utls colombia: de la genética clásica a la genómica funcional del siglo xxi: evolución del...

Paul Laissue MD, PhDUnidad de Genética-Grupo GENIUROS

EMCS-Universidad del Rosario

UTLS-24 de octubre de 2012

•Before DarwinBefore Darwin

•Lamarckismo vs DarwinismoLamarckismo vs Darwinismo

•Las leyes de MendelLas leyes de Mendel

•ADN: estructura y funciónADN: estructura y función

•Mutaciones del ADNMutaciones del ADN

•Secuenciación y arraysSecuenciación y arrays

•Medicina molecular del siglo XXIMedicina molecular del siglo XXI

ESTRUCTURAESTRUCTURA

Época prehistóricaÉpoca prehistórica

•La genética existe desde siempre, por comparación de la similitud de los rasgos familiares

Hace 10.000 años: cruces de animales domesticados y plantas

Los griegos (Los griegos (400-300 A.C)

Hipócrates: Pangénesis

Nicolaas Hartsoeker, 1695

Aristóteles

Los rasgos semejan frecuentemente los de generaciones anteriores

No todos los rasgos se heredan

Las partes de cuerpo mutiladas no se heredan

Se hereda la capacidad de producción de los caracteres

Siglos XV a XVIII: hacia la teoría de la evoluciónSiglos XV a XVIII: hacia la teoría de la evolución

•Siglos XV a XVII: la vida en la tierra se desarrolló mecanicamente sin intervención divina

•Siglo XVIII: Pierre de Maupertuis: las modificaciones establecidas durante la reproducción se acumulan para generar nuevas razas o especies

•Siglo XVIII: Georges-Louis Buffon. Las 200 especies de mamiferos conocidas descienden de 38 ancestros comunes

•Siglo XVIII: Carl von Linné: padre de la taxonomía

Siglo XIX: la transformación de las especiesSiglo XIX: la transformación de las especies

•Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829): Filosofía zoológica: 1815

Cambio del medio ambiente

Cambio necesidades

Cambios heredables

Cambio comportamiento

Cambio uso órganos

Siglo XIX: la transformación de las especiesSiglo XIX: la transformación de las especies

•Charles Darwin (1809-1882)

Beagle: 1831-1836

Clasificación de especímenes

Textos de geología

Experimentos en plantas

El origen de las especies, 1859

Charles Darwin: la teoría de la evoluciónCharles Darwin: la teoría de la evolución

•Este proceso lento resulta en cambios en las poblaciones para adaptarse a sus entornos, y en última instancia, estas variaciones se acumulan con el tiempo para formar nuevas especies.

•Los individuos de una población varían considerablemente.

•Gran parte de esta variación es heredable.

•Los individuos menos adecuadas para el medio ambiente tienen menos probabilidades de sobrevivir y menos probabilidades de reproducirse.

• Los individuos más adaptados al medio ambiente tienen más probabilidades de sobrevivir y más posibilidades de reproducirse y de dejar sus rasgos hereditarios a las generaciones futuras, lo que produce el proceso de selección natural.

Darwin vs LamarckDarwin vs Lamarck

Gregorio Mendel: el padre de la genéticaGregorio Mendel: el padre de la genética

•Leyes de Mendel: 1866/1900

•Primera ley: Principio de la segregación

Rasgos dominantes y recesivos

Gregorio Mendel: el padre de la genéticaGregorio Mendel: el padre de la genética

•Leyes de Mendel: 1866/1900

•Segunda ley: Principio de la transmisión independiente

Organismo

Sistemas(Cardiovascular)

Organos

Corazón

Vasos sanguíneos

T. Muscular liso

Tejidos

T. Epitelial

T. Conectivo

Células

MoléculasAtomos

Proteínas

Núcleo

Niveles de organización de los seres vivosNiveles de organización de los seres vivos

Estructura subcelularEstructura subcelular

46 cromosomas23 origen ♀23 origen ♂

Núcleo de una célula somática humanaNúcleo de una célula somática humana

Cromosoma mitótico completo

Sección condensada del cromosoma

Sección extendida del cromosoma

Cromatina de 30 nm formando nucleosomas

Cromatina

ADN

Disección molecular de un cromosoma humanoDisección molecular de un cromosoma humano

•Doble hélice antiparalela•Esqueleto fosfato•Desoxiribosa•Bases nitrogenadas: A-T-G-C

Ley de complementariedad de bases

1953

Estructura molecular del ADNEstructura molecular del ADN

•Organismos: codificar y transmitir la información molecular necesaria a la

herencia

•Células: garantizar la renovación celular (mitosis) por replicación

•Permitir la expresión de genes y la síntesis de proteínas (transcripción y

traducción): dogma central de la biología molecular (ADN-ARN-Proteína)

•Regulación genética y genomica

Funciones del ADNFunciones del ADN

•Proceso mediante el cual una célula madre se divide en dos células hijas idénticas

•La composición cromosómica diploide se mantiene (2n)

Mitosis y replicación del ADNMitosis y replicación del ADN

•Base molecular de la técnica de PCR

que permite la amplificación de ADN

Replicación del ADNReplicación del ADN

•Regiones promotoras

•Exón: secuencia codificante

•Intrón: secuencias no codificantes separando los exones

Estructura de los genesEstructura de los genes

ADN

ARN

Proteína

Dogma central de la biología molecularDogma central de la biología molecular

Transcripción y traducción del ADNTranscripción y traducción del ADN

Traducción: ARNm-ARNt-Protéina

Transcripción y traducción del ADNTranscripción y traducción del ADN

•Código

Universal

El código genéticoEl código genético

Algunas mutaciones del ADNAlgunas mutaciones del ADN

2001: el Genoma Humano2001: el Genoma Humano

•Determinar la secuencia completa de un individuo “sano”

•Crear una base de datos para guardar esta información

•Desarrollar herramientas informáticas de análisis

•Incentivar la creación de tecnología para el desarrollo de otras áreas:

transcriptómica y proteómica

•Crear un espacio legal, ético y social para su utilización

El Genoma Humano (1990-2001) ObjetivosEl Genoma Humano (1990-2001) Objetivos

•3.000.000.000 nucleótidos

•~25000-30000 genes

•SNPs

•Pseudogenes

•Regiones repetidas

•Transposones

•Retrotransposones

•Disponible

El Genoma Humano-ResultadosEl Genoma Humano-Resultados

•Comparación de secuencias entre individuos

•Diagnóstico molecular

•Genómica

•Transcriptómica

•Proteómica

•Evolución

•Genética de poblaciones

El Genoma Humano: algunas aplicacionesEl Genoma Humano: algunas aplicaciones

•PCR: FSHR, LHR, BMP15, GDF9

Técnicas de secuenciaciónTécnicas de secuenciación

T443C

BMP15-Exon 2

WT

Técnicas de secuenciación de primera generaciónTécnicas de secuenciación de primera generación

T443C

BMP15-Exon 2 WT

•C.557C>A → p.Ser186Tyr

•Score SIFT 0,03 → Efecto deletéreo potencial

•Ausente en los controles

Técnicas de secuenciación de primera generaciónTécnicas de secuenciación de primera generación

Ictiosis Curth-MacklinIctiosis Curth-Macklin

Fonseca et al. Br J Dermatol. 2012, in press

Enfermedad ADMutaciones KRT1

Ictiosis Curth-Macklin: mutaciones de KRT1Ictiosis Curth-Macklin: mutaciones de KRT1

KRT1-c.1577delG

Fonseca et al. Br J Dermatol. 2012, in press

KRT1-p.Gly526Alafs*88

Los microarreglosLos microarreglos

Microarreglo (microarray o “chip”): superficie sólida en la cual se fijan

fragmentos de ADN en posiciones específicas.

Primera descripción por microtecnología: 1995

Trends Biotechnol. 1998 16: 301-6.

Microspot mecánico

Inyección

Los microarreglos: algunas aplicacionesLos microarreglos: algunas aplicaciones

•Expresión global: Transcriptómica

•GWAS (Asociación de Genoma Completo)

•Secuenciación de nueva generación (NGS)

•CGH (Hibridización Genómica comparada)

•ChIP-seq

•CNVs

•Proteómica

Microarreglos de expresión: transcriptómica globalMicroarreglos de expresión: transcriptómica global

Secuenciación a gran escala con microarreglosSecuenciación a gran escala con microarreglos

Métodos de NGS

•Microelectroforéticos

•Hibridización

•Análisis de moléculas Tr

•Arreglo cíclico

NGS: métodos de inmobilización/amplificaciónNGS: métodos de inmobilización/amplificación

Roche 454, Polonator, SOLiD

Solexa/Illumina

Emulsión/PCR, y Amplificación en fase sólida

NGS: secuenciaciónNGS: secuenciación

NGS: resultadosNGS: resultados

NGS: tipos de alteraciones genómicas detectablesNGS: tipos de alteraciones genómicas detectables

Exoma(30Mb)

NGS: algunas aplicacionesNGS: algunas aplicaciones

PaquidermoperiostosisPaquidermoperiostosis

Enfermedad ARMutaciones HPGD (-)

Secuenciación exoma 50XHum Mutat. 2012, 33:1175-81

PaquidermoperiostosisPaquidermoperiostosis

Secuenciación exoma 50X

Mutaciones de SLCO2A1

Hum Mutat. 2012, 33:1175-81

Matzuk et al. Nat Med. 2008 14:1197-213.

La reproducción: un rasgo fenotípico complejoLa reproducción: un rasgo fenotípico complejo

Genes implicados en la función testicular murinaGenes implicados en la función testicular murina

Qué genes pueden estar implicados en la disfunción Qué genes pueden estar implicados en la disfunción reproductiva de la pareja hipofértil?reproductiva de la pareja hipofértil?

Secuenciación simultánea de regiones codificantes Secuenciación simultánea de regiones codificantes de 387 genesde 387 genes

Cobertura y diseño del método diagnósticoCobertura y diseño del método diagnóstico

385 genes en 7 categorías funcionales385 genes en 7 categorías funcionales

•♀ Gametogénesis, Foliculogénesis, Ovulación, Eje HHG

•♀ Fecundación•♀ Efecto Materno•♀ Implantación

256 genes256 genes

•♂ Espermatogénesis•♂ Fecundación•♂ Eje HHG

277 genes277 genes

145 genes comunes145 genes comunes

Genómica del siglo XXIGenómica del siglo XXI

•Diagnóstico: enfermedades monogénicas y complejas

•Pronóstico: cáncer

•Tratamiento: farmacogenética

Cuál es el origen genético del Síndrome de Miller?

Nat Genet. 2010 : 30-5

NGS: identificación de genes causales de patologías mendelianasNGS: identificación de genes causales de patologías mendelianas

Nat Genet. 2010 : 30-5

DHODHConfirmación por secuenciación directa en 4 pacientes no relacionados


Nat Genet. 2010 : 30-5

NGS: conclusionesNGS: conclusiones

Disección molecular de un cromosoma humanoDisección molecular de un cromosoma humano

Orden1600-1850

Antes de darwin: Histoire de la pensée évolutionnistewikipipedia

LamarckDarwin

1866-1900Mendel

KGN KGNTransfección

pFOXL2Mock(Vector Vacío)

Extracción ARNs totales

Síntesis de ADNc


PCR cuantitativa

Microarrays de expresión

Permiten la comparación del efecto de dos condiciones sobre el nivel

de transcrito a una escala genómica global

Micorarrays de expresión

Répression / Induction

-4,00

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

JAM

2

StA

R

INH

BB

ES

R1

HS

D17

B4

CA

V1

NC

OR

1

FU

SIP

BS

T2

ZN

F50

3

AR

GL

TL

2

CY

P19

A1

CR

EB

3L2

BC

DO

2

HS

D17

B1

CA

V2

BM

P4

BC

L2

TG

FB

R2

PT

GS

1

CD

K6

SO

X9

FS

T

FO

XL

2

AC

DK

C5

HS

D3B

1

FS

HR

INH

BA

ES

R2

BM

P6

AC

VR

1B

OS

R2

PT

GS

2

*

****

**

n=3 (tres transfecciones indépendientes)

* = p<0.025 for a one-tailed test

Biosíntesis de prostanoides

Vía de señalización TGFβBiosíntesis de

esteroides

induction

represión


Eur J Endocrinol. 2006, 154:739-44.

Análisis de resultadosAnálisis de resultados

NGS: métodos de inmobilización/amplificaciónNGS: métodos de inmobilización/amplificación

Emulsión/PCR, y Amplificación en fase sólida

Roche 454, Polonator, SOLiD

Solexa/Illumina

NGS: identificación de variantes patogénicasNGS: identificación de variantes patogénicas

NGS: exoma y genómica médicaNGS: exoma y genómica médica

•Electroforesis sobre gel de agarosa y visualización UV

Purificación + secuenciación

Técnicas de secuenciación de secuenciación directaTécnicas de secuenciación de secuenciación directa

Nature. 2009 461: 272–276

Es posible cartografiar patologías monogénicas a partir de la secuenciación del exoma de algunos individuos?



Nature. 2009 461: 272–276

NGS: secuenciaciónNGS: secuenciación

Solexa/Illumina

La Edad Media: ideas evolucionistasLa Edad Media: ideas evolucionistas

•Al-Jahiz (776-868): lucha por la existencia, transformación de las especies, influencia del medio ambiente

•Siglo X: (Ikhwan al-Safa): creación de los mundos y de la evolución

• Nasir ad-Din at-Tusi (1201-1274): « takamul » (perfeccionamiento): la transformación del medio ambiente conduce a la evolcución de las especies

• Ibn Khaldoun (1338-1405): « el plano humano se alcanza a partir del mundo de los monos »

utls colombia: de la genética clásica a la genómica funcional del siglo xxi: evolución del...

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