Uso potencial de las especies de Rhizobium. Para mejorar la condición de plantas no fijadoras de nitrógeno

Introducción

Un número de estudios han demostrado que la inoculación de semillas con bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) puede resultar en el incremento de la germinación y aparición de plántulas y mejorar el crecimiento de varios cereales y cultivos no cereales (de freitasy germida, 1992; chen et al., 1994; javed y arshad, 1997, biswas et al., 2000ª, 2000b; dobbelaere et at., 2001; matiru y dakora, 2004; Wang et al., 2007). El efecto potencial y la contribución exitosa de PGPR cepas de crecimiento de las plantas están fuertemente influenciadas por el medio ambiente, incluyedo las características del suelo, especies de plantas incluso especies vegetales dentro de una especie, microflora y otros indígenas de la rizosfera( nowak, 1998). Condiciones subóptimas o desfavorables pueden llevar a la síntesis de poco o nada de sustancias biológicamente activas en la zona de la raíz. Dando lugar al fallo de la PGPR para promover el crecimiento de platas (chanway y holl, 1992). Lo que dificulta el uso práctico del PGPR, ya que los efectos son impredecibles debido a las diversas condiciones del medio ambiente.

Al mismo tiempo, un número creciente de informes muestran que los rizobios pueden actuar como PGPR en las plantas no leguminosas. Höflich (1994) obtuvo significantes aumentos en el rendimiento de brotes de forraje (7-8%) inoculando maíz (Zea mays), trigo de primavera (Triticumaestivum), y cebada de primavera (Hordeumvulgare L.) con cepa R39 de R. leguminosarumbv. Trifolii en campos experimentales. Yanni (1997) también observó que cierta cepa eficaz de tipo salvaje de R. leguminosarumbv. Trifolii era capaz de establecer asociaciones naturales de plantas y bacterias que tenían el potencial de estimular el crecimiento de plantas de arroz (Oryza sativa) bajo condiciones del campo y el laboratorio, mientras Chabot (1996) reportó que la inoculación de los campos de cosecha de maíz y lechuga (lactuca sativa) incrementaba el rendimiento de los cultivos. Galleguillos (2000) reportó que la inoculación de lechuga con la modificación genética Sinorhizobiummeliloti mejoraba la producción de forraje cinco veces.Una serie de experimentos de laboratorio con inoculación de rhizobium en trigo, llevado a cabo por Zahir (2004) también demostró un incremento en la elongación de la raíz (mas del 20%), peso seco de la raíz (mas del 13 %), elongación de las ramas (por encima del 38%), y peso seco de las ramas (por encima del 36%). Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales las cepas de Rhizobial estimulan el crecimiento de las plantas necesitan ser conocidos con el fin de

optimizar cada mecanismo. Ademas, un numero de reportes ha demostrado la habilidad de rhizobia para actuar como un endófito de plantas no fijadoras de nitrógeno (Spencer, 1994). El objetivo del presente estudio es identificar cepas de rhizobial con la capacidad de usarse como promotoras potenciales de crecimiento de plantas no fijadoras de nitrógeno.

Materiales Y Métodos

Materiales vegetales

Las semillas de varias plantas no fijadoras de nitrógeno fueron obtenidas de la compañía de semillas Impecta AB, Julita, Suiza. Los datos y características de las especies seleccionadas son presentados en la Tabla I. Todas las especies vegetales fueron seleccionadas aleatoriamente como plantas no fijadoras de nitrógeno. Las plantas son de diferentes familias botánicas y tienen diferentes tamaños, estructura, color, sabor, forma, olor, tasa de crecimiento, tasa de germinación, ciclo de vida, ecología y presencia en la naturaleza.

Cepas Rhizobiales

Ocho diferentes cepas rhizobiales fueron obtenidas de ElosmestariLtd, Finlandia (Originalmente de Rusia); en adicion una cepa (E-11) se obtuvo de Italia. Las diferentes cepas son presentadas en la Tabla II. La mayoria de esas cepas ya han sido probadas o examinadas con respeco a su potencial, para ambas plantas, leguminosas y no fijadoras de nitrógeno.

Condiciones de crecimiento de las plantas

El medio de crecimiento fue obtenido de la compañía Askania AB, Suiza. El medio es suelo arenoso completamente esterilizado y el nombre comercial del producto es “Silversand and 55”. La distribución de las partículas es: 40% de las partículas son de 0.35mm, 30% de 0.50 mm, 16% de 0.25 mm, 10% de 0.707 mm. La composición química es: 99.2% SiO2, 0.09% Al2O3, 0.058% Fe2O3 y 0.1% perdida al fuego.

Preparación de Inoculantes rhizobiales

Con una semana de edad, crecimiento satisfactorio y buen desarrollado, las colonias rhizobiales se mantienen en “YM agar” (1.5% agar) hecho de acuerdo a Somasegaran y Hoben (1994) donde se usaron para la preparación de inoculantes. Para este propósito, los bucles de las colonias respectivas se

dispersaron en esteriles 0.02 M K2HPO4, pH 7 y la concentración de rizobios en suspensión fue ajustada a 105 c.f.u. mL-1 al uso de un espectofotometro .nueve inoculaciones de una sola sepa se prepararon, una cepa mixta de inoculo y un tratamiento que consiste en una mezcla de la célula autoclave con la misma densidad celular inicial en los otros. Por lo tanto hubo 12 tratamientos en total (8 cada sepa, una mezcla de todas las cepas, un tratamiento de esterilización, y un control (YM solo agar)).

La inoculación de plantas.

El diseño del experimento con plantas de mezcla que participan los seis tipos de semillas de plantas en una maceta (2 semillas por especie de planta) incluyendo 6 repeticiones para cada tratamiento. Por lo tanto hubo 2 (semillas década tipo de planta) x 6(repeticiones) x 12 (tratamientos), equivalente a 144 semillas por cada planta del cultivo.

Para la esterilización de las semillas de la superficie, las semillas de cada especie de cultivo individuales fueron colocadas en un erlenmeyer y tratadas con hipoclorito de sodio al 1% por 2 minutos, seguido de un enjuague de seis veces con agua esteril. Después de que, las semillas sellena de las suspensiones de rizobios diferentes. Las semillas tratadas solo con 0.02 M K2HPO4 de la solución se utilizaron como control. Todos los matraces se arremolinaba suavemente para que las semillas y bacterias en contacto durante 30 minutos para obtener un inóculo uniforme de 105c.f.u. Semillas -1.

Experimento de efecto invernadero

El experimento de efecto invernadero fue llevado a cabo a mediados de agosto de 2006. Las semillas tratadas y controladas (2 por especie de cultivo) se sembraron inmediatamente en macetas de plástico previamente preparadas (8 cm de diámetro y 11 cm de longitud) usando cucharas plásticas esterilizadas y ubicándolas en un invernadero donde la temperatura del aire y del suelo era de 27 y 30°C, respectivamente. Las semillas fueron cubiertas con tierra a 1 cm de profundidad inmediatamente después de la siembra.

La germinación de la semilla inicio a los tres días y continúo por los siguientes dos días. En la segunda semana después de la germinación, las prácticas normales de cultivación fueron aplicadas. Dichas prácticas incluían riego dos veces por semana en una dosis inicial de 100 mL por maceta, la cual fue incrementada a 200 mL de acuerdo al crecimiento y desarrollo de las plantas. Una planta por maceta de Zea maysy Helianthusannuus fueron podadas para producir una bien balanceada distribución del follaje. La solución liquida de

nutrientes para plantas (Compañía Bayer), que contiene 7.0% N, 2.2% P, 5.0% K, 0.04% S, 0.01% B, 0.02% Fe, 0.01% Cu, 0.01% Mn, 0.005% Mo, 0.005% Zn, y 0.006% Mg, fue introducida en una dosis inicial de 1 mL en 2 L de agua destilada después de dos semanas.La concentración de nutrientes fue duplicada cada semana durante cuatro semanas hasta una constante de 4 mL de solución de nutrientes en 2 L de agua destilada, aplicándolo durante el riego. Todas las macetas fueron movidas e un invernadero con una temperatura promedio en el dia de 25°C, en la oche de 22°C, iluminación de 30 klx, y un promedio de humedad relativa de 85% después de tres semanas. Todas las raíces de las plantas fueron re-inoculadas dos veces con el mismo tratamiento en la misma concentración usando un cuentagotas de vidrio esterilizado para aplicar el liquido a la superficie del suelo. La primera re-inoculación fue dos semanas después de la siembra y la segunda fue cinco semanas después de la siembra. La posición de las macetas fue reordenada cada semana para lograr una distribución uniforme de la luz en todos los tratamientos. Todas las plantas fueron cosechadas con sus raíces intactas después de 58 dias y el suelo fue removido cuidadosamente de las plantas usando un corriente de agua. Todas las plantas limpias fueron etiquetadas y ubicadas en un secador a 60°C por 48 horas para la determinación del peso seco de la biomasa. Las raíces de las plantas y los brotes fueron separados y pesados separadamente por una balanza digital y la información fue registrada.

Efectos de la densidad de inoculo en la germinacion y desarrollo de Linumusitatissimum

En un experimento adicional, el impacto de la densidad de inoculo bacterial en la germinación y desarrollo fue investigado usando linaza (Linumusitatissimum) como la planta de prueba. Un total de 60 semillas viables de linaza esterilizadas con 1% de hipoclorito de sodio fueron preparadas. Esas semillas fueron dividadas en cinco grupos iguales, tres de los cuales fueron inoculados con el aumento de concentraciones de cepas de Sinorhizobiummeliloti (c.f.u.

103 ,104 ,105 ,respectivamente). El tratamiento de esterilización en autoclave

involucro una solución de cepas Sinorhizobiummeliloti a 121 °C por 20 minutos y 0.02 M K2HPO4 utilizada como control. El procedimiento para la inoculación de las semillas fue el mismo que el anterior y la inoculación de las semillas fue inmediatamente sembrada en macetas plásticas (4 semillas por maceta, 3 repeticiones por tratamiento, y 5 tratamientos) previamente preparadas en el invernadero y cubierto con 1 cm de suelo. El promedio de temperatura del aire fue de 20.3°C, del suelo (5 cm de profundidad) fue de 20.6°C, iluminación de 30 klx, y humedad relativa de 85%. La germinación de las semillas comenzó a los tres días. Después de dos semanas, las plántulas fueron tratadas otra vez con la concentración previa de solución de cepas Sinorhizobiummeliloti usando goteros de vidrio esterilizado. Practicas de cultivo tales como riego, aplicación

de nutrientes vegetales, y reorganización de las posiciones de las macetas llevado a cabo como antes, pero no hubo poda. Todas las plantas fueron cosechadas a los 56 dias con cuidado removiendo la tierra de la zona de las raíces mediante corrientes de agua, secadas a 60°C por 48 horas y el peso seco de las raíces y fitomasa fueron determinados separadamente usando una balanza digital.

Interaccion entre rhizobia y hongos patógenos

Ocho diferentes cepas rhizobiales y dos tipos de hongos (Fusarium oxysporum y Rhizoctoniasolani)fueron usados para este propósito. El experimento fue realizado en un medio de nutrientes YMA. Una pequeña cantidad de colonia de rhizobial exponencial puro de cada uno de las ocho cepas fue recogida con un “lazo” plástico del tubo de cultivo bacteriano puro y rallado en una única línea de 8 cm de longitud en la superficie superior de separadas placas de YMA. Esas placas fueron mantenidas por siete días a 25°C para su crecimiento y desarrollo.

Después de 7 dias, tapones de agar del cultivo de 14 dias de Fusarium oxysporumy Rhizoctoniasolani mantenidos en agar depapa-dextrosa, fueron colocados a una distancia de 2 cm de cada línea rhizobial. Las placas fueron incubadas a 25°C. El crecimiento horizontal de hongos hacia la línea bacterial fue documentado diariamente.

DISCUSIÓN

en este estudio, la intención fue seleccionar el potencial de rhizobia más efectivo para

la fijación de las plantas. algunos de los resultados no fueron significativos. por

ejemplo, cepa PAR-207 pertenecientes al género Sinorhizobiummeliloti demostró una

amplia gama de capacidades para mejorar todos los tipos de plantas no fijadoras de

nitrógeno (cuadro 3), pero no mostró diferencias estadísticamente significativas para

materia seca PAR cepa-201, también pertenecientes a Sinorhizobiummeliloti, se

finalmente que el crecimiento de las plantas mejoró significativamente en todos los

casos, pero no mejoro el crecimiento de las raíces de papaverrhoeas (tabla 3), aunque

los valores medios obtenidos parecen ser sustancialmente diferentes. la mayoría de

las cepas de Sinorhizobiummelilotirizhobial se reportan para producir ácido indol-3-

acético, que es una planta de conocer la hormona estimulante. también son conocidos

por producir sideróforos, que también promueven el crecimiento de plantas.

Galleguillos et al (2000) también ha informado de los efectos beneficiosos de

Sinorhizobiummeliloti en la lechuga. se ha demostrado que las cepas de Rhizobium

tienen un buen efecto en el arroz durante la producción de ácido indol-3-acético. Hilali

et al (2000) demostraron que trifoliiRhizobium leguminosa tienen un mayor rendimiento

de grano de trigo en un 18%. Sin embargo, en el stady presentar una respuesta de

crecimiento positivo se obtuvo en sólo dos casos.

másrizhobia se sienten atraídos hacia los aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y

por una respuesta quimiotáctica. Sin embargo, las cepas de Rhizobium loti no se

sienten atraídos por estos compuestos. Desde esta perspectiva, el estudio cepa PAR-

804, que pertenece a este grupo, no es adecuado para no plantas fijadoras de

nitrógeno, ya que no se activaatraídos por su rizosfera, que es un requisito previo que

se ha funcionado como RPCP. además, esta cepa no dio lugar a en las

respuestas positivas de plantas, excepto para el caso de aumentar la biomasa de

raíces de papaver rhoeas. se puede concluir que la cepa PAR-804 no es adecuado

para la inoculación de las plantas no fijadoras de nitrógeno.

por ejemplo, se ha demostrado que lumichrome y LCOS

publicado por rizobios estimular la germinación de las semillas y el crecimiento de las

plantas de cultivo diferentes. 

muy probablemente, la planta de estimulantes efectos dependen de la densidad

de inoculante de rizobios, que a su vez regula las concentraciones de sustancias de la

planta estimulante. en el presente sub-estudiosobre el efecto de la densidad

de inóculo en el crecimiento de las plantas, se encontró que una concentración de

10 UFC de la cepa PAR-207 dio la tasa más alta de semillas de germinación y el

crecimiento de la planta de prueba, Linum usitatissimum.

en el estudio de las interacciones entre los rizobios y hongos patógenos de plantas, los

experimentos  realizados mostraron que ninguno de los nueve cepas de rizobiosla

prueba fue capaz de prevenir el crecimiento de hongos directa hacia la línea de

bacterias y el contacto con éxito entre los dos. 

Sin embargo, después de un par de días de siete de las nueve cepas disolvió y se

fusionó el micelio del hongo hacia el micelio denso de edad. la gravedad de

esteefecto varía de cepa a cepa y con la disponibilidad de nutrientes en

el medio. Elmecanismo posible razón es que, después

delcontacto con el hongo, rizobios comenzó a  utilizar el

contenido nutricional delos micelios de hongos, que hidrolizo la

reacción enzimática para su crecimiento y desarrollo, y por lo tanto la línea hacia el

micelio del hongo.

aumentó significativamente la biomasa vegetal indica que los rizobios tienen

unahabilidad innata para promover el crecimiento de la no-plantas fijadoras de

nitrógeno.Sin embargo, la realización de esta capacidad depende de la

asociación adecuadaentre las cepas de rizobios y la no fijación de nitrógeno, las

especies de plantas. La concentración del inóculo de Rhizobium es otro

factor importante para la germinación y crecimiento de las plantas. Los

resultados confirman anteriores estudios lo que indica que ciertas

cepas de rizobios pueden promover el crecimiento de plantas no fijadoras de

nitrógeno, posiblemente a través de mecanismos que implican cambios en la fisiología

del crecimiento y la morfología de la raíz. más cepas de rizobios deben

serexaminados a través de experimentos de

laboratorio yde campo para explotar supotencial como RPCP para la producción

vegetal sostenible.