p/v
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Metodología
Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs
0,3 g de quitina en 10 mL de medio base
Esterilización en autoclave 121º C durante 15 min
Vertido de las placas y siembra de las bacterias
Adición del agar 1,5 % p/v
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Resultados
Placa a 72 h Placa a 0 h
Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi
Discusión
La confirmación de la capacidad quitinasa de la
cepa de V. harveyi aislada puede ser determinante a la hora de prevenir futuras
reapariciones de la enfermedad
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Introducción
De acuerdo con la FAO/WHO:
“Un organismo probiótico es un microorganismo vivo que cuando es suministrado en cantidades adecuadas
confiere un beneficio sobre la salud en el huésped”
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Metodología
Se emplearon ocho cepas potencialmente probióticas
DCF 12.2.14/3
DCF 12.1.14/3
DCF 12.10.14/3
DCF 12.4.14/3
DCF 12.9
P12.14/2
P15.14/3
Vibrio fisheri 14/3
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Metodología
Cultivo primario
Caldo de cultivo 2 mL de solución salina +
masa bacteriana
Placas de medio TSA
Inoculación en pocillos
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Resultados
Los resultados obtenidos fueron positivos
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Resultados
Diámetro (cm)
Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas
Discusión
El empleo de probióticos ofrece una alternativa adecuada
para el control de patógenos en instalaciones acuícolas
La cepa DCF 12.10 se postula como la más prometedora
Son necesarios estudios adicionales para contrastar la utilidad in vivo
No es posible desechar la posible utilidad como organismos probióticos de aquellas cepas que no han dado lugar a halos de inhibición
Conclusiones La actividad hemolisina no es un marcador adecuado para la
identificación de las cepas virulentas de V. harveyi
El empleo de Dictyota dichotoma en piscifactorías se postula como una estrategia eficiente para combatir a V. harveyi
Ninguna de los extractos de las macroalgas presenta compuestos con actividad antibiótica frente a V. harveyi bajo las condiciones empleadas
Chlorella no produce compuestos bioactivos frente a V. harveyi
Los organismos quitinosos son potenciales reservorios de V. harveyi
Las cepas probióticas DCF 12.2.14/3, DCF 12.4.14/3, DCF 12.9 y DCF 12.10.14/3 ofrecen enormes posibilidades para prevenir los
brotes de V. harveyi