universidad privada autonoma del sur facultad de …

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“EFECTO ANTIMICROBIANO DEL EXTRACTO DE HOJAS DE

Aloysia citriodora Palau (CEDRÓN) SOBRE Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida

albicans ATCC 10231, AREQUIPA, 2018”

PRESENTADA POR:

Bach. Molleapaza Picha, Andreina Beatriz

Bach. Quispe Surco, Miriam Amparo

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

ASESORA:

Mg. Celia Choquenaira Quispe

AREQUIPA – PERÚ

2019

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“EFECTO ANTIMICROBIANO DEL EXTRACTO DE HOJAS DE

Aloysia citriodora Palau (CEDRÓN) SOBRE Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida

albicans ATCC 10231, AREQUIPA, 2019”

PRESENTADA POR:

Bach. Molleapaza Picha, Andreina Beatriz

Bach. Quispe Surco, Miriam Amparo

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO

FARMACÉUTICO

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO ……………………………………

PRIMER MIEMBRO DEL JURADO ……………………………………

SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO .………………………………..

i

DEDICATORIA

La presente tesis está dedicada a Dios, ya que gracias a él he

logrado concluir mi carrera.

A mis padres, porque ellos siempre estuvieron a mi lado

brindándome su apoyo y sus consejos para hacer de mí una mejor

persona.

A mi hermana y familia entera, por sus palabras y compañía, a

mi abuela Julia aunque no esté físicamente con nosotros, pero sé

que desde el cielo siempre me cuida y me guía para que todo me

salga bien.

Andreina Beatriz Molleapaza Picha

ii

DEDICATORIA

A mis padres Dominga y Mario, por su constancia y su amor en

todo momento. Por cada palabra de amor y aliento que han

dejado guiar mis pasos a lo largo de la vida. Por los sacrificios que

juntos hemos pasado y por ser los mejores padres del mundo.

A mi amigo especial que es Dios, que esta conmigo en las buenas y

malas, en las noches frías y largas se lo debo todo.

A mis hermanos, por lo que representan para mí y por ser parte

importante de una hermosa familia unida.

A mi amigo incondicional Giancarlo, que siempre estuvo

apoyándome en todo momento.

A mi compañera y amiga Andreina, que a pesar de las

dificultades que tuvimos, salimos adelante.

Y a mí misma, porque en cada caída supe levantarme a pesar de

los problemas, dificultades, de personas que no sumaron a mi vida

sigo aquí luchando por un futuro mejor.

Miriam Amparo Quispe Surco

iii

AGRADECIMIENTO

A Dios, porque me ha hecho sentir su sabiduría y su amor infinito

en cada etapa de mi vida. “Todo lo puedo en cristo que me

fortalece” (Filipenses 4:13).

Gracias Papito Pascual, usted es la mano que me sostiene el sol que

calienta mi alma y la estrella que vela mi sueño.

A nuestra asesora Mg.QF Celia Choquenaira Quispe por todo el

apoyo brindado a lo largo de esta investigación, por su tiempo y

por los conocimientos que nos transmitió.

A nuestro docente Mg.QF Elvis Gilmar Gonzales Condori por su

consejo, amistad y apoyo para la realización de este trabajo de

investigación.

Andreina Beatriz Molleapaza Pich

iv

AGRADECIMIENTO

A Dios todo poderoso por darme la oportunidad de obtener un

triunfo personal, por darme salud, sabiduría, y entendimiento

para lograr esta meta.

A mi querida madre Dominga Natalia, por ser tan dulce y buena

Dios te bendiga siempre mamita.

A mi padre José Mario, en el cielo los ángeles se regocijan con tu

presencia. Te agradezco infinitamente por haber hecho una buena

hija, siempre guiándome, y corrigiéndome.

Mi Alma Mater; me siento orgullosa de haber recibido mi

formación académica en sus aulas, siempre estaré eternamente

agradecida de haber egresado de la Universidad Privada

Autónoma del Sur.

A los asesores Académicos de la Universidad los profesores Mg.

QF Celia Choquenaira Quispe, y Mg. QF Elvis Gilmar Gonzales

Condori por todo el apoyo brindado a lo largo de esta

investigación, por su tiempo y por sus conocimientos, por su

consejo, amistad y apoyo para la realización de este trabajo de

investigación.

A mi compañera y amiga Andreina, que a pesar de las

dificultades que tuvimos, salimos adelante, augurando una vida

profesional exitosa.

A mi jefe Renato Antonio Sejuro Riveros, por darme el apoyo

incondicional.

Gracias a las personas que de una forma u otra han sido claves en

mi vida profesional.

Y agradecerme a mí misma, porque en cada caída supe

levantarme a pesar de los problemas, dificultades, de personas que

no sumaron a mi vida sigo aquí luchando por un futuro mejor.

Miriam Amparo Quispe Surco

v

RESUMEN

Actualmente, existen reportes en la literatura de que numerosas

investigaciones están encaminadas a la búsqueda de nuevos

compuestos con actividades biológicas a partir de fuentes naturales,

mientras otras, están destinadas a verificar las propiedades que se les

atribuyen, en tal sentido el presente trabajo de investigación tuvo como

objetivo principal evaluar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC

10231.

Como resultado del desarrollo del trabajo se identificó la presencia de

flavonoides y taninos condensados. La cuantificación de fenoles totales

fue de 50,43 ± 1,041 mg equivalentes a ácido gálico (GAE) por el

método de Folin Ciocalteu.

La determinación del efecto antimicrobiano se realizó a través del

método de microdilución en caldo y el análisis por discos de difusión en

cuyos resultados se determinó que la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas

sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue de 6,25 mg/mL

equivalente a una concentración final de 0,63 % y 6,25 µl/ml equivalente

a una concentración final de 0,63% respectivamente, en relación a la

sensibilidad sobre Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans

ATCC 10231, no se logró determinar la CMI ni la CMB - CMA debido

que a las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no tuvo

efecto antimicrobiano.

Finalmente, la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC

25923 se produjo a las concentraciones de 0,31 al 100 %, para el caso

de Escherichia coli ATCC 25922 la sensibilidad fue a las concentración

de 100%, para Candida albicans ATCC 10231 la sensibilidad fue a una

concentración de 100% del extracto etanólico de Aloysia citriodora Palau

(Cedrón).

Palabras clave: A. citriodora, E. coli, S. aureus, C. albicans, CMI, CMB,

CMA.

vi

ABSTRACT

Currently, there are reports in the literature that many investigations are

aimed at finding new compounds with biological activities from natural

sources, while others are designed to verify the properties attributed to

them, in this sense the present research work The main objective of this

study was to evaluate the antimicrobial effect of leaf extract of Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) on Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC 10231.

As a result of the development of the work, the presence of flavonoids

and condensed tannins was identified. The quantification of total phenols

was 50,43 ± 1,041 mg equivalent to galic acid (GAE) by the Folin

Ciocalteu method.

The determination of the antimicrobial effect was made through the

method of microdilution in broth and the analysis by diffusion discs in

whose results it was determined that the Minimum Inhibitory

Concentration (CMI) and Minimum Bactericidal Concentration (CMB) of

the leaf extract on Staphylococcus aureus ATCC 25923 was 6,25 mg /

mL equivalent to a final concentration of 0,63% and 6,25 μl / ml

equivalent to a final concentration of 0,63% respectively, in relation to the

sensitivity on Escherichia coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC

10231, it was not possible to determine the CMI or the CMB - CMA

because, at the concentrations that were worked on, the extract had no

antimicrobial effect.

Finally, the antimicrobial sensitivity of leaf extract of Aloysia citriodora

Palau (Cedrón) on Staphylococcus aureus ATCC 25923 occurred at

concentrations of 0,31 to 100%, for the case of Escherichia coli ATCC

25922 the sensitivity was at the concentration 100% and for Candida

albicans ATCC 10231 the sensitivity was at a 100% concentration of the

ethanolic extract of Aloysia citriodora Palau (Cedrón).

Key words: A. citriodora, E. coli, S. aureus, C. albicans, CMI, CMB,

CMA.

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA i

AGRADECIMIENTO iii

RESUMEN v

ABSTRACT vi

ÍNDICE DE CONTENIDOS vii

ÍNDICE DE TABLAS x

ÍNDICE DE FIGURAS xi

ÍNDICE DE ANEXOS xii

INTRODUCCIÓN xiii

CAPÍTULO I 1

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 1

1.1. Descripción de la realidad problemática 1

1.2. Formulación del problema 3

1.2.1. Problema principal 3

1.2.2. Problemas secundarios 3

1.3. Objetivos 4

1.3.1. Objetivo general 4

1.3.2. Objetivos específicos 4

1.4. Justificación 5

CAPÍTULO II 7

MARCO TEÓRICO 7

2.1. Antecedentes investigativos 7

2.1.1. A nivel internacional 7

2.1.2. A nivel nacional 8

2.1.3. A nivel local 9

2.2. Base Teórica 11

2.2.1. Cedrón 11

2.2.2. Infecciones 15

2.2.3. Métodos de evaluación del efecto antimicrobiano 18

2.2.4. Antibiograma 19

2.3. Hipótesis 22

viii

2.3.1. Hipótesis principal 22

2.3.2. Hipótesis secundarias 22

2.4.- Variables 23

2.4.1. Identificación de variables 23

2.4.2. Definición conceptual de variables 23

2.4.3. Definición operacional de variables 23

CAPÍTULO III 25

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN 25

3.1. Tipo y nivel de investigación 25

3.1.1. Nivel de la investigación 25

3.1.2. Tipo de investigación 25

3.1.3. Diseño de la investigación 25

3.2. Descripción del ámbito de la investigación 25

3.2.1. Ubicación espacial 25

3.2.2. Ubicación temporal 25

3.3. Población, muestra y muestreo 25

3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 26

3.4.1. Material biológico 26

3.4.2. Materiales 26

3.4.3. Recolección, almacenamiento e identificación hojas Aloysia citriodora

Palau 29

3.4.4. Obtención del extracto seco de Aloysia citriodora Palau 30

3.4.5. Escala de Mc Farland 31

3.4.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana 32

3.4.7. Análisis de datos 34

CAPÍTULO IV 35

RESULTADOS 35

4.1. Recolección y determinación taxonómica 35

4.2. Rendimiento de la extracción etanólico 35

4.3. Extracto etanólico de hojas Aloysia citriodora Palau (Cedrón) 36

4.4. Identificación de taninos 37

4.5. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda 37

4.6. Cuantificación de fenoles totales 38

ix

4.7. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 39

4.7.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau

frente a Escherichia coli ATCC 25922 39

4.7.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau

frente a Escherichia coli ATCC 25922 43

4.7.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau en Escherichia coli ATC 25922 comparada

con ciprofloxacino 44

4.8. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. 49

4.8.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. 49


frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53

4.9. Evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau

frente a Candida albicans ATCC 10231. 59


frente a Cepas de Candida albicans ATCC 10231 59

4.9.2 Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora Palau

frente a Candida albicans ATCC 10231 62

4.9.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231

comparada con clotrimazol 1 %. 63

CAPÍTULO V 69

DISCUSIÓN 69

CONCLUSIONES 74

SUGERENCIAS 76

BIBLIOGRAFÍA 77

ANEXOS 86

x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación taxonómica 12

Tabla 2. Variables 24

Tabla 3. Determinación de CMI por microdilución en caldo peptonado 33

Tabla 4. Identificación y tipificación de hojas de cedrón recolectadas 35

Tabla 5. Valores del gráfico de calibración de concentración de

ácido gálico vs absorbancia promedio 38

Tabla 6. Concentración de fenoles totales equivalente en ácido gálico

por gramos de extracto 39

Tabla 7. Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI)

de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 42

Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Minima Bactericida

de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 43

Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones

del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau. 45

Tabla 10. Análisis de sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922

a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 46

Tabla 11. Test de Tukey de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922

a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 47

Tabla 12. Resultados de la determinación de la concentración inhibitoria de

Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 52

Tabla 13. Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora

Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53

Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus

aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 55

Tabla 15. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Staphylococcus


Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcu


Tabla 17. Resultados de la determinación de Concentración Mínima Inhibitoria

de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 61

Tabla 18. Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia

citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 62

Tabla 19. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Candida

albicans ATCC 10231 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 64

Tabla 20. Análisis de varianza de la prueba de la sensibilidad de Candida

albicans ATCC 10231 al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 65

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Aloysia citriodora Palau (Cedrón) 11

Figura 2. Composición química del Cedrón 13

Figura 3. Hojas de Aloysia citriodora Palau 29

Figura 4. Reacción química en la prueba de Shinoda 30

Figura 5. Cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus

ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 KwikStik 32

Figura 6. Extracción por Soxhlet 36

Figura 7. Rotaevaporador 36

Figura 8. Identificación de taninos condensados en Aloysia citriodora Palau 37

Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavanonas

en Aloysia citriodora Palau 37

Figura 10. Gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles

totales por el método de Folin Ciocalteu 38

Figura 11. Ensayo de determinación de concentración mínima inhibitoria

de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli 41

Figura 12. Siembra en placa (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a

Escherichia coli ATCC 2592 43

Figura 13. Sensibilidad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau frente a

Escherichia coli ATCC 25922 44

Figura 14. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia

coli a concentraciones de hojas de Aloysia citriodora Palau 48

Figura 15. Siembra en placa para determinar la (CMB) de Aloysia citriodora

Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53

Figura 16. Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysi

citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 54

Figura 17. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de

Staphylococcus a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 58

Figura 18. Ensayo de determinación de concentración mínima

inhibitoria frente a Cándida albicans ATCC 10231 60

Figura 19. Siembra en placa (CMA) de Aloysia citriodora

Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 62

Figura 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad

frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 66

Figura 22. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad a

concentraciones hojas de Aloysia citriodora Palau . 68

xii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Constancia de identificación taxonómica del cedrón 87

Anexo 2. Recolección de Aloysia citriodora Palau 88

Anexo 3. Pesando la muestra triturada de hojas de cedrón 88

Anexo 4. Elaboración de cartuchos 89

Anexo 5. Armado del Equipo Soxlhet 89

Anexo 6. Momento preciso de la extracción de Aloysia citriodora Palau 90

Anexo 7. Obtención del extracto de Aloysia citriodora Palau 90

Anexo 8. Preparación de medios de cultivo 91

Anexo 9. Pesando los Medios de Cultivo 92

Anexo 10. Preparación del Agar Müeller Hinton 92

Anexo 11. Preparación de placas con el Agar Müeller Hinton 92

Anexo 12. Preparación de las placas para el sembrado

de Staphyloccocus aureus en Agar Manitol salado 93

Anexo 13. Colocando los Discos de difusión con el extracto de

cedrón en placas con Agar Manitol salado 93

Anexo 14. Resultados en los diferentes medios de cultivos(Agar

Müeller Hinton, Manitol salado y Sabouraud) 94

Anexo 15. Preparación de la solución madre 94

Anexo 16. Adición del inoculo preparado 95

Anexo 18. Proceso del método de la concentración mínima

bactericida (CMB) en Agar manitol salado 95

Anexo 17. Autoclavado final en donde se esterilizo todo material

y desecho que se usó en todo procedimiento 96

xiii

INTRODUCCIÓN

“La utilización de sustancias naturales en el tratamiento de diferentes

enfermedades, incluidas las de etiología infecciosa, constituye en la actualidad

un desafío en la medicina y se ofrece como una alternativa, especialmente en

aquellas dolencias para las que no existe un remedio adecuado.”1 “Después de

un período en que la industria farmacéutica se dedicó exclusivamente a la

fabricación de fármacos de síntesis, dejando atrás las antiguas medicinas que

tenían como base los extractos de plantas medicinales, hay un cambio

cualitativo en los programas industriales con dedicación a la búsqueda de

nuevos medicamentos de origen herbario. Un número creciente de personas

recurren a sus propiedades curativas basándose en su uso tradicional. No

obstante, ciertas plantas medicinales no han mostrado las propiedades que les

atribuye la medicina popular, e incluso han resultado peligrosas.”2 Existen

reportes en la literatura de que numerosas investigaciones están encaminadas

a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas a partir de

fuentes naturales, mientras otras están destinadas a verificar las propiedades

que se les atribuyen.

“El estudio científico de las plantas medicinales es una fuente relevante para el

descubrimiento de nuevos fármacos que luego se sintetizan, pero también

permite un conocimiento más profundo de los vegetales que conduce a que

muchos productos naturales sean reconocidos como fitofármacos, es decir,

compuestos que igualan el nivel de los fármacos de síntesis.”1 Actualmente,

uno de los problemas más comunes es que existen plantas medicinales que

tienen una actividad antimicrobiana conocida por la población, sin embargo no

han sido analizadas a fondo, para determinar cuáles son sus beneficios,

pasando muchas veces desapercibidas.

El cedrón es una especie muy popular y ampliamente distribuida, esto es por

su propagación facilitada por matas. Además, se le han atribuido propiedades

diuréticas, antimicóticas y antimicrobianas a causa de su aceite esencial de

aroma cítrico. Es por este uso potencial que la extracción y posterior estudio

del mismo es importante; ya que existe un amplio mercado de interés en la

industria farmacológica y cosmética. En tal sentido, el presente trabajo de

investigación tuvo como objetivo principal evaluar el efecto antimicrobiano del

xiv

extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC

10231. Debido a que estos microorganismos son los responsables de las

principales infecciones que afectan la salud de las personas y animales con

enfermedades como infecciones urinarias, osteomielitis, sinusitis, furúnculos,

queratitis, onicomicosis entre otros.

1

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1. Descripción de la realidad problemática

“Se sabe que, las infecciones ocupaban los primeros puestos en cuanto a

mortandad, sin embargo, en la actualidad, son la segunda causa de muerte tras

las enfermedades cardiovasculares. Así pues, durante el siglo XX la mortandad

por enfermedades infecciosas descendió de forma drástica aumentando así la

expectativa de vida. Estos cambios se debieron principalmente a la aparición

de los antibióticos y al desarrollo en técnicas diagnósticas y terapéuticas

medico quirúrgicas. Además, es necesario saber que, a las infecciones

comunitarias se agregan las infecciones nosocomiales (IN) que, en general,

perjudican a los pacientes más graves. La IN, en su definición habitual, es

aquella que aparece durante el ingreso hospitalario, aunque en la actualidad se

extiende también a la que se relaciona con los cuidados sanitarios en un

sentido amplio. Estas infecciones son unas veces motivo de ingreso en las

unidades de cuidados intensivos (UCI) y otras, consecuencia de la estancia en

éstas.” 3

“En Perú, un estudio en el año 2000 realizado en 70 hospitales con más de

1500 egresos por año, se evidenció una prevalencia de 3,7 % de infecciones

intrahospitalarias, siendo las áreas más afectadas la UCI y neonatología” 4; “por

otro lado, un segundo estudio realizado en un hospital de la Seguridad Social

nivel cuatro presentó una prevalencia de 7,5 % siendo en su mayoría pacientes

de cuidados intermedios.” 5

“Como responsables de los casos de infección de tracto urinario asociado a

catéter permanente en la UCI-Emergencia se halló Klebsiella sp. y

Acinetobacter sp ambos con 7,7 %.”6 7 “Para la UCI-Medicina los

microorganismos aislados fueron Pseudomona sp. y Staphylococcus aureus

ambos con 6,6 %.” 6 8 “Finalmente, en la UCI-Quirúrgica el agente más

frecuente fue Candida sp. Con el 50 %”.” 9 10

“En la actualidad, el gran reto para los países ricos en biodiversidad es poder

vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en

compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte

2

del aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en

beneficio de la sociedad.” 11

“El uso de extractos vegetales para el tratamiento de enfermedades a nivel

hospitalario es limitado, se supone que las bacterias no han desarrollado

mecanismos de resistencia en su contra, es por esto que se pretende que los

extractos pudieran ser una opción importante para el tratamiento de estas

afecciones.” 12

“Un estudio revela que, a partir de la valoración de los extractos íntegros de las

diferentes partes de la planta, así como multiples compuestos aislados en

extractos han evidenciado significativa actividad biológicas como son:

antihelmíntica, antibacteriana, vermífuga, antidiarreica y antidisentérica.” 13

3

1.2. Formulación del problema

1.2.1. Problema principal

− ¿Cuál es el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231?

1.2.2. Problemas secundarios

− ¿Cuál es el resultado de la identificación de flavonoides y taninos del

extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)?

− ¿Cuál es la concentración de fenoles totales en el extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)?

− ¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración

Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923?


Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922?


Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231?

− ¿Cuál es la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de


25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231?

4

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo general

− Determinar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231

1.3.2. Objetivos específicos

− Identificar flavonoides y taninos en el extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón).

− Cuantificar fenoles totales en el extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) por el método de Folin Ciocalteu.

− Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la

Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de


25923.


Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922.


Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231.

− Evaluar la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de


25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231.

5

1.4. Justificación

“Según datos obtenidos por la Universidad de Santander de Colombia, en los

últimos años, el fallecimiento de niños menores a cinco años de edad han

disminuido; no obstante, las cifras aún son alarmantes. Entre las primeras

causas de muerte por infecciones se encuentran la neumonía, seguida por

diarrea y malaria. Datos adquiridos de los análisis sistemáticos, evidencio que

entre los años 2010 y 2011 se presentaron entre 7,6 y 6,9 millones de muertes

de niños bajo cinco años de edad, respectivamente. El 9,9% de esas muertes

fue a causa de la diarrea producida por Rotavirus, calicivirus, Escherichia coli

enteropatógena y E. coli enterotoxigénica.”60

“En relación a Staphylococcus aureus, comunico que en los trabajos publicados

en la revista cubana de pediatría, mencionan que esta bacteria es oportunista,

debido a que ocasiona enfermedades al humano, principalmente cuando éste

atraviesa lapsos de debilidad asociados a circunstancias anómalas que

disminuyen la competencia de su sistema inmunológico.”2

Bajo tales condiciones, Staphylococcus aureus es capaz de provocar

afecciones en casi cualquier región anatómica, lo cual refleja su amplio bagaje

en cuanto a genes de virulencia que lo habilitan para establecerse,

reproducirse, sobrevivir y extenderse en diversas clases de tejidos,

ciertamente, S. aureus es una causa común de piodermitis, intoxicaciones

alimentarias y toda una gran variedad de afecciones entre la población general;

no obstante, el "blanco" preferido de esta especie se ubica predominantemente

dentro de los hospitales, en donde entra en contacto con numerosos pacientes

debilitados, ya sea debido a que éstos padecen de enfermedades graves,

traumatismos o quemaduras serios u otras lesiones, incluyendo las provocadas

por alguna cirugía, o bien, porque han sido sometidos a tratamientos que

abaten la inmunidad celular o a la implantación inapropiada de dispositivos

médicos, tales como prótesis, catéteres u otros materiales plásticos.

“Por otro lado, las especies del género Candida sp. son hongos en forma de

levaduras ovales que conviven como microorganismos comensales, en el

individuo inmunodeprimido, ya que hacen parte de la flora normal de la piel y

mucosa en la mayoría de sistemas del cuerpo humano (gastrointestinal,

respiratorio y genitourinario); este microorganismo es el más habitualmente

6

implicado en las infecciones por hongos en pacientes críticos y las especies

patógenas más frecuentes de Candida sp son: C. albicans, C. tropicalis, C.

glabrata, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. orthopsilosis, C. metapsilosis, C.

krusei, C. famata, C. guilliermondii y C. Lusitania.”38

Con todo lo mencionado, actualmente la utilización de antibióticos plantea

problemas debido al inconveniente de elegir el antibiótico adecuado entre un

gran número de ellos. La enorme incremento de antibióticos con la

consecuente incapacidad de conocer las características de cada uno, y la

sensación de seguridad que crea el prescribir aquellos que tienen un amplio

espectro de acción, conduce en muchas ocasiones a una utilización masiva e

indiscriminada de antibióticos y, lo cual es peor, así, el consumo de antibióticos

supone la primera o segunda partida económica de los gastos de farmacia de

un hospital. Este enorme volumen de consumo se traduce en cifras de

utilización inadecuada de antibioticos, en la aparición de efectos secundarios,

el desarrollo de resistencias bacterianas, colonizaciones o infecciones graves.

Una alternativa al uso, a veces indiscriminado, de antibióticos reside en la

utilización de plantas medicinales o fitoterapia, la cual ha sido empleada en

todo el mundo desde épocas remotas. En la actualidad las infecciones

nosocomiales en Perú y hospitales de Arequipa son causadas por especies de

Staphylococcus aureus meticilino resistente (SAMR), Pseudomona aeruginosa,

así mismo, las infecciones del tracto gastrointestinal a menudo se dan por

Escherichia coli, en cuanto a infecciones vaginales o dérmicas también pueden

estar asociadas Candida albicans.

En tal sentido, en el presente trabajo de investigación se busca evaluar el

efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y

Candida albicans ATCC 10231.

7

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes investigativos

2.1.1. A nivel internacional

“Ricco, Wagner y Gurni en su investigación titulada “Dinámica de

polifenoles de “Cedrón” (Aloysia citrodora Palau -Verbenaceae-) en

relación al desarrollo foliar” en el año 2011 expuso que; se examinaron las

infusiones realizadas a partir de las hojas de Aloysia citrodora Palau –

Verbenaceae-, conocida holgadamente como “cedrón”, con el objeto de

establecer la influencia del grado de desarrollo foliar en el perfil de

polifenoles. Se obtuvieron los perfiles cromatográficos y se cuantificaron

los fenoles totales, taninos totales, flavonoides totales y ácidos

hidroxicinámicos totales provenientes de los extractos acuosos de las

hojas jóvenes y adultas. Se examinó diferencias cuali-cuantitativas en el

perfil de polifenoles cuando se comparan las hojas jóvenes con las hojas

adultas. En las hojas jóvenes, las concentraciones de fenoles totales,

flavonoides totales y ácidos hidroxicinámicos totales resultaron ser

significativamente superiores a las determinadas en las hojas adultas. Los

estudios realizados sugieren que la variable aquí analizada debe ser

considerada al momento de elaborar productos en base a hojas de

cedrón, dado que las diferentes concentraciones detectadas podrían

traducirse en diferentes actividades biológicas.” 17

“En Ecuador ejemplares de las especies vegetales Lippia citriodora K

(cedrón), Ambrosia artemisifolia L (altamisa), Taraxacum officinale Weber

(diente de león), Ageratum conyzoides L (mastrante), Piper carpunya Ruiz

& Pav (guaviduca), Borago officinalis L (borraja), Coriandrum sativum L

(cilantro), Melissa officinalis L (toronjil), Cymbopogon citratus S (hierba

luisa), Artemisia absinthium L (ajenjo), Momordica charantia L (achochilla)

y Moringa oleífera Lam (moringa) se recolectaron al azar en las

localidades de Machala y Santa Rosa, Ecuador. Las hojas fueron lavadas,

secadas, molidas y extraídas por maceración con metanol; los filtrados

concentrados por evaporación a presión reducida. Para determinar la

8

actividad antimicrobiana de los extractos metanólicos obtenidos, se utilizó

la técnica de difusión en agar, mediante la cual éstos se probaron frente a

cepas de bacterias Gram positiva (Staphyloccocus aureus) y Gram

negativa (Escherichia coli y P. aeruginosa), y una cepa del hongo

(Candida albicans). Todos los extractos analizados, a excepción de los de

L. citriodora y A. conyzoides, manifestó una acción bactericida contra

todas las cepas bacterianas ensayadas, lo cual refleja la gran importancia

de estas especies en la producción de fitofármacos antibióticos. T.

officinale y P. carpunya presentaron un efecto antibacteriano alto contra

E. coli; sin embargo, S. aureus no presentó sensibilidad frente los

extractos de L. citriodora y P. carpunya. El bioensayo de actividad

antifúngica realizado a los extractos de las especies estudiadas contra C.

albicans, mostró que todos tienen acción fungicida alta, a excepción de T.

officinale con un menor efecto inhibitorio del crecimiento fúngico. Se

puede inferir que estas plantas constituyen una fuente promisoria de

compuestos químicos antimicrobianos de gran valor farmacológico.”1

2.1.2. A nivel nacional

“Chicoma y Malca” 18, “en su investigación titulada efecto antibacteriano in

vitro del aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la

Región Cajamarca, frente a las bacterias patógenas Escherichia coli

ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, tuvieron como

objetivo demostrar el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de

hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la región Cajamarca, frente a las

bacterias patógenas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus

aureus ATCC 25923. El material vegetal se obtuvo de la zona de Huacariz

(Región Cajamarca), del cual se obtuvo el aceite esencial por

hidrodestilación utilizando el destilador de caldera de acero inoxidable.

Las cepas estandarizadas fueron obtenidas del Instituto Nacional de

Salud, Lima- Perú. Para analizar la actividad antibacteriana se utilizaron

los métodos de Kirby Bauer y los pocillos. En el método de Kirby Bauer se

utilizó un grupo problema constituido por discos embebidos con 20 µL del

aceite esencial de Aloysia triphylla P. “cedrón” diluido con etanol de 70º

(diluciones de 10%, 50% y 100%), un grupo control constituido por discos

9

con etanol de 70º, 5 µg de ciprofloxacino y 30 µg de cloranfenicol para la

cepa de Escherichia coli y 15 µg de eritromicina y 2 µg de clindamicina

para la cepa de Staphylococcus aureus. Para el método de los Pocillos se

utilizó un grupo problema con 40 µL del aceite esencial de Aloysia triphylla

P. “cedrón” diluido con etanol de 70º (diluciones de 10%, 50% y 100%), un

grupo control constituido por 40 µL de las diluciones de cloranfenicol y

ciprofloxacino (10 mg/ml, 50 mg/ml y 100 mg/ml) para la cepa de

Escherichia coli, diluciones de eritromicina y clindamicina (10 mg/ml, 50

mg/ml y 100 mg/ml) para la cepa de Staphylococcus aureus y 40 µL de

etanol de 70º para ambas cepas, llevando a incubar las placas a 37 °C

durante 24 horas. Luego se procedió a observar, medir y analizar los

halos de inhibición obtenidos sobre las cepas en estudio. Los resultados

se analizaron con el método estadístico no paramétrico de Mann -

Whitney, obteniendo un valor de p=0,034 para Escherichia coli y para

Staphylococcus aureus p=0,046, por el método de los discos de

sensibilidad y por el método de los Pocillos, Escherichia coli p=0,010 y

p=0,016 Staphylococcus aureus siendo menor que p<0,05, lo que hace

que el estudios sea significativo. Según los resultados se concluye que el

aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” tiene efecto

antibacteriano sobre las cepas de Staphylococcus aureus pero no contra

Escherichia coli.” 18

2.1.3. A nivel local

Sabiendo que la capacidad antioxidante de un extracto está relacionado

con la actividad antimicrobiana y debido a que no hay referencias

bibliográficas de estudios realizados en el tema a nivel local se cita a

“Alpaca” 19 “que en evaluación de la capacidad antioxidante del extracto

de cedrón (Aloysia triphylla) para la realización de una bebida funcional

plantea que; las plantas han formado parte de la medicina tradicional de

muchos países. En Perú, son ampliamente utilizadas en el alivio de

numerosas enfermedades. Una de estas plantas es el cedrón (Aloysia

triphylla), el cual posee propiedades analgésicas y antiespasmódicas.

Dicho trabajo tuvo como objeto evaluar la capacidad antioxidante y

fenoles totales de los extractos de cedrón a través de un método

10

espectrofotométrico y sus características organolépticas con la finalidad

de elaborar una bebida funcional como una nueva alternativa para el

mercado. Para lo cual la materia prima fue sometida a análisis para

conocer la calidad de ella, además se realizó como experimento

preliminar el método de secado del cedrón, bajo sombra (T max: 22°C, T

min: 11°C) por un tiempo de 40 hrs, alcanzando una humedad promedio

final de 9,99% y artificialmente en cámara de aire caliente (T: 40+5°C )

por un tiempo 4 hrs y 30 min, alcanzando una humedad promedio final de

9,41% de estas muestras se llevaron al experimento de extracción con el

cedrón con un porcentaje de humedad de 65.64% para ver cómo estas

variables influyen en las características tanto sensoriales como en sus

compuestos antioxidantes. Los parámetros para la extracción por infusión

en cuanto al estado del cedrón y la proporción (cedrón: agua) son: cedrón

deshidratado bajo sombra a temperatura ambiente, a una proporción de

1:50 respectivamente, obteniendo los mejores resultados en cuanto a sus

compuestos antioxidantes y características sensoriales. Los parámetros

para la pasteurización son: a 92°C por 5 minutos, con el fin de mantener

su capacidad antioxidante y fenoles totales, sin afectar las características

sensoriales y asegurar una eliminación microbiana que garantice la

inocuidad del producto. Se efectuaron los análisis de sus compuestos

antioxidantes en la bebida funcional, los cuales fueron: 5797,940 μmol

TR/L de su capacidad antioxidante y 5902,258 μmol TR/L de fenoles

totales., también se le realizaron sus análisis físico – químico, químico –

proximal, sensorial y microbiológico al producto final. La bebida funcional

elaborado a base de extracto de cedrón, es altamente aceptado por los

consumidores.”19

“El tiempo de vida útil de la bebida funcional es de 4 meses y 10 días a

una T=5°C. En el capítulo IV, se evaluó la propuesta a nivel industrial

realizando los cálculos de ingeniería y especificaciones de la planta, la

ubicación de la planta estará en la Provincia de Arequipa, en el distrito de

Characato, tendrá un periodo operativo de 300 días al año, con un turno

de 8 horas/día; y una capacidad de producción de 288 000 lt/año.”19

11

2.2. Base Teórica

2.2.1. Cedrón

A. Descripción

“La Aloysia triphylla, pertenece a la familia de las Verbenáceas y es

también conocida botánicamente con los nombres de Lippia citriodora

Kunth, Lippia triphylla Kuntze, Aloysia citriodora Ortega. Habitualmente,

se le conoce en Colombia como “Cidrón”; en Perú “Cedrón”, en Argentina,

“Cedrón”, “Hierba Luisa”; “María Luisa” y “Hierba de la princesa”, en

España. Es apreciada como planta engalanada en los jardines y solares,

debido al intenso y agradable olor a limón que desprenden sus hojas.” 20

“El Cedrón (Aloysia triphylla) es un arbusto que crece en forma natural,

puede medir más de 1.50 m de altura, es muy olorosa, de hojas opuestas

y trifoliadas, con flores blancas y verdosas. Sus frutos son drupas

pequeñas, de color verde y sus semillas son de color gris.” 21

“Hojas: Su nombre “triphylla” se debe a que sus hojas simples, rugosas e

insertadas en cada nudo, están reunidas en vértices de tres.” 22

Figura 1. Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

12

“Flores: Son pequeñas, blancas por fuera y violáceas por dentro. Esta

planta es originaria de la región montañosa del norte de Argentina (la

Rioja, Salta), donde crece silvestre.” 22

“Habitad: La planta se adapta bien en climas templado y templado-cálido.

Con frío riguroso suele perder las hojas. Prospera bien en buenos suelos,

de consistencia media, sueltos, permeables, profundos, con pH entre 6,5

y 7,2 más bien frescos, pero no húmedos, pues el exceso de agua

favorece la podredumbre de raíces.”22

B. Clasificación taxonómica

En la Tabla 1 se presentan la clasificación taxonómica correspondiente a

Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

Tabla 1. Clasificación taxonómica

F

u

e

n

t

e

:

R

a

m

o

s

Fuente: “Ramos” 23

C. Composición

“La fracción volátil es la característica más destacada del cedrón. Su

rendimiento en aceite esencial fluctúa entre 0,2 y 1,0% dependiendo de

diversos factores endógenos y exógenos. El principal componente de la

calidad habitual del cedrón es el citral (mezcla de los isómeros geranial y

Categoria Taxonómíca Descripción

Reino Vegetal – Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Subclase Asteridae

Orden Lamiales

Familia Verbenaceae

Género Aloysia

Especie Triphylla

Nombres comunes Aloysia citriodora, Hierba Luisa o Verbena de Indias

13

neral) como se observa en la Figura 2. El rendimiento mínimo requerido

de aceite esencial en la Farmacopea Francesa X (1996) es de 0,4%.

Existe también una norma IRAM-SAIPA (1970) para su esencia, donde se

exige un contenido de compuestos carbonilicos expresados como citral de

20 al 40%.” 24

Figura 2. Composición química del Cedrón

Fuente: “Adaptado de García” 21

14

“En cuanto a otros compuestos identificados en el cedrón, destacan los

flavonoides como salvigenia, eupafolina, cirsiol, eupatorina, hispidulina,

apigenina, diosmetina, 7-O-glucosil-luteolina y 7-O-diglucuronil-luteolina.

Además, el cedrón contiene irioides heterosidicos, como el

acidogeniposidico; derivados del acidohidroxicinamico (7%),

especialmente verbascosido (5%), mucilagos, taninos, alcaloides, nonanal

y fitoesteroles.”21 “monoterpenos (8-17%), sesquiterpenos (8-10%),

monoterpenos oxigenados (60-77%) y sesquiterpenos oxigenados (5-

13%) y limoneno.”60

D. Usos

“Andoni (1988), indica que el cedrón es utilizado para trastornos

digestivos tales como, diarrea, cólicos, indigestión, náusea, vómitos y

flatulencia; en trastornos del sistema nervioso como sedante en insomnio

y ansiedad; en estados gripales (resfriados con fiebre).”25

“La infusión se prepara con 1 cucharada de la planta para I litro de agua

recién hervida, dejar reposar y beber de 3 a 4 tazas al día. Efectos:

antiespasmódico (calma los retortijones estomacales), carminativo

(previene y favorece la expulsión de gases), sedante suave (modera la

actividad del sistema nervioso).”25

“Posee una importante cantidad de melatonina, sustancia que se usa

como relajante natural y que favorece el sueño nocturno, ayuda al

descanso total de la memoria.”25

“Estudios científicos han demostrado importantes propiedades

antimicrobianas de A. triphylla. El extracto acetónico de las partes aéreas

evidenció significativa actividad contra Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris” 26; “el

extracto etanólico fue activo contra Listeria monocytogenes” 27; “por otra

parte, el aceite esencial mostró actividad contra Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes, Klebsiella

ozaenae, Enterococcus sp, Bacillus subtilis, Candida albicans” 28 “y

produjo inhibición in vitro de la replicación de cuatro serotipos del virus del

dengue.”29

15

2.2.2. Infecciones

“Una infección primaria es una infección aguda que causa la enfermedad

inicial. Una infección secundaria es la causada por un patógeno

oportunista después de que la infección primaria debilito las defensas del

organismo.”30

“Las infecciones nosocomiales son resultados de las interacciones de

varios factores como son; los microorganismos presentes en el ambiente

hospitalario, así como, el estado comprometido (debilitado) del huésped y

finalmente la cadena de trasmisión en el hospital. Así pues, la interacción

de los tres factores expuestos plantea un riesgo significativo de una

probable infección nosocomial.” 30

A. Staphylococcus aureus

“Los Staphylococcus son cocos Gram positivos cuyo diámetro varía de

0,8 a 1,0 µm. En cultivo sólidos, se desarrollan formando racimos, sin

embargo, en medios líquidos forman a menudo cadenas cortas.”31 “Las

colonias de Staphylococcus son circulares de 2 a 8 mm de diámetro,

convexas, desde traslucidas a opacos grises blanquecinas, amarillas.” 32

“Staphylococcus aureus, produce varias enzimas y toxinas que pueden

contribuir a su virulencia.” 33

a. Enzimas

− “Catalasa: La producción de catalasa por parte de estos

microorganismos puede ejercer la inactivación del peróxido de

hidrogeno y los radicales libres tóxicos formados por el sistema

mieloperoxidasa dentro de la célula fagocitas después de la ingestión

de estos microrganismos.” 33

− “Coagulasa: Tanto la coagulasa libre como la unida (también

denominada factor de agregación) pueden revestir las células

bacterianas con fibrina y trasformarlas resistentes a la ozonización y

la fagocitosis.” 33

− “Fibrinolisinas (Estafiloquinasa): Estas pueden degradar coágulos

de fibrina y permitir la dispersión de la infección a los tejidos

contiguos.” 33

16

− “Hialuronidasa: Hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacáridos

en los tejidos y por lo tanto puede actuar diseminando los

microorganismos a zonas aledañas.” 33

− “Lipasa: Las cuales son activas sobre una variedad de sustratos

incluyendo plasma, grasas y aceites que se acumulan en la superficie

del cuerpo, lo cual explica la intensa repoblación del Staphylococcus

por las áreas sebáceas de mayor actividad.” 33

− “Nucleasas: La elaboración de una nucleasa resistente al calor

parece estar asociada con cepas Staphylococcus aureus. Se halla en

la célula o en la superficie de ella.” 33

− “Lactamasas: La producción de estas enzimas puede ser inducibles

es decir se producen solo en presencia de antibióticos β-Lactámicos

o constitutiva es decir se producen continuamente y hace que estos

microorganismos sean resistentes a la penicilina y la ampicilina.” 33

− Otros: “Los estudios inmunológicos y de especificidad indican que

Staphylococcus aureus producen por lo menos tres tipos

diferentes.”33

b. Toxinas

− “Toxinas citolíticas: Existen varias de ellas.” 34

− “Alfa hemolisina: Es una proteína que puede producir lisis de los

eritrocitos y lesionar las plaquetas.” 34

− “Beta hemolisina: Esta degrada la hemolisina y es toxica para

muchas clases de células, incluso los eritrocitos.” 34

− “Leucosidinas: Toxina que puede extinguir a los leucocitos

expuestos de muchos animales.” 34

− “Enterotoxinas: Hay por lo menos seis toxinas solubles designadas

de la A-F producidas por el Staphylococcus aureus, estas son

termoestables resistente a cocción por 30 minutos y a la acción de la

enzima intestinales; son causas importantes de intoxicación con

alimentos.” 34

− “Toxina exfoliativa o epidermolítica: Esta toxina está constituidas

por lo menos dos proteínas que producen eczema generalizada del

síndrome estafilocócico de piel escaldada.” 34

17

c. Patogenicidad de Staphylococcus aureus

“Staphylococcus aureus interviene en la mayor parte de los procesos

infecciosos de heridas en el hombre. Puede localizarse en cualquiera de

los tejidos corporales, por lo que es el germen que con más frecuencia

produce piemía. En el hombre es uno de los agentes etiológicos de

osteomielitis, sinusitis, tonsilitis, forúnculos, mastoiditis, endocarditis y

queratitis ulcerativa. Como agente secundario interviene en la angina

séptica, escarlatina, tuberculosis y neumonía.” 34

“La adquisición puede ser exógena o endógena. Es un agente de gran

relevancia intrahospitalaria, donde ha adquirido resistencia a la Oxacilina.

La contaminación intrahospitalaria se lleva a cabo a través de las manos

del personal a cargo.” 34

B. Escherichia coli

“Es una de las primeras especies que coloniza al mamífero recién nacido,

adquiriendo las primeras cepas del canal de parto y de las heces de su

madre. Las invasiones posteriores se deben por lo general a la deglucion

de alimentos contaminados. Las especies pertenecientes a este género

son bastones rectos de 1,1 – 1,5 x 2,0 - 6,0 µm, que se encuentran tanto

aislados como en parejas. Algunas de las cepas pueden presentar

cápsula o microcápsula. Móviles por flagelos perítricos o inmóviles. Son

Gram negativos, anaerobios facultativos y presentan tanto un

metabolismo fermentativo como oxidativo.”35

“E. coli es un organismo quimioorganotrofo, oxidasa negativa y catalasa

positiva, cuya temperatura óptima de crecimiento es de 37 ºC y cuyas

colonias, aisladas en agar nutritivo, pueden ser tanto lisas como

rugosas.”35

a. Patogenicidad de Escherichia coli

“Las infecciones más frecuentes debidas a E. coli son las urinarias.

Asimismo puede originar infecciones de las vías biliares, peritonitis,

meningitis neonatal, neumonía, y gastroenteritis entre otras.”36 “Aunque

E. coli es parte de la flora comensal puede causar infecciones en

determinada condición, como son la emigración desde el intestino al

tracto urinario, produciendo infecciones urinarias bajas y eventualmente

18

bacteriemia o infecciones focales por vía hematógena, aunque la vía de

entrada más común es la urinaria, ello no significa que sea la única que

permite el acceso del germen a la circulación.” 37

“Son muchos los síndromes clínicos que pueden estar causados por E.

coli entre ellos destacan los siguientes:” 37

− Infecciones urinarias

− Gastroenteritis

− Meningitis neonatal

− Bacteriemia

− Otras infecciones: neumonía, infecciones de las vías biliares,

− infecciones localizadas

C. Candida albicans

Candida albicans es el agente más común y patógeno dentro del género

Candida principal promotor de la Candidiasis vaginal.

“Candida es un organismo común en la flora vaginal, lo que ocurre es que

se puede presentar bajo dos formas. En su forma como fermento (no

patógena, blastoporo) y en su forma micelar donde desarrolla una especie

de raíces, pseudohifas (forma patógena) que se entrelazan entre sí y con

las que traspasan y se fijan a las células de la mucosa vaginal.” 38

a. Patogenicidad de Candida albicans

“La adherencia de C. albicans es el primer paso es la colonización y

penetración de los tejidos mucocutáneos, la cual es probablemente

mediada por la interacción de las glicoproteínas de superficie del fermento

con la célula epitelial del hospedero. Luego se produce la aparición de

tubos germinativos, micelio o pseudomicelio (según la especie), los cuales

ingresan directamente en la célula epitelial. La adherencia continúa con la

obtención de enzimas hidrofílicas como proteinasas, fosfatasas, y

fosfolipasas.”38

2.2.3. Métodos de evaluación del efecto antimicrobiano

A. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

“La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se define como la mínima

concentración de antimicrobiano (en µg/mL) que impide el crecimiento

visible de un microorganismo después de 24 horas de inoculación a 37°C.

19

La CMI se ha establecido como “gold Standard” frente a otros métodos

que evalúan sensibilidad antimicrobiana; además de confirmar

resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado

obtenido por otros métodos es impreciso.”39

B. Concentración Mínima Bactericida (CMB)

“La Concentración Mínima Bactericida (CMB), se define como la mínima

concentración de antimicrobiano que mata a más del 99,9% de los

microorganismos viables después de un tiempo determinado de

inoculación (generalmente 24 horas).” 40 41 “En ocasiones se hace

necesario determinar la actividad bactericida de un agente antimicrobiano,

como es el caso de endocarditis, osteomielitis, meningitis o infecciones

en pacientes inmunosuprimidos, existe la necesidad de establecer

métodos de laboratorio que definan la actividad de estos agentes.” 40

2.2.4. Antibiograma

A. Generalidades

“La realización de un antibiograma se basa en el patrón de resistencia de

cada bacteria. Así, los antibióticos a los que esa bacteria es

intrínsecamente resistente o cuya sensibilidad puede inferirse por otros,

no suelen informarse en el antibiograma. Los patrones de antibiograma

poco frecuentes o imposibles requieren confirmación, ya que no

responden a mecanismos de resistencia conocidos.” 42

“Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten

en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a

diferentes concentraciones de antibiótico. La interpretación de los

resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en

categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes. Hay que tener en

cuenta que no siempre un valor de CMI más bajo indica mayor actividad

de este antimicrobiano, ya que las CMI que definen la sensibilidad o

resistencia son diferentes para cada especie bacteriana y cada

antimicrobiano. Si un microorganismo es sensible indica que con las dosis

habituales se espera una evolución favorable de la infección, siempre que

se alcancen valores adecuados en el lugar de la infección, lo que en

ocasiones no es posible (p. ej., en el sistema nervioso central).” “Por el

contrario, si el microorganismo es intermedio o resistente, es probable

20

que la evolución sea desfavorable. La interpretación de la sensibilidad

pronostica mejor el fracaso (cuando es resistente) que el éxito de un

tratamiento. Entre los métodos fenotípicos, las técnicas de dilución

determinan la CMI utilizando un medio líquido (dilución en caldo) o un

medio sólido (dilución en agar) para disolver las diferentes

concentraciones del antimicrobiano.”42

“El medio estandarizado para la realización del antibiograma es el medio

Müeller Hinton, al que se le incorpora sangre u otros suplementos para

bacterias que no crecen en él. La CMI es la dilución más baja de

antimicrobiano en la que no se examina crecimiento bacteriano. La

dilución en caldo suele realizarse en micrométodo (microdilución), en

paneles multipocillos, y es el sistema mayoritariamente adoptado por los

sistemas automáticos comerciales para determinar la sensibilidad a los

antimicrobianos. En estos sistemas, la lectura de los valores de CMI y la

interpretación de resultados se realizan de forma automática.” 42

B. Lectura interpretada del antibiograma

“El análisis de los resultados de sensibilidad es un aspecto esencial para

una correcta información del antibiograma y tiene una gran trascendencia

clínica.” 43 “En tal sentido, la lectura interpretada del antibiograma analiza

los fenotipos de sensibilidad y permite interpretar posibles mecanismos de

resistencia.” 44 “Además, este proceso permite inducir la sensibilidad de

antibióticos no estudiados en el antibiograma y la corrección, en su caso,

de ficticias sensibilidades analizadas in vitro, como ocurre en el caso del

antibiograma de una enterobacteria con una BLEE, en el que no siempre

aparecen como resistentes todas las cefalosporinas, si bien, en la práctica

debe evitarse su uso. Asimismo, favorece el acondicionamiento del

tratamiento, el control de las políticas de antimicrobianos, la

descubrimiento de nuevos mecanismos de resistencia y el conocimiento

de su epidemiología.” 44

“Un requisito esencial para poder realizar una correcta lectura interpretada

es conocer la identificacion del microorganismo estudiado, tanto el género

como la especie, ya que sin ella el resultado puede llevar a errores en la

utilización de los antimicrobianos. Así, una cepa de S. aureus con CMI de

21

cloxacilina de 1 mg/l es sensible a cloxacilina y a todos los β-lactámicos,

mientras que si se trata de un estafilococo coagulasa negativa la CMI de 1

mg/l indica resistencia a cloxacilina.”42 “Otro requisito para poder realizar

correctamente la lectura interpretada del antibiograma es conocer el

fenotipo de sensibilidad de un microorganismo, ya que hay bacterias que

siempre son resistentes a determinados antibióticos y otras que siempre

son sensibles, y la desviación de estos patrones indica si el patrón del

antibiograma corresponde a un fenotipo habitual, raro o imposible.” 45 46

“Los fenotipos habituales son los aislamientos con mecanismos de

resistencia cuya presencia es epidemiológicamente normal en el medio

donde se realiza el antibiograma. Un ejemplo de ello son la resistencia a

penicilina y sensibilidad a cloxacilina en un aislado de S. aureus. Los

fenotipos raros son los que presentan resistencias poco habituales, bien

porque han sido recientemente caracterizadas o porque son muy poco

frecuentes en nuestro medio. Un ejemplo de los primeros es la resistencia

a imipenem en Enterobacter cloacae” 47, “y de los segundos las cepas de

enterococo resistentes a la vancomicina.” 48

“Finalmente, los fenotipos imposibles no responden a mecanismos de

resistencia conocidos y, por tanto, es necesaria su comprobación. Estos

fenotipos imposibles, en muchas ocasiones, representan un error en la

identificación del microorganismo o bien problemas técnicos en la

realización del antibiograma, pero también hay que tener en cuenta que la

repetición de estos fenotipos en bacterias correctamente identificadas

puede suponer un nuevo mecanismo de resistencia, tal es el caso de la

resistencia a linezolid en enterococos.”49

22

2.3. Hipótesis

2.3.1. Hipótesis principal

Dado que el cedrón, es utilizado como agente terapéutico en la medicina

tradicional y según estudios bibliográficos presenta en su composición

química taninos y flavonoides como eupatorina, apigenina, diosmetina, ,

es probable que, el extracto de hojas de dicha droga vegetal presente

efecto antimicrobiano del sobre cepas de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y Candida albicans.

2.3.2. Hipótesis secundarias

− Es posible que el extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau

presente flavonoides y taninos

− Es probable cuantificar fenoles totales en el extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau (Cedrón) por el método de Folin Ciocalteu

− Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y

la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC

25923


la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau sobre Escherichia coli ATCC 25922


la Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231

− Es probable que Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia

coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231 presenten

sensibilidad al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.

23

2.4.- Variables

2.4.1. Identificación de variables

− Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Aloysia

citriodora Palau.

− Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922

y Candida albicans ATCC 10231.

2.4.2. Definición conceptual de variables

− Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Aloysia

citriodora Palau.



y Candida albicans ATCC 10231.

Actividad antimicrobiana evaluada mediante la Concentración

Mínima Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima Bactericida (CMB),

Concentración Mínima Antimicótica (CMA) y sensibilidad por el

método de Antibiograma.

2.4.3. Definición operacional de variables

− Variable independiente: Extracto etanólico de Aloysia citriodora

Palau.

Gramos de extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau obtenido

por el método de extracción por Soxhlet.



y Candida albicans ATCC 10231

Actividad antimicrobiana evaluada por la determinación de la

Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima

Bactericida y por el método del antibiograma midiendo los halos de

inhibición.

24

Tabla 2. Variables

VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR

Variable Independiente

Extracto etanólico de hojas

de Aloysia citriodora Palau

(Cedrón)

Extracto etanólico de

hojas de Aloysia

citriodora Palau.

%

Variable Dependiente

Actividad antimicrobiana

sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC

25922 y Candida albicans

ATCC 10231

Concentración

inhibitoria mínima µL/Ml

Concentración

bactericida mínima µL/Ml

Sensibilidad

bacteriana

Halo de inhibición

(mm) medidos con un

vernier

Fuente: Elaboración propia

25

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. Tipo y nivel de investigación

3.1.1. Nivel de la investigación

Experimental

3.1.2. Tipo de investigación

Según manipulación de variables: Experimental

Según número de mediciones: Transversal

Según la temporalidad: Prospectivo

Enfoque: Cuantitativo

Por el propósito o finalidad: Aplicada

Paradigma: Positivista

3.1.3. Diseño de la investigación

Experimental

3.2. Descripción del ámbito de la investigación

3.2.1. Ubicación espacial

El presente trabajo se realizó en la región, provincia y

departamento de Arequipa, en la Universidad Privada Autónoma

del Sur.

3.2.2. Ubicación temporal

Universidad Privada Autónoma del Sur; periodo septiembre 2018 a

enero del 2019.

3.3. Población, muestra y muestreo

Muestreo: No probabilístico

26

3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos

3.4.1. Material biológico

− Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli

ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231

− Hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

3.4.2. Materiales

Insumos

• Agua destilada

Materiales de Laboratorio

• Asa de Kolle

• Gradilla para tubos

• Guantes

• Matraz

• Mechero

• Micropipeta de 1000 l

• Micropipeta de 100 l

• Papel filtro rápido

• Piceta

• Pinza

• Puntas para micropipeta azul (1000 l)

• Puntas para micropipeta amarillas (100 l)

• Termómetro

• Tubos de ensayo

Material de vidrio

• Beaker de 100 ml

• Probeta de 100 ml

• Frasco de tapa azul

• Embudo

Reactivos químicos

27

• Etanol de 96°

• Etanol de 70°

• Mix de antibióticos

• Suero fisiológico

• Idopovidona

• Ron de quemar

Medios de cultivo

• Agar Müeller Hinton (Merck)

• Agar Manitol Salado (Merck)

• Agar Sabouraud (Merck)

• Caldo peptonado (Merck)

Equipos de laboratorio

• Autoclave

• Balanza analítica

• Cocina eléctrica

• Equipo de Extracción Soxhlet

• Estufa

• Refrigerador

• Rota vapor

Otros materiales

• Aguja

• Algodón

• Bolsas Ziploc

• Cinta masking

• Fosforo

• Gasa

• Hilo

• Jeringa de 5 ml

• Marcador indeleble

• Pabilo

• Papel aluminio

28

• Papel kraft

• Pinzas metálicas

• Strech film

• Tijeras

• Vernier metálico

29

3.4.3. Recolección, almacenamiento e identificación hojas Aloysia

citriodora Palau

Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) recolectadas fueron

cubiertas con papel kraft para ser trasportadas a los laboratorios de la

Universidad Privada Autónoma del Sur ubicada en la ciudad de Arequipa,

donde fueron almacenadas en ausencia de luz, para luego ser

determinadas en el Herbarium Areqvipense, Departamento Académico de

Biología de la Universidad Nacional de San Agustín (Anexo 1).

Para el trabajo en el laboratorio, la muestra fue estabilizada a temperatura

ambiente de la siguiente manera: procedimos a limpiar y liberarlas de

polvo y cualquier otro contaminante, luego continuamos con el lavado con

abundante agua destilada 2 L para después sumergirlas por unos

segundos en etanol de 70° y luego sacarlas de esta manera poder

eliminar todo microorganismo que podrían descomponer el material

biológico y sus metabolitos secundarios a través de una degradación

enzimática. Finalmente dejamos secar la planta en un lugar con sombra,

bien aireada y exenta del polvo, sobre papel kraft encima de una mesa.

Figura 3. Hojas de Aloysia citriodora Palau


30

3.4.4. Obtención del extracto seco de Aloysia citriodora Palau

A. Obtención del extracto seco

“Para la obtención del extracto etanólico de Aloysia citriodora Palau se

pesaron 20 g de hojas trituradas para ser empaquetadas en un cartucho

de extracción y se llevaron a la cámara de extracción de un equipo

Soxhlet adaptado en el balón con 150 ml de etanol absoluto.”50

B. Identificación de Taninos

Los taninos fueron identificados con cloruro férrico al 5%: Resultando

positivo cuando se examina un cambio como sigue a continuación:

Interpretación

− Taninos hidrolizables o gálicos: Dan coloración azul negruzco

− Taninos condesados: Dan coloración verde a marrón

C. Identificación de Flavonoides

“La identificación de flavonoides fue realizada por la prueba de Shinoda

que se basa en la oxidación del magnesio en medio ácido. El hidrogeno

liberado produce por perdida el ion flavilio de color rojo escarlata que

varía de un rosa pálido hasta escarlata.”52

Figura 4. “Reacción química en la prueba de Shinoda”

En un tubo de ensayo se colocó una cantidad adecuada de extracto para

luego agregar etanol en presencia de magnesio metálico y dos gotas

ácido clorhídrico concentrado.

31

Interpretación

− La coloración de naranja al rojo indica la presencia de flavonas

− La coloración rojo carmesí, purpura y azul indican presencia de

flavononas

− El color amarillo pálido o incoloro indica presencia de flavonas y

flavonoles

− Una coloración de amarillo rojizo indica presencia de isoflavonas.

D. Determinación de fenoles totales

“La determinación de polifenoles totales se llevó a cabo utilizando el

método utilizado por Singleton, Orthofer y Lamuela-Raventos, cuyo

reactivo está compuesto por una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y

fosfomolíbdico en medio básico, los que sufren disminucion al oxidar los

compuestos fenólicos, originando un complejo wolframio-molibdeno de

color azul cuya absorbancia es dependiente de la concentración de los

polifenoles de la muestra y se midió en un espectrofotómetro a 725 nm.

Los resultados se expresan como mg equivalentes de ácido gálico/100 g

de muestra.”52

Procedimiento

En fiolas de 10 mL se preparará una curva de calibración adicionando

concentraciones de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µL de ácido gálico luego se

adicionaron 4 mL de agua destilada, posteriormente de agregaron 0,25

mL del reactivo de Folin Ciocalteu y finalmente 2 mL de carbonato de

calcio al 20 % y se dejó reaccionar 2 horas en la oscuridad. Luego de las

2 horas se leyeron en el espectrofotómetro a 725 nm.

En cuanto a la muestra 0,2 mL fueron medidos en una fiola de 10 mL y se

desarrolló de la misma forma que el ácido gálico.

3.4.5. Escala de Mc Farland

“Fue preparada mediante la formación de un precipitado de sulfato de

bario (BaSO4) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (BaCl2) al

1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36 N).” 51

32

3.4.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana

A. Reactivación de las cepas

Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus

ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 fueron adquiridas de

KwikStik y almacenadas para su conservación en un intervalo de

temperaturas entre 2 a 8°C.

Figura 5. Cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus

aureus ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 adquiridas de

KwikStik


Luego para la activación de las cepas de Escherichia coli ATCC 25922 se

sembró el contenido del vial en agar Müeller Hinton y Staphylococcus

aureus ATCC 25923 en Agar Manitol Salado para luego ser incubados a

37 °C por 24 horas, en cambio la cepa de Candida albicans ATCC 10231

se sembró el contenido del vial en agar Sabouraud y fue incubado a 37 °C

por 48 horas.

33

B. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

“Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria se

acondiciono una solución madre de 500 mg/ml del extracto seco en

etanol.”51

“Posteriormente, el inoculo con una concentración de 108 UFC/ml fue

preparado tomando con un asa de kolle estéril una cantidad adecuada de

colonias para luego sumergir el asa de kolle en 5 ml del caldo peptonado,

hasta obtener una turbidez del medio similar a la del tubo N°5 de la escala

de Mac Farland, la cual corresponde, a una concentración de 15x108

UFC/ml. Se Incubará a 37°C por 24 horas.” 51

“Luego se procedió a realizar una dilución de 1:100 del inoculo ya

preparado para obtener una solución de 106 UFC /ml.”53 Las diluciones se

observan a continuación en la Tabla 3.

Finalmente, se prepararon diluciones a estudiar cómo se observa en la

Tabla 3, donde se presentan las concentraciones de 25, 12,5, 6,25,

1,562, 0,781, 0,39, 0,195 de extracto que fueron puestas en contacto con

el inóculo preparado para luego observar la turbidez en un tiempo de 24 a

48 horas.

Tabla 3. Determinación de CMI por microdilución en caldo peptonado

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+)

T10 (-)

SOLUCIÓN MADRE (500 mg/mL) 100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500

CALDO PEPTONADO (μL) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _

CONCENTRACIÓN INICIAL 50 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,78 0,39 _

INÓCULO (μL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _

VOLUMEN FINAL (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,5

CONCENTRACIÓN FINAL (μL/mL) 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 _ 500


34

C. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

“De los tubos estudiados en la tabla precedente se sembró un volumen de

50 µL en agar Manitol Salado, Müeller Hinton y Sabouraud para S.

aureus, E. coli y C. albicans respectivamente, incubando de 24 a 48 horas

para luego evaluar el crecimiento.” 53

D. Determinación de la sensibilidad antimicrobiana

“El principio básico de este método consiste en que el disco este

empapado con el extracto para luego poner en contacto con la placa de

microorganismos a evaluar, El resultado es una zona de inhibición del

desarrollo con borde delineado (halo de inhibición); los cuales se

expresan como sensible (S), intermedio (I), y resistente (R). Siendo entre

30 y 35 mm altamente sensible, de 20 a 30 mm sensibles, de 15 a 20

intermedio y menores a 15 mm resistentes.” 51

“Se elaboraron discos de papel filtro de 6 mm de diámetro, los cuales

fueron esterilizados en la autoclave por 15 minutos a 121°C,

posteriormente fueron almacenados en un frasco previamente

esterilizado, posteriormente con la ayuda de una micropipeta los discos

serán empapado con las diferentes concentraciones del extracto.” 51

3.4.7. Análisis de datos

Para la presente investigación se utilizó el software Microsoft Excel y

Minitab 16 para la comparación de grupos utilizando la técnica de análisis

de varianza (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

35

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1. Recolección y determinación taxonómica

Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) recolectadas fueron

identificadas en el Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional

de San Agustín de Arequipa, identificándose como Aloysia citriodora Palau

(Cedrón). Los resultados de la identificación son detallados a continuación en la

Tabla 4. (Anexo 1)

Tabla 4. Identificación y tipificación de hojas de cedrón recolectadas

Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San

Agustín de Arequipa

4.2. Rendimiento de la extracción etanólico


Categoría Taxonómica Descripción

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsidae

Subclase Asteridae

Orden Lamiales

Familia Verbenaceae

Género Aloysia

Especie Aloysia citriodora Palau

Extracto Rendimiento

Extracto seco 1 21,6105

Extracto seco 2 20,7245

Extracto fluido 3 20ml

36

4.3. Extracto etanólico de hojas Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

Los extractos fueron obtenidos por el método de extracción por Soxhlet usando

20 gramos de hojas pulverizadas de Aloysia citriodora Palau. (Ver Figura 6).

Figura 6. Extracción por Soxhlet


Posteriormente se concentraron los extractos usando un rotaevaporador a

70°C hasta obtener aproximadamente 20 mL del extracto fluido (Figura 7).

Figura 7. Rotaevaporador


37

4.4. Identificación de taninos

Figura 8. Identificación de taninos condensados en Aloysia citriodora

Palau


En la Figura 8 se observa el tubo de la izquierda que corresponde al blanco con

cloruro férrico al 5 %, el tubo del medio al extracto sin tratamiento y finalmente

el tubo del extremo derecho corresponde a la reacción de identificación de

taninos dando una coloración marrón lo cual indica la presencia de taninos

condensados (Figura 8).

4.5. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda

La identificación de flavonoides realizada mediante la prueba de Shinoda, dio

como resultado la aparición de un color rojizo a azul tenue (Figura 9).

Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavanonas en

Aloysia citriodora Palau


38

4.6. Cuantificación de fenoles totales

En la Tabla 5 se observan los datos de la curva de calibración donde las

absorbancias promedio para concentraciones de ácidos gálico de 1, 2, 3, 4, 5, y

6 mg/L (ppm) son 0,125, 0,275, 0,422, 0,578, 0,718 y 0,887 respectivamente.

Tabla 5. Valores del gráfico de calibración de concentración de ácido

gálico vs absorbancia promedio

Concentración de ácido gálico

(ppm) Absorbancia 725 nm

1 0,125

2 0,275

3 0,422

4 0,578

5 0,718

6 0,887

Fuente. Elaboración Propia

Posteriormente, en la Figura 10 se calculó el coeficiente de regresión lineal R2

de 0,9996 que indica que el método es lineal al ser superior a 0,995.

1 2 3 4 5 6

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Absorb

ancia

Concentración (ppm)

y = 0.1513 x - 0.0287

R2 = 0.9996

Figura 10. Gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles totales

por el método de Folin Ciocalteu a una longitud de onda de 725nm


39

En la Tabla 6 se observa la concentración de fenoles totales por el método

Folin Ciocalteu donde se observa que el extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau presento una concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg

equivalentes a ácido gálico (GAE).

Tabla 6. Concentración de fenoles totales equivalente en ácido gálico por gramos de extracto

N Extracto (g) Absorbancia 725 nm mg GAE/g

1 0,4 0,4208 51,12

2 0,4 0,4042 49,23

3 0,4 0,4192 50,94

�̅� 50,43

S 1,041

DSR (%) 2,070

*�̅�= Promedio, s= Desviación estándar, DSR= Desviación estándar relativa,

GAE= equivalente a ácido gálico


4.7. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922

4.7.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau

frente a Escherichia coli ATCC 25922

La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó por el método de

microdilución en caldo evaluando concentraciones finales de 0,195, 0,390,

0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 µL/mL de extracto de Aloysia citriodora

Palau.

Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con 900

µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se

adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC/mL lográndose una

concentración final de 25 mg/mL (2,5 %) de extracto.

Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le

adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al

40

tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL

lográndose una concentración final de 12,5 mg/mL (1,25 %) de extracto.



tubo 4, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL









lográndose una concentración final 1,562 mg/mL (0,16 %) de extracto.










adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta solución

se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una

concentración final 0,195 mg/mL (0,02 %) de extracto.

El tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de caldo peptonado

con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro lado, el tubo 10 se

tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL de solución madre

(500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 24 horas a 37 °C.

41


(CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922

En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de

incubación, encontrándose que en todos los tubos se encontró crecimiento de

Escherichia coli ATCC 25922 interpretándose que el extracto no presenta

actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922 hasta una

concentración máxima de 25 mg /mL por el método de micro dilución en caldo.

42

Tabla 7. Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922

DESCRIPCIÓN

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500

CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04 0,02 0 50

Escherichia coli ATCC 25922 ENSAYO 1 + + + + + + + + + -



*(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo


43


frente a Escherichia coli ATCC 25922

La concentración mínima bactericida (CMB) realizada por el método de siembra

en placas con agar Müeller Hinton de los tubos del 1 al 5 con el fin evaluar el

crecimiento bacteriano.

Figura 12. Siembra en placa (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a

Escherichia coli ATCC 2592

En la Tabla 7 y Figura 12 se evidencia que en todas las placas existe

crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922.

Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922

DESCRIPCIÓN

PLACAS

T1 T2 T3 T4 T5

CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562

CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16

Escherichia coli ENSAYO 1 + + + + +




44

4.7.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de

hojas de Aloysia citriodora Palau en Escherichia coli ATCC 25922

comparada con ciprofloxacino

Se determinó la sensibilidad antimicrobiana de concentraciones de 0,31, 0,63,

1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto por el método de dilución

en discos en placas con agar Müeller Hinton (Figura 13).

Figura 13. Sensibilidad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau frente a

Escherichia coli ATCC 25922

Los halos de inhibición correspondiente a los ensayos por el método de dilución

en discos fueron desarrollados por triplicado a las concentraciones ya

indicadas, además se evaluó un disco con etanol y otro con ciprofloxacino. Los

resultados se observan en la Tabla 9 donde se presentan los ensayos por

triplicado con halos de inhibición en mm de cada concentración.

45

Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.

Concentración Halos de inhibición (mm)

(%) E1 E2 E3 Promedio

100 14,3 9,2 9,2 10,9

80 7,2 7,3 7,5 7,3

60 7,0 7,7 7,2 7,3

40 7,0 6,5 6,0 6,5

20 6,9 6,3 6,3 6,5

10 6,9 6,2 6,4 6,5

5 6,6 6,7 6,8 6,7

2,50 6,5 6,5 6,3 6,4

1,25 6,2 6,1 6,0 6,1

0,63 6,1 6,5 6,4 6,3

0,31 6,1 6,0 6,1 6,1

Etanol 96° 0,0 0,0 0,0 0,0

Ciprofloxacino 0,3% 44,1 44,2 44,5 44,3

Fuente. Elaboración propia

El disco impregnado con etanol no presentó halo de inhibición por lo que no

presenta actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922. Sin

embargo, a partir de una concentración de 80 % se puede observar halos de

inhibición desde de 7,33 a 10,90 mm de diámetro. Ciprofloxacino mostró halos

46

de inhibición de aproximadamente 44,3 mm en promedio. Por otro lado, para

poder comparar la sensibilidad bacteriana de las diversas concentraciones del

extracto de Aloysia citriodora Palau, etanol y ciprofloxacino frente a Escherichia

coli ATCC 25922 se procedió a realizar un análisis de varianza, obteniendo

como resultado que el valor crítico para F es menor al valor de F experimental

(Fc:2,4<Fexp:501,11), por la cual, se concluye que al menos un grupo es

diferente al 95 % de confianza (Tabla 10).

Tabla 10. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados

F Probabili

dad

Valor crítico para F

Entre

grupos 4162,74

12 364,89

477,3

8

2,74x10-

27 2,14

Dentro de

los grupos 18,89

26 0,726

Total 4181,63 38

* Fc:2,14<Fexp: 477,38; p<0,05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)

Para poder evaluar que grupos son iguales en cuanto a la sensibilidad

bacteriana y que grupos son diferentes se aplicó un test de Tukey como se

observa en la Tabla 11.

Por otro lado, la sensibilidad de la concentración del 100 % difiere de todas las

concentraciones estudiadas, sin embargo, existe diferencia significativa entre

los halos de inhibición generados por las concentraciones de 0,31, 0,63, 1,25,

2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 % del extracto.

47

Tabla 11. Test de Tukey de la compasión de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.

FACTOR N PROMEDIO GRUPO

Ciprofloxacino 0.3% 3 44,3 A

100,00% 3 10,9 B

80,00% 3 7,3 C

60,00% 3 7,3 C

40,00 % 3 6,5 C

20,00% 3 6,5 C

10,00% 3 6,5 C

5,00% 3 6,7 C

2,50% 3 6,4 C

1,25% 3 6,1 C

0,63% 3 6,3 C

0,31% 3 6,1 C

Etanol 96° 3 0,0 D

Fuente. Elaboración propia adaptado de Minitab 17

En la Figura 13 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente a

los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de

las diversas concentraciones de extracto seco de hojas de Aloysia citriodora

Palau, etanol y ciprofloxacino ensayados frente a Escherichia coli ATCC 25922,

dando como resultado que ninguna concentración de extracto se iguala a la

potencia antibacteriana del ciprofloxacino.

48

Figura 14. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto

de hojas de Aloysia citriodora Palau.

Cipro

floxa

cino

Etano

l

0.31%

0.63

%

1.25%

2.50

%

5.00

%

10.0

0%

20.0

0%

40.00%

60.00%

80.00

%10

0%

50

40

30

20

10

0

Halo

de i

nh

ibic

ión

49

4.8. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.


frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.



0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 mg/mL de extracto de Aloysia citriodora

Palau.


µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2, se

adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una


















50













Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de

caldo peptonado con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro

lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL

de solución madre (500 mg/mL) de extracto con 500 L de suero fisiológico. Se

dejó incubar por 24 horas a 37 °C.


(CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC

25923

51

En la Tabla 12 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de

incubación, encontrándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2 y 3, en

cambio en el tubo 4 si existe crecimiento debido a la presencia de turbidez

correspondiendo como punto de corte y como Concentración Mínima Inhibitoria

a la concentración de 6,25 mg/mL (0,63 %) de extracto que corresponde al

tubo 3.

52

Tabla 12. Resultados de la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

DESCRIPCIÓN

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500


Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + + + + + + -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + + + + + + -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + + + + + + -



53


frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

Para la determinación de Concentración Mínima Bactericida (CMB) se

sembraron en placas de agar Manitol Salado los tubos del 1 al 5 con el fin

evaluar el crecimiento bacteriano como se observa en la Figura 15.

Figura 16. Siembra en placa para determinar la (CMB) de Aloysia

citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

En la Tabla 13 y Figura 16 se evidencia que en las placas 1,2 y 3

correspondientes a los tubos 1,2 y 3 de la prueba de CMI no existe crecimiento

a diferencia de las placas 4 y 5 que si presentaron crecimiento de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 por lo que la Concentración Mínima

Bactericida es de 6.25 µL/mL equivalente al 0.63 % de extracto de hojas de

Aloysia citriodora Palau.

Tabla 13. Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

DESCRIPCIÓN PLACAS

T1 T2 T3 T4 T5

CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562


Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + +

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + +

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + +



54


hojas Aloysia citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923

comparada con ceftriaxona y ampicilina

Para la determinación de la sensibilidad antimicrobiana se utilizó el método de

dilución en discos en placas con agar Manitol Salado. Las concentraciones

evaluadas fueron de (100,00, 80,00, 60,00, 40,00, 20,00, 10,00, 5,00, 2,50,

1,25, 0,63 y 0,31) % de extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau en discos.

Figura 17. Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 frente a

Ceftriaxona

En la Tabla 14 se observan los halos de inhibición correspondiente a los

ensayos por el método de dilución en discos los cuales fueron desarrollados

por triplicado a las concentraciones ya indicadas, además se evaluó un disco

con etanol, ceftriaxona y ampicilina.

55

Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau.



100% 15,1 18,1 16,1 16,43

80% 14,1 13,5 14,95 14,18

60% 13,15 10,25 11,14 11,51

40% 12,85 10,2 10,2 11,08

20% 11,8 10,1 11,1 11,00

10% 11,2 10,3 9,45 10,32

5% 10,2 10,1 8,9 9,73

2.50% 10,1 10,2 10,9 10,40

1.25% 9,3 9,3 9,2 9,27

0.63% 8,5 8,2 8,8 8,50

0.31% 7,2 7,1 7,5 7,27

Etanol 96° 0 0 0 0,00

Ampicilina 1g 19,45 18 20 19,15

Ceftriaxona 1g 21,55 19 20 20,18


No se encontraron halos de inhibición en los discos impregnados con etanol,

por otro lado, se obtuvieron halos de inhibición entre 7,27 a 16,43 mm en el

rango de concentraciones de 0,31 al 100 % y realizando el análisis estadístico

mediante un análisis de varianza, se obtuvo que, el valor crítico para F es

menor al valor de F experimental (Fc:2,09<Fexp:88,88) y la probabilidad es

56

menor a 0,05 razón por la cual se concluye que al menos un grupo es diferente

al 95 % de confianza.

Tabla 15. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau

Origen de las variaciones

Suma de cuadrado

s GL

Promedio de los

cuadrados F

Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 1006,49 13 77,42 88,88 4,46 x10-19 2,09

Dentro de los

grupos 24,95 28 0,89

Total 1031,44 41

* Fc:2.09<Fexp:165.47; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)

Para poder evaluar que grupos son iguales en cuanto a la sensibilidad

bacteriana y que grupos son diferentes se aplicó un test de Tukey.

En la Tabla 16 se evidencia que al 95 % de confianza:

− No hay diferencia significativa entre los halos de inhibición de ceftriaxona y

ampicilina

− No hay diferencia significativa entre los halos de inhibición obtenidos con

Ampicilina y la concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora

Palau

− No hay diferencia significativa en cuanto a los halos de inhibición obtenidos

con 80 a 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau.

57

Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau


Ceftriaxona 1g 3 20,183 A

Ampicilina 3 19,150 A B

100,00% 3 16,433 B C

80,00% 3 14,183 C D

60,00% 3 11,513 D E

40,00% 3 11,083 E F

20,00% 3 11,000 E F

10,00% 3 10,400 E F G

5,00% 3 10,317 E F G

2,50% 3 9,733 E F G

1,25% 3 9,2667 E F G

0,63% 3 8,500 F G

0,31% 3 7,267 G

Etanol 96° 3 0,000 H

Fuente: Elaboración propia adaptado de MINITAB 16

En la Figura 18 se observa el gráfico de cajas y bigotes donde se observa que

el extracto al 100 % presenta valores semejantes a la ampicilina. Finalmente, el

Staphylococcus aureus ATCC 25923 es sensible a la concentración de 100 % y

resistente a las demás concentraciones de extractos estudiadas.

58

Figura 18. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de

Aloysia citriodora Palau

Ceftr

iaxo

na

Ampici

l ina

Etan

ol

0.31%

0.63

%

1.25%

2.50

%

5.00

%

10.0

0%

20.0

0%

40.0

0%

60.0

0%

80.0

0%

100.0

0%

20

15

10

5

0

Hal

o d

e in

hib

ició

n (

mm

)

59

4.9. Evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau

frente a Candida albicans ATCC 10231.


frente a Cepas de Candida albicans ATCC 10231



0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 µL/mL de extracto de Aloysia citriodora

Palau.


µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se

adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una


















60













Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de

caldo peptonado con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro

lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL

de solución madre (500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 48 horas a 37

°C.


(CM) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231

En la Tabla 17 se observan los resultados obtenido luego de las 48 horas de

incubación, hallando presencia de turbidez en todos los tubos.

61

Tabla 17. Resultados de la determinación de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231

Descripción

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500


Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 + + + + + + + + + -



*(+) crecimiento microbiano positivo; (-) crecimiento microbiano negativo

62

4.9.2 Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora

Palau frente a Candida albicans ATCC 10231

La Concentración Mínima Antimicótica (CMA) fue realizada por el método de

siembra en placa a partir de los tubos del ensayo de CMI, por lo cual, se

sembraron en agar Sabouraud los tubos del 1 al 5 con el fin de evaluar el

crecimiento fúngico.

Figura 20. Siembra en placa (CMA) de Aloysia citriodora Palau frente a

Candida albicans ATCC 10231

En la Tabla 18 se presentan los resultados los cuales mostraron crecimiento de

Candida albicans en todas las placas, mostrando que el extracto no presenta

actividad antimicótica por el método de microdilución en caldo y su posterior

estudio en placa.

Tabla 18. Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231

DESCRIPCIÓN PLACAS

T1 T2 T3 T4 T5

CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6.25 3,125 1,562


Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 + + + + +



*(+) crecimiento microbiano positivo; (-) crecimiento microbiano negativo

63


hojas de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231

comparada con clotrimazol 1 %.

Se determinó la sensibilidad microbiana de Candida albicans ATCC 10231 a

concentraciones de 0,31, 0,63, 1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de

extracto por el método de dilución en discos en placas con agar Sabouraud

(Figura 21).

Figura 21. Sensibilidad antimicrobiana al extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 comparada con

clotrimazol 1 %.

En la Tabla 19 se observan los halos de inhibición correspondiente a los

ensayos por el método de dilución en discos los cuales fueron desarrollados

por triplicado a las concentraciones ya indicadas, además se evaluó un disco

con etanol y otro con clotrimazol al 1%.

64

Tabla 19. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau



100% 10,5 10,5 10,5 10,50

80% 6,1 6,1 6,0 6,07

60% 6,0 6,2 6,0 6,07

40% 6,0 6,0 6,0 6,00

20% 6,0 6,0 6,0 6,00

10% 6,0 6,0 6,0 6,00

5% 6,0 6,0 6,0 6,00

2.50% 6,0 6,0 6,0 6,00

1.25% 6,0 6,0 6,0 6,00

0.63% 6,0 6,0 6,0 6,00

0.31% 6,0 6,0 6,0 6,00

Etanol 96° 0,0 0,0 0,0 0,00

Clotrimazol 1% 29,0 27,0 27,0 27,67


65

En la Tabla 19 se observa que en cuanto a los halos de inhibición obtenidos de

las concentraciones de 0,31% hasta el 80% presentan valores promedio de

6,07 mm, por lo que los extractos a esas concentraciones no tienen efecto

antimicótico, sin embargo, el extracto al 100% presenta un tamaño de halo de

10,5 mm de diámetro demostrando así que, si existe efecto antimicótico, a

dicha concentración, finalmente el clotrimazol 1% (control positivo) también

presenta efecto antimicótico. Por otro lado, se procedió a realizar un análisis de

varianza, obteniendo como resultado que el valor crítico para F es menor al

valor de F experimental (Fc: 2,14<Fexp: 1189,27) y la probabilidad es menor a

0,05 razón por la cual se concluye que al menos un grupo es diferente al 95 %

de confianza (Tabla 20).

Tabla 20. Análisis de varianza de la prueba de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados GL

Promedio

de los

cuadrados

F Probabilidad

Valor

crítico

para F

Entre grupos 1482,01 12 123,50 1189,27 2,02x10-32 2,14

Dentro de los grupos

2,7 26 0,104

Total 1484,71 38

* Fc:2,14<Fexp: 1189,27; p<0,05: (al menos un grupo difiere al 95 % de

confianza)

Para poder evaluar que grupos son iguales o diferentes en cuanto a la

sensibilidad microbiana se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla

21.

66

Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Candida

albicans ATCC 10231 frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau


Clotrimazol 1% 3 27,667 A

100.00% 3 10,50 B

80.00% 3 6,067 C

60.00% 3 6,067 C

40.00 % 3 6,000 C

20.00% 3 6,000 C

10.00% 3 6,000 C

5.00% 3 6,000 C

2.50% 3 6,000 C

1.25% 3 6,000 C

0.63% 3 6,000 C

0.31% 3 6,000 C

Etanol 96° 3 0,000 D

Fuente: Minitab 17

En la Figura 22 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente a

los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad

antimicrobiana de las diversas concentraciones de extracto seco de hojas de

Aloysia citriodora Palau, etanol y clotrimazol 1% ensayados frente a Candida

67

albicans ATCC 10231, dando como resultado que ninguna concentración de

extracto se iguala a la potencia antimicótico del clotrimazol 1%.

Por otro lado, la sensibilidad de la concentración del 100 % difiere de todas las

concentraciones estudiadas, sin embargo, no existe diferencia significativa

entre los halos de inhibición generados por las concentraciones de 0,31, 0,63,

1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 % del extracto.

Finalmente, Candida albicans ATCC 10231, resulto resistente a todas las

concentraciones de extracto evaluadas.

68

Figura 22. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 a concentraciones del

extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau .

Clotrim

azol

Etano

l

0.31%

0.63

%

1.25%

2.50

%

5.00

%

10.0

0%

30.0

0%

50.00%

70.00%

80.00

%10

0%

30

25

20

15

10

5

0

Halo

de i

nh

ibic

ión

(m

m)

69

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN

“La información etnofarmacológica refiere diversos usos de la Aloysia

triphylla (cedrón) en la medicina popular; la ingesta por vía oral de la

infusión o decocción de las partes aéreas de esta planta se utiliza en

Sudamérica como antiespasmódico, tranquilizante, calmante nervioso,

expectorante y estomacal; además de este uso, en Bolivia se utiliza

también para la hipertensión arterial; en Ecuador para tratar fiebre, dolor

de cabeza y como diurético. En Asia también se utiliza tradicionalmente

para tratar espasmos gastrointestinales, resfrío común y como sedativo.”

54

“Los taninos son compuestos polifenólicos, más o menos complejos, de

origen vegetal, masa molecular relativamente elevada y sabor

astringente, se trata de compuestos hidrosolubles, dando a veces

disoluciones coloidales en agua, solubles también en alcohol y en

acetona e insolubles en disolventes orgánicos apolares. Dentro de los

vegetales los taninos suelen encontrarse en las vacuolas celulares,

combinados con alcaloides, proteínas u osas.”11

“Tras el análisis fitoquímico del extracto etanólico de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón), se logró la identificación de taninos

condensados (coloración marrón), el cual, según kuklinski se conocen

también como no hidrolizables, ya que se hidrolizan con dificultad y por

el contrario, el tratamiento con calor y ácidos minerales origina polímeros

de alto peso molecular (flobáfenos). Además, Este tipo de taninos se

producen en el metabolismo normal de los vegetales por lo que se

consideran fisiológicos y se encuentran ampliamente repartidos en el

reino vegetal.”31

“La aparición de un color rojo a azul tenue tras la prueba de Shinoda

para la identificación de flavonoides, indica que el extracto etanólico de

hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) presenta este metabolito

70

secundario, además, algunas investigaciones indican que varios tipos de

flavonoides son conocidos por conferir resistencia frente al ataque de

microorganismos 55 y que la mayor inhibición en el desarrollo bacteriano

de Escherichia coli la presentaron las flavanonas, estructuras que no

poseen un doble enlace entre C-2 y C-3.” 55

“Por otro lado, el extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau presenta

una concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg equivalentes a

ácido gálico (GAE), estos metabolitos secundarios son de gran

importancia ya que durante el estudio realizado con tinturas de las hojas

de cedrón, en la década de los años 90, Balbuena planteó que los

flavonoides, producto de su estructura, podrían ser los responsables del

efecto de inhibición de crecimiento bacteriano por la inducción de la

ruptura de su DNA en un sitio determinado; por bloqueo del complejo

aminoacil transferasa, por intercalación entre bases de DNA alterando la

síntesis de ácido nucleico o por la formación de dímeros de timina.” 56

“También consideró que otros mecanismos provocados por los

flavonoides pudieran propiciar resultados semejantes, alterando la

composición de las membranas y el metabolismo celular por medio de

inhibición de la fosforilación de proteínas o por la formación de

complejos con proteínas solubles de la pared de las células bacterianas.”

56

“Sin embargo, años después, Domingo y López-Brea. Plantearon que la

actividad de las flavonas frente a los microorganismos probablemente se

debe a que forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares

y con las células de la pared bacteriana, de forma similar a las quinonas,

lo que refuerza el efecto observado y resulta concordante con alguna de

las especulaciones realizadas en relación con el posible mecanismo de

acción.” 56 57

“En cuanto a la evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia

citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus

71

aureus ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231, Estudios

científicos han demostrado importantes propiedades antimicrobianas de

A. triphylla. y reportan que el extracto acetónico de las partes aéreas

evidenció significativa actividad contra Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris” 54, en

tal sentido, tras el análisis de la concentración inhibitoria mínima CIM

determinado por el método de microdilución en caldo, el extracto de

Aloysia citriodora Palau (Cedrón).

No presenta actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC

25922 hasta una concentración máxima de 25 mg/mL, en relación a la

Concentración Mínima Bactericida realizada por el método de siembra

en placa con agar Müeller Hinton se evidencia que en todas las placas

existe crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 por lo cual, se puede

mencionar que el extracto de Cedrón no tiene efecto bactericida y

finalmente, en relación a la determinación de la sensibilidad por el

método de disco difusión, se observó que a partir de una concentración

de 80 % hasta el 100% se puede observar halos de inhibición desde de

7,3 a 10,90 mm de diámetro, el Ciprofloxacino mostró halos de inhibición

de aproximadamente 44,3mm en promedio, además ninguna

concentración de extracto se iguala a la potencia antibacteriana del

ciprofloxacino (control positivo), dichos resultados guardan relación con

“el trabajo de investigación titulado efecto antibacteriano in vitro del

aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la Región

Cajamarca, frente a las bacterias patógenas Escherichia coli ATCC

25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 en cuyos resultados se

concluye que el aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P.

“cedrón” tiene efecto antibacteriano sobre las cepas de Staphylococcus

aureus, pero no contra Escherichia coli .”18

En cuanto a la evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia

citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, tras el

análisis de la concentración mínima inhibitoria CMI determinado por el

método de microdilución en caldo se observó que no existe turbidez en

72

los tubos 1, 2 y 3, en cambio en el tubo 4 si existe crecimiento debido a

la presencia de turbidez correspondiendo como punto de corte y como

Concentración Mínima Inhibitoria a la concentración de 6,25 mg/mL

(0,63 %), en relación a la concentración mínima bactericida CMB, esta

es de 6,25 µL/ mL equivalente al 0,63 % de extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau, en relación a la determinación de la sensibilidad por el

método de disco difusión se observa que se obtuvieron halos de

inhibición entre 7,27mm a 16,43 mm en el rango de concentraciones de

0,31 al 100 %. Además, no hubo diferencia significativa entre los halos

de inhibición obtenidos con Ampicilina (Control positivo) y la

concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau.

En cuanto a la evaluación de la actividad antimicótica de Aloysia

citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231, Tras el análisis

de la concentración mínima inhibitoria CMI determinado por el método

de microdilución en caldo, el extracto no presenta actividad antimicótica

frente a Candida albicans ATCC 10231 hasta una concentración máxima

de 25 mg /mL por el método de micro dilución en caldo, en cuanto a los

halos de inhibición obtenidos de las concentraciones de 0,31% hasta el

80% presentan valores promedio de 6 mm, por lo que los extractos a

esas concentraciones no tienen efecto antimicótico, sin embargo el

extracto al 100% presenta un tamaño de halo de 10,5 mm de diámetro

demostrando así que si existe efecto antimicótico , a dicha

concentración, finalmente el clotrimazol 1% (control positivo) también

presenta efecto antimicótico. Este efecto antimicótico a una

concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau puede

ser explicada y guarda relación con el trabajo de investigación realizado

por “Oliva”58 “de quien determinó la actividad antimicrobiana y el efecto

sobre la estructura celular del aceite esencial de Aloysia triphylla contra

Candida sp aislada de enfermedades humanas, en dicho trabajo Oliva

reportó que los aceites esenciales de Aloysia triphylla mostraron

actividad antifúngica contra todas las levaduras: C. albicans, C.

dubliniensis, C. glabrata, C. krusei, C. guillermondii, C. parapsilosis y C.

tropicalis que eran resistentes al fluconazol (150 mg / ml).” “El rango de

73

valores de MIC reportado fue de: 35 a 140 ug/mL y MFC: 1842 a 2300

ug/mL. El tiempo de muerte en el MFC contra C. albicans (3 x 10 (5)

UFC/mL) fue de 140.”58

“Oliva”58 “menciona que los resultados del estudio demuestran

claramente que A. triphylla es una alternativa prometedora para el

tratamiento de la candidiasis y nuestros resultados a las concentraciones

indicarían lo mismo.” 58

Finalmente todos los resultados antes mencionados del uso del extracto

etanólico de Aloysia citriodora Palau (cedrón) , se puede deber a que

“Ramirez y colaboradores en su trabajo de investigación reportaron que

los principales componentes de Aloysia citriodora Palau (Cedron) son

neral, geranial, limoneno, espatulenol, y variaciones intrínsecas en la

cantidad y calidad del resto de terpenos como α-tujeno, α-pineno,

camfeno, mirceno, p-cimeno, γ-terpineno, linalol, camferol,

dihidrolinalool, citronelol, mentona, isoborneol, α-terpineol, carvona,

etc.”59

“Además, según el componente principal en relación al origen de la

planta, se han identificado cinco quimiotipos: I, mircenona (37%) y α-

tujona (17%); II, α-tujona (23%) y cis-carveol (18%), ambos en Argentina;

III, 1,8-cineol (12%) y geranial (10%), en Marruecos; IV, limoneno (37%),

geranial (14%) y neral (11%), en Turquía; V, neral (10%) y geranial

(40%), es el más abundante en el mundo y se encuentra principalmente

en Colombia, Chile, Brasil, Eslovenia, Portugal, Francia y Grecia” 54, “por

otro lado, los resultados del estudio de RMN de 1H ,mostraron que tanto

en el extracto acuoso como en acetato de etilo de las hojas de cedrón,

se encuentran presentes los compuestos citral, neral y limoneno los

cuales podrían tener efecto antimicrobiano.” 59

74

CONCLUSIONES

PRIMERO: Se logró identificar flavonoides y taninos el extracto de hojas

de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) tras la visualización de

un color rojo a azul tenue a la prueba de Shinoda y una

coloración marrón para taninos condensados

respectivamente.

SEGUNDO: Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) presenta una

concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg

equivalentes a ácido gálico (GAE) por el método de Folin

Ciocalteu.

TERCERO: La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de

hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de 6,25 mg/mL

equivalente a una concentración final de 0,63 % en relación

a La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto

de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de 6,25 µl/ml

equivalente a una concentración final de 0,63%

CUARTO: No se logró determinar la concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau

(Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922 debido que a

las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no

tuvo efecto inhibitorio ,del mismo modo no se logró

determinar la determinar la Concentración Mínima

Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora

Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922 debido

que a las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto

no tuvo efecto Bactericida.

QUINTO: No se logró determinar la concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau

(Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231 debido que a

las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no

tuvo efecto inhibitorio, del mismo modo no se logró

determinar la determinar la Concentración Mínima

75

Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC

10231 debido que a las concentraciones a las cuales se

trabajó, el extracto no tuvo efecto antimicótico.

SEXTO: La sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus

ATCC 25923 se produjo a las concentraciones de 0,31 al

100 %, para el caso de Escherichia coli ATCC 25922 la

sensibilidad fue a las concentraciones de 100% y para

Candida albicans ATCC 10231 la sensibilidad ocurrió a una

concentración del 100% del extracto etanólico de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón).

76

SUGERENCIAS

PRIMERO: Realizar estudios de la sensibilidad antibacteriana de Aloysia

citriodora Palau (Cedrón) frente a otro tipo de bacterias y/o

hongos.

SEGUNDO: Realizar estudios de toxicidad de Aloysia citriodora Palau

(Cedrón) para promover su uso en tratamientos

antiinfecciosos.

TERCERO: Realizar estudios de la CMI y CMB a diferentes

concentraciones de las estudiadas en el presente trabajo de

investigación frente a otro tipo de bacterias u hongos.

77

BIBLIOGRAFÍA

1. Azuero A, Jaramillo Jaramillo C, San Martin D, D’Armas H. Análisis del

efecto antimicrobiano de doce plantas medicinales de uso ancestral en

Ecuador. Ciencia UNEMI. 2016; 9(20): p.11-18.

http://ojs.unemi.edu.ec/index.php/cienciaunemi/article/view/342

2. Hernández N, Ramos A, Viszoso A. Evaluación tóxica y genotóxica del

extracto fluido de Piper auritum H.B.K. Rev Cubana Plant Med. 2006.

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1028-

47962006000300004&lng=es&nrm=iso&tlng=en

3. Fauci A, Tocuchette N, Folkers J. Emerging infectious diseases: A 10-year

perspective from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

Emerg Infect Dis. 2005; 11.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3320336/

4. Situación epidemiológica de las infecciones respiratorias agudas (IRA) y

neumonías en menores de cinco años en el Perú hasta la SE. Bol

Epidemiol. 2012; 21(35).

http://www.dge.gob.pe/portal/docs/tools/02.pdf

5. Hidalgo L, Marroquin J, Antigoni J, Salmavides F. Prevalencia de

Infecciones hospitalarias en un hospital peruano de nivel IV, en el año 2008.

Rev Med Hered. 2012; 22(2).

http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1018-

130X2011000200006

6. Kanj S, Kanafani Z, Sidani N, Alamuddin L, Zahreddine N, Rosenthal V.

International nosocomial infection control consortium findings of device-

associated infections rate in an intensive care unit of a Lebanese university

hospital. J Glob Infect Dis. 2012; 4(1).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22529622

7. Esparatti M, Ferrer M, Thessen A, Liapikou A, Valencia M, Saucedo L.

Nosocomial pneumonia in the intensive care unit acquired by mechanically

ventilated versus non ventilated patients. Am J Respir Crit. 2010; 182(12).

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1028-47962006000300004&lng=es&nrm=iso&tlng=en

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1028-47962006000300004&lng=es&nrm=iso&tlng=en


http://www.dge.gob.pe/portal/docs/tools/02.pdf

http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1018-130X2011000200006

http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1018-130X2011000200006


78


8. Gastmeier P, Weist K, Rüden H. Catheter-associated primary bloodstream

infections: epidemiology and preventive methods. Infection. 1999; 27.

http://www.medintensiva.org

9. Guggenbichler J, Assadian O, Boeswald M, Kramer A. Incidence and clinical

implication of nosocomial infections associated with implantable

biomaterials-catheters, ventilatorassociated pneumonia, urinary tract

infections.GMS Krankenhhyg Interdiszip. 2011; 6(1).


10. Ministerio de Salud. Norma Técnica 026-MINSA/OGE-V.01: Vigilancia

Epidemiológica de las Infecciones Intrahospitalarias. Lima; 2008.

bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/3802.pdf

11. Lizcano R, A J, Vergara G, J L. Evaluación de la actividad antimicrobiana de

los extractos etanólicos y/o aceites esenciales de las especies vegetales.

Profesional. Bogotá: Pontificia Universidad Javeriana; 2008.

https://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis151.pdf

12. Garcia L. Actividad antibacteriana de extractos vegetales en cepas

hospitalarias de Staphylococcus aureus con resistencia múltiple.

Profesional. Mexico: Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. ; 2006.

file:///C:/Users/MIRIAM/Downloads/Dialnet-Actividad Antibacteriana De

Extractos Vegetales En Cepas-13743%20(2).pdf

13. Osuna L, Tapia M, Aguilar A. Plantas medicinales de la medicina tradicional

mexicana para tratar afecciones gastrointestinales.Tesis Profesional.

Universität De Barcelona; 2005.

http://www.publicacions.ub.es/refs/indices/06499.pdf

14. OMS. Resistencia a los antimicrobianos: una: Boletín de medicamentos ;

2010.

https://www.who.int/antimicrobial-resistance/es/

15. Grayer R, J B. A survey of antifungal compounds from higher plants, 1982-

1993.. Harborne. 1994; 37(1).


http://www.medintensiva.org/


http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/3802.pdf

http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/3802.pdf

http://www.publicacions.ub.es/refs/indices/06499.pdf

https://www.who.int/antimicrobial-resistance/es/

79

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0031942294850054

16. Cruz X. Determinación de la Acción In Vitro Del Extracto. Profesional.

Arequipa: Universidad Católica Santa María ; 2017.

http://renati.sunedu.gob.pe/handle/sunedu/136?offset=740

17. Ricco R, Wagner M, Gurni A. Dinámica de polifenoles de “Cedrón” (Aloysia

citrodora Palau -Verbenaceae-) en relación al desarrollo foliar. Boletín

Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas. 2011;

10(1): p. 67 - 74.

https://www.redalyc.org/revista.oa

18. Chicoma R, Malca A. Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de las

hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la Región Cajamarca, frente a las

bacterias patógenas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus

ATCC 25923. Tesis de título profesional. Cajamarca: Universidad de

Cajamarca; 2015.

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UPAG_5aedbb264a1a092b763

bfe8cef3e9beb

19. Alpaca S. Evaluación de la Capacidad Antioxidante del Extracto de Cedrón

(Aloysia Triphylla) Para la Elaboración de Una Bebida Funcional – Ucsm,

2017. Tesis de Título profesional. Arequipa: Universidad Católica de Santa

Maria; 2018.

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_f9073c09f03c776b2683

051acd4adb40

20. Perez V, Vela A. Efecto del Aceite Esencial de Aloysia triphylla en Ileon

aislado de Cavia porcellus. Profesional. Trujillo:; 2014.

http://dspace.unitru.edu.pe/handle/UNITRU/3733

21. Garcia J. Extracción de Aceite Esencial por fluidos supercríticos y arrastre

con vapor de cedrón (Aloysia triphylla) en la región Arequipa. Profesional.

Arequipa: Universidad Nacional de San Agustin; 2017.

http://repositorio.unsa.edu.pe/handle/UNSA/3413

22. Bruneton J. Farmacognosia Fotoquímica y Plantas Medicinales

ZARAGOZA: Acribia S.A.; 2002.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0031942294850054

http://renati.sunedu.gob.pe/handle/sunedu/136?offset=740

https://www.redalyc.org/revista.oa

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UPAG_5aedbb264a1a092b763bfe8cef3e9beb

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UPAG_5aedbb264a1a092b763bfe8cef3e9beb

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_f9073c09f03c776b2683051acd4adb40

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_f9073c09f03c776b2683051acd4adb40

http://dspace.unitru.edu.pe/handle/UNITRU/3733

http://repositorio.unsa.edu.pe/handle/UNSA/3413

80

https://www.fitoterapia.net/publicaciones/documentacion/flavonol-

glycosides-from-ithevetia-peruvianai-284.html

23. Ramos S. Efecto Antiinflamatorio Topico Del Extracto Etanolico de Aloysia

triphylla (Cedrón), en Animales De Experimentacion. Profesional. Arequipa:

Universidad Católica de Santa Maria ; 2013.

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_564d24731ae923f0e23b

ea435ef61824

24. Dellacasa E, Bandoni A. Hierbaluisa, Aloysia citriodora Palau. Revista de

fitoterapia. 2003; 3(1).

https://dialnet.unirioja.es/ejemplar/270744

25. Adoni A. Concretos de especies silvestres argentinas: Imprefepp; 1988.

http://repositorio.utmachala.edu.ec/bitstream/48000/2822/2/CD0000-20-

TRABAJO%20COMPLETO.pdf

26. Kumar N, Kumar K, Raman B, Reddy I, Ramarao M, Rajagopal S.

Antibacterial activity of Lippia citriodora a folklore plant. JPAM. 2008; 2(1)

https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/309/2538

27. Bayoub K, Baibai T, Mountassif D, Retmane A, Soukri A. Antibacterial

activities of the crude ethanol extracts of medicinal plants against Listeria

monocytogenes and some other pathogenic strains. Afr J Biotechnol. 2010;

9(27).

https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/82639

28. Oliva M, Beltramino E, Galluci M, Casero C, Zygadlo J, Demo M.

Antimicrobial activity of essential oils of Aloysia triphylla (L`Her.) Britton from

different regions of Argentina. BLACPMA. 2010; 9(1).

https://www.redalyc.org/html/856/85612108005/

29. Ocaziones R, Meneses R, Torres F, Stashenko E. Virucidal activity of

Colombian Lippia essential oils on dengue virus replication in vitro. Mem Inst

Oswaldo Cruz; 105(3).


30. Tortora G, Funke B, Case C. Introducción a la microbiologia: Médica

Panamerica S.A; 2007.

https://www.fitoterapia.net/publicaciones/documentacion/flavonol-glycosides-from-ithevetia-peruvianai-284.html

https://www.fitoterapia.net/publicaciones/documentacion/flavonol-glycosides-from-ithevetia-peruvianai-284.html

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_564d24731ae923f0e23bea435ef61824

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UCSM_564d24731ae923f0e23bea435ef61824

http://repositorio.utmachala.edu.ec/bitstream/48000/2822/2/CD0000-20-TRABAJO%20COMPLETO.pdf

http://repositorio.utmachala.edu.ec/bitstream/48000/2822/2/CD0000-20-TRABAJO%20COMPLETO.pdf

https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/82639



81

http://redbiblio.unne.edu.ar/pdf/0603-002731_d.pdf

31. Kuklinski C. Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen

natural. España: Edición Omega S.A; 2003.

http://www.ediciones-omega.es/botanica/95-farmacognosia-978-84-282-

1191-8.html

32. Garcia J, Picazo J. Microbiología Medica General. España: Editorial Brace

de España S.A; 1998.

https://www.iberlibro.com/MICROBIOLOGIA-MEDICA-1-GENERAL-

GARCIA-RODRIGUEZPICAZO/12997715723/bd

33. Koneman E. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color: Edición

Médica Panamericana; 2008.

http://media.axon.es/pdf/115317.pdf

34. Milla C. El Efecto antimicrobiano In Vitro del Zingiber officinale Roscoe

((ljengibre) frente a Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,

Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa,

provenientes del HNCASE Es salud Arequipa, 2007. Tesis Profesional.

Arequipa; 2007.

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UNAP_b13c6d8624d2c19f6b7d

261cb985fcf6

35. Aquili V. Caracterización de cepas de Escherichia coli con fenotipos de

multirresistencia inducidos o seleccionados in vitro con antimicrobianos o

con fármacos no antimicrobianos. Doctorado. Las Palmas de Gran Canaria :

Universidad de las Palmas de Gran Canaria ; 2007.

https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=77054

36. Kaper J, Nataro J, Mobley H. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev

Microbiol; 2(2).


37. Garcia J, Bermejo C. Infecciones por enterobacterias. Medicine. 1998;

7(78).


38. Moncayo D. Candida albicans en Secreción Vaginal de Mujeres en Edad

http://redbiblio.unne.edu.ar/pdf/0603-002731_d.pdf

http://www.ediciones-omega.es/botanica/95-farmacognosia-978-84-282-1191-8.html

http://www.ediciones-omega.es/botanica/95-farmacognosia-978-84-282-1191-8.html

https://www.iberlibro.com/MICROBIOLOGIA-MEDICA-1-GENERAL-GARCIA-RODRIGUEZPICAZO/12997715723/bd

https://www.iberlibro.com/MICROBIOLOGIA-MEDICA-1-GENERAL-GARCIA-RODRIGUEZPICAZO/12997715723/bd

http://media.axon.es/pdf/115317.pdf

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UNAP_b13c6d8624d2c19f6b7d261cb985fcf6

https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UNAP_b13c6d8624d2c19f6b7d261cb985fcf6

https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=77054



82

Fértil y su Relación con los Factores de Riesgo. Tesis Profesional. Loja:

Universidad Nacional de Loja; 2015.

http://dspace.unl.edu.ec/jspui/bitstream/123456789/13585/1/TESIS%20

CANDIDA%20ALBICANS.pdf

39. Andrews M. Determination of Minimum Inhibitory Concentration. J

Antimicrob Chemother. 2001; 48(31).


40. Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobials.: National

Committee for Clinical Laboratory Standards; 1999

https://clsi.org/media/1462/m26a_sample.pdf

41. Isenberg D. Tests To Assess Bactericidal Activity. Antimicrobial

Susceptibility Testing Clinical Microbiology Procedures Handbook. 1999;

5(16).

https://link.springer.com/article/10.1007/BF02977005

42. Cercenado E, Saavedra J. El antibiograma.Interpretación del antibiograma :conceptos generales I. Servicio de Microbiología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid. España. 2009; 7(4).

www.apcontinuada.com/es/el.interpretación-delantibiograma/articulo/8000

0504 /

43. Macgowan A. Clinical implications of antimicrobial resistance for therapy. J

Antimicrob Chemother. 2008; 62(2)


44. Catón R. Lectura interpretada del antibiograma: ejercicio intelectual o

necesidad clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2002; 20.

www.aefa.es/.../Lectura-interpretada-del-antibiograma_ejercicio-intelectual-

o-necesida

45. Courvalin P. Interpretive reading of antimicrobial susceptibility tests. ASM

News. 1992; 58.

https://www.escmid.org/escmid_publications/escmid../material/

46. Livermore D, Winstanley T, Shannon K. Interpretive reading: recognizing the

unusual and inferring resistance mechanisms from resistance phenotypes. J

https://link.springer.com/article/10.1007/BF02977005

83

Antimicrob Chemother. 2001;(1).


47. Cornaglia G, Russell K, Satta G, Fontana R. Relative importance of outer

membrane brane permeability and group 1 beta-lactamase as determinants

of meropenem and imipenem activities against Enterobacter cloacae.

Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39.


48. Murray B. Vancomycin-resistant enterococcal infections.. N Engl J Med.

2000; 342.

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejm200003093421007

49. Gonzales R, Schreckenberger P, Graham M, Kakar S, Denbesten K, Quinn

J. Infections due to vancomycin-resistant Enterococcus faecium resistant to

linezolid. Lancet. 2001; 357(1179).


50. Carrión A, García R. Preparación de extractos vegetales: determinación de

eficiencia de metódica. Tesis de pregrado. Cuenca: Universidad de Cuenca;

2010.

http://dspace.ucuenca.edu.ec/bitstream/123456789/2483/1/tq1005.pdf

51. Salud INd. Manual de procedimiento para la prueba de sensibilida

antimicrobiana por el método de disco de difusión INS INdS, editor. Lima-

Perú: Ministerio de Salud; 2002.

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/manual%20sensibilidad

%202.pdf

52. Oliveira G. Capacidad antioxidante de averrhoa carambola L. (carambola)

frente a sistemas generadores de radicales lbres. Tesis de Maestría. Lima:

Universidad Mayor de San Marcos; 2014.

http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/3943

53. Ardila M, Pérez L, Mejía L. Ensayo Preliminar de la actividad antibacteriana

de extractos de Allium sativum, Coriandrum sativum, Eugenia

Caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis Y Thymus vulgaris

frente a Clostridium perfringens. Biosalud. 2009; p. 46-57.



https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejm200003093421007


http://dspace.ucuenca.edu.ec/bitstream/123456789/2483/1/tq1005.pdf

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/manual%20sensibilidad%202.pdf

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/manual%20sensibilidad%202.pdf

http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/3943

84

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-

95502009000100007

54. Rojas J, Palacios O, Ronceros S. Efecto del Aceite Esencial de Aloysia

Triphylla Britton (Cedrón) sobre el Trypanosoma Cruzi en Ratones. Rev

Peru Med Exp Salud Publica. 2012 Aug 02; p. 61-68.

https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/309

55. Modak B, Arrieta A, Torres R, Urzua A. Actividad Antibacteriana de

Flavonoides Aislados del Exudado Resinoso de Heliotropium Sinuatum:

Efecto del Tipo de Estructura. Boletín de la Sociedad Chilena de Química.

2002; 47(1).

https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0366-

16442002000100005

56. Balbuena Escalona. Evaluación del efecto antimicrobiano de flavonoides

obtenidos de extractos de hojas de Tamarindus indica Lin. Multimed. 2012;

16(1).

http://www.revmultimed.sld.cu/index.php/mtm/article/view/517/846

57. Domingo D, López Brea M. Plantas con acción antimicrobiana. Esp

Quimioterap. 2003; 16(4): p. 385-393.

http://www.seq.es/seq/0214-3429/16/4/385.pdf

58. Oliva Mde L, Carezzano M, Gallucci M, Demo M. Antimycotic effect of the

essential oil of Aloysia triphylla against Candida species obtained from

human pathologies. Pubmed. 2011; p. 1039-43.


59

60

Ramírez Godínez J, Salazar Pereda V, Añorve Morga J, Castañeda Ovando

A, Jaimez Ordaz J, González Olivares L, et al. Identificación de Compuestos

Antixodantes Presentes en Cedrón Mediante Resonancia Magnética

Nuclear de 1H. Investigación y Desarrollo en Ciencia y Tecnología de

Alimentos. 2016; 1(2): p. 825-830.

http://www.fcb.uanl.mx/IDCyTA/files/volume1/2/10/143.pdf

Diaz O, Duran D, Martinez J, Stashenko L. Estudio comparativo de la

composición química de los aceites esenciales de Aloysia triphylla l´her

britton cultivada en diferentes regiones de Colombia. Universidad industrial

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-95502009000100007

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-95502009000100007

https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/309

https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0366-16442002000100005

https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0366-16442002000100005

http://www.revmultimed.sld.cu/index.php/mtm/article/view/517/846

http://www.seq.es/seq/0214-3429/16/4/385.pdf


http://www.fcb.uanl.mx/IDCyTA/files/volume1/2/10/143.pdf

85

de Santander; 2007.

file:///C:/Users/pc/Downloads/Dialnet-

EstudioComparativoDeLaComposicionQuimicaDeLosAceit-4815186.pdf

86

ANEXOS

87

Anexo 1. Constancia de identificación taxonómica del cedrón

88

Anexo 2. Recolección de Aloysia citriodora Palau


Anexo 3. Pesando la muestra triturada de hojas de cedrón


89

Anexo 4. Elaboración de cartuchos


Anexo 5. Armado del Equipo Soxlhet


90

Anexo 6. Momento preciso de la extracción de Aloysia citriodora Palau


Anexo 7. Obtención del extracto de Aloysia citriodora Palau


91

Anexo 8. Preparación de medios de cultivo

Agar Manitol Salado

Se añadió 55,5 gramos de Agar Manitol Salado en 500 ml de agua destilada,

calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto, para

disolver completamente. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos dejando enfriar a

temperatura ambiente antes de su utilización.

Agar Sabouraud

Se añadió 32,5 gramos de Agar Sabouraud en 500 ml de agua destilada.

Calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto para

disolver completamente los ingredientes. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos,

dejando enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización.

Agar Müeller Hinton

Se añadió 19 gramos de Agar Müeller Hinton en 500 ml de agua destilada.

Calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto para

disolver completamente los ingredientes. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos,

dejando enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización.

Anexo 9. Pesando los Medios de Cultivo


92

Anexo 10. Preparación del Agar Müeller Hinton


Anexo 11. Preparación de placas con el Agar Müeller Hinton


93

Anexo 12. Preparación de las placas para el sembrado de Staphyloccocus aureus en Agar Manitol salado


Anexo 13. Colocando los Discos de difusión con el extracto de Aloysia citriodora Palau (cedrón) en placas con Agar Manitol salado


94

Anexo 14. Resultados en los diferentes medios de cultivos (Agar Müeller Hinton, Manitol salado y Sabouraud)


Anexo 15. Preparación de la solución madre


95

Anexo 16. Adición del inoculo preparado


Anexo 17. Proceso del método de la concentración mínima bactericida (CMB) en Agar manitol salado


96

Anexo 18. Autoclavado final en donde se esterilizo todo material y desecho que se usó en todo procedimiento


universidad privada autonoma del sur facultad de …

Documents