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Bol. San. Veg. Plagas, 35: 595-615, 2009

Uso de Bioten para la protección biológica de plantones de olivocontra la Verticilosis causada por el patotipo defoliante deVerticillium dahliae

R. M. JIMÉNEZ DÍAZ, J. L. TRAPERO CASAS, J. BONED, B. B. LANDA, J. A. NAVAS CORTÉS

La protección del sistema radical de plantones de olivo certificados libres de Verti-cillium dahliae de la infección severa por inóculo del patógeno residente en el suelopuede reducir el potencial de Verticilosis en árboles jóvenes y facilitar la expresión enellos del fenómeno de recuperación sintomatológica. En este trabajo se ha contrastadoesta hipótesis con el formulado de biocontrol Bioten®, compuesto por estirpes de loshongos Trichoderma asperellum y T. gamsii, utilizando plantones de olivo ‘Picual’micropropagados o autoenraizados e inoculados con V. dahliae defoliante por inmersiónradical o transplante a suelo infestado en experimentos repetidos en condiciones contro-ladas y en microparcelas en condiciones naturales. El tratamiento del sistema radical dela planta con Bioten® al 1% redujo en más de 30% y de forma consistente la severidadde síntomas en plantones inoculados por inmersión radical, y en proporción variable, de18 a 60%, la incidencia de la enfermedad en ellos. El transplante a suelo infestado tam-bién redujo la incidencia y severidad de síntomas en cierta extensión, pero la mayor vari-abilidad y menor desarrollo de enfermedad en los plantones no tratados con Bioten® hadificultado la significación estadística de los efectos de éste. La supresión de Verticilo-sis por Bioten® en condiciones controladas fue reproducida en condiciones de campobajo un elevado potencial de enfermedad, indicado por la aparición de los primeros sín-tomas de Verticilosis a los 4 meses de la inoculación y por el 100% de incidencia deenfermedad en los plantones no tratados a los 16 meses de aquélla. Dicha supresión tam-bién se caracterizó por la reducción global de la severidad de síntomas en los plantonestratados con el formulado, que determinó una disminución significativa del 60% en lacantidad total de enfermedad desarrollada en los controles no tratados.

R. M. JIMÉNEZ DÍAZ. Departamento de Agronomía, ETSIAM, Universidad de Córdoba; Edi-ficio C4 Celestino Mutis, Campus Rabanales, Apdo. 14071 Córdoba ([email protected]).J. L. TRAPERO CASAS, B. B. LANDA DEL CASTILLO, J. A. NAVAS CORTÉS. Departamentode Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC; Alameda del Obis-po, s/n, Apartado 4084, 14080 Córdoba.J. BONED, ISAGRO ESPAÑA, S. L. Maldonado, 63, E-C, 2º I, 28006 Madrid.

Palabras clave: Control biológico, control integrado, Olea europaea, producciónviverista.

INTRODUCCIÓN

Los ataques de Verticilosis causada por elhongo Verticillium dahliae constituyen sinduda uno de los problemas sanitarios másimportantes del olivar español en la actuali-dad. Esta enfermedad fue diagnosticada por

vez primera en España en 1979 (CABALLERO etal., 1980), en olivares experimentales delactual IFAPA en Córdoba, y pocos años mástarde se constató su amplia distribución y ele-vada incidencia y severidad de los ataques enlas provincias de Córdoba, Jaén y Sevilla(BLANCO-LÓPEZ et al., 1984). Sin embargo,

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dicha información no originó entonces, -niaparentemente en fechas inmediatas posterio-res- mayor preocupación en el sector oleícola.Desde entonces, la Verticilosis se ha extendi-do a nuevas zonas olivareras en Andalucía(incluyendo las provincias de Cádiz, Huelva yGranada) (SÁNCHEZ-HERNÁNDEZ et al., 1998,JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 2008a; RODRÍGUEZ et al.,2008; JIMÉNEZ DÍAZ, datos no publicados),afectando en particular y severamente a árbo-les jóvenes en nuevas plantaciones de regadío;y ha sido diagnosticada en olivares en otrasComunidades Autónomas (Ej., Aragón, Casti-lla-La Mancha, Cataluña, Extremadura yValencia) (J. ARMENGOL; A AZPILICUETA; J.TOUS; S. TRIVIÑO, comunicación personal; R.M. JIMÉNEZ DÍAZ, datos no publicados).

En Andalucía, tal incremento en la exten-sión de la Verticilosis del olivo ha coincidido

con la expansión en ella de este cultivo -queocupa ahora ca 80% de las aproximadamen-te 2,5 millones ha de olivar existentes enEspaña (MAPA, 2006)- así como con lasnotables innovaciones tecnológicas en laproducción oleícola que caracterizan a la‘Nueva olivicultura’; i.e., el establecimientode nuevas plantaciones intensivas o superin-tensivas, la propagación viverista del mate-rial de plantación, regadío, mínimo o nolaboreo, fertilización, mecanización de lacosecha, etc. (RALLO, 1998a; b; VILLALOBOS

et al., 2006). Junto con dichos cambios en elcultivo se ha producido además un cambiosignificativo en las poblaciones de V. dahliaeque infectan olivo en Andalucía, en las queahora predomina el patotipo defoliante (D)que se caracteriza por ser mucho más viru-lento que el patotipo no-defoliante (ND) pre-

Figura 1. Síntomas de Verticilosis causados por el patotipo defoliante de Verticillium dahliae en olivo ‘Arbequina’ de1,5 años de edad plantado en un suelo con historia de Verticilosis de algodonero en Écija (Sevilla). Nótese la

defoliación completa o sectorial de las ramas del árbol.

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valente hasta ahora (MERCADO-BLANCO etal., 2001; 2002; LÓPEZ-ESCUDERO y BLAN-CO-LÓPEZ, 2007), al cual son moderada oaltamente susceptible los cultivares demayor interés oleícola (LÓPEZ-ESCUDERO yBLANCO-LÓPEZ; 2004). El patotipo D fuediagnosticado originariamente en la zona decultivo intensivo de algodón en las Marismasdel Guadalquivir (BEJARANO et al., 1996),pero se ha extendido progresivamente haciazonas olivareras y actualmente es el patotipode V. dahliae predominante en las provinciasde Córdoba, Jaén y Sevilla, y ha sido diag-nosticado en menor extensión en Huelva yGranada (JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 2008a).

La extensión y severidad de los ataquespor el patotipo D, que con frecuencia deter-minan la muerte del árbol (Fig. 1), ha creadohonda preocupación al olivicultor y auspi-ciado expectativas de que la enfermedadpuede ser controlada eficientemente median-te intervenciones simples de naturaleza quí-mica sobre el olivo afectado (i.e., la “cura-ción” del árbol enfermo), que está generandouna profusión de recomendaciones y trata-mientos con una variedad de productos,registrados o no, cuya eficacia no ha sidodemostrada experimentalmente ni publicadaen ámbitos científicos o técnicos. Por el con-trario, el conocimiento que se viene produ-ciendo durante los últimos años a través de lainvestigación científica y técnica sobre lanaturaleza etiológica y epidemiológica de laenfermedad, indican convincentemente quela Verticilosis del olivo es una enfermedad denaturaleza compleja y su control ha de basar-se fundamentalmente en la aplicación demedidas de lucha previas a la plantación enuna estrategia de manejo integrado (TJAMOS,1993; TJAMOS y JIMÉNEZ-DÍAZ, 1998; JIMÉ-NEZ DÍAZ et al., 2003).

La oportunidad de una estrategia de con-trol integrado de la Verticilosis del olivo esdeterminada por la patogénesis de la enfer-medad. Entre las características generales deésta que dificultan su control merecen serdestacadas: (i) la capacidad de V. dahliae desobrevivir en el suelo durante más de unadécada mediante microesclerocios formados

en tejidos enfermos que se incorporan alsuelo tras la degradación de éstos; (ii) el quedicho agente sea capaz de infectar varioscentenares de plantas de hoja ancha, herbá-ceas y leñosas, cultivadas o arvenses; y (iii)el hábito infeccioso de V. dahliae de crecerconfinado en el xilema de su huésped duran-te la fase parasítica de su ciclo vital; queimpide poder acceder a él mediante fungici-das aplicados tópicamente. A estas caracte-rísticas se suman además algunas peculiaresde la Verticilosis en Andalucía, como son;(iv) la prevalencia del patotipo D, cuyasinfecciones originan la caída extensa dehojas verdes infectadas (que no se produceen olivos infectados por el patotipo ND) yeventualmente la muerte de la planta infecta-da (JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 1998; NAVAS-COR-TÉS et al., 2008); y (v) la versatilidad demedios mediante los que se puede dispersarel patógeno en general, y el patotipo D enparticular, que incluyen al menos: (1) el des-plazamiento de suelo infestado medianteaperos, maquinaria, vehículos, agua de riegoa pié, etc.; (2) la diseminación de materialvegetal (Ej., restos de plantas enfermas,hojas de algodón y olivo) y transporte decosechas de cultivos (particularmente algo-dón) infectados por el patógeno; (3) la utili-zación de plantones de olivo infectados porV. dahliae; y (4) el uso de agua de riegoinfestada por éste (THANASSOULOPOULOS,1993; JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 1998; MERCADO-BLANCO et al., 2003; RODRÍGUEZ JURADO yBEJARANO ALCÁZAR, 2007; JIMÉNEZ-DÍAZ etal., 2008b; NAVAS-CORTÉS et al., 2008).Dichos medios de dispersión han podidocontribuir a la extensa distribución del pato-tipo D en Andalucía en la actualidad.

Uno de los aspectos más intrigantes de laVerticilosis del olivo, que es de relevanciapara su manejo integrado, es la disminuciónprogresiva de la cantidad de enfermedad quetiene lugar en el transcurso de los años des-pués de la infección inicial por el patógeno,como consecuencia de la recuperación de laplanta de los síntomas de aquélla si la pri-mera infección no origina enfermedad seve-ra (denominada recuperación sintomática de

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la planta enferma). Este fenómeno de reduc-ción natural de Verticilosis en olivares afec-tados fue descrito por WILHELM y TAYLOR

(1965) en California, observado más tarde enAndalucía (BLANCO-LÓPEZ et al., 1990) eIsrael (LEVIN et al., 2003), y confirmadoexperimentalmente mediante inoculacionesartificiales de plantones de olivo en condi-ciones controladas (RODRÍGUEZ JURADO,1993; MERCADO-BLANCO et al., 2001;LÓPEZ-ESCUDERO y BLANCO-LÓPEZ, 2005).La interpretación fitopatológica de dichofenómeno es que, en condiciones de infec-ciones de severidad moderada, la recupera-ción sintomatológica de los olivos está aso-ciada con la inactivación de V. dahliae en sustejidos de manera que son necesarias nuevasinfecciones a través del sistema radical de laplanta antes afectada para que la enfermedadse desarrolle de nuevo. En consecuencia,reducir el potencial de enfermedad severa enla primera infección, y proteger el sistemaradical del árbol recuperado de los síntomascontra subsiguientes infecciones son opcio-nes para el control de la Verticilosis delolivo. A ello puede contribuir la utilizaciónde plantones certificados libres de V. dahliaey tratados con agentes de biocontrol, y evitarel uso de suelos infestados por el patógeno,particularmente el patotipo D.

En este artículo se presentan resultados deexperimentos realizados en condiciones con-troladas óptimas para el desarrollo de infec-ciones del patotipo D en plantones de‘Picual’, así como en condiciones de campo,para determinar si el tratamiento del sistemaradical de plantones de olivo con el formula-do Bioten® es eficiente en reducir el desarro-llo de Verticilosis causada por el patotipo Dde V. dahliae.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetalPara los experimentos se han utilizado

plantones de olivo ‘Picual’ certificados libresde V. dahliae de diversa procedencia y natu-raleza; incluyendo plantones de 3, 4 y 6meses de edad, micropropagados de yemas

axilares en condiciones axénicas por Cotevi-sa (Alicante); y plantones propagados porautoenraizado de estaquillas semileñosas encama caliente, bajo nebulización, por Vive-ros Aulaga (Córdoba). El cv. Picual es el másextensamente cultivado en España y es muysusceptible al patotipo D de V. dahliae(LÓPEZ-ESCUDERO et al. 2004; RODRÍGUEZ

JURADO 1993). Con la elección de dichomaterial se ha pretendido asegurar la dispo-nibilidad de plantones de calidad representa-tivos de las varias formas de propagación uti-lizadas por viveros comerciales en España.

El formulado Bioten®

Bioten® WP es un formulado fitosanitariogranulado de Isagro S. L registrado en laUnión Europea (UE) y en el Ministerio deMedio Ambiente y Medio Rural y Marino(Nº de registro 25.234) para su utilizacióncontra V. dahliae en olivo, compuesto porestirpes de los hongos Trichoderma aspere-llum (2%) (ICC012, Nº de registro 25.212) yT. gamsii (2%) (ICC080, Nº de registro25.211). Ambas estirpes son cultivables ymorfológicamente diferenciadas en cultivo enmedios microbiológicos comunes, y han sidocaracterizadas molecularmente mediante laamplificación y secuenciación de la regiónITS1-5.8S-ITS2 del ADN ribosómico y delgen tef1 (factor de elongación), y subsiguienteanálisis filogenéticos “Neighbor-Joining” y de“Máxima Parsimonia” de las secuenciasamplificadas junto con las 250 secuencias mássimilares que están depositadas y accesibles enel Genbank. Las secuencias amplificadas hansido depositadas en el GenBank (GQ351595,GQ351596, GQ351597, GQ351598).

Efectos del tratamiento con Bioten®

sobre el desarrollo de Verticilosis en con-diciones controladas

Tratamiento con el formulado Bioten®

Para determinar la dosis de Bioten® ade-cuada para los experimentos de biocontrol,se estimó primero la densidad de inóculo deTrichoderma spp. viable contenido en el for-mulado mediante diluciones en serie decinco muestras de 1 g del mismo, que se


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incubaron en un medio selectivo en placaspetri (ELAD et al., 1981; NEMEC et al. 1996)a 25±1º C y un fotoperiodo de 12 h/día deluz fluorescente y NUV de 180 µEm-2s-1.Los resultados indicaron una densidad deinóculo de 4,9x108 unidades formadoras decolonias (ufc)/g de formulado, que estuvoconstituida por proporciones similares de losdos aislados que lo componen

Asimismo, en un bioensayo preliminar sedeterminó la población de Trichoderma spp.que se establece y persiste en el sistema radi-cal de plantones de olivo tratados con Bio-ten®; así como en qué medida la extensiónde dicha población puede ser influida por lamanipulación de las plantas tratadas durantela subsiguiente inoculación de ellas con V.dahliae. Para ello, sobre el sistema radicaldesnudo de plantones micropropagados delcv. Picual de 3 meses de edad (20 repeticio-nes) se distribuyeron 100 g de una mezcla desuelo (limo: turba, 2:1 v/v) pasteurizado (1h, 70º C) conteniendo Bioten® a las dosis de1% o 10% (p/p), de manera que las raícesquedaron adecuadamente cubiertas por ella.Como testigos se utilizaron plantones simi-larmente tratados con la mezcla de suelopasteurizada que no contenía Bioten®. Losplantones tratados y testigos se transplanta-ron a la mezcla de suelo pasteurizada enmacetas de arcilla (0,75 L) (1 plantón/mace-ta) y se incubaron durante 14 días (10 plan-tones) ó 60 días (10 plantones) en una cáma-ra de crecimiento ajustada a 25±1º C, 60-90% de humedad relativa (HR), y un fotope-riodo de 14 h/día de luz fluorescente de 360µE m-2s-1. Durante el desarrollo del experi-mento, las plantas se regaron de forma regu-lar, según necesidad, y se fertilizaron con lasolución nutritiva de Hoagland.

Transcurrido el periodo de incubación, elsistema radical de los plantones se sacudióligeramente para retener el suelo rizosférico,las raíces se trocearon en fragmentos de 5 a10 mm de longitud, y la población de Tri-choderma spp. asociada con la rizosfera delos plantones se estimó en 1 g de dichos frag-mentos. A tal fin, los fragmentos de raíces sesuspendieron en 10 ml de agua estéril, la sus-

pensión se sometió a sonicado durante 20min, y del sonicado se realizaron dilucionesen serie en placas petri con el medio selecti-vo anterior incubadas en las mismas condi-ciones antes descritas.

Los plantones de “Picual” tratados conBioten® 1% crecieron sin síntomas y deforma satisfactoria. A los 14 días del trata-miento, la población de Trichoderma spp. enla rizosfera de su sistema radical conteníauna densidad de inóculo media de 106 ufc/gde raíz, y dicha densidad de inóculo dismi-nuyó a 2,5x105 ufc/g de raíz cuando las raí-ces de los plantones se sumergieron en aguaestéril durante 20 min para simular el proce-so de inoculación con V. dahliae. Sin embar-go, transcurridos 60 días del tratamiento conBioten® 1% dicha población rizosférica dis-minuyó hasta 8,7x105 ufc/g de raíz y lainmersión en agua estéril la redujo hasta1,2x105 ufc/g de raíz. Contrariamente a loanterior, el tratamiento con Bioten® 10% ori-ginó el desarrollo de clorosis y necrosisfoliar, y defoliación en proporción variable,que comenzó 1 semana después del trata-miento y se acentuó 1 semana más tarde,dando lugar a la muerte de aproximadamen-te 50% de las plantas. Las raíces de las plan-tas afectadas mostraban zonas necróticas deextensión variable y podredumbres húmedasque facilitaron la retención de abundantesuelo al sistema radical de las plantas extraí-das de las macetas. El desarrollo de dichossíntomas en el sistema radical de los planto-nes desaconsejó la estimación subsiguientede la población de los aislados fúngicos en larizosfera de ellos.

Inóculo e inoculación con Verticilliumdahliae

En los experimentos in planta se utilizó elaislado monoconídico V138I de V. dahliaeD, altamente virulento sobre algodón y olivo(BEJARANO-ALCÁZAR et al., 1996; MERCADO-BLANCO et al., 2002; 2003; 2004). El inócu-lo consistió en una suspensión de conidias deV. dahliae V138I D en agua desionizadaestéril obtenidas de cultivos del hongo encaldo de patata dextrosa en agitación a 130


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rpm, e incubados 25±1º C, en oscuridad,durante 7 días.

Los plantones tratados y no tratados conBioten® e incubados durante 2 semanas enla mezcla de suelo pasteurizada, se retiraroncuidadosamente de las macetas y se inocu-laron por uno de los siguientes procedi-mientos: (i) inmersión de su sistema radicaldesnudo e intacto en una suspensión de 107

conidias del patógeno/ml durante 20 min ysubsiguiente transplante a la mezcla desuelo limo: turba (2:1 v/v) esterilizada(121º C durante 1 h, dos veces consecuti-vas) en macetas de arcilla de 0,75 L (1 plan-tón/maceta); o (ii) transplante de los planto-nes a dichas macetas conteniendo la mezclade suelo estéril infestada con una densidadde inóculo de 2x106 conidias de V. dahliae/gde suelo. Como controles sirvieron planto-nes tratados similarmente a los inoculados,excepto por la ausencia de inóculo de V. dah-liae.

Desarrollo experimental La eficacia de Bioten® para el control de

Verticilosis en plantones de olivo se determi-nó en cinco experimentos (I-V) en el escena-rio más favorable para el desarrollo de lasinfecciones y la enfermedad, incluyendo eluso del aislado V138I de V. dahliae D alta-mente virulento, el cv. Picual, altamente sus-ceptible al mismo, y condiciones de incuba-ción óptimas para el desarrollo de la Vertici-losis. En los experimentos I y II se utilizaron,respectivamente, plantones de 6 meses deedad micropropagados o autoenraizados,que fueron inoculados con V. dahliae porcada uno de los dos métodos de inoculaciónreferidos anteriormente. Los plantones setrataron con Bioten® 1% en la mezcla desuelo pasteurizada (1 plantón/maceta) comose ha descrito anteriormente, y crecierondurante 14 días en dicha mezcla en macetasde 0,75 L en una cámara de crecimientoajustada a 25±1º C, 60-90% HR, y un foto-periodo de 14 h/día de luz fluorescente de360 µEm-2s-1. Como testigo sirvieron planto-nes cuyo sistema radical fue similarmentetratado con la mezcla de suelo pasteurizado

sin Bioten®. Los plantones tratados con Bio-ten® 1% crecieron libres de síntomas.

Para confirmar los resultados obtenidosen los experimentos I y II, se repitieron éstoscon ligeras modificaciones (experimentos IIIy IV) a fin de explorar procedimientos queeventualmente podrían ser empleados paratratamientos en condiciones naturales. En elexperimento III se utilizaron plantonesmicropropagados de 4 meses de edad, mien-tras que para el experimento IV se emplea-ron plantones autoenraizados similares a losdel experimento II. En ambos casos, el trata-miento con Bioten® se realizó durante eltransplante de los plantones desde el substra-to de enraizamiento en el vivero a la mezclade suelo pasteurizada en macetas, medianteriego del sistema radical en el cepellón delplantón con 100 ml de una suspensión delformulado al 5% (p/v) en agua desionizadaestéril. Como testigo sirvieron plantonescuyo sistema radical fue similarmente trata-do con agua estéril; y los plantones tratadosy testigos se incubaron durante 14 días en lascondiciones anteriormente mencionadas.Los plantones tratados con Bioten® 5% cre-cieron sin síntomas; y la población rizosféri-ca de los aislados fúngicos del formuladoestimada en su sistema radical alcanzó unadensidad media de 1,6x106 ufc/g de raíz enlos plantones micropropagados y 1,9x106

ufc/g de raíz en los autoenraizados.Los plantones tratados y no tratados con

Bioten® se inocularon con V. dahliaemediante: (iii) inmersión de su sistemaradical intacto –previamente sacudido lige-ramente hasta retener el cepellón de subs-trato de enraizamiento-, en una suspensiónde 107 conidias /ml durante 20 min y subsi-guiente transplante a la mezcla de sueloesterilizada, o (iv) transplante de los planto-nes a la mezcla de suelo estéril infestadacon una densidad de inóculo de 5x106 coni-dias de V. dahliae/g de suelo. Como contro-les sirvieron plantones tratados similarmen-te a los inoculados, excepto por la ausenciade inóculo de V. dahliae. Todos los planto-nes crecieron en macetas de arcilla de 0,75L (1 plantón/maceta).


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En el experimento V, los plantones micro-propagados o autoenraizados se trataron conla suspensión de Bioten® al 5% e inocularonal mismo tiempo con V. dahliae mediantetransplante a la mezcla de suelo estéril infes-tada con 5x106 conidias del patógeno/g desuelo. A tal fin, durante el transplante a lamezcla de suelo infestada se depositaron 25ml de la suspensión de Bioten® sobre un ter-cio del volumen total de mezcla en la maceta,25 ml de ésta sobre el segundo tercio de mez-cla alrededor del cepellón, y los 50 ml restan-tes sobre el resto de volumen de aquélla.Como testigos y controles sirvieron, respecti-vamente, plantones tratados similarmente alos descritos excepto por la ausencia del for-mulado Bioten®, o de inóculo de V. dahliae.

Los plantones utilizados en los experimen-tos I-V se incubaron en cámaras de creci-miento ajustadas a 25±1º C, 60-90% HR, y unfotoperiodo de 14 h/día de luz fluorescente de360 µEm-2s-1 durante 2 meses, momento enque se dieron por finalizados. Adicionalmen-te, la incubación de los plantones autoenraiza-dos del experimento II se prolongó duranteotras 25 semanas en el periodo de Diciembrea principios de Junio de 2006 en condicionesnaturales bajo umbráculo, con lo que el perio-do experimental se extendió a 8 meses tras lainoculación con V. dahliae, aproximadamen-te. En todos los experimentos, los plantonesse regaron de forma regular, según necesidad,y se fertilizaron con la solución nutritiva deHoagland.

Diseño experimental, evaluación de laenfermedad y análisis de datos

Los experimentos I-V tuvieron un diseñofactorial de tratamientos con tres repeticio-nes completamente al azar, cada una de lascuales constó de 5 plantones (i.e., 15 plan-tones por combinación experimental, eigual número de plantones tratados y no tra-tados con Bioten® pero no inoculados conV. dahliae.

El desarrollo de Verticilosis durante losexperimentos se evaluó por: (i) la incidenciade plantas sintomáticas (expresada en por-centaje); (ii) la severidad de los síntomas en

plantas individuales (estimada en una escala0-4 según el porcentaje de parte aérea afecta-da; 0 = sin síntomas, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%,3 = 67-100%, 4 = planta muerta) (Mercado-BLANCO et al., 2001; 2002; 2004) determina-da a intervalos semanales después de la ino-culación con el patógeno; y (iii) el área bajola curva de progreso de la enfermedad estan-darizada por el tiempo de desarrollo de éstaen días (ABCPE) calculada según MADDEN etal. (2007). En el experimento II se evaluóademás el desarrollo de enfermedad durantela incubación adicional en umbráculo a inter-valos de 2-4 semanas. Asimismo, 3 mesesdespués de la inoculación se determinó lainfluencia del tratamiento con Bioten® y lainfección por V. dahliae sobre el crecimientode los plantones estimada por la variaciónporcentual en la longitud total del tallo y bro-tes de cada planta desde el momento de lainoculación con el patógeno. Los datos sesometieron a análisis de varianza previatransformación de valores porcentuales a arc-sen (Y/100)1/2, y las medias de tratamientosse compararon entre si mediante el contrastede la mínima diferencia significativa protegi-da de Fisher (LSD) a P ≤ 0,05.

Para confirmar la infección las plantaspor V. dahliae, finalizados los experimentosse realizaron aislamientos del patógeno enagar patata dextrosa (PDA) de todos losplantones inoculados con V. dahliae, asícomo de cuatro plantones de los testigos notratados ni inoculados, o tratados sólo conBioten®, seleccionados aleatoriamente. Lasraíces y tallos de los plantones se lavaronbajo agua de grifo; los tallos defoliados ycuatro raíces por plantón elegidas arbitraria-mente se desinfestaron superficialmente enlejía comercial al 10% en agua estéril duran-te 1min (tallos) o 1,5 min (raíces); y trozosde 0,5 cm de tallos desinfestados y descor-tezados, y raíces desinfestadas se incubaronen PDA suplementado con aureomicina(30µg/L) en placas petri a 25±1ºC en oscu-ridad durante 3 semanas. Asimismo, finali-zados los experimentos II a V se estimó ladensidad de población de Trichoderma spp.que persistió en el sistema radical de 3 plan-


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tones de olivo testigos e inoculados mues-treados aleatoriamente.


sobre el desarrollo de Verticilosis en con-diciones de campo

El efecto de Bioten® sobre el desarrollode Verticilosis en condiciones de campo seestudió en microparcelas (1,25 x1,25 m2, 0,5m de profundidad) solarizadas de un sueloareno limoso (pH 8,5, 1,4 % de materia orgá-nica) en la Finca Alameda del Obispo delIFAPA, (Córdoba, 37,5°N, 4,8°W, altitud110 m) durante el periodo 2007 a 2009. Elsuelo de las microparcelas humectado a lacapacidad de retención se solarizó cubrién-dolo con una lámina de polietileno transpa-rente (50 µm de grosor) durante el periodo11 de Julio a 31 de Septiembre, 2006.

El suelo solarizado se infestó con inóculodel aislado V. dahliae V138I D en el momen-to de transplantar en las microparcelas plan-tones de ‘Picual’ autoenraizados (ViverosAulaga, Córdoba). El inóculo se incrementóen matraces erlenmeyer conteniendo unamezcla de arena: harina de maíz: agua(9:1:2, p/p) (AMA) esterilizada en autoclave(2,5 h, 121ºC), e infestada con 15 discos dePDA de 5 mm de diámetro colonizados porel patógeno durante 7 días a 25±1º C. ElAMA infestado se incubó a 25±1ºC en oscu-ridad durante 30 días, agitándose el cultivovigorosamente cada 4-5 días para redistri-buir el crecimiento fúngico. La densidad depropágalos de V. dahliae en el AMA coloni-zado estimada por el método de tamizadohúmedo fue de 3,1x108 ufc/g AMA. Elpotencial de dichos propágulos como inócu-lo se determinó en dos ensayos preliminaresutilizando plantones de olivo ‘Picual’ auto-enraizados de 6 meses de edad y plántulas desandía cv. Dulce Maravilla, cuyos resultadospermitieron ajustar la proporción de AMAinfestado para la inoculación en las micro-parcelas.

Desarrollo experimental El experimento en las microparcelas se

planteó con un abordaje que simulara la

eventual utilización del formulado Bioten®

en un esquema de producción viverista deplantones autoenraizados de olivo. Para ello,el cepellón de plantones ‘Picual’ de 6 mesesse trató con 100 ml de una suspensión deBioten® al 5% (p/v) en agua desionizadaestéril, como se describe en el experimentoIV anterior, y los plantones tratados y testi-gos se incubaron en las mismas condicionesdescritas para los experimentos anteriores,durante 3 meses.

Los plantones tratados con Bioten®, de 9meses de edad, se transplantaron en lasmicroparcelas (2 plantones/microparcela ubi-cados diametralmente en ella) el 6 de Marzode 2007 y la inoculación con V. dahliae serealizó durante el transplante. Como inóculose empleó una mezcla de suelo solarizado yAMA infestado (5%, v/v), que en el momen-to del transplante contenía 1,4x107 propágu-los de V. dahliae/g estimados por el métodode tamizado húmedo. Para la inoculación decada plantón se distribuyeron 2 kg de la mez-cla infestada sobre el fondo del hoyo de plan-tación y otros 2 kg alrededor del cepellón delplantón depositado en aquél. Como controlesno infestados sirvieron microparcelas simila-res en las que se aportó mezcla de suelo sola-rizado y AMA no infestado. Seis meses des-pués de la inoculación, la densidad de inócu-lo de V. dahliae en el suelo próximo al siste-ma radical de los plantones en dos micropar-celas no tratadas con Bioten® se estimó enuna media de 650 propágulos/g suelo secomediante tamizado húmedo.

Coincidentemente con el transplante y lainoculación con V. dahliae se realizó un tra-tamiento adicional con Bioten® 2% en losplantones tratados anteriormente e incuba-dos en cámara de crecimiento. Para ello, elformulado se hidrató durante 24 h a la tem-peratura ambiente en agua desionizada (20g/L) y 1L de la suspensión se distribuyósobre el plantón, aportando 1/3 de dichovolumen sobre el inóculo de V. dahliae depo-sitado en el fondo del hoyo (o la mezcla quesirvió como testigo), otro 1/3 sobre el cepe-llón de transplante cubierto parcialmente pordichos inóculo o mezcla, y el 1/3 restante

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sobre el suelo solarizado que cubrió deforma completa el plantón transplantado.Los plantones que sirvieron como testigorecibieron agua en igual volumen al de lasuspensión de Bioten®. La aplicación deBioten® se repitió aproximadamente 1 añodespués de la plantación, mediante riego delos plantones tratados con 1L de suspensióndel formulado hidratado al 1%, después deretirar la capa superficial de suelo en lamicroparcela. Tras la aplicación de Bioten®,las microparcelas se regaron con agua parafacilitar la percolación del formulado hacialas raíces de los plantones y se cubrieron conel suelo antes retirado. Las microparcelasque sirvieron como testigos recibieron aguasolamente. Las microparcelas se fertilizaroncon un complejo NPKS después del trans-plante (15:15:15:15) y 1 año después con uncomplejo similar (NPKS 12:12:17:15), seregaron por goteo a satisfacción de demandacon agua de río (dos goteros de 4L/h porplantón), y los plantones se trataron conclorpirifos al 0,2% y abamectina 1,8 al 0,2%.Las plantas arvenses se retiraron de lasmicroparcelas manualmente.

El experimento constó de un diseño en par-celas sub-subdivididas, siendo la infestacióndel suelo con V. dahliae el factor principal y eltratamiento con Bioten® el factor subordina-do, con seis repeticiones completamente al

azar (dos plantones/microparcela). El desa-rrollo de Verticilosis en las microparcelas seevaluó por: (i) la incidencia de plantas sinto-máticas (expresada en porcentaje); (ii) laseveridad de los síntomas en plantas indivi-duales (estimada en una escala 0-4 determina-da a intervalos de 2 semanas después la ino-culación con el patógeno; y (iii) el ABCPEestandarizada por el tiempo de desarrollo dela enfermedad. Los datos se sometieron a aná-lisis de varianza previa transformación devalores porcentuales a arcsen (Y/100)1/2, y lasmedias de tratamientos se compararon entre simediante el contraste de la mínima diferenciasignificativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤0,05. La infección de los plantones por V. dah-liae se confirmó mediante aislamiento delpatógeno de las hojas caídas de plantas afec-tadas en PDA. Dichas hojas se mantuvieronsobre el suelo de las microparcelas durante elcurso del experimento.

RESULTADOS

Efectos del tratamiento con el formula-do Bioten® sobre el desarrollo de Vertici-losis en condiciones controladas

Plantones ‘Picual’ micropropagados En los experimentos I y II, los plantones de

6 meses de edad tratados o no tratados con


Figura 2. Síntomas de Verticilosis causados por el patotipo defoliante de Verticillium dahliae en plantones de ‘Picual’de 6 meses de edad 8 semanas después de la inoculación por inmersión radical en una suspensión de conidias del

patógeno e incubación a 25±1º C en cámara de crecimiento (Véase el texto para más detalles).

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Figura 3. Efecto de Bioten® sobre el desarrollo de Verticilosis en plantones de ‘Picual’ micropropagados (A) oautoenraizados (B) inoculados con Verticillium dahliae defoliante e incubados a 25±1º C en cámara de crecimiento. A,B) El sistema radical de plantones de 6 meses de edad se trató con Bioten® 1% en una mezcla de suelo pasteurizado(Bioten®), o no se trató, y los plantones se inocularon con V. dahliae (Vd) por inmersión del sistema radical en una

suspensión de conidias o por transplante a suelo infestado con ella. Periodo de incubación = Tiempo transcurrido desdela inoculación hasta la aparición de los primeros síntomas; Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severidad =

Proporción de tejido aéreo afectado estimada en una escala 0-4 (0 = sin síntomas, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%, 4 = planta muerta). ABCPE = Área bajo la curva de progreso de la severidad de enfermedad estandarizada por

el tiempo de desarrollo de ésta. Letras distintas en las barras de un histograma correspondiente a un método deinoculación indican diferencias significativas entre plantones tratados y no tratados, según el contraste de la mínima

diferencia significativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤ 0,05. *= Diferencias significativas entre valorescorrespondientes a métodos de inoculación para un tratamiento indicados por las barras de un histograma según el

contraste LSD a P ≤ 0,05. (Véase el texto para más detalles).

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Bioten® 1% (p/p) pero no inoculados con V.dahliae crecieron sin síntomas. Por el contra-rio, los plantones inoculados con el patógenomostraron los síntomas característicos induci-dos por el patotipo D de V. dahliae, incluyen-do clorosis de las hojas y defoliación (Fig. 2).

En el experimento I, el desarrollo de laenfermedad varió con el método de inocula-ción y el tratamiento con Bioten® 1%, demanera que la interacción entre ambos facto-res fue estadísticamente significativa (P <0,05), siendo la reacción más acentuada enlos plantones inoculados por inmersión radi-cal (Fig. 3A). El tratamiento con Bioten® 1%no influyó sobre el periodo de incubación(i.e., tiempo transcurrido desde la inocula-ción hasta la aparición de los primeros sínto-mas), que fue 33 días en las plantas inocula-das por inmersión, y de 35 o 40 días en lasinoculadas por transplante a suelo infestado,respectivamente (Fig. 3A). Sin embargo,comparado con las plantas no tratadas, el tra-tamiento con Bioten® 1% redujo significati-vamente (P < 0,05) en 20% la incidencia deVerticilosis, en 30% el ABCPE, y de 3,0 a1,1 (en una escala 0 a 4) la severidad mediade los síntomas en los plantones inoculadospor inmersión radical (Fig. 3A).

La inoculación por transplante a sueloinfestado originó un desarrollo de enferme-dad de inferior incidencia y severidad que elcausado por la inmersión del sistema radicalen la suspensión de inóculo (Fig. 3A). Aun-que el tratamiento con Bioten® 1% produjoen los plantones transplantados a suelo infes-tado efectos similares a los indicados paralos plantones inoculados por inmersión radi-cal, particularmente en lo concerniente a lareducción de la severidad de síntomas (de1,4 a 0,6) y del ABCPE (22% inferior) res-pecto de las plantas no tratadas, dicha reduc-ción no fue estadísticamente significativa (P≥ 0,05) (Fig. 3A).

La repetición del experimento I utilizandoplantones micropropagados de 4 meses origi-nó en el experimento III una reacción deenfermedad más severa comparada con laobtenida en plantones de 6 meses en el expe-rimento anterior, independientemente del

método de inoculación utilizado. Sin embar-go, a diferencia del experimento I, el incre-mento de la densidad de inóculo del patógeno(2,5x) en la mezcla de suelo infestada delexperimento III dio lugar a una incidencia de100% de síntomas severos (Fig. 4A). Endicho experimento, a diferencia del anterior,el tratamiento del sistema radical con una sus-pensión acuosa de Bioten® 5% previo a lainoculación con V. dahliae no redujo la inci-dencia y severidad de síntomas de Verticilosiscomparado con el control no tratado con elformulado. Sólo el tratamiento simultáneo ala inoculación redujo de forma ligera aunquesignificativa (P < 0,05) la severidad de sínto-mas y el ABCPE (datos no mostrados). En losplantones tratados o no tratados con Bioten®

5% (p/v) pero no inoculados con V. dahliae nose produjo desarrollo de síntoma alguno.

Al finalizar el experimento III, 10 semanasdespués de la aplicación del formulado, lapoblación de Trichoderma spp. en la rizosferade las plantas tratadas fue de 1,5x105 ufc/g deraíz de los plantones no inoculados con V.dahliae y 1,9x105 ufc/g de raíz de los planto-nes inoculados con el patógeno. Dichaspoblaciones fueron aproximadamente unorden de magnitud inferior a las establecidasinicialmente tras 2 semanas de incubacióndespués del tratamiento con Bioten® 5% pre-viamente a la inoculación con V. dahliae.

Plantones ‘Picual’ autoenraizados de esta-quillas semileñosas

Efectos de Bioten® en plantones incuba-dos en cámara de crecimiento

El tratamiento con Bioten® 1% no originósíntoma alguno en los plantones autoenraiza-dos; y la inoculación con V. dahliae dio lugaral desarrollo de Verticilosis característico dela infección por el patotipo D de V. dahliae,incluyendo defoliación comparable a la quetuvo lugar en los plantones micropropagadosincubados en las mismas condiciones delexperimento I (Fig. 2).

Al igual que los plantones micropropaga-dos de 6 meses de edad, los efectos del trata-miento con Bioten® 1%, variaron significati-vamente (P < 0,05) con el método de inocula-


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Figura 4. Efecto de Bioten® sobre el desarrollo de Verticilosis en plantones de ‘Picual’ micropropagados (A) oautoenraizados (B) inoculados con Verticillium dahliae defoliante e incubados a 25±1º C en cámara de crecimiento. A,

B) El cepellón radical de plantones de 6 meses de edad se trató con una suspensión de Bioten® al 5% en aguadesionizada estéril (Bioten®), o sólo con ésta, y los plantones se inocularon con V. dahliae (Vd) por inmersión delsistema radical en una suspensión de conidias o por transplante a suelo infestado con ella. Periodo de incubación =Tiempo transcurrido desde la inoculación hasta la aparición de los primeros síntomas; Incidencia = Proporción deplantas afectadas; Severidad = Proporción de tejido aéreo afectado estimada en una escala 0-4 (0 = sin síntomas,

1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%, 4 = planta muerta). ABCPE = Área bajo la curva de progreso de la severidad de enfermedad estandarizada por el tiempo de desarrollo de ésta. Letras distintas en las barras de un histograma

correspondiente a un método de inoculación indican diferencias significativas entre plantones tratados y no tratados,según el contraste de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤ 0,05. *= Diferencias

significativas entre valores correspondientes a métodos de inoculación para un tratamiento indicados por las barras deun histograma según el contraste LSD a P ≤ 0,05. (Véase el texto para más detalles).

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ción, siendo la inoculación por inmersiónradical la que determinó el desarrollo mástemprano, extenso y severo de Verticilosis(Fig. 3B). Comparada con la inmersión radi-cal, la inoculación por transplante originóvalores de incidencia, severidad, y ABCPEsignificativamente (P < 0,05) inferiores, y unperiodo de incubación significativamente (P <0,05) superior, independientemente del trata-miento (Fig. 3B). El tratamiento con Bioten®

1% no influyó sobre el periodo de incubaciónen los plantones inoculados por inmersión (31y 42 días en las plantones testigo y tratados,respectivamente), pero redujo significativa-mente (P < 0,05) la incidencia de Verticilosisen 18%, el ABCPE en 43%, y de 3,9 a 1,4 (enla escala 0 a 4) la severidad media de los sín-tomas en los plantones tratados respecto delos no tratados (Fig. 3B).

En los plantones inoculados mediantetransplante a suelo infestado, el tratamientocon Bioten® 1% determinó un patrón dereducción de Verticilosis similar al descritopara los plantones inoculados por inmersiónde las raíces en el inóculo, pero en ningúncaso resultó estadísticamente significativa (P< 0,05). No obstante, dicho tratamientoincrementó de 49 a 54 días el periodo deincubación y redujo la incidencia de enfer-medad de 73 a 50%, el ABCPE de 32 a 18%y la severidad media de síntomas de 1,7 a 0,7(en la escala 0 a 4) (Fig. 3B)

El tratamiento con Bioten® 1% no influyósignificativamente sobre el crecimientoaéreo de los plantones que sirvieron comocontrol en la inoculación por inmersión radi-cal o transplante (Fig. 5D). Así, tras 3 mesesde incubación a 25±1º C, el crecimiento rela-tivo de tallos y brotes en los plantones con-trol de inmersión radical no tratados conBioten® fue 10% superior (P ≥ 0,05) al delos tratados. Por el contrario, la infección porel patógeno redujo acentuadamente el creci-miento de los plantones inoculados porinmersión radical, pero dicha reducción nofue contrarrestada significativamente (P ≥0,05) por el tratamiento con Bioten® 1%(Fig. 5D). Comparado con la inoculación porinmersión de raíces, el transplante a suelo

infestado con V. dahliae influyó menos sobreel desarrollo de los plantones, de manera queel crecimiento de los así inoculados fue sig-nificativamente (P < 0,05) superior al de losinoculados mediante inmersión radical. Ade-más; el crecimiento de los plantones inocu-lados mediante transplante fue comparableal de los controles no inoculados, pero el tra-tamiento con Bioten® 1% no repercutió sig-nificativamente sobre el crecimiento de lasplantas enfermas (P ≥ 0,05) (Fig. 5D). Talesdiferencias podrían ser debidas a la menorcantidad de enfermedad que se desarrolló enla inoculación por transplante comparadacon la alcanzada por inmersión de raíces(Fig. 5B,C).

La repetición del experimento II, median-te tratamiento del sistema radical con la sus-pensión acuosa de Bioten® 5% previo a lainoculación con V. dahliae (experimento IV)reprodujo los efectos del formulado sobre eldesarrollo de enfermedad descritos anterior-mente pero acentuó la reducción de Vertici-losis observada en el experimento II (Fig.4B). Así, mientras que la incidencia y severi-dad de síntomas en los plantones no tratadose inoculados por cada uno de los dos proce-dimientos fueron comparables a las alcanza-das en el experimento II; el tratamiento conBioten® 5% en el experimento IV redujo sig-nificativamente (P < 0,05) en 66% la inci-dencia de Verticilosis y de 3,2 a 0,5 la seve-ridad media de los síntomas en los plantonesinoculados por inmersión radical, y en 53 %y de 2,3 a 0,6 los valores de éstos en losplantones transplantados a suelo infestadocon el patógeno (Figs. 3B, 4B). Comparati-vamente, el tratamiento con Bioten® 5%simultáneamente a la inoculación con V.dahliae (experimento V) redujo ligera perono significativamente (P ≥ 0,05) la inciden-cia y severidad de síntomas respecto de loscontroles no tratados con el formulado(datos no mostrados). En los plantones trata-dos o no tratados con Bioten® 5% (p/v) perono inoculados con V. dahliae no se produjodesarrollo de síntoma alguno.

Al finalizar el experimento IV, 10 sema-nas después del tratamiento con Bioten® 5%,


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Figura 5. Duración del efecto de Bioten® 1% sobre el desarrollo de Verticilosis en plantones de ‘Picual’ autoenraizados einoculados con Verticillium dahliae defoliante (Vd). Los plantones se incubaron primero a 25±1º C en cámara de

crecimiento durante 3 meses (experimento II; A, B), y 25 semanas adicionales en condiciones naturales bajo umbráculo(A, C). Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severidad = Proporción de tejido aéreo afectado estimada en unaescala 0-4 (0 = sin síntomas, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%, 4 = planta muerta). D) Variación porcentual en la

longitud total del tallo y brotes de cada planta desde el momento de la inoculación con V. dahliae (Vd) de plantones de 6meses de edad tratados con Bioten® 1% en una mezcla de suelo pasteurizado (Bioten®), o no tratados. Las plantas se

inocularon por inmersión del sistema radical en una suspensión de conidias o por transplante a suelo infestado con ella yse incubaron a 25±1º C en cámara de crecimiento. Control = Plantones no tratados ni inoculados. Letras distintas en lasbarras de un histograma correspondiente a un método de inoculación indican diferencias significativas entre plantones

tratados y no tratados, según el contraste de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤ 0,05. *=Diferencias significativas entre valores correspondientes a métodos de inoculación para un tratamiento indicados por las

barras de un histograma según el contraste LSD a P ≤ 0,05. (Véase el texto para más detalles).

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la población fúngica del formulado en larizosfera de los plantones tratados no inocu-lados alcanzó un valor medio de 2,5x105

ufc/g de raíz, que es aproximadamente unorden de magnitud inferior a la establecidasinicialmente tras 2 semanas de incubacióndespués del tratamiento con Bioten®. En estecaso no se estimó la densidad de poblaciónrizosférica en los plantones tratados e inocu-lados con V. dahliae.

Efectos de Bioten® en plantones incuba-dos bajo umbráculo

La incubación durante 25 semanas adicio-nales bajo umbráculo en el experimento II,de los plantones autoenraizados inoculadoscon V. dahliae por inmersión del sistemaradical, no modificó la reducción de inciden-cia y severidad de Verticilosis determinadapor el tratamiento con Bioten® 1% durantelas 8 semanas de incubación a 25±1º C encámara de crecimiento que tuvo lugar pre-viamente (Fig. 5A). De hecho, en los planto-nes tratados se produjo una moderada reduc-ción de la enfermedad (‘recuperación’), cuyaincidencia disminuyó de 82 a 55% con unaseveridad media de síntomas de 1,5 compa-rada con 3,9 en los plantones no tratados conBioten® 1% (Figs. 5B,C).

Similarmente, la incubación durante 25semanas bajo umbráculo de los plantonesinicialmente trasplantados a suelo infestadocon V. dahliae, no modificó la ausencia designificación (P ≥ 0,05) de la diferencia en laincidencia de enfermedad entre plantonestratados y no tratados con Bioten® 1% quehabía sido observada tras 8 semanas de incu-bación a 25±1º C (Fig. 5A). Sin embargo,tanto en los plantones control como en lostratados con Bioten® 1% se produjo un lige-ro incremento de severidad media de los sín-tomas de 0,4 y 0,5, respectivamente, respec-to de los valores observados a las 8 semanasde incubación a 25±1º C, y la diferencia deseveridad de 0,8 entre dichos tratamientos alas 25 semanas no fue estadísticamente sig-nificativa (P ≥ 0,05) (Figs. 5B,C). Este lige-ro incremento de severidad de síntomas pudoestar relacionado con circunstancias deestrés que también determinaron un ligero

desarrollo de síntomas foliares en los planto-nes testigos, no tratados con Bioten® 1% niinoculados con V. dahliae.

Al final del experimento, el patógeno seaisló en cultivo puro del tallo del 100 % y30%, respectivamente, de los plantones con-trol afectados y de los tratados con Bioten®

1% e inoculados con V. dahliae por inmer-sión del sistema radical. Por el contrario, V.dahliae se aisló del 22% de los plantones notratados e inoculados por transplante a sueloinfestado, pero de ninguno de los plantonessimilarmente inoculados y tratados con Bio-ten® 1%. Asimismo, finalizado el experi-mento, 35 semanas después de la inocula-ción, la estimación de la población rizosféri-ca de Trichoderma spp. en los plantonesindicó una densidad media de 4,3x104 ufc/gde raíz en los plantones tratados no inocula-dos, y de 8,9x104 ufc/g de raíz en los planto-nes tratados e inoculados con V. dahliae.Dichas poblaciones fueron aproximadamen-te un orden de magnitud inferior a las esta-blecidas inicialmente tras 2 semanas de incu-bación después del tratamiento con Bioten®

1% previo a la inoculación con V. dahliae.


sobre el desarrollo de Verticilosis enmicroparcelas infestadas con V. dahliae

Los plantones tratados o no tratados conBioten®, pero no inoculados con V. dahliae,crecieron durante el experimento sin síntomaalguno que pudiera indicar efecto alguno delformulado sobre la planta. Además, ocasio-nalmente se realizaron aislamientos de hojasy ramitas de plantones tratados en PDA, queresultaron consistentemente negativos res-pecto de la presencia del patógeno o de loscomponentes fúngicos del formulado en lostejidos asintomáticos de aquéllos.

Los primeros síntomas de Verticilosis enlos plantones inoculados con V. dahliae D sedesarrollaron a principios del mes de Junio,aproximadamente 3 meses después del trans-plante en las microparcelas, tanto en planto-nes control (severidad media 1,1 en la escala0-4) como en aquéllos que habían sido trata-dos con Bioten® (severidad media 0,6).


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Figura 6. Efecto del tratamiento con Bioten® sobre el desarrollo de la Verticilosis del olivo en condiciones de campo.Plantones de ‘Picual’ de 6 meses de edad cuyo cepellón radical se trató con una suspensión de Bioten® al 5% en agua

desionizada estéril (Bioten®), o sólo con ésta, se incubaron 3 meses a 25±1º C, se transplantaron a microparcelassolarizadas infestadas o no con Verticillium dahliae defoliante, y se trataron o no con Bioten® al 5% en el momento deltransplante, y de nuevo con Bioten® al 1% aproximadamente 1 año después. A) Plantas inoculadas con V. dahliae (Vd)

14 meses después de la inoculación; Izquierda: Plantas no tratadas con Bioten® (control) severamente afectadas porVerticilosis (nótese el rebrote en la base de la planta); Derecha: Plantas tratadas con Bioten® (Vd+ Bioten®) (nótenselas plantas control al fondo de la imagen). B) Curvas de progreso de severidad de síntomas de Verticilosis (estimada

por la proporción de tejido aéreo afectado en una escala 0-4; 0 = sin síntomas, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%,4 = planta muerta) en plantas control (Vd) y tratadas con Bioten® (Vd+ Bioten®). La flecha señala el segundotratamiento con Bioten®. Cada valor es media de 12 plantas. C) Incidencia (proporción de plantas afectadas) y

severidad de Verticilosis en plantas control y tratadas con Bioten® a los 4, 10, 16, y 22 meses tras el transplante einoculación con V. dahliae en el mes de Marzo de 2007. D) Periodo de incubación = tiempo transcurrido desde lainoculación hasta la aparición de los primeros síntomas; Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severidad =Proporción de tejido aéreo afectado estimada en una escala 0-4 (0 = sin síntomas, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-

100%, 4 = planta muerta). ABCPE = Área bajo la curva de progreso de la severidad de enfermedad estandarizada porel tiempo de desarrollo de ésta. Letras distintas en las barras de un histograma correspondiente a un método de

inoculación indican diferencias significativas entre plantones tratados y no tratados, según el contraste de la mínimadiferencia significativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤ 0,05. (Véase el texto para más detalles).

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Dichos síntomas fueron los característicosdel síndrome defoliante, incluyendo la caídaprofusa de hojas cloróticas o asintomáticas(Fig. 5A,B). La enfermedad en los plantonesno tratados alcanzó una incidencia de 75%un mes más tarde; de 92% en Enero de 2008,a los 10 meses de la inoculación, y 100% alos 16 meses de ésta (Fig. 6C). Comparativa-mente, a los 4 y 10 meses de la inoculaciónla incidencia de Verticilosis en los plantonestratados con Bioten® fue inferior en 17% y33% a la de los controles no tratados con elformulado, respectivamente. Sin embargodicha incidencia aumentó hasta 83% 6 mesesmás tarde, y a 92% 6 meses después, enEnero de 2009, a los 22 meses de la inocula-ción (Fig. 6C). Aún así, la incidencia deenfermedad en los plantones tratados con elformulado se mantuvo siempre ligeramenteinferior a la de los controles no tratados.

El efecto más notorio del tratamiento conBioten® sobre el desarrollo de Verticilosis enlos plantones fue la reducción de la severidadde síntomas comparada con los controles notratados, que fue claramente discernible desdelos 4 meses de la inoculación y ocurrió deforma continuada y acentuada en el tiempodesde entonces. Así, la severidad media en losplantones no tratados con Bioten® aumentóde 1,1 a los 4 meses de la inoculación a 2,2 y2,4 a los 16 y 22 meses de la inoculación, res-pectivamente; mientras que en los plantonestratados aumentó de 0,7 a 0,8 y 1,0 en dichosperiodos, pero fue significativamente inferior(P < 0,05) en 1,4 unidades a la severidad desíntomas en los plantones no tratados a los 16y 22 meses de aquélla (Fig. 6B,C). Estareducción de la severidad de síntomas, juntocon la menor incidencia de ellos antes referi-da, determinó una disminución significativa(P < 0,05) de la cantidad total de enfermedaden los plantones tratados reflejada por elABCPE (Fig. 6D).

DISCUSIÓN

La justificada alarma generada en el sec-tor oleícola por la extensión y severidad delos ataques de Verticilosis en el olivar anda-

luz ha generado demanda de tecnologíaspara el control de la enfermedad, que ha aus-piciado una profusión de recomendaciones ytratamientos con una variedad de productosregistrados o no. Lamentablemente, en lamayoría de los casos dichas recomendacio-nes no se basan convincentemente sobreconocimientos científico-técnicos acredita-dos y accesibles para su contraste experi-mental, y su ineficacia abre la posibilidad dedesencanto en el usuario y descrédito haciael sector fitosanitario. A estas circunstanciasse une la conveniencia de que el control deenfermedades se basen en el uso de produc-tos biológicos, dada la escasa disponibilidadde substancias activas autorizadas en olivar yotros cultivos, consecuencia de la revisión detodas las utilizadas con fines fitosanitarios enla UE (Directiva 91/414EEC) finalizada enMarzo de 2009 y de las normativas para laEstrategia de Uso Sostenible de ProductosFitosanitarios (Directiva 2009/128/CE;Reglamento (CE) 1107/2009).

Los resultados de este trabajo indican quelas estirpes ICC012 de T. asperellum eICC080 de T. gamsii que componen el for-mulado Bioten® tienen el potencial de redu-cir el desarrollo de Verticilosis en plantonesde olivo, en extensión adecuada para utilizarel producto en una estrategia de manejo inte-grado de la enfermedad basado en el fenó-meno de la capacidad de recuperación sinto-mática de la planta enferma. Dicho potencialde biocontrol ha sido puesto de manifiesto deforma reproducible, en experimentos repeti-dos en ambiente controlado, con un escena-rio experimental elegido ad hoc para favore-cer el desarrollo óptimo de Verticilosis queincluyó el cv. Picual muy susceptible al pato-tipo D de V. dahliae, densidad de inóculo deéste que en investigaciones anteriores asegu-raron el desarrollo de infección severa (MER-CADO-BLANCO et al., 2002; 2004) y tempera-tura de incubación favorable para el patóge-no y la enfermedad.

El nivel de biocontrol de la enfermedadalcanzado en el escenario anteriormentereferido varió con el procedimiento de ino-culación y el tipo de material vegetal; de


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manera que la reducción de Verticilosis fuesuperior y más consistente cuando se inocu-laron plantones autoenraizados por inmer-sión del sistema radical en una suspensión deconidias del hongo, que dio lugar a una ele-vada incidencia y severidad de enfermedaden los controles inoculados con V. dahliae Dpero no tratados con el formulado de estudio.En este caso, el efecto más consistente delbiocontrol fue la reducción de la severidadde síntomas de Verticilosis, que fue siempreinferior en más de 30% a la del control notratado con el formulado, aunque la inciden-cia de enfermedad también resultó reducidaen proporción variable de 18 a 60% depen-diendo de la combinación experimental.Comparativamente, la inoculación por trans-plante a suelo infestado determinó mayorvariabilidad experimental y menor desarrollode enfermedad en los plantones no tratadoscon Bioten®, que ha dificultado la distinciónestadísticamente significativa de los efectosdel formulado. No obstante, el tratamientocon Bioten® también redujo en cierta exten-sión la incidencia y severidad de síntomas encomparación con los controles no tratados.Por otra parte, la utilización en el experi-mento III de una elevada densidad de inócu-lo en el suelo (5x106 conidias/g) y plantonesmicropropagados jóvenes de crecimientosuculento, determinaron un potencial deenfermedad de una magnitud tal que impidiódiferenciar los efectos de los agentes de bio-control en el formulado.

Numerosas investigaciones sobre el usode diversos microorganismos para el controlbiológico de enfermedades de plantas indi-can que éste puede resultar de uno o variosmecanismos, incluyendo: (i) la competiciónpor nutrientes, nichos ecológicos o zonas deinfección; (ii) la inhibición directa del pató-geno mediante antibiosis o lisis; (iii) el para-sitismo; y (iv) la inducción de la expresiónde mecanismos de defensa innatos en laplanta (COOK Y BAKER, 1983). Los mecanis-mos que subyacen en la supresión de Vertici-losis en olivo por los aislados fúngicos deBioten® no han sido objeto de esta investiga-ción, ni son conocidos. No obstante, experi-

mentos preliminares in vitro ponen en duda ala antibiosis como modo de acción funda-mental de aquéllos (JIMÉNEZ DÍAZ et al., nopublicado). Además, que la supresión deenfermedad se produjera tanto en procesosde infección que promueven el acceso delinóculo directamente al xilema (i.e., inmer-sión radical), como en los que promueven lapenetración de tejido radical intacto (i.e.,transplante a suelo infestado), sugiere que endicha supresión puede confluir más de unmecanismo.

EL efecto de supresión de Verticilosis deltratamiento con Bioten® alcanzado en condi-ciones controladas fue reproducido en condi-ciones de campo que simularon un procesode plantación comercial. Dicha supresióntambién se caracterizó por la reducción glo-bal de la severidad de síntomas en los plan-tones tratados, que determinó una disminu-ción significativa del 60% en el ABCPE. Enesta reducción subyace el incremento en eltiempo de la proporción de tejido sano res-pecto del sintomático, sugiriendo que notuvieron lugar nuevas infecciones por V. dah-liae en el tejido radical formado de novo, apesar de que en las microparcelas se produjoaporte continuado de nuevo inóculo del pató-geno a través de las hojas infectadas quecayeron de las plantas afectadas. En esteescenario, es digno de resaltar el elevadopotencial de enfermedad que determinó laelevada densidad de inóculo en el suelo delas microparcelas (650 propágulos/g sueloseco), indicado por la temprana aparición delos primeros síntomas de Verticilosis a los 4meses de la inoculación y el 100% de inci-dencia de enfermedad en los plantones notratados a los 16 meses de la inoculación.Comparativamente; los primeros síntomasen plantones ‘Picual’ transplantados porLÓPEZ-ESCUDERO y BLANCO-LÓPEZ (2007) asuelo infestado con 10 microesclerocios/gsuelo de V. dahliae se produjeron a los 8meses de la inoculación, y fueron necesarios24 meses para alcanzar una incidencia deenfermedad de 55%. Por el contrario, ennuestro experimento se había producido unaincidencia de 91% de Verticilosis en los con-


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troles no tratados con Bioten® a los 10 mesesde la inoculación.

El nivel de supresión de Verticilosis delolivo determinado por el tratamiento conBioten® en nuestros experimentos es compa-rable al alcanzado por otros autores en inves-tigaciones similares con el mismo o diferen-tes patosistemas y agentes de biocontrol (Ej.,HERVÁS et al., 1997; 1998; LANDA et al.,2001; MERCADO-BLANCO et al., 2004), eindica que la aplicación de éstos debe serconcebida y comprendida como un compo-nente más de una estrategia de manejo inte-grado de enfermedades de cultivos (LANDA

et al., 2004). En la Verticilosis del olivo,dicha estrategia debe ir dirigida a obviarescenarios de alto potencial de enfermedadinicial mediante acciones previas a la planta-ción, que incluye necesariamente la elecciónde suelos que contengan la menor cantidadposible de inóculo virulento del patógeno, elempleo de las variedades de olivo menossusceptibles al patotipo D de V. dahliae(LÓPEZ-ESCUDERO et al., 2004), la utilizaciónde plantones certificados libres del patógeno,y la protección de éstos contra infeccionessubsiguientes a su plantación (TJAMOS, 1993;TJAMOS y JIMÉNEZ-DÍAZ, 1998; JIMÉNEZ DÍAZ

et al., 2003). Posiblemente, la utilizaciónpara nuestros experimentos de plantones‘Arbequina’ (menos susceptibles que‘Picual’) habría potenciado el nivel de supre-sión de Verticilosis derivado del tratamientocon Bioten® (JIMÉNEZ DÍAZ et al., no publi-cado). Finalmente, utilización del formuladoBioten® en una estrategia de control integra-

do aconseja no sólo el tratamiento del siste-ma radical del plantón durante la producciónviverista, sino también la subsiguiente apli-cación periódica del producto durante los 2primeros años de plantación para asegurar eladecuado establecimiento del árbol y en pre-visión del acceso de nuevo inóculo del pató-geno a través de agua o restos vegetalesinfestados (JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 1998;RODRÍGUEZ JURADO y BEJARANO ALCÁZAR,2007; JIMÉNEZ DÍAZ et al. 2008b; NAVAS-CORTÉS et al., 2008). La potencial disminu-ción del inóculo fúngico de Bioten® en elsistema radical de los plantones durante sucrecimiento en el vivero, observada durantela incubación prolongada de los plantonestratados en nuestros experimentos, puede sersubsanada con aplicaciones periódicas desuspensiones del formulado al substrato deenraizamiento durante la fase de endureci-miento del plantón enraizado, hasta su distri-bución comercial (JIMÉNEZ DÍAZ et al., nopublicado).

AGRADECIMIENTOS

Los autores (RMJD, JLTC, BBLC, yJANC) son miembros del Grupo de investi-gación AGR 136 “Sanidad Vegetal” delPAIDI, Junta de Andalucía. Las investigacio-nes de los autores referidas en este artículohan sido financiadas por el proyecto ‘Vertici-losis del olivo’ subvencionado ISAGROESPAÑA, S. L., la Fundación Ramón Arecesy ayudas de investigación del PAIDI, Juntade Andalucía.


ABSTRACT

JIMÉNEZ DÍAZ, R. M., J. L. TRAPERO CASAS, J. BONED, B. B. LANDA, J. A. NAVAS

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Protection of the root system of Verticillium dahliae-free olive planting stocks fromsevere infection by residual soilborne or incoming inoculum may reduce the potential forVerticillium wilt in young trees and facilitate expression in them of the phenomenon ofsymptoms recovery. In this work we have addressed that hypothesis with the biocontrolfungal formulation Bioten®, composed by strains of Trichoderma asperellum and T. gam-sii, using micropropagated or self-rooted planting stocks of ‘Picual’ olives inoculatedwith defoliating V. dahliae by root dipping or transplanting to soil infested with the

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pathogen in repeated experiments in growth chamber and field microplots. Treating theplant root system with Bioten® 1% consistently reduced by more than 30% symptomsseverity in root-dip inoculated plants, and in a variable extent of 18 to 60% the diseaseincidence. Transplanting treated plants to V. dahliae-infested soil also reduced diseaseincidence and severity to an extent but higher variability and less disease developed innon-treated controls made difficult to demonstrate statistical significance of the effects.Suppression of Verticillium wilt by Bioten® under controlled conditions was reproducedunder field conditions and high disease potential indicated by the development of firstwilt symptoms just 4 mo after inoculation and 100% incidence of diseases by 16 mo afterthat. Suppression of the disease in the field was also characterized by lesser symptomsseverity in treated plants that determined a significant 60% reduction of total disease inthem.

Key words: Biological control, integrated control, Olea europaea, nursery produc-tion.

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(Recepción: 21 abril 2009)(Aceptación: 14 octubre 2009)


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