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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO,

PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA:

EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ETANÓLICO, ACUOSO DEL RIZOMA SMILAX purhampuy EN BACILLUS

cereus, STAPHYLOCOCCUS aureus, CÁNDIDA albicans.

AUTORAS:

JOSELIN ENRÍQUEZ SALAS

ESPERANZA SOLANGE FEIJÓO FREIRE

TUTORA:

QF. MARIANITA RENDÓN MARISCAL MSc

COTUTORA:

Q.F PILAR SOLEDISPA CAÑARTE, MSc

PERIODO LECTIVO

2019

GUAYAQUIL-ECUADOR

XII


CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA

UNIDAD DE TITULACIÓN

DEDICATORIA

Dedico todo este esfuerzo y sacrificio primero a Dios por darme la salud,

sabiduría y la fortaleza necesaria para cumplir mis metas y por bendecirme cada

día e mi vida.

A mis padres Manuel Honorio Feijóo León y Jenny Maribel Freire Intriago por ser

los principales promotores de mis sueños, por siempre darme su apoyo, su amor

incondicional, por confiar y creer en mí y en todas mis expectativas, por cada

esfuerzo que hicieron para ayudarme económicamente y por cada consejo que

me ha guiado en mi vida.

A mi hija Jaylin Anelisse Parrales Feijóo por haberme dado la fortaleza para

seguir adelante, por ser mi motor día a día, por ser mi inspiración en todo lo que

hago y por estar siempre en mi pensamiento para no rendirme.

A mis hermanos Jorge, Denisse y Stefanía por ser las personas a las cuales

debo darles el buen ejemplo, para que sigan adelante siempre, para

demostrarles que en la vida nada es fácil y que si uno tiene una meta lucha por

ella.

A mi Abuelita Esperanza Germania León Soriano, aunque ya no está con

nosotros, gracias por enseñarme el camino de la vida, por los consejos, por el

amor que me brindo y por su apoyo incondicional, por considerar todos mis

triunfos como si fuera uno suyo, gracias por cada oración que hiciste para que

este sueño se cumpla.

ESPERANZA SOLANGE FEIJOO FREIRE.

XIII




DEDICATORIA

Dedico esta Tesis con todo mi amor a Dios que inspiro mi espíritu para la

realización de este estudio, por darme salud y bendición para alcanzar mis metas

como persona y como profesional.

A mis madre Jane Salas Rosas que es una mujer que día a día me llena de

orgullo, te amo demasiado y jamás tendré suficiente para devolverte por tanto.

Gracias por tú ayuda, por tú compañía, paciencia, dedicación, amor, solvencia,

trabajo fuerte, te amo.

A mi padre Félix Edmundo Enríquez Martínez quien ha trabajado duro, me ha

inspirado a salir adelante con cada ayuda, me ha brindado las bases suficientes

y es el hombre que me hace la mujer más feliz. Gracias padre por acompañarme

en este camino y ser mi soporte te amo.

Siempre me he sentido feliz por la linda familia paterna y materna que tengo, a

uds. Les dedico este logro porque han sido parte de mi formación, han estado

ahí frente a cualquier adversidad y son mi total orgullo.

JOSELIN ENRÍQUEZ SALAS.

XIV




AGRADECIMIENTO

Agradezco primero a nuestra tutora, la QF. Marianita Rendón por haber sido

parte de este trabajo, por aportarnos conocimientos, por brindarnos su ayuda a

lo largo de este período, por la paciencia y por incentivarnos a hacer un excelente

trabajo.

A mis padrinos Javier Esteban Cevallos Luzcando y Luisa Delia León Soriano

por haberme ayudado económicamente a lo largo de mi carrera, por ayudarme

con los gastos de mi tesis, y por cada consejo brindado a lo largo de mi vida.

A mi esposo Jordy Alfredo Parrales Guerrero por ver en mí una persona

inteligente y capaz de lograr todos mis propósitos, gracias por ayudarme en lo

que no lograba entender de las materias, gracias por estar en las buenas y en

las malas.

A mis suegros Jorge Alfredo Parrales Morales y Virginia Isabel Guerrero Ibarre

por haberme apoyado económicamente este último período y por ayudarme

cuidando a mi hija los días que estuve ocupada realizando este trabajo.

A mi compañera de tesis y amiga Joselin Enríquez Salas por permitirme realizar

este trabajo junto a ella y adquirir nuevas experiencias y conocimientos.

ESPERANZA SOLANGE FEIJOO FREIRE

XV




AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por guiarme a lo largo de este camino estudiantil y ser el

apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de debilidad.

Expreso mi agradecimiento profundo a nuestra tutora QF. Marianita Rendón, que

me brindó su tiempo y dedicación para orientarnos al desarrollo de un excelente

trabajo, por su apoyo, amistad y conocimientos brindados.

Gracias a mis padres que son mi pilar y a pesar de la distancia, con mucho

esfuerzo me ayudaron a culminar mi carrera Universitaria y fueron mi total

soporte. Fueron mis mejores maestros en momentos difíciles, realmente las

palabras quedan cortas para expresar mis totales agradecimientos a los seres

que más amo.

A mi hermano que con sus palabras me hizo sentir orgulloso, a mis sobrinos

bellos que con cada sonrisa en cada foto me animaron a no recaer por ningún

motivo y seguir luchando cada día.

Gracias infinitas a mi abuelita materna Genith Salas Rosas, por cada oración,

por esas frases que me impulsaron a seguir, por ayudar a mis papás quienes

decaían en mi ausencia, por muchos aportes económicos y consentimiento de

caprichos.

Gracias a mi abuela paterna Celina Martínez por seguir a mi lado, por recordarme

y aportar demasiada alegría a mi vida, por sus consejos y detalles. Gracias por

cada palabra bonita.

JOSELIN ENRÍQUEZ SALAS

XVI

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ..................................................................................................... XXI

ABSTRACT ................................................................................................... XXII

INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1

CAPÍTULO I PROBLEMA ................................................................................. 3

I.1. Planteamiento y formulación del problema .............................................. 3

I.2. Formulación del Problema ....................................................................... 4

I.3. Justificación e Importancia ....................................................................... 4

I.4. Hipótesis .................................................................................................. 5

I.5. Objetivos .................................................................................................. 5

I.5.1. Objetivo general................................................................................. 5

I.5.2. Objetivos específicos ......................................................................... 5

1.6 Operacionalización de las variables ......................................................... 6

CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO ..................................................................... 7

II.1 FAMILIA SMILACACEAE ......................................................................... 7

II.2 GÉNERO: Smilax L. ................................................................................. 8

II.2.1. Composición química del género Smilax .......................................... 9

II.3 Descripción botánica .............................................................................. 10

II.3.1 Hábito y sistema reproductivo .......................................................... 10

II.3.2 Rizoma. ........................................................................................... 10

II.3.3 Tallos. .............................................................................................. 10

II.3.4 Hojas. .............................................................................................. 11

II.3.5 Polen. .............................................................................................. 11

II.3.6 Frutos. ............................................................................................. 11

II.3.7 Suelo adecuado. .............................................................................. 12

II.3.8 Relaciones filogenéticas. ................................................................. 12

II.4 Usos tradicionales .................................................................................. 12

II.5 Actividad antinflamatoria del género Smilax ........................................... 13

II.6 Estudio Toxicológico .............................................................................. 14

II.7 Propiedades ........................................................................................... 15

II.7.1 Acción hormonal .............................................................................. 15

II.7.2 Para la piel ....................................................................................... 15

II.7.3 Para el reumatismo .......................................................................... 15

II.7.4 Desintoxicantes ............................................................................... 15

II.8 ESPECIE SMILAX purhampuy............................................................... 16

II.8.1 Importancia ......................................................................................... 18

XVII

II.8.2 Comparación con otra especie del género Smilax .............................. 18

II.9 Extractos ................................................................................................ 19

II.10 MICROORGANISMOS ........................................................................ 20

II.11 FAMILIA: BACILLACEAE ..................................................................... 20

II.13 Género: Bacillus................................................................................... 20

II.14 Características de Bacillus cereus ....................................................... 21

II.15 Acción patógena .................................................................................. 23

II.16 Identificación ........................................................................................ 24

II.16.1 Pruebas de confirmación ............................................................... 25

II.17 Resistencia .......................................................................................... 25

II.18 Antibióticos .......................................................................................... 26

II.19 Medios de cultivo ................................................................................. 26

II.19.1 Bacillus cereus Selectivo Agar ....................................................... 27

II.19.2 Agar MYP, Manitol-Yema de huevo y Polimixina. .......................... 28

II.19.3 Mueller Hinton Agar ....................................................................... 29

II.20 FAMILIA: MICROCOCACEAE ............................................................. 29

II.21 Género: Staphylococcus ...................................................................... 30

II.22 Características de Staphylococcus aureus ........................................... 31


II.23.1 Factores de Virulencia: .................................................................. 32


II.24 1 Análisis microbiológico. .................................................................. 34

II.24.2 Pruebas bioquímicas ..................................................................... 34

II.24.3 Prueba de la catalasa .................................................................... 34

II.24.4 Prueba de la coagulasa ................................................................. 35

II.25 Resistencia .......................................................................................... 35

II.25.1 Vancomicina .................................................................................. 36


II.26.1 Agar Baird-Parker .......................................................................... 37

II.26.2 Mannitol Salt Agar ......................................................................... 38

II.25.3 Agar ............................................................................................... 39

II.27 FAMILIA: CRYPTOCOCCACEA .......................................................... 39

II.28 Género: Cándida .................................................................................. 40

II.29 Características de Cándida albicans .................................................... 41



II.31.1 Cultivos y morfología de las colonias ............................................. 43

XVIII

II.31.2 Características microscópicas ....................................................... 43

II.31.3 Identificación bioquímica enzimática .............................................. 44

II.32 Resistencia .......................................................................................... 44

II.33 Antibióticos .......................................................................................... 45

II.33.1 Ketoconazol ................................................................................... 45

II.33.2 Nistatina......................................................................................... 45


II.34.1 Sabouraud Glucosado Agar ........................................................... 46

II.34.2 Agar Sangre .................................................................................. 47

II.34.3 Tripteína Soya Agar ....................................................................... 47

II.35 Antibióticos y alertas de la OMS .......................................................... 48

II.35.1 Historia .......................................................................................... 48

CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS .................................................... 50

III.1 Tipo de Investigación ............................................................................ 50

III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos ........................................... 50

III.2.1 Equipos .......................................................................................... 50

III.2.2 Aparatos ......................................................................................... 51

III.2.3 Materiales ....................................................................................... 51

III.2.4 Reactivos ........................................................................................ 52

III.3 Muestra ................................................................................................. 53

III.4 Metodología Experimental .................................................................... 53

III.3.1 Recolección del material vegetal .................................................... 53

III.3.2 Secado, molida y almacenamiento ................................................. 53

III.3.3 Obtención de los extractos ............................................................. 53

III.3.4 Microorganismos ............................................................................ 55

III.3.5 Fármacos de referencia .................................................................. 55

III.3.6 Medios de cultivo ............................................................................ 55

III.3.7 Concentraciones de los extractos ................................................... 55

III.3.8 Método Kird-Bauer .......................................................................... 55

III.3.9 Lectura e Interpretación .................................................................. 57

CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................ 59

DISCUSIÓN .................................................................................................... 61

CONCLUSIÓN ................................................................................................ 63

RECOMENDACIÓN ........................................................................................ 64

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 65

ANEXOS ......................................................................................................... 75

XIX

ÍNDICE DE TABLAS Tabla I. Definición operacional de las variables................................................. 6

Tabla II. Características de la Smilax purhampuy ............................................. 9 Tabla III. Ventajas y desventajas de Smilax purhampuy ................................. 16

Tabla IV. Taxonomía de Smilax purhampuy R. ............................................... 18

Tabla V Taxonomía de Bacillus cereus ........................................................... 21

Tabla VI Características de las patologías (B. cereus) .................................... 24

Tabla VII Fórmula ........................................................................................... 28

Tabla VIII. Fórmula Agar MYP ........................................................................ 29

Tabla IX. Fórmula Mueller Hinton Agar ........................................................... 29 Tabla X. Taxonomía de Staphylococcus aureus ............................................. 30

Tabla XI. Fórmula Agar Baird-Parker .............................................................. 37

Tabla XII. Fórmula Mannitol Salt Agar ............................................................. 38

Tabla XIII. Fórmula Agar DNAsa ..................................................................... 39 Tabla XIV. Taxonomía Cándida albicans ........................................................ 40

Tabla XV. Fórmula Sabouraud Glucosado Agar.............................................. 46

Tabla XVI. Fórmula Agar sangre ..................................................................... 47

Tabla XVII. Fórmula Tripteína Soya Agar ........................................................ 48

Tabla XVIII. Equipos utilizados en la elaboración de extractos de Smilax purhampuy ...................................................................................................... 50

Tabla XIX. Equipos utilizados en el análisis microbiológico del extracto etanólico y acuoso del rizoma de la Smilax purhampuy ................................................. 50

Tabla XX. Materiales utilizados en la elaboración de extractos de Smilax purhampuy ...................................................................................................... 51

Tabla XXI. Materiales utilizados en la elaboración de extractos de Smilax purhampuy ...................................................................................................... 51

Tabla XXII. Materiales utilizados en el análisis microbiológico del extracto etanólico y acuoso del rizoma de la Smilax purhampuy .................................. 51

Tabla XXIII. Reactivos utilizados en la elaboración de extractos de Smilax purhampuy ...................................................................................................... 52

Tabla XXIV. Reactivos utilizados en el análisis microbiológico del extracto etanólico y acuoso del rizoma de la Smilax purhampuy .................................. 52

Tabla XXV. Cepas bacterianas utilizadas en el análisis microbiológico de Smilax purhampuy ...................................................................................................... 52

Tabla XXVI. Escala de Duraffourd ................................................................... 58

Tabla XXVII7. Promedio de la Actividad antimicrobiana del Extracto etanólico del rizoma de la Smilax purhampuy comparado con Nistatina sobre cepas de Cándida albicans ATCC 10231 in vitro ............................................................ 60

XX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Rizoma de smilax purhampuy .......................................................... 16

Figura 2. Colonias de Bacillus cereus en agar sangre Columbia. .................... 26

Figura 3. Características Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus .. 36

Figura 4. Características Macro y Microscópicas de Cándida albicans ........... 46

Figura 5. Maceración etanólico. ...................................................................... 53

Figura 6. Maceración acuosa. ......................................................................... 54

ÌNDICE DE ANEXOS

Anexo A. Lavado y cortado del rizoma de la Smilax purhampuy ..................... 75 Anexo B. Secado del rizoma de la Smilax purhampuy .................................... 75

Anexo C. Preparación de extractos (Etanólico y acuoso) ............................... 76

Anexo D. Método Kirby-Bauer ......................................................................... 79

Anexo E. Medición de halos ............................................................................ 81

XXI




“EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ETANÓLICO, ACUOSO DEL RIZOMA SMILAX PURHAMPUY EN BACILLUS

CEREUS, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, CÁNDIDA ALBICANS”.

Autoras: Esperanza Feijóo y Joselin Enriquez Salas

Tutor: QF. Marianita Rendón Mariscal MSc

Co-Tutor: Q.F. Pilar Soledispa Cañarte, MSc

RESUMEN

El presente trabajo de titulación tiene como propósito determinar la actividad antimicrobiana mediante extractos etanólico y acuoso del rizoma de Smilax purhampuy. Los extractos fueron realizados en el Laboratorio de PROGECA y el análisis microbiológico en el laboratorio de Microbiología I de la Facultad de Ciencias Químicas. En esta investigación se empleó el método de difusión en disco Kirby-Bauer, mediante el cual se demuestra la susceptibilidad de dos cepas Gram-positivas (B. cereus, S. aureus), y un hongo (C. albicans) para obtener resultados reproducibles y comparables. Finalmente se demostró la existencia de actividad antimicrobiana, lo que dio como resultado, en el extracto acuoso de la especie Smilax purhampuy no presentó actividad antimicrobiana en ninguna de las cepas, mientras que el extracto etanólico mostró actividad antimicrobiana en todas las cepas estudiadas. La lectura del antibiograma se efectuó a las 24 y 48 horas después de haber realizado el método. La actividad antimicrobiana fue más alta en Staphylococcus aureus, seguido Bacillus cereus y Cándida albicans.

Palabras clave: Smilax purhampuy, susceptibilidad, Kirby-Bauer, extracto

etanólico, extracto acuoso.

XXII




"EVALUATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ETHANOLIC

EXTRACTS, AQUEOUS OF SMILAX PURHAMPUY RHIZOME IN BACILLUS

CEREUS, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, CÁNDIDA ALBICANS.

Authors: Esperanza Feijóo and Joselin Enriquez

Tutor: QF. Marianita Rendón Mariscal MSc

Co-Tutor: Q.F. Pilar Soledispa Cañarte, MSc

ABSTRACT

The purpose of this titration work is to determine the antimicrobial activity using ethanolic and aqueous extracts of the Smilax purhampuy rhizome. The extracts were made in the Laboratory of PROGECA and the microbiological analysis in the Laboratory of Microbiology I of the Faculty of Chemical Sciences. In this research, the Kirby-Bauer disk diffusion method was used, which demonstrates the susceptibility of two Gram-positive strains (B. cereus, S. aureus), and a fungus (C. albicans) to obtain reproducible and comparable results. Finally, the existence of antimicrobial activity was demonstrated, which resulted in the aqueous extract of the Smilax purhampuy species showing no antimicrobial activity in any of the strains, while the ethanolic extract showed antimicrobial activity in all the strains studied. The antibiogram was read 24 and 48 hours after the method. Antimicrobial activity was higher in Staphylococcus aureus, followed by Bacillus cereus and Candida albicans. Translated with www.DeepL.com/Translator

Keywords: Smilax purhampuy, susceptibility, Kirby-Bauer, ethanolic extract,

aqueous extract.

1

INTRODUCCIÓN

Las plantas se utilizan en atención primaria de salud, ya sea individualmente

o en ciertas combinaciones por profesionales de la medicina. Países europeos,

americanos y africanos emplean varias especies de plantas como medicina para

curar un número de dolencias o trastornos (Shree, Noorain, & Kekuda, 2018).

Las enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos, parásitos y

los virus siguen siendo una gran amenaza para población. Su impacto es

particularmente grande en los países en desarrollo debido a la falta de

disponibilidad de medicamentos y la aparición de resistencia generalizada a los

medicamentos (Mateen, Ahmed, & Uddin, 2010)

La actividad antimicrobiana es uno de los principales temas en discusión por

su incidencia en la resistencia de los microorganismos frente a antibióticos. El

uso de ciertas especies vegetales cuyas partes presentan metabolitos que

puedan ser aprovechados en el área de la medicina y en general para contribuir

de forma positiva en la salud de las personas.

Se ha informado que el Smilax tiene muchas propiedades farmacológicas que

se usan para curar enfermedades como el cáncer, diabetes mellitus, dolencias

de la piel, incluyendo heridas, inflamaciones, forúnculos y úlceras. Los rizomas

de Smilax tienen diferentes tipos de comportamientos farmacológicos como

antibacterianos, antifúngicos, antioxidantes y otras actividades (Zubair, Rizwan,

& Saeed, 2013)

La actividad antimicrobiana de diferentes extractos de plantas han sido

reportados por muchos autores, por lo que se estudian los extractos acuosos y

etanòlicos del rizoma de la especie Smilax purhampuy, una de las plantas que

han sido muy utilizada de manera ancestral para aliviar ciertas afecciones

(Mateen et al, 2010)

2

De ahí radica la importancia de indagar y sustentar de manera científica las

propiedades que posee esta especie y de esta manera aportar a la comunidad

con información muy relevante sobre los usos y tecnologías que se pueden

aplicar para la obtención de productos de calidad y eficaces que combatan a

microorganismos patógenos.

3

CAPÍTULO I PROBLEMA

I.1. Planteamiento y formulación del problema

Según la OMS, la resistencia a los antibióticos es la capacidad que tienen los

microorganismos de impedir que los antimicrobianos actúen contra ellos. En

consecuencia, los tratamientos habituales se vuelven ineficaces y las infecciones

persisten y pueden transmitirse a otras personas. (Organización Mundial de la

Salud, 2017)

A nivel mundial se registra un incremento de esta resistencia, y como

consecuencia hay una pérdida de la eficacia de los respectivos tratamientos, los

cuales ponen en peligro la capacidad para tratar las enfermedades infecciosas

comunes. El control de diferentes patologías, ya sean causadas por hongos o

bacterias, utilizando extractos etanólico o metanólico de una gran variedad de

plantas medicinales cultivadas en Ecuador, es algo que aún no ha sido probado

(Azuero, Jaramillo, & San Martín, 2016)

De acuerdo a los conocimientos ancestrales existen diferentes plantas

medicinales, las cuales tienen propiedades antiinflamatorias, diuréticas y

digestivas. Además hay estudios que demuestran una actividad antimicrobiana

en las especies de la familia Smilacaceae, estos estudios logran ampliar y

confirmar sus acciones farmacológicas; la Smilax purhampuy es una de ellas.

El presente trabajo tiene como finalidad determinar si existe actividad

antimicrobiana en la Smilax purhampuy, especie ecuatoriana de la que no

existen muchos estudios de acuerdo a la bibliografía investigada.

4

I.2. Formulación del Problema

¿Presentarán actividad antimicrobiana los extractos obtenidos del rizoma de

Smilax purhampuy en cepas de Bacilus cereus, Staphylococcus aureus y

Cándida albicans?

I.3. Justificación e Importancia

En la actualidad es importante buscar nueva información para combatir las

infecciones a través de diferentes plantas como lo es la Smilax purhampuy. Gran

cantidad de infecciones se suelen tratar con antibióticos, pero existe el riesgo

que se adquiera una resistencia a estos medicamentos debido a diferentes

factores y aparezcan enfermedades incurables.

Desde tiempos muy remotos las plantas han cumplido un papel importante en

el área terapéutica gracias a las múltiples propiedades que ellas poseen. Por

esta razón se ha considerado importante su estudio y el desarrollo de técnicas

analíticas que permitan la determinación de los beneficios de estas especies

vegetales (Lizcano & Vergara, 2008).

Se han encontrado estudios sobre la capacidad antimicrobiana de varias

especies de la familia Smilacaceae, por lo que este trabajo de investigación

pretende determinar la posibilidad de la actividad antibacteriana en una especie

ecuatoriana, como lo es la Smilax purhampuy.

Actualmente, uno de los problemas más comunes es que existen plantas

medicinales que tienen actividad antimicrobiana que son conocidas por la

población, sin embargo no han sido analizadas a fondo, para determinar sus

beneficios, pasando muchas veces desapercibidas. (Azuero et al, 2016).

5

Este estudio se realizará con la finalidad de obtener información sobre esta

planta, para tener la posibilidad de encontrar un efecto antimicrobiano en ciertas

infecciones, evaluando su efectividad en extractos etanólico y acuoso. Debido a

que en la actualidad no se encuentran registros suficientes.

I.4. Hipótesis

Los extractos etanòlicos y acuosos obtenidos del rizoma de Smilax

purhampuy, poseen actividad antimicrobiana en cepas de Bacilus cereus,

Staphylococcus aureus y Cándida albicans.

I.5. Objetivos

I.5.1. Objetivo general

Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos etanólico y acuoso del

rizoma de la Smilax purhampuy, frente a cepas de Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus y Cándida albicans.

I.5.2. Objetivos específicos

Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos etanólico y acuoso

del rizoma de la Smilax purhampuy, frente a cepas de Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus y Cándida albicans mediante el método de Kirby

Bauer

Establecer en qué concentración de los extractos etanólico y acuoso del

rizoma de la Smilax purhampuy, frente a cepas de Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus y Cándida albicans se presenta mayor actividad

antimicrobiana.

Comparar los resultados de la actividad microbiana obtenida de las

diferentes concentraciones de los extractos etanólico y acuoso del rizoma

6

de la Smilax purhampuy, frente a antibióticos comerciales relacionando

las tres cepas de microorganismos estudiadas.

1.6 Operacionalización de las variables

Tabla I. Definición operacional de las variables

TIPO VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADOR

Dependiente Actividad antibacteriana

Se basa en la medición del efecto inhibitorio frente a un determinado microorganismo, se determina normalmente por métodos de análisis microbiológicos (Pedraza & Hassbleidy, 2009).

Medición de halo de inhibición en mm.

Independiente Extracto etanólico y acuoso del Rizoma

Los métodos de extracción

utilizados farmacéuticamente

implican la separación de

porciones medicinales

activas de tejidos vegetales

de los componentes

inactivos mediante el uso

selectivo de disolventes.

(Pandey, 2013).

Extracto acuoso y etanólico en g/ml.

Elaborado por: (Autores)

7

CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO

II.1 FAMILIA SMILACACEAE

Según (Freire, 2004) indica en el libro de Botánica Sistemática Ecuatoriana

que: “Smilacaceae es el origen etimológico del nombre de la familia. El nombre

del género que es Smilax L., este proviene del nombre clásico griego de la

planta”.

La zarzaparrilla es un arbusto trepador originario de América del Sur. En

medicina, se aprovecha el rizoma atribuyéndosele propiedades anti-

inflamatorias, antiséptico, antibacterial y antioxidante. Es muy aprovechada para

el tratamiento diurético, artritis reumática, desintoxicación, enfermedades

inflamatorias y en tratamiento de tumores.

Smilacaceae está compuesta por los géneros Smilax L. y HeterosmilaxKunth,

que se encuentran distribuidas en zonas templadas, tropicales y subtropicales.

Son plantas monocotiledóneas, herbáceas o leñosas, perennes, con tallos en

forma de zig-zag.

La identificación de las especies de Smilax puede tornarse un poco dificultoso

debido a las semejanzas que poseen. Estas plantas son dioicas, las flores y los

frutos maduros son efímeras, además los tallos y las hojas de la parte basal son

distintas a la de la porción distal. Con frecuencia, para realizar una buena

determinación se dispone de ejemplares que ayuden a su caracterización.

Las plantas del género Smilax presentan un crecimiento rápido, y al no

controlarlo pueden llegar a ser invasoras. Los frutos de esta planta son similares

a los de una cereza pequeña, por lo que no deben ser ingeridos debido a que

suelen ser venenosos.

8

II.2 GÉNERO: Smilax L.

“Tournefort fue el primer taxónomo que estudió el género Smilax; él consideró

importante el color de los frutos”. Mientras que Linneo “Describe una planta de

tallos angulosos con aguijones y hojas dentado-crenadas con el nombre

Smilaxaspera” (Ferrufino & Gómez, 2004).

Según Vandercolme, 1947 “el nombre Smilax se deriva del griego smile que

significa raspa, por la presencia de acúleos que aparecen en la mayoría de las

especies. Pero otros autores opinan que Smilax significa hierba para atar y que

el nombre fue usado por primera vez por Plinio para referirse a una hierba de

atar, que es Smilaxaspera” (Vandercolme, como se citó en Ferrufino & Gómez,

2004).

Grisebach, 1842 “Realiza el tratamiento de 33 especies de Smilax; divide el

género en Pharmacosmilax y Pachysmilax por la base y la forma de la antera, y

la consistencia y el patrón de la nervadura de la hoja. Ubica Smilax en

Smilacaceae” (Grisebach, como se cito en Ferrufino & Gómez, 2004).

Kunth, 1850 “Enumera 188 especies de Smilax y estudia 124. Ubica a

Smilaxen Smilaceae”. Vandercolme, 1871 “Estudia las especies medicinales de

Smilax e incluye S. officinalisHumb. & Kunth, S. sarsaparrilla L. y S. china L.

como plantas de uso medicinal” (Ferrufino & Gómez, 2004).

9

II.2.1. Composición química del género Smilax

“Saponinas esteroidales, flavonoides, polifenoles y estigmasterol; han sido los

componentes químicos descritos en las largas raíces y cortos rizomas de estas

especies”(González, Cuellar, de-Armas, Gómez, & Dopico, 2017).

“Las saponinas estereoidales de la zarzaparrilla incluyen la parrillina,

sarsapogenina y la esmilagenina y éstas son las encargadas de la actividad

tónica, de aumentar los niveles de energía y de aumentar la fuerza y la masa

muscular”(Hentze, 2012).

Tabla II. Características de la Smilax purhampuy

Porte Hiervas rizomatosas con tallos trepadores espinosos.

Hojas Opuestas o alternas; subsésiles o pecioladas; en el género Smilax la vaina se encuentra modificada en zarcillo.

Flores Actinomorfas; en su mayoría imperfectas, las pistiladas con estaminodios; dispuestas en espigas, racimos o umbelas axilares.

Perigonio 2 verticilos de tres tépalos inconspicuos y petaloides, libres o soldados formando un tubo o columna corto o largo. Nectarios en la base de los tépalos.

Androceo Estambres introrsos o extrorsos; comúnmente 2 verticilos de 3, dehiscencia longitudinal. Anteras bitecas, pero éstas pueden confluir.

Gineceo Ovario súpero, gamocarpelar de 3 carpelos, trilocular, 1 ó 2 óvulos por lóculo.

Fruto Baya, con 1-3 semillas.

Semillas Globosas u ovoides y muy duras; endosperma escaso; embrión recto y muy pequeño.

(Freire, 2004)

10

II.3 Descripción botánica

II.3.1 Hábito y sistema reproductivo

“Las especies del género Smilax en Costa Rica son bejucos leñosos o

herbáceos, dioicos, de pequeña y mediana longitud. Algunas plantas podrían

alcanzar 20 o 30 m de largo, según el soporte” (Ferrufino & Gómez, 2004).

II.3.2 Rizoma.

No se han encontrado trabajos enfocados a la organografía del rizoma de esta

especie. En la morfología externa, el sistema subterráneo se divide con

engrosamiento tuberoso, con nudos y entrenudos engrosados.

El rizoma que presentan Smilax domingensis, S. panamensis y S. spissa, está

formado por una parte caulinar cuya consistencia es leñosa. El sistema caulinar

subterráneo se encuentra cubierto por catafilos dispuestos dísticamente y raíces

adventicia, para facilitar el enraizamiento. El color del rizoma varía según las

condiciones ambientales.

II.3.3 Tallos.

La forma de los tallos son generalmente cilíndricas, excepto en S. vanilliodora,

en esta especie son cuadrangulares. La superficie en S. espinosa puede ser

estriada, mientras que poseen superficies lisas la gran parte de las especies.

En S. mollis y S. subpubescens, especialmente en estructuras jóvenes de la

planta se halla pubescencia. En S. panamensis, S. domingensis y en S.

vanilliodora; los tallos son grandes y robustos en la parte inferior, dependen de

la edad del bejuco y son aplanados respectivamente.

11

El color del tallo en S. domingensis varia de rojo ha morado en su parte

inferior, en gran número de las especies el tallo es verde. Sin embargo el color

de tallo varia en dependencia al medio donde crece la planta.

II.3.4 Hojas.

La forma y el tamaño de las hojas varían entre los bejucos de una misma

especie, aunque muchos autores utilizan estos caracteres para distinguir las

especies de Smilax.

Esta variación ha sido interpretada como respuesta a los factores

ambientales; se trata de una plasticidad fenotípica de origen genético o de

polimorfismo foliar como es el caso de Smilax aspera(Vernet, como fue citado

por Ferrufino Lilian & Gómez Jóse, 2004).

II.3.5 Polen.

Los primeros estudios sobre la morfología del polen de Smilax se llevaron a

cabo con seis especies de Brasil, utilizaron microscopia electrónica y

consideraron que el polen era pequeño (18.5 – 21.1 mm), apolar, inaperturado,

esferoidal y espiculado. En Panamá se estudiaron cinco especies de la isla de

Barro Colorado y usando el tamaño de los granos, desplegamiento de exina y

conspicuidad verrucosa elaboraron un patrón (Ferrufino & Gómez, 2004).

En Costa Rica se analizaron cinco especies de Smilax, éstas presentaban

granos de polen que varían entre 15 y 21 micras, son granulosos, subglobosos

y espinosos. El tamaño tiende a variar entre plantas de una misma especie

(Ferrufino & Gómez, 2004).

II.3.6 Frutos.

Los frutos son bayas globosas, varían de tamaño entre los bejucos de la

misma especie;

12

El exocarpo es de color morado o rojo en Smilaxdomingensis, S. spissa y S.

spinosa. En S. vanilliodora es rojo, S. panamensis, S. mollis y S. subpubescens

es anaranjado (Ferrufino & Gómez, 2004).

Las especies de Smilax presentan tres fases de coloración: una inicial que es

verde, una intermedia, que puede ser roja y la fase final con el color de la

maduración: rojo, morado, negro y anaranjado. La cantidad de frutos varía según

la infrutescencia y sus semillas poseen una forma esférica que varían de 1 a 3

por baya (Ferrufino & Gómez, 2004).

II.3.7 Suelo adecuado.

La planta debe ubicar en rocallas o paredes protegidas de las heladas. Se

cultiva por la belleza de sus frutos, que resultan tóxicos para las personas, por el

aroma de sus flores, las cuales son muy poco vistosas. Cualquier tipo de terreno

con un buen drenaje (Cáceres, Cruz, & Martínez, 2012).

II.3.8 Relaciones filogenéticas.

Smilacaceae se sitúa en el orden Liliales dentro del grupo Monocotiledoneae.

Algunas sinapomorfías del orden son: plantas geófitas; hojas elípticas, venación

fina reticulada, base no envainadora; tépalos grandes, androceo extrorso,

nectarios solo en los tépalos, óvulos tenuinucelados, varios por carpelo.

Smilacaceae es la familia hermana de Liliaceae con la cual no tiene

aparentemente sinapomorfías morfológicas/anatómica(Departamento de

Ecología & Ciencias Ambientales, 2006).

II.4 Usos tradicionales

“En la medicina tradicional, el rizoma se utiliza como remedio antiinflamatorio,

antifúngicos, anti-prurito, antiséptico, cicatrizante, diurético y tónico. Las

actividades antimicrobianas y anti-tumorales se atribuyen a parillina. Algunas

13

formas farmacéuticas están disponibles, tales como infusión, tintura, elixir,

loción” (Bhati, Singh, Anand, & Ram, 2011).

Cuculmeca o zarzaparrilla son otros de los nombres con los que se conocen

a las plantas de éste género, y se les atribuyen numerosas propiedades

medicinales entre ellas; afecciones a la piel y riñones, problemas estomacales,

artritis, entre otras (Bhati, Singh, Anand, & Ram, 2011).

II.5 Actividad antinflamatoria del género Smilax

El ser humano siempre ha usado las hierbas para curar o aliviar las

alteraciones que afectan a su salud.

Los egipcios desarrollaron un conocimiento muy completo acerca de los

tratamientos de origen vegetal. Sin embargo, a partir del siglo XX, la química

experimentó un avance que le permitió sintetizar productos de manera más

compleja y fabricar medicinas sintéticas(Uría, 2005, pg12).

Los extractos de las plantas, contienen los llamados componentes

secundarios que han sido tradicionalmente usados en la salud humana.

Presentan efectos positivos en ciertas enfermedades cardiovasculares, algunos

tumores, procesos inflamatorios, y en general donde la proliferación de radicales

libres representan un grave peligro, sin embargo la acción más importante de

estos compuestos es la antiséptica(Polin, Muro, & Díaz, 2014, pg28).

“La inflamación es fundamentalmente una respuesta de carácter protector,

cuyo objetivo es defender al organismo de la lesión iniciada por

microorganismos, toxinas, alérgenos, entre otros factores”(Parrales & Villamar,

2018).

14

En las pruebas biológicas de Xanthiumspinosum L.; Smilaxaspera L;

Urticaurens L; se demostraron buena actividad antinflamatoria frente al control,

sin embargo especies como: Verbena officinalis L. y Sambucusperuviana

presentan una baja actividad.

En Cuba el cocimiento del rizoma se usa como depurativo y sudorífico. Se le

atribuye, además propiedades anti-blenorrágicas, antiasmáticas y anti

herpéticas. Dice el citado autor que las raíces de Smilax son sudoríficos muy

empleados(Gonzáles et al., 2017).

II.6 Estudio Toxicológico

En Sao Paulo, se realizó un estudio cuyo objetivo comprendía la recopilación

de información sobre zarzaparrilla que allí se comercializan, evaluando la

diversidad genética de Smilax sprengy evaluar las condiciones de crecimiento y

la productividad de cinco especies de Smilax.

S. fluminensis posee un peso significativo de la biomasa subterránea, 188.3

g, a diferencia de otras especies cuyo valor es de 28,3 a 79,6 gramos, el estudio

antes mencionado demostró la alta diversidad genética entre la S. brasiliensis,

plantas pertenecientes al banco Centro Pluridisciplinal de Pesquisas Químicas,

Biológicas e Agrícolas (CPQBA), que fue confirmado por los resultados del

estudio de genotipificación, el cual utiliza un marcador de Simple Sequence

Repeats SSR en S. brasiliensis.

“El alto consumo de zarzaparrilla y el bajo rendimiento de las plantas jóvenes

cultivadas a partir de semillas con alta variabilidad genética refuerzan la

necesidad de nuevos estudios sobre la producción de Smilax”(Soares, Martins,

& Junior, 2014).

15

II.7 Propiedades

II.7.1 Acción hormonal

El extracto de la raíz de zarzaparrilla puede incidir de manera negativa

afectando a los órganos reproductivos. Sin embargo, por otro lado estimula a la

producción de hormonas en su cuerpo, aumentando los niveles de testosterona

y progesterona. Un elevado nivel de testosterona en el cuerpo despierta los

deseos sexuales en humanos.

II.7.2 Para la piel

La propiedad antiinflamatoria de la zarzaparrilla es utilizada en algunas

afecciones a la piel como eccema, psoriasis, dermatitis, lepra y picazón. Con

esta propiedad se confirma el efecto de este género.

II.7.3 Para el reumatismo

Los extractos de zarzaparrilla son también utilizados para tratar las

condiciones de reumatismo y artritis reumatoide.

El extracto de zarzaparrilla es generalmente tomado como tónico herbario

generalmente para debilidades físicas asociadas con el cuerpo humano. De

nuevo, las propiedades antiinflamatorias de la hierba se dice que son las

responsables de este efecto reductor de dolor (Montecel N. , 2016).

II.7.4 Desintoxicantes

Zarzaparrilla puede utilizarse para la remoción de metales presentes en el

cuerpo y la sangre. También actúa como purificador y desintoxicante herbario,

promoviendo la sudoración y orina excesivas con el fin de eliminar toxinas del

cuerpo.

16

Tabla III. Ventajas y desventajas de Smilax purhampuy

Ventajas Desventajas

La infusión del rizoma de esta planta posee excelentes propiedades diuréticas y sudoríficas.

Precauciones: dosis altas producen náuseas y vómitos.

Contiene glucósidos saponínicos, resina, y aceite esencial, que le confieren propiedades diuréticas, sudoríficas, depurativas, aperitivas y tonificantes.

No se recomienda el consumo de las bayas de la zarzaparrilla.

Favorece la eliminación de urea, de ácido úrico y de otros residuos orgánicos, y disminuye el nivel de colesterol en la sangre.

A dosis altas puede causar gastroenteritis.

Fuente: (Merino, 2017).

II.8 ESPECIE SMILAX purhampuy

Figura 1. Rizoma de smilax purhampuy

Fuente: (Autores)

Raíz muy corpulenta, algunas hasta del peso de 14 libras o más turmosa y

prolongada y a veces más o menos arredondeada, nudosa; con tubérculos o

hijuelos aovados y prolongados; maciza y pesada; por fuera de color rojo castaño

más o menos oscuro¸ poblada de fibras largas y filiformes.

Acabada de sacar de la tierra, de una consistencia tierna y de sabor grato,

algo viscoso y gelatinoso; después de seca, dura y más compacta por el centro

17

a causa de mayor porción de sustancia gelatinosa de que abunda en aquella

parte, y sin olor sensible(Gaston & Ruíz, 1852 pg134).

“Entre sus nombres comunes en Latinoamérica incluye Uva de perro

Zarzaparrilla, Sarsaparilla, Zarza. Smilaxrecibe su nombre de mito griego de

Crocus y la ninfa Smilax”(Parrales & Villamar, 2018).

En Perú se conoce a Smilax purhampuy como China Peruviana. Las raíces

del purhampuy se recolectan después que la planta haya dispuesto sus hojas y

semillas. Aquellas raíces más nutridas, lisas, compactas y pesadas, de colores

rojo castaño tiernos, jugosos ni excesivamente áridos y leñosos, son las que se

recolectan. Cuando se hallan muy tiernas y cargadas de jugosidad, indican no

estar en el estado de perfección, sin embargo cuando se hallan duras, leñosas y

se dificulta cortarlo en rebanadas, es señal de envejecimiento y alterados

algunos de sus principios constitutivos.

El tamaño y peso de las raíces de Purhampuy es muy variada, se registran

raíces turbosas cuyos pesos van desde una onza hasta catorce o más libras. En

las raíces de la Smilax purhampuy se encuentran asombrosos efectos

antisifilíticos que no se encuentran en la China Oriental.

“Los indios que han tomado la infusión de las raíces frescas de Smilax

purhampuy por veinte o cuarenta días manifiestan que pueden arrojar el mal por

la orina, por sudor y por traspiración, también añaden que quedan curados o

aliviados por largos periodos de tempo de los dolores reumáticos y artríticos, y

de cualquier otra molestia”(Ruíz, 1821).

18

Tabla IV. Taxonomía de Smilax purhampuy R.

Clase Equisetiopsida C. Agardh Subclase MagnoliidaeNováckk ex. Takht Superorden LilianaeTakht Orden Liliales Perleb Familia SmilacaceaeVent. Género Smilax L. Especie purhampuy Ruiz Nombre Científico Smilax purhampuy Ruiz Nombre vernáculo Zarzaparrilla

Fuente: (Parrales Cruz & Villamar León, 2018)

II.8.1 Importancia

La zarzaparrilla se obtiene de raíces de varias especies tropicales de Smilax.

Se cosechan cuando alcanzan los 3 años. Poseen una sustancia amarga

utilizada como aromatizante. La zarzaparrilla se mezcla con otras plantas, la

decocción de estas raíces se bebe como antisifilítico y antirreumático, en casos

de enfermedades de vías urinarias, vejiga y riñones, blenorragia y contra la

llamada orina ardiente.

Los tallos foliosos se consumen en decocción como digestivo, diurético y

antifebril. Se emplea también como depurativo sanguíneo y en aplicación externa

para curar enfermedades cutáneas. Los rizomas contienen saponinas y aceites

esenciales. Poseen geninas que se utilizan como precursores en la obtención de

cortisona. (Guía de Consultas Diversidad Vegetal, 2008).

II.8.2 Comparación con otra especie del género Smilax

En el año 2011 la Sociedad Coreana de preservación de alimento, realizó un

estudio sobre la actividad antimicrobiana en extractos etanólico y acuoso de la

especie de Smilax china obteniendo como resultado alta actividad antimicrobiana

en Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella typhymurium, y

19

Staphylococcus aureus, en ese orden. Las sustancias antimicrobianas en los dos

extractos se mantuvieron después del calentamiento a 65-125. °C durante 30

min. (Seo, Lee, Kim, Lee, & Lee, 2013)

II.9 Extractos

Los métodos de extracción utilizados farmacéuticamente implican la

separación de porciones medicinales activas de tejidos vegetales de los

componentes inactivos mediante el uso selectivo de disolventes. Durante la

extracción, los solventes se difunden en el material vegetal sólido y se solubilizan

compuestos con polaridad similar. (Pandey, 2013).

Los extractos consisten en la fracción no volátil de los principios activos, es

decir, aquellos que por no ser volatilizables o ser inestables con la temperatura,

no se pueden obtener mediante destilación, sino que se obtienen mediante

diversas técnicas de extracción que veremos a continuación.

El uso de extracto de plantas para el tratamiento medicinal se ha convertido

popular cuando la gente se dio cuenta que la duración del antibiótico es limitada

y el mal uso de los antibióticos tradicionales está causando resistencia en los

microorganismos (Sakha, Shrestha, & Dhakal, 2018).

La utilización de extractos crudos de partes de plantas, de propiedades

antimicrobianas conocidas es de gran importancia en los tratamientos

terapéuticos. La extracción es la separación de porciones médicamente activas

de los tejidos vegetales (Sakha, Shrestha, & Dhakal, 2018).

Para la obtención y análisis de los extractos de las plantas medicinales se

realiza la obtención de la muestra a partir de la materia prima. Se puede utilizar

la planta entera, por trozos, pulverizada, aceites esenciales o extractos. La

20

determinación del contenido de humedad, cenizas, residuo seco, y la obtención

de la fracción volátil y no volátil son distintos ensayos que se realiza a la materia

vegetal.

II.10 MICROORGANISMOS

II.11 FAMILIA: BACILLACEAE

Bacillaceae son taxones con varillas quimioorganotróficas aerobias o

facultativamente anaeróbicas que poseen estructuras de pared celular de tipo

Gram-positivo que forman endosporas. Los miembros aeróbicos o

facultativamente anaeróbicos de las Bacillaceae fueron, hasta principios de la

década de 1990, colocados dentro del género Bacillus, que se encontraba junto

a la clostridia estrictamente anaeróbica.

Desde entonces, se han producido importantes cambios taxonómicos y, en

consecuencia, la familia ahora alberga representantes del género Bacillus y otros

géneros recién formados con nomenclatura relacionada (Mandic-Mulec,

Stefanic, & van Elsas, 2015).

II.13 Género: Bacillus

Es un género de bacteria aerobios o anaerobios facultativos, formadores de

esporas, la mayoría Gram positivos y móviles. La forma de estas células son de

varilla, rectas o ligeramente curveadas, se presentan por separado y en pares,

algunos en cadenas y ocasionalmente, filamentos largos (Vos et al., 2011).

Se forman endosporas, no más de uno por célula, las cuales las hacen ser

resistentes a condiciones adversas; su motilidad es mediante flagelos perítricos

o degenerativamente peritricos. La mayoría de las especies crece en medios

21

rutinarios como es el agar nutriente y el agar sangre, la morfología de estas

colonias y tamaño son muy variables dentro de las especies (Vos et al., 2011).

Tabla V Taxonomía de Bacillus cereus

Dominio Bacteria Filo Firmicutes Clase Bacili Orden Bacillales Familia Bacillaceae Género Bacillus Especie B. cereus

Fuente: (Frankland, 1887)

II.14 Características de Bacillus cereus

B. cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio facultativo, esporulado y móvil

de aproximadamente 1.0 a 1.2 µm de ancho y de 3 a 5 µm de largo. Su espora

le confiere resistencia en condiciones ambientales extremas, tales como

calentamiento, congelación, secado y radiación; La temperatura optima de

crecimiento de B. cereus es de 30 a 40°C, aunque algunas cepas pueden crecer

a una temperatura de 55 °C, el rango de pH es de 4,5 a 9,5 con un pH óptimo de

6 a 7 (Fuentes, 2011).

En la década de 1950, Hauge demostró que el consumo de salsa de vainilla

contaminada con B. cereus puede causar diarrea. Desde el notable

descubrimiento de Hauges, se han descrito dos complejos de toxina (Nhe:

enterotoxinas hemolítica y Hbl: no hemolítica) y una toxina única (CytK: citotoxina

K), que generalmente se cree que contribuyen al tipo de intoxicación por los

alimentos, ocasionando diarrea (Ehling-Schulz et al, 2019).

HBL presenta actividad hemólitica y es considerada el factor de virulencia más

importante de B. cereus debido a que esta enterotoxina es responsable de

22

diferentes reacciones del microorganismo constituida por diferentes subunidades

(Sánchez, Correa, & Castañeda, 2016).

La Toxina no hemolítica (NHE), está formada por tres subunidades; la

subunidad NheA la cual actúa como componente citolítico y las subunidades

NheB y NheC que favorecen la unión a las células epiteliales del intestino

delgado. La enterotoxina NHE es codificada por 3 genes, los cuales conforman

el operón nhe, ubicado en el cromosoma de B. cereus y la citotoxina K (CytK)

forma poros en la membrana de las células epiteliales y tiene actividad

necrotizante y citotóxica (Sánchez et al., 2016).

Las enterotoxinas CytK–1 y CytK–2 codificadas por sus respectivos genes son

dos variantes de B. cereus y a diferencia de las demás enterotoxinas presentes

en este microorganismo, estas se diferencian por su efecto biológico en el cultivo,

donde CytK–1 presenta un efecto más tóxico que la variante CytK–2, y de esta

manera se podría decir que la enterotoxina Cytk-1 constituye un riesgo a nivel

del hombre (Sánchez et al., 2016).

El Bacillus cereus es considerado un patógeno de riesgo moderado directo,

de diseminación limitada, categoría 8 de la clasificación de la I.C.M.S.F.

nombrado así, según sus siglas en inglés (Comisión Internacional de

Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos).

La distribución de B. cereus es universal. Esta bacteria es de tipo ubicuo, por

lo tanto se encuentra distribuida en suelo, polvo, ambiente, de fácil propagación

a vegetales. En cuanto a su transmisión, no se transmite de persona a persona,

aunque sí puede multiplicarse en el medio en el cual se encuentre, comúnmente

en alimentos y gran parte están contaminados con esta bacteria, pero no

alcanzan la dosis infectiva, la cual es de aproximadamente 105 UFC/g (Uddin,

Ahmed, Pathan, Al-Amin, & Rana, 2015).

23

II.15 Acción patógena

Bacillus cereus produce dos enterotoxinas; durante su crecimiento

exponencial: la toxina diarreica y la toxina emética que dan lugar a dos distintas

formas clínicas de intoxicación alimentaria (Ehling-Schulz et al., 2019).

En cuanto al síndrome emético es ocasionado en la ingesta de un alimento,

al momento en que la bacteria ha producido la toxina cereúlida y cuando llega al

estómago del humano es liberada al duodeno, en esta parte interactúa con los

receptores de la 5-hidroxitriptamina (5-HT) del nervio vago, ocasionando el

vómito; esta toxina también puede inducir a la oxidación de los ácidos grasos en

las mitocondrias de los hepatocitos y como consecuencia ocasionar una

insuficiencia hepática.

El síndrome diarreico es el que se genera por las enterotoxinas Hbl, Nhe y la

CytK, las cuales al momento de ingerir el alimento contaminado, las esporas de

B. cereus colonizan las células epiteliales del intestino delgado del humano y en

su fase exponencial de crecimiento es donde se producen las enterotoxinas

(Bhunia, 2008).

El síndrome diarreico se manifiesta entre las ocho y diesciseis horas después

del consumo del alimento contaminado, refiriéndose al producto de la

estimulación del sistema del adenosin monofosfato cíclico (AMPc) y de la

formación de poros en la membrana de las células epiteliales intestinales,

ocasionando la perdida de sodio, cloro y agua, y como consecuencia se

desencadena un desequilibrio electrolítico.

24

Tabla VI Características de las patologías (B. cereus)

Tipo de intoxicación

Mecanismo que causa la

enfermedad

Síntomas

Dosis infecciosa

Emética Producción de toxina emética en el alimento (tóxina preformada).

Vómito: 1-5 horas después de la ingestión del alimento, Diarrea 8-16 horas después de la ingestión.

Mayor a 105 B. cereus/g

Diarreica Ingestión de células y esporas. Producción de la toxina en el intestino delgado

Diarrea acuosa, dolor abdominal después de la ingestión del alimento contaminado.

105 -108 células o esporas.

Fuente: (Fuentes, 2011)

En cuanto a su modo de transmisión se da en la ingestión de alimentos que

son mantenidos a temperatura ambiente, después de su cocimiento, la forma

emética se asocia frecuentemente con el arroz cocido.

II.16 Identificación

Según (Durán, 2011) B. cereus tiene la enzima que oxida la catalasa, ya que

este microorganismo posee lecitinasa, la cual tiene actividad sobre la yema de

huevo, produciendo un resultado positivo en la prueba de Voges-Proskauer, el

crecimiento en medios de cultivo es aeróbico, no hay producción de ácido ni gas

a partir de glucosa, lleva a cabo la reducción de nitratos a nitritos y no crece a

temperatura de 50 °C.

B. cereus es difícil de identificar, principalmente debido a la estrecha relación

entre este y otros miembros del grupo de B. cereus. La diferenciación

generalmente se logra mediante el crecimiento en medios selectivos seguidos

de una observación microscópica (Durán, 2011).

25

II.16.1 Pruebas de confirmación

Algunas pruebas específicas para distinguir a B. cereus de otros miembros de

la familia de B. son:

II.16.1.1 Métodos moleculares. La segunda generación de métodos

moleculares para la detección e identificación de géneros y especies son la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR múltiple, la secuenciación

de genes específicos, el análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado,

entre otros (Batt, 2014).

Cada una de las enterotoxinas está constituida por varias subunidades que a

su vez son codificadas por genes distintos. Para poder realizar un estudio

completo se debe detectar cada uno de los genes que pueden elaborar los

distintos componentes. Estos genes son el complejo de HBL, NHE y la cytK (Batt,

2014).

II.17 Resistencia

La prevalencia de infección clínica por B. cereus es baja, pero la mortalidad

es alta a pesar de tratamientos agresivos con diferentes antibióticos. B. cereus

generalmente produce -lactamasas y es por lo tanto uniformemente resistente

a los antibióticos betalactámicos, incluidas las cefalosporinas de tercera

generación (Park, Jeong, Park, & Koo, 2018).

La mayoría de cepas de B. cereus son sensibles a los agentes

antimicrobianos distintos de los antibióticos betalactámicos, algunos de ellos han

sido reportados como resistentes a la tetraciclina, eritromicina y rifampicina

(Ozcelik & Citak, 2009).

26

II.18 Antibióticos

B. cereus es susceptible a los aminoglucósidos, los cuales se descubrieron en

1944 y en cuanto a su modo de acción y espectro antibacteriano, se fijan en la

subunidad 30S del ribosoma, provocando una alteración de la síntesis de las

proteínas. Son activos in vitro sobre diferentes microorganismos, entre estos

están los bacilos gram positivos aerobios como: Listeria monocytogenes,

Bacillus spp., entre otros (Alfandari & Cannesson, 2016).

La vancomicina es un antibiótico glicopeptídico de uso parenteral obtenido de

la Nocardia orientalis. Solamente es eficaz solo contra bacterias gram-positivas;

en cuanto a su mecanismo de acción, este antibiótico es bactericida y sus efectos

los ejerce uniéndose a los precursores de la pared celular de las bacterias y de

esta manera impiden la síntesis de estas («Vademecum Nacional de

Medicamentos», s. f.).

II.19 Medios de cultivo

Figura 2. Colonias de Bacillus cereus en agar sangre Columbia.

Fuente: (López, 2018)

27

Para detectar la presencia de B. cereus y realizar diferentes pruebas

microbiológicas se deben utilizar medios de cultivo los cuales contengan

inhibidores y de esta manera impedir el desarrollo de otros microorganismos

presentes en la muestra.

Los medios de cultivo recomendados para la determinación de Bacillus cereus

son agar selectivo, agar yema de huevo-polimixina-rojo de fenol, agar yema de

huevo piruvato, agar Mueller-Hinton (MH).y agar sangre de caballo en el cual se

puede observar la hemólisis provocar por cepas de B cereus, entre otros

(Andrews & Wise, 2002).

II.19.1 Bacillus cereus Selectivo Agar

Uso: Medio diagnostico utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus

cereus en alimentos.

Fundamento: En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%)

y la adición de piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejoran el

aislamiento y esporulación de esta bacteria, además permite estudiar la actividad

lectinásica de los microrganismos. El manitol es el hidrato de carbono

fermentable y el azul de bromotimol es el indicador de pH que es de color azul y

en medio ácido cambia a color amarillo.

Puede lograrse el aislamiento selectivo de Bacillus cereus inhibiendo el

desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra.

28

Tabla VII Fórmula

Gramos por Litro

Peptona de carne 1,0 Manitol 10,0 Cloruro de Sodio 2,0 Sulfato de Magnesio 0.1 Fosfato Disódico 2.5 Fosfato Monopotásico 0.25 Azul de Bromotimol 0.12 Piruvato de Sodio 10.0 Agar 14.0 pH Final: 72 ±0.2

Fuente: («Laboratorios Britania S.A.», s. f.)

II.19.2 Agar MYP, Manitol-Yema de huevo y Polimixina.

(«Insumolab», s.f.)

Uso: Agar selectivo y diferencial recomendado para el aislamiento y recuento

de Bacillus cereus en muestras de alimentos y ambientales.

Fundamento: El agar MYP es un medio selectivo y diferencial, específico

para el aislamiento de B. cereus en alimentos. En el medio B. cereus no utiliza

el manitol y la mayoría de las cepas producen fosfolipasa C (lecitinasa).

El manitol es el carbohidrato y su fermentación es detectada por el indicador

de pH rojo fenol. La yema de huevo permite la detección de la actividad de

lecitinasa (precipitación). Polimixina B inhibe a microorganismos Gram (-) y el

NaCl mantiene el ambiente osmótico.

La peptona aporta la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono. El agar es

adicionado como agente solidificante.

29

Tabla VIII. Fórmula Agar MYP

Gramos por Litro

Extracto de carne 1,0 Peptona 10,0 Manitol 10,0 Cloruro de Sodio 10,0 Rojo de Fenol 0,025 pH Final: 72 ±0.2 a 25 °C

II.19.3 Mueller Hinton Agar

Uso: Medio de Cultivo recomendado universalmente para la realización de la

prueba de sensibilidad a los antimicrobianos.

Fundamento: Medio no selectivo que promueve el desarrollo microbiano. Por

su composición, ha sido utilizado en forma rutinaria para diferentes pruebas

microbiológicas, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetropina y

tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos microbianos crece

satisfactoriamente.

Tabla IX. Fórmula Mueller Hinton Agar

Gramos por Litro

Infusión de carne 300.0 Peptona Ácida de Caseína 17,5 Agar 15,0 pH Final: 7.2 ±0.1

Fuente: («Laboratorios Britania S.A.», s. f.)

II.20 FAMILIA: MICROCOCACEAE

Micrococaceae es una familia de bacterias Gram-positivas que incluye el

género Staphylococcus, conocido por abarcar varios patógenos médicamente

significativos. Los cinco géneros pertenecientes a esta familia son:

30

Jeotgalicoccus, Macrococcus, Nosocomiicoccus, Salinicoccus y Staphylococcus

han demostrado ser monofiléticos, mientras que Gemella parece ser polifilética.

El patógeno Staphylococcus aureus resistente a la meticilina es un miembro de

esta familia (Bot, 2018).

II.21 Género: Staphylococcus

El género Staphylococcus cubre un gran grupo de bacterias Gram positivas

que se clasifican taxonómicamente en familia Staphylococcaceae, orden

Bacillales, clase Bacilli, filo Firmicutes. Representando a uno de los cinco

géneros (por ejemplo, Jeotgalicoccus, Macrococcus, Nosocomiicoccus,

Salinicoccus y Staphylococcus) dentro de la familia Staphylococcaceae, el

género Staphylococcus es complejo y contiene 40 especies reconocidas (Liu,

2015).

De las especies de Staphylococcus identificadas hasta la fecha, 15 han sido

implicadas en actividades de infecciones. En particular, S. aureus que es

responsable de causar infecciones de la piel y enfermedades respiratorias y

además estas cepas son productoras de enterotoxina, por lo que cada vez

causan más intoxicación alimentaria en los humanos (Brooks, Carroll, & Butel,

2000).

Tabla X. Taxonomía de Staphylococcus aureus

Dominio Bacteria Filo Firmicutes Clase Bacili Orden Bacillales Familia Micrococaceae Género Staphylococcus Especie S. aureus

(Liu, 2015)

31

II.22 Características de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es un patógeno que puede colonizar el huésped

humano y causar graves enfermedades mortales. Esta bacteria puede residir e

infectar una amplia gama de tejidos del huésped, que van desde superficies

como la piel, hasta los tejidos más profundos, como en el tracto gastrointestinal,

el corazón y los huesos (Balasubramanian, Harper, Shopsin, & Torres, 2017).

Debido a su estilo de vida multifacético, S. aureus utiliza redes reguladoras

complejas para detectar señales diversas que le permitan adaptarse a diferentes

entornos, esta bacteria es anaerobia facultativa, grampositiva, productora de

coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada (Contero & Adriana, 2013).

A nivel nosocomial S. aureus es conocido como el principal causante de

infecciones y en cuanto al nivel de la piel de los seres humanos a través de las

heridas quirúrgicas, debido a que penetra el torrente sanguíneo del paciente y

se convierte en agente de infección (Seija, 2012).

Con el paso de los años, las infecciones por S. aureus han aumentado mucho

en los individuos, siendo una de las principales causas de infecciones

bacterianas humanas en todo el mundo, y las cepas de S. aureus resistentes a

la meticilina (SARM) han aparecido como importantes agentes etiológicos de la

infección (Baptista, Rocha, Cunha, Saraiva, & Almeida, 2016).

S. aureus puede crecer en un rango de temperatura de 15 a 45 grados y en

concentraciones altas de NaCl de hasta 15 por ciento. Casi todas las cepas de

S. aureus producen la enzima coagulasa, DNAs y catalasa positiva. Las colonias

de esta especie son de color amarillo dorado característico (Todar &

Bacteriology, 2015).

32


La patogenicidad de S. aureus depende de los componentes estructurales de

la pared celular, las toxinas y enzimas y dependiento de estos componentes se

ocasionan las respectivas infecciones características, algunas de ellas son

osteomielitis, la enteritis y la intoxicación alimentaria por enterotoxína (Contero

& Adriana, 2013).

II.23.1 Factores de Virulencia:

(Ordás & Carmen, 2006)

II.23.1.1 Componentes de la pared celular:

Peptidoglicano. Evita la lisis celular y es el componente básico de la pared de

s. aureus. Otra de sus propiedades es la de estimular la quimiotaxis y la

producción de pirógenos endógenos.

Ácido teicoico. Son polímeros de un polialcohol, proporciona soporte

estructural a la pared celular y su función es ayudar al estafilococo en la

adherencia a la fibronectina de las superficies mucosas.

Proteína A. Es específica de S. aureus y se une a la región Fc de la IgG,

inactivándola. De esta manera previene la eliminación del microorganismo

mediada por anticuerpos inhibiendo la osonización y la fagocitosis.

Capa de polisacáridos extracelulares. Facilita la adherencia de las bacterias a

cuerpos extraños. De 11 serotipos capsulares que se han descrito, el serotipo 5

y 8 se los relaciona con la mayor parte de las infecciones.

33

II.23.1.2 Enzimas.

Son sustancias que participan en zonas próximas para la patogenicidad del

microorganismo. Estas son:

Catalasa. El peróxido de hidrógeno lo transforma en agua, por lo que

resguarda al microorganismo en el proceso de la fagocitosis.

Coagulasa. Convierte el fibrinógeno en fibrina, por lo que hace más resistente

al s. aureus y permite la formación de abscesos, la detección de coagulasa libre

es la prueba que diferencia este microorganismo de los demás.

Hialuronidasa. Enzima que cataliza la destrucción del ácido hialurónico del

tejido conjuntivo, permitiendo el paso del s. aureusy propagando la infección.

Penicilinasa. Hidroliza el anillo b-lactámico que inactiva la penicilina.

II.23.1.3 Toxinas.

S. aureus es capaz de sintetizar muchas toxinas que producen su acción en

zonas diferentes al lugar infeccioso. Las más importantes son:

Hemolisinas. Sintetizada por la mayoría de cepas de S. aureus. La toxina alfa

es termolábil y es la más estudiada, produce toxicidad para otras líneas celulares

y es significativa para el hombre junto con la toxina delta, poseen capacidad

hemolítica y citolitica (Ordás & Carmen, 2006).

Toxina exfoliativa. Separación del tejido intraepidérmico, se han identificado

dos serotipos A y B y ambas pueden producir el síndrome de la piel escaldada,

debido a que la primera es termoestable de codificación cromosómica y la

segunda es termolábil de codificación plasmática (Ordás & Carmen, 2006).

34

Enterotoxinas. Son las responsables de las intoxicaciones alimentarias,

ocasionando emesis y cuadros diarreicos. Algunas Poseen características

propias de superantigenos.

Toxina-1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1). Proteína termoestable y

resistente a proteólisis que produce el TSST-1 al actuar como un superantígeno.

Esta toxina induce a la liberación de citosina por macrófagos y linfocitos T,

ocasionando un efecto citotóxico (Ordás & Carmen, 2006).


II.24 1 Análisis microbiológico.

En la identificación de S. aureus los medios de cultivo especiales son

indispensables, cada identificación se enfoca en las enzimas y toxinas que

produce este microorganismo, los medios para aislar esta bacteria son Baird-

Parker, agar salado manitol, agar estafilococos N° 110, agarDNAsa (Zendejas-

Manzo, Avalos-Flores, & Soto-Padilla, 2014).

II.24.2 Pruebas bioquímicas

Para el estudio del patógeno las pruebas o ensayos bioquímicos que se deben

hacer son las reacciones que permitan identificar la existencia de una enzima o

presencia de la bacteria en la muestra que se analiza. Las pruebas bioquímicas

necesarias para la identificación de los estafilococos son:

II.24.3 Prueba de la catalasa

La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y

oxígeno, las bacterias se protegen del efecto tóxico de este peróxido, el cual es

un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares (Seija, 2012).

35

II.24.4 Prueba de la coagulasa

S. aureus posee dos tipos de coagulasa, pero esta prueba permite identificar

al microorganismo debido a su coagulasa positiva, mientras que las otras

especies de estafilococos son coagulasa negativa (Seija, 2012).

II.25 Resistencia

Debido a las diferentes alertas a nivel mundial con respecto a la resistencia

antimicrobiana se plantean diferentes ideas.

La resistencia antimicrobiana ha sido reconocida por la OMS como una de las

mayores amenazas para la salud humana. La advertencia sobre su aumento no

es asunto nuevo e incluso poco después de su advenimiento, en un hospital de

Londres se halló que el 38% de cepas de Staphylococcus aureus fueron

resistentes a las penicilinas (Medina-Morales, 2015).

En los comienzos de la segunda década del siglo XXI, S. aureus fue el primer

microorganismo en evidenciar resistencia a la penicilina, posteriormente en 1957

cepas de este microorganismo presentaron resistencia a estreptomicina,

tetraciclina, cloranfenicol y eritromicina, a partir de 1959 introducen la meticilina,

pero en 1961 aparecen las primeras cepas resistentes a este antibiótico (Ordás

& Carmen, 2006).

Staphylococcus aureus es resistente a la penicilina debida a la producción de

la enzima penicilinasa (un tipo de ß-lactamasa) (Contero & Adriana, 2013).

Afirman: “Actualmente más del 90% de S. aureus producen esta enzima en

muchas regiones geográficas, en el Ecuador la resistencia a penicilina está en el

94%” (p.27)

36

El uso indebido de agentes antimicrobianos ha contribuido al aumento y

propagación de bacterias resistentes. El Staphylococcus aureuses resistente a

la meticilina (SARM) y representa entre el 60-70% de las infecciones en los

hospitales, causa el mayor número de infecciones invasivas, como bacteriemia,

abscesos cutáneos, neumonía y endocarditis (Alves et al., 2019).

II.25.1 Vancomicina

Es un glucopéptido que inhibe la síntesis de la pared celular por medio de la

unión a la terminación D-Ala-D-Ala del peptidoglucano. Durante mucho tiempo

ha sido el antibiótico de primera línea en el tratamiento de infecciones graves

causadas por SARM (S. aureus resistente a la meticilina) (Hiramatsu et al.,

2014).

Se han evidenciado estudios, donde el antibiótico vancomicina ya está

generando una resistencia frente al S. aureus, debido a que hay cepas con

sensibilidad disminuida al antibiótico, por lo que los diferentes tratamientos frente

a este medicamento están fracasando. De igual manera la vancomicina está

presenta efectos secundarios, particularmente en lo relacionado con la

insuficiencia renal aguda (Medina-Morales, 2015).


Figura 3. Características Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus

Fuente: (Lizcano & Vergara, 2008)

37

II.26.1 Agar Baird-Parker («BAIRD PARKER AGAR», 2009)

Uso: este Agar es recomendado para el aislamiento y enumeración de S.

aureus en muestras de alimentos, ambientales y clínicas.

Fundamento: fue publicada en 1962, es un medio parcialmente selectivo, y

aprovecha las diferentes propiedades del S. aureus, algunas de ellas

son:coagulasa positivo, reducir el Telurito Potásico y actuar sobre la Lecitina de

huevo, dando colonias negras (Telurito) rodeadas de un halo claro por ser

lecitinasa positiva.

Es un medio selectivo para el aislamiento de S. aureus y contiene las fuentes

de carbón y nitrógeno necesarias para soportar los crecimientos. Para la

inhibición de otras bacterias el medio tiene Cloruro de Litio y el Telurito, la yema

de huevo es el substrato que aporta la Lecitina para poner de manifiesto la

actividad lecitinasa, y la presencia de la Glicina y el Piruvato son factores que

potencian el crecimiento de los Staphylococcus.

Tabla XI. Fórmula Agar Baird-Parker

Gramos por Litro

Hidrolizado pancreático de caseína 10,0 Extracto de carne 5,0 Extracto de levadura 1,0 Cloruro de litio 5,0 Glicina 12,0 Piruvato sódico 10,0 Telurito potásico 0,1 Agar 20,0 Emulsión de yema de huevo 50,0

pH : 6.8 ±0,2

38

II.26.2 Mannitol Salt Agar (tankeshwar, 2013)

Uso: medio de cultivo sólido, selectivo y diferencial para el aislamiento de

cocos Gram positivos patógenos, especialmente Staphylococcus aureus.

Fundamento: La incorporación de cloruro de sodio al 7,5% en el medio ayuda

a seleccionar sólo aquellas bacterias que pueden tolerar altas concentraciones

de sal. Las especies de estafilococos son capaces de tolerar esta concentración

de sal, pero otras bacterias patógenas pueden no hacerlo.

Los estafilococos patógenos, es decir, Staphylococcus aureus, son capaces

de fermentar manitol (es positivo en la prueba de coagulasa), pero otros

(estafilococo coagulasa negativo) no lo son. Por lo tanto, si ese espécimen en

particular contiene S. aureus, fermenta manitol (cuando se produce ácido

fermentado del azúcar) y cambia el pH del medio a ácido.

Como el Agar manitol sal (MSA) contiene rojo de fenol como indicador de pH,

a niveles de pH inferiores a 6,9, el medio es de color amarillo. Pero si los

estafilococos Coagulasa negativos (CONS) crecen, no pueden fermentar

Manitol, por lo que el color del medio alrededor de la colonia bacteriana no

cambia a amarillo, sino que aparece rosado.

Tabla XII. Fórmula Mannitol Salt Agar

Gramos por Litro

Extracto de Carne bovina 1,0 Digerido pancrreático de caseína 5,0 Digerido péptico de tejido animal 5,0 Cloruro de Sodia 75,0 D-manitol 10,0 Rojo fenol 0.025 Agar 15.0 pH Final: 7,4 ±0.2

39

II.25.3 Agar Desoxirribonucleasa (DNAsa) («DNAsa Agar», 2015)

Uso: medio utilizado para la detección de enzimas desoxirribonucleasa. Con

este medio se diferencian diferentes especies entre ellas estafilococos.

Fundamento: en este medio la función dela tripteína proporciona nutrientes

para el adecuado desarrollo bacteriano. El cloruro sódico mantiene el equilibrio

osmótico. El alto nivel de ácido desoxirribonucleico molecular haceposible la

detección de la desoxirribonucleasa (DNasa) que despolimeriza el ADN.

Este medio se utiliza principalmente en la identificación de los estafilococos,

pero también puede usarse para la detección de la actividad de la DNasa en

otros microorganismos y de aquellos que no la poseen.

Tabla XIII. Fórmula Agar DNAsa

Gramos por Litro

Tripteína 20,0 Acido Desoxirribonucleico 2,0 Cloruro de Sodio 5,0 Agar 15,0 pH Final: 72 ±0.2 a 25 °C

II.27 FAMILIA: CRYPTOCOCCACEA

Según (Bennington, 1991) afirma:

“Cryptococcacea es una familia de hongos imperfectos, de la clase

Deuteromycetes, cuyos miembros son de tipo levaduriforme durante la

mayor parte de su ciclo vital. Ciertos géneros como Cándida, Cryptococcus,

Torulopsis y Pityrosporum son de importancia médica debido a su

patogenicidad para los seres humanos”.

40

II.28 Género: Cándida

La Cándida es un género de hongos diploides, polimórficos y oportunistas,

son también llamados levaduras. Estos hongos son la causa más común de

provocar micosis en todo el mundo; hay alrededor de 145 especies de Cándida,

de estas la Cándida albicans es la más patógena para el hombre, ya que causa

lo que se conoce como candidiasis, seguida por la C. tropicalis, C. stellatoidea,

C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. viswanathii, y C.

lusitaniae, en orden descendente de virulencia (Kumar & Jha, 2017).

Las especies que pertenecen al género Cándida se relacionan a menudo con

las diferentes patologías que se presentan en el humano, ya que son

microorganismos que se encuentran principalmente en mucosa oral, tracto

gastrointestinal y genitourinario femenino; el 90% de enfermedades a nivel

hospitalario son producidas por Cándida y Aspergillus, presentando una tas alta

de mortalidad (Castillo, 2016).

Las levaduras del genero Cándida generalmente crecen bien en medios

aerobios a un pH de 2.5 – 7.5, a una temperatura de 20 a 38°C, aunque C.

albicans crece mejor a un temperatura de 37°C. También pueden crecer con

elevadas concentraciones de dióxido de carbono (Barrionuevo, 1995).

Tabla XIV. Taxonomía Cándida albicans

Dominio Deuteromycota Clase Cryptococcaceae Género Cándida Especie Albicans

(Salazar & Jhoselin, 2018)

41

II.29 Características de Cándida albicans

Cándida albicans es una célula oval levaduriforme, de 2,5 por 3,14 μm y de

paredes finas, las cuales contiene los constituyentes micóticos típicos y además

compuestos no identificados que son tóxicos. La forma filamentosa del hongo

(hifa), es una estructura microscópica tubular. Este es un hongo dimorfo ya que

es capaz de producir hifas y micelios, y en ocasiones las blastosporas varían de

ovoide a elongada o esférica (Contero & Adriana, 2013).

A diferencia de las demás especies, C. albicans se distingue por su capacidad

de formar cuerpos terminales de pared gruesa conocidos como clamidosporos.

En un medio enriquecido como el agar extracto de maíz, se da a conocer la

presencia de células levaduriformes, las pseudihifas, verdaderas hifas y sus

clamidosporos (Barrionuevo, 1995).

El hongo Cándida albicans es un miembro común de la microbiota intestinal

humana. Es un organismo comensal que se puede encontrar con frecuencia en

el tracto gastrointestinal, el tracto urogenital, boca, piel y vías respiratorias de

adultos sanos; también es un patógeno micótico oportunista de los humanos y

puede pasar de ser un organismo comensal benigno a patógenico en huéspedes

inmunocomprometidos como los pacientes con VIH y los transplantados de

órganos hematopoyéticos o de órganos sólidos (Xu et al., 2019).

Cándida tiene dos formas de desarrollo: planctónica y en biopelícula y está

asociadas con la formación de biopelículas en la superficie de dispositivos

biomédicos, sin embargo también se forman sobre los tejidos nativos, por lo que

alrededor del 70% de las infecciones humanas son de carácter subagudo o

crónico (Del Pozo & Cantón, 2016).

Según (Costa, Pereira, Freire, Junqueira, & Jorge, 2013) “Las biopelículas de

C. albicans son las más estudiadas y están formadas por una red compleja de

42

células levaduriformes, hifas y pseudohifas interconectadas con una matriz

extracelular formada por múltiples biocapas. El mayor componente de la matriz

extracelular son los hidratos de carbono (39,6%, de ellos el 32,2% es glucosa, el

5% proteínas, el 3,3% hexosaminas, el 0,5% fósforo y el 0,1% ácido úrico)”


Cándida albicans es el patógeno más frecuente de otras especies y son

comensales normales del ser humano en las mucosas, esta levadura produce

enfermedades en aquellos organismos que tienen el sistema defensivo dañado

o disfuncional, niños pequeños y personas con SIDA.

Según (Contero & Adriana, 2013) el 50% de las personas poseen C. albicans

en su tracto gastrointestinal y alrededor del 30% de las mujeres tienen

colonización vaginal en algún momento, la portación vaginal es particularmente

prevalente durante el embarazo; la candidiasis es la más frecuente de las micosis

sistemáticas.

En la adherencia de C. albicans a las mucosas las células de levadura se

adhieren a las superficies de las células huéspedes mediante la expresión de

adhesinas, lo que facilita al microrganismo su conversión de forma comensal a

patógena (Mayer, Wilson, & Hube, 2013).

Hay algunos componentes que favorecen la adherencia de C. albicans, como

el fenotipo, temperatura, pH, la hidrofobia celular del hongo, entre otros. Algunos

microorganismos pueden afectar la adherencia de Cándida, por ejemplo los

Estreptococos y anaerobios orales; a diferencia de E. coli, el cual facilita la

adherencia (Olea Barrionuevo, 2006).

El segundo paso en la patogenia es la invasión del epitelio celular, y puede

utilizar dos mecanismos diferentes para invadir las células huéspedes las cuales

43

son endocitosis inducida y por medio de penetración activa el cual es un proceso

impulsado por hongos y requiere de las hifas viables presentes en C. albicans,

para que penetren la membrana de las células epiteliales (Olea Barrionuevo,

2006).

Como tercer paso esta la respuesta inflamatoria, donde se ocasiona también

un daño tisular y para completar la patógenesis de C. albicans ocurre la

alteración de las defensas inmunitarias del huésped, donde la función de los

neutrófilos y de linfocitos T puede ser excitada durante el curso de infección de

Cándida (Mayer et al., 2013).


Examen directo de la muestra: ayuda a diagnosticar las infecciones por

hongos y su apariencia morfológica. Estos exámenes se los puede hacer en

orina para infección de tracto urinario y biopsia de tejido hepático para el

diagnóstico de hepatitis candidiásica (Olea Barrionuevo, 2006).

II.31.1 Cultivos y morfología de las colonias

Candida albicans crece en agar Sabouraud donde se puede ver colonias

blancas, blandas, cremosas, con olor a levadura, agar sangre en el cual se

muestra un borde finamente estrellado las cuales son hifas o pseudohifas, soya

tripticasa y en otros medios enriquecidos, al ser cultivados a una temperatura de

25 a 37°C.

II.31.2 Características microscópicas

Pruebas fisiológicas para identificación: esta prueba se la realiza en un tubo

germinativo, el cual permite diferenciar las especies de Cándida albicans de las

no albicans, se debe incubar a 37°C durante dos horas, debido a que es el tiempo

para que C. albicans forme tubos germinales a diferencia de otras especies (Olea

Barrionuevo, 2006).

44

Examen microscópico: se debe observar levaduras redondas de 7 a 15 μm de

diámetro. Su principal características es la de presentar una cápsula que la

circunda, visible al examen directo con la tinta china (Medicina & Laboratorio

2010).

II.31.3 Identificación bioquímica enzimática

Se usan sustratos cromógenos para detectar la enzima MUGAL y PRO.

También se basa en la asimilación o fermentación de distintos carbohidratos

como maltosa (positivo), sacarosa (positivo), trehalosa (positivo), galactosa

(positivo), xilosa (positivo), rafinosa (negativo), lactosa (negativo), dulcitol

(negativo), melibiosa (negativo), ureasa (negativo), celiosa (negativo).

II.32 Resistencia

(Salazar & Jhoselin, 2018) indican que “la resistencia a los antifúngicos por

parte de los hongos se da mediante alteraciones en la permeabilidad de las

membranas, inactivación de antifúngicos por medio de sus enzimas hidrolíticas,

desvíos del ergosterol perdiendo así la capacidad de ataque de los fármacos”.

Según el estudio de (Bedout et al., 2003) las infecciones causadas por

levaduras del género Cándida han aumentado. Se consideraba que los hongos

eran regularmente susceptibles a los antimicóticos; sin embargo una década

más tarde la situación ha cambiado drásticamente al observarse aumento en la

frecuencia de candidemias debidas no sólo a C. albicans resistentes sino

también a especies diferentes; Los centros con el mayor número de C. albicans

resistentes al fluconazol fueron el Hospital Militar de Ecuador (7,2%) y el Hospital

Universitario de Caracas, Venezuela (5,9%).

Los antifúngicos más utilizados son los derivados imidazólicos (fluconazol,

itraconazol, ketoconazol, miconazol etc.), C. albicans puede adquirir resistencia

a un azol por las mutaciones moleculares de la enzima diana del antifúngico, o

por la formación de barreras de permeabilidad (López et al, 2016).

45

II.33 Antibióticos

Fármacos antifungicos: son aquellos fármacos con capacidad de evitar el

crecimiento de algunos hongos.

II.33.1 Ketoconazol

Este fármaco pertenece al grupo de medicamentos llamados antifungicos

derivado de imidazol autorizado por primera vez en España en 1982. Inhibe el

crecimiento de los hongos atacando directamente sobre su estructura celular

<ergosterol>, lesiona la membrana de la pared celular fúngica alterando su

permeabilidad y como consecuencia se puede producir la pérdida de elementos

intracelulares esenciales (Salazar & Jhoselin, 2018).

II.33.2 Nistatina

Medicamento empleado en infecciones por hongos actúa tanto como

fungistático como fungicida, en función de la concentración. La Nistatina a más

de erradicar el origen de las molestias ayuda a desaparecer la presencia del

hongo en la cavidad bucal al administrar el tratamiento, de manera tópica cada

ocho horas (Salazar & Jhoselin, 2018).

46


Figura 4. Características Macro y Microscópicas de Cándida albicans

Fuente: (Lizcano & Vergara, 2008)

II.34.1 Sabouraud Glucosado Agar (Gil, 2019a)

Uso: medio de cultivo sólido utilizado para el aislamiento, identificación y

conservación de hongos, como levaduras; mohos y dermatofitos

Fundamento: el medio de cultivo contiene peptona de caseína, alta

concentración de glucosa que actúa como fuente de energía y tripteína. La

presencia de cloranfenicol, pH ácido y la glucosa son ideales para recuperar

levaduras y hongos filamentosos, por lo que inhiben el crecimiento bacteriano.

Tabla XV. Fórmula Sabouraud Glucosado Agar

Gramos por Litro

Peptona 5,0 Tripteína 5,0 Glucosa 40,0 Cloranfenicol 0.05 Agar 15,0 pH Final: 5.6 ± 0.2

(«Britania», 2019)

47

II.34.2 Agar Sangre (Gil, 2019b)

Uso: medio de cultivo sólido enriquecido, diferencial pero no selectivo. Es

utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser

suplementado con sangre ovina permite el crecimiento de microorganismos

nutricionalmente exigentes.

Fundamento: agar con alto valor nutritivo, lleva como aditivo principal 5-10%

de infusión de músculo de corazón, lo cual permite el crecimiento de una gran

cantidad de microorganismos que crecen sin restricción.

Este agar sangre es un medio diferencial debido a la sangre ovina, ya que

permite distinguir 3 tipos de bacterias: los beta-hemolíticos, alfa –hemolíticos y

gamma-hemolíticos.

Tabla XVI. Fórmula Agar sangre

Gramos por Litro

Infusión de Músculo crazón 375.0 Peptona 10,0 GlucosaCloruro de Sodio 5,0 Agar 15,0 pH Final: 7.3 ± 0.2


II.34.3 Tripteína Soya Agar

Uso: agar soya tripticasa es un medio de cultivo sólido, no selectivo y nutritivo,

utilizado para diferentes propósitos. Se designa con las letras TSA por sus siglas

en ingles Trypticase Soy Agar. Está compuesto por tripteína, peptona de soya,

cloruro de sodio y agar-agar.

48

Por su fórmula es ideal para el cultivo de microorganismos moderadamente

exigentes y no exigentes, este agar también sirve como base para la preparación

de medios enriquecidos así como el agar sangre.

Fundamento: los aminoácidos, vitaminas, bases púricas y pirimidínicas son

nutrientes que aportan al medio de cultivo, al igual que la tripteína y la peptona

de soya, además de ser fuentes de hidrato de carbono.

El laboratorio («Britania», 2019c) indica que el agregado de 5-10% sangre

obvina desfibrinada estéril promueve el desarrollo de bacterias exigentes en sus

requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las reacciones de

hemolisis.

Tabla XVII. Fórmula Tripteína Soya Agar

Gramos por Litro

Tripteína 15.0 Peptona de Soya 5,0 Cloruro de Sodio 5,0 Agar 15,0 pH Final: 7.3 ± 0.2


II.35 Antibióticos y alertas de la OMS

II.35.1 Historia

Los antibióticos son considerados habitualmente como uno de los

descubrimientos terapéuticos más importantes en la medicina. Son agentes muy

eficaces y actúan de gran forma sobre el paciente que los recibe de una correcta

manera, en la actualidad es imposible estimar que una persona pueda vivir

correctamente sin utilizar ningún tipo de terapia con antibióticos.

49

El primer producto antibacteriano de origen natural fue descubierto por

Freudenreich al estudiar la piocianasa, un pigmento azul liberado por el “bacilo

piociánico” (hoy conocido como Pseudomonas aeruginosa). La liberación de la

piocianasa por la Pseudomonas en cultivo impedía el crecimiento de otras

bacterias (Bustamante & Carmita, 2017).

Los antibióticos inhiben diversos procesos metabólicos que son

fundamentales para la supervivencia del microorganismo. La especificidad

depende del bloqueo del fármaco sobre una enzima o sustrato que no se

encuentre en las células eucariotas humanas o distintas.

Según la OMS, pueden ser nombradas por categorías en dependencia a la

urgencia en que se necesitan los nuevos antibióticos; la prioridad crítica abarca

bacterias como Acinetobacter, Pseudomonas, entero bacterias como Klebsiella,

E. coli, Serratia y Proteus las cuales se caracterizan por su multiresistencia y su

riesgo radica principalmente en centros hospitalarios, asilo de ancianos y en

pacientes cuya atención está dada con ventiladores y catéteres intravenoso

La preocupación más seria con la resistencia a los antibióticos es que algunas

bacterias se han vuelto resistentes a casi todos los antibióticos fácilmente

disponibles. Estas bacterias pueden causar enfermedades graves y este es un

importante problema de salud pública (Services, 2019).

50

CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS

III.1 Tipo de Investigación

La disertación de este proyecto presenta un tipo de investigación exploratoria,

debido a que se desarrollan dos extractos, los cuales son etanólico y acuoso a

partir del Rizoma de la Smilax purhampuy, frente a tres microorganismos como

son: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Cándida albicans como agentes

causantes de diferentes enfermedades.

Esta investigación se va a realizar a partir de dos fases: fase de extracción y

fase microbiológica, las cuales serán detalladas en el punto de la metodología.

III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos

III.2.1 Equipos

Tabla XVIII. Equipos utilizados en la elaboración de extractos de Smilax

purhampuy

Equipos

Balanza analítica

Estufa de Secado

Tabla XIX. Equipos utilizados en el análisis microbiológico del extracto

etanólico y acuoso del rizoma de la Smilax purhampuy

Equipos

Incubadora

Mechero de Bunsen

51

III.2.2 Aparatos

Tabla XX. Materiales utilizados en la elaboración de extractos de Smilax

purhampuy

Materiales

Hornilla eléctrica

III.2.3 Materiales

Tabla XXI. Materiales utilizados en la elaboración de extractos de Smilax

purhampuy

Materiales Descripción

Erlenmeyer 250 mL

Papel aluminio

Probeta 10 mL

Embudo Vidrio

Papel filtro

Cristalizador sin pico Capacidad: 150 mL Diámetro: 80 mm Altura: 40 mm

Pipeta volumétrica 5 mL 10 mL

Pipeta automática 10 µl – 100 µl 100 µl – 1000 µl

Puntas para pipeta automática Azules y Amarillas

Tubos durham

Gradilla

Tabla XXII. Materiales utilizados en el análisis microbiológico del extracto


Materiales Descripción

Cajas Petri estériles Mono

Papel aluminio 6 mts

Pipeta automática 100 µl – 1000 µl

Puntas para pipeta automática Azules y Amarillas

Tubos durham

52

Pinzas

Lápiz graso

Algodón

Alcohol

Hisopos estériles

Tubo de ensayo pequeño

Asa en argolla

Gradilla

III.2.4 Reactivos

Tabla XXIII. Reactivos utilizados en la elaboración de extractos de Smilax

purhampuy

Reactivos Descripción

Agua Destilada

Etanol 96%

Dimetilsulfóxido (DMSO)

Tabla XXIV. Reactivos utilizados en el análisis microbiológico del extracto


Reactivos

Agua de peptona

Agar Muller Hinton

Discos en Blanco

Discos de Nistatina

Discos de Sulfametoxazol

Discos de Vancomicina

Tabla XXV. Cepas bacterianas utilizadas en el análisis microbiológico de

Smilax purhampuy

Cepas ATCC

Bacillus cereus 7464

Staphylococcus aureus 25923

Cándida albicans 10231

53

III.3 Muestra

El espécimen vegetal objeto del análisis microbiológico es el rizoma de la

Smilax purhampuy.

El presente trabajo de investigación se realizó en dos laboratorios de la

facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Estatal de Guayaquil, los

cuales fueron el laboratorio de PROGECA (Obtención de Extractos) y el

laboratorio Microbiología I (Análisis microbiológicos).

III.4 Metodología Experimental

III.3.1 Recolección del material vegetal

Los Rizomas de la especie vegetal Smilax purhampuy.se recolectaron en la

República del Ecuador, provincia de Francisco de Orellana en las coordenadas

1°10,03.7¨S 76°56´30.9¨W en el mes de Marzo y Abril en el año 2019.

III.3.2 Secado, molida y almacenamiento

Una vez realizada la descripción macromorfológica, se procedió a cortar en

pequeños trozos el rizoma y secarlo en una estufa, en un tiempo de 48 horas a

50°C, después se pulverizo en una licuadora y se lo almaceno.

III.3.3 Obtención de los extractos

Figura 5. Maceración etanólico. Elaborador por: (Autores)

Pesar 20 gr de

la muestra

Transferir a un

Erlenmeyer

(250 mL)

Adicionar 100 mL

de Etanol(96

%)

Rotular -Envolver

con papel

aluminio

Dejar en reposo por 48 hras

54

Figura 6. Maceración acuosa.

Elaborador por: (Autores)

La maceración obtenida a partir del rizoma de la Smilax purhampuy se

observó después de las 48 horas y se procede a la obtención del extracto.

III.3.3.1 Procedimiento después de la maceración etanólica

1. Pesar cristalizador vacío.

2. Filtrar la muestra, rotular, almacenar en refrigeración.

3. Concentrar el extracto seco en baño María.

4. Dejar enfriar

5. Hacer cálculos para el porcentaje de rendimiento:

%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛 = 𝐶𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜 − 𝐶𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑐𝑜𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

6. Adicionar el solvente DMSO (dimetil sulfóxido) a partir del resultado de la

diferencia de los cristalizadores.

III.3.3.2 Procedimiento después de Maceración acuosa.

1. Pesar cristalizador vacío

2. Filtrar la muestra, rotular, almacenar en refrigeración por 48 horas.

Pesar 20 gr de la muestra

Transferir a un

Erlenmeyer

(250 mL)

Adicionar 100 mL de agua destilada

Rotular -Envolver con papel aluminio

Dejar en reposo por 48 hras

55

III.3.4 Microorganismos

Los microorganismos utilizados para la prueba fueron 2 bacterias Gram

positivas Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 7464),

y un hongo, Cándida albicans (ATCC 10231).

III.3.5 Fármacos de referencia

Se utilizaron discos comerciales de Vancomicina, Nistatina y Sulfametoxazol

para el control positivo de actividad antimicrobiana.

III.3.6 Medios de cultivo

Se realizó la siembra de los microorganismos en Agar Mueller Hinton, las

cuales se incubaron a 35°C durante 24 horas, posterior a esta incubación se

sembró cada microorganismo en medios selectivos para cada uno. Para

Staphylococcus aureus BD Mannitol Salt Agar, para Bacillus cereus Agar Mueller

Hinton y Cándida albicans Agar sangre.

III.3.7 Concentraciones de los extractos

A partir de cada extracto (etanólico y acuoso), se prepararon concentraciones

al 100%, 75%, 50% y 25%, para agregar 50 µl de cada concentración en los

respectivos discos, siguiendo con el método establecido de Kirby-Bauer.

III.3.8 Método Kird-Bauer

III.3.8.1. Fundamento:

“Se basa en la inhibición del crecimiento bacteriano, mediante la difusión de

las sustancias activas en un medio sólido, la que se evidencia con la formación

de halos de inhibición” (Villafuerte & Boris, 2017). Este método está apoyado en

el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores, es uno de los métodos que el

N.C.C.L.S (National committee for clinical laboratory standards) recomienda para

la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos.

56

Este consiste en depositar en la superficie de una placa de agar MH

previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel de filtro

impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado en

antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro

absorbe agua y el antibiótico difunde por el agar, formándose un gradiente de

concentración. Transcurridas 18 a 24 horas de incubación, los discos pueden o

no aparecer rodeados por una zona de inhibición de crecimiento bacteriano.

Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato

de bario como estándar de turbidez que corresponde a un 0,5 del nefelómetro

de Mc Farland. La densidad se corrobora con un espectrofotómetro. Luego de

preparado el patrón de turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por

cada tubo). Estos deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de

la luz. Esta turbidez corresponde a 1.5 x 108 UFC/ml.

III.3.8.2 Desarrollo del Método de Kirby-Bauer:

Primera fase:

1. Con un asa bacteriológica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas

del mismo tipo morfológico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado,

como caldo MH.

2. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35°C 36 hasta que aparece una

turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 h). La turbidez se ajusta

con suero fisiológico estéril o caldo para obtener una turbidez visualmente

comparable a la de un estándar preparado previamente (llamado 0.5 de

Mc Farland).

3. Este estándar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma

visual con el inóculo preparado. Para ello se miran ambos tubos al mismo

tiempo contra un fondo blanco con una línea negra como contraste Este

método es recomendado cuando el cultivo tiene más de 24 h de

incubación.

57

Segunda fase:

1. Introducir el hisopo estéril en el inóculo bacteriano preparado, de manera

que quede completamente embebido. Antes de retirarlo se debe escurrir

sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo.

2. Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento confluente,

para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta

abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el procedimiento

rotando la placa 60° en dos oportunidades más. Deben extremarse los

cuidados en sembrar las placas de borde a borde.

3. Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos.

4. Colocar los discos. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza

estéril. Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos

levemente para que queden adheridos al mismo. Deben estar a más de 15

mm del borde de la placa y deben ser distribuidos de manera de que no

haya superposición de los halos de inhibición.

5. Dejar incubar a 37°C durante 24 horas y realizar la primera lectura de cada

halo de inhibición (mm), posteriormente dejar otras 24 horas, para cumplir

las 48 horas y hacer la segunda lectura.

6. Todos los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron tres (3) veces.

III.3.9 Lectura e Interpretación

Escala de Duraffourd: Escala utilizada para determinar el efecto inhibitorio in

Vitro, según diámetro de inhibición. (Llajaruna & Pilar, 2015)

Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.

Sensibilidad límite (sensible +) para un diámetro comprendido entre 8

a 14 mm.

Medio (muy sensible ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm.

Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm.

58

Tabla XXVI. Escala de Duraffourd

Nula - Menor o igual a 8 mm

Sensible + 9 – 14 mm

Muy sensible ++ 15 – 19 mm

Sumamente sensible +++ Mayor o igual a 20 mm

59

CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 27. Promedio de la Actividad antimicrobiana del extracto etanólico del

rizoma de la Smilax purhampuy comparado con Sulfametoxazol sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25924 in vitro.

Promedio del halo de inhibición de Staphylococcus aureus

Concentración

24 horas 48 horas

PROMEDIO mm

PROMEDIO mm

25% 9 12

50% 12 14

75% 12 15

100% 14 16

Antibiótico Sulfametoxazol

31

Elaborada por (Autores)

Análisis: el extracto etanólico tuvo un promedio de 16 mm a las 48 horas y el

antibiótico un diámetro de 31 mm. Aunque la diferencia de rango es amplia,

según la escala de Duraffourd el extracto seria sensible a partir de la

concentración del 25% y 50% y muy sensible al 75% y 100%.

Tabla 28. Promedio de la Actividad antimicrobiana del extracto etanólico del

rizoma de la Smilax purhampuy comparado con Vancomicina sobre cepas de

Bacillus cereus ATCC 7464 in vitro

Promedio del halo de inhibición de Bacillus cereus

concentración

24 horas 48 horas

PROMEDIO mm

PROMEDIO mm

25% 9 12

50% 12 14

75% 13 15

100% 14 16 Antibiótico

Vancomicina 21


60

Análisis: el poder inhibidor del extracto etanólico Smilax purhampuy es muy

similar al del antibiótico comercial Vancomicina, representando una buena

actividad antimicrobiana para este microorganismo.

Tabla XXVII7. Promedio de la Actividad antimicrobiana del Extracto etanólico

del rizoma de la Smilax purhampuy comparado con Nistatina sobre cepas de

Cándida albicans ATCC 10231 in vitro

Promedio del halo de inhibición de Cándida albicans

Concentración

24 horas 48 horas

PROMEDIO mm

PROMEDIO mm

25% 7 8

50% 9 9

75% 9 10

100% 10 10

Antibiótico Nistatina

25


Análisis: según la Escala utilizada para determinar el efecto inhibitorio in Vitro

(Escala de Duraffourd), el extracto etanólico del rizoma de la Smilax purhampuy,

C. albicans es sensible, debido a que el diámetro en esta concentración es de 9

mm y muy sensible para las concentraciones de 75% y 100%, en relación al

antibiótico, la diferencia es bastante alta con respecto a la longitud del halo, esto

puede ser debido a las diferentes propiedades de esta levadura y sus diferentes

mecanismos de defensa ante cualquier anti fúngico.

61

DISCUSIÓN

Se realizó una comparación de un estudio realizado en la Sociedad Coreana

de preservación de alimento, sobre la actividad antimicrobiana en extractos

etanólico y acuoso de la especie de Smilax China obteniendo como resultado,

presencia de actividad antimicrobiana tanto en el extracto etanólico como en el

acuoso. La zona de inhibición en el extracto etanólico varió de 22.3 (Bacillus

cereus) a 17.5mm (S. aureus) y en el extracto acuoso varía 16.3 mm (S. aureus)

y 20.7 (Bacillus cereus), mostrando un mayor halo de inhibición en el extracto

etanólico para la cepa de Bacillus cereus. Mientras que nuestro estudio de la

especie Smilax purhampuy en extracto etanólico la zona de inhibición varió de

16 mm (B. cereus y S. aureus) a 10 mm (C. albicans), se observó mayor actividad

frente a S.aureus y B. cereus y el extracto acuoso no presentó actividad

antimicrobiana (Yan, 2011).

Otro estudio realizado en la Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad

de Dibrugarh, Dibrugarh, Assam, India, sobre la actividad antimicrobiana en

extracto etanólico de la especie de Smilax perfoliata Lour se obtuvieron

resultados favorables de actividad antimicrobiana en el extracto etanólico contra

seis de las ocho cepas bacterianas y también inhibió los hongos. La zona de

inhibición varió de 10 ± 0 mm (S. epidermidis) a 13 ± 1 mm (P. mirabilis y B.

cereus). La actividad máxima se observó contra P. mirabilis y B. cereus. Mientras

que nuestro estudio de la especie Smilax purhampuy en extracto etanólico la

zona de inhibición varió de 16 mm (B. cereus y S. aureus) a 8 mm (C. albicans),

se observó mayor actividad frente a S. aureus y B. cereus y en extracto acuoso

no presentó actividad antimicrobiana (Borkataky, 2014).

En un trabajo de investigación sobre la actividad antimicrobiana de un extracto

etanólico de Smilax lanceifolia realizado en el Department of Pharmacy, Institute

of Medicine, Tribhuvan University, Nepal se obtuvieron resultados de los

extractos que se encontraban activos contra S. aureus, Enterococcus faecalis,

E. coli y Salmonela typhi pero no mostraron ninguna actividad contra P.

aeroginosa. La zona de inhibición varió de 5 mm (E. coli) a 20 mm (S. aureus).

62

La actividad máxima se observó contra Echerichia coli y Staphylococcus aureus.

Mientras que nuestro estudio de la especie Smilax purhampuy en extracto

etanólico la zona de inhibición varió de 16 mm (B. cereus y S. aureus) a 10 mm

(C. albicans), se observó mayor actividad frente a S. aureus y B. cereus y en

extracto acuoso no presentó actividad antimicrobiana (Prajapati, Mukunda, &

Bharti, 2014).

En el estudio de la actividad antibacteriana de extractos de hojas y frutos de

Smilax zeylanica, realizado en el Department of Microbiology, S.R.N.M.N College

of Applied Sciences, N.E.S campus, Balraj Urs Road, Shivamogga, Karnataka,

India, presento actividad en el extracto de hoja. La zona de inhibición en extracto

de hojas varió de 12 ±0.00 (S. typhimurium) a 22 ±0.00 mm (B. cereus) y en

extracto de frutos varió de 11±0.00 mm (S. typhimurium) a 14 ±0.05 (B. cereus).

Ambas hojas y los extractos de frutas inhibieron B. cereus y S. typhimurium en

mayor y menor medida respectivamente. En nuestro estudio de la especie Smilax

purhampuy en extracto etanólico la zona de inhibición varió de 16 mm (B. cereus

y S. aureus) a 10 mm (C. albicans), se observó mayor actividad frente a S. aureus

y B. cereus y en extracto a acuoso no presentó actividad antimicrobiana (Shree,

Ayesha, & Noorain, 2018).

Evaluación de actividad antimicrobiana en Smilax kraussiana Leaves,

realizado en el Department of Chemistry, University of Ibadan, Ibadan-Nigeria,

en este estudió se demostró la presencia de actividad en los extractos de

hexano, acetato de etilo y metanol. La zona de inhibición en extracto hexano fue

de 10 mm (Klebsiellae pneumonae) a 19 mm (S. aureus), en el extracto de

acetato de etilo varió de 10mm (Pseudomonas aeruginosa) a 15 mm (S. aureus)

y en el extracto de metanol varió de 13 mm (E. coli) a 23 mm (S. aureus), se

observó mayor actividad frente a S. aureus. En nuestro estudio de la especie

Smilax purhampuy en extracto etanólico la zona de inhibición varió de 16 mm (B.

cereus y S. aureus) a 10 mm (C. albicans), se observó mayor actividad frente a

S. aureus y B. cereus y en extracto acuoso no presentó actividad antimicrobiana

(HAMID & AIYELAAGBE, 2011).

63

CONCLUSIÓN

En el presente trabajo de investigación se determinó la actividad

antimicrobiana en los extractos acuoso y etanólico del rizoma de Smilax

purhampuy en lo que se evidenció la ausencia de actividad antimicrobiana en el

extracto acuoso al 100% de dicha especie, mientras que el extracto etanólico al

100 % presentó actividad antimicrobiana en todas las cepas estudiadas.

Se logró comprobar la existencia de actividad antibacteriana en el extracto

etanólico de Smilax purhampuy con mayor halo de inhibición para la cepa de

Staphylococcus aureus, seguido la cepa de Bacilus cereus y Cándida albicans

para lo que se realizaron diluciones al 100%, 75%, 50% y al 25% con la ayuda

del solvente Dimetilsulfoxido, agregando una concentración de 50 µL de cada

dilución.

Se relacionó los promedios de los halos de inhibición de los microorganismos

con los antibióticos comerciales, en el caso de Staphylococcus aureus el

antibiótico Sulfametoxazol fue de 31 mm, para Bacillus cereus la Vancomicina la

medición fue de 21 mm y por último para la levadura Cándida albicans la

medición del antifúngico Nistatina dio como resultado una medición de 25 mm.

Lo que indica que estos antibióticos comerciales presentaron mayor actividad

antimicrobiana.

64

RECOMENDACIÓN

1. Realizar estudios con otros solventes que también presenten actividad

antimicrobiana en la especie Smilax purhampuy en todas las cepas estudiadas.

2. Realizar el estudio de la actividad antimicrobiana del Rizoma de Smilax

purhampuy en técnicas diferentes, variando las condiciones desde la obtención

del extracto hasta la respectiva siembra.

65

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alfandari, S., & Cannesson, O. (2016). Aminoglucósidos. EMC - Tratado de

Medicina, 20(3), 1-4. https://doi.org/10.1016/S1636-5410(16)79473-6

Alves, F. C. B., Albano, M., Andrade, B. F. M. T., Chechi, J. L., Pereira, A. F. M.,

Furlanetto, A., … Fernandes Junior, A. (2019). Comparative Proteomics

of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Subjected to Synergistic

Effects of the Lantibiotic Nisin and Oxacillin. Microbial Drug Resistance

(Larchmont, N.Y.). https://doi.org/10.1089/mdr.2019.0038

Andrews, J. M., & Wise, R. (2002). Susceptibility testing of Bacillus species.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 49(6), 1040-1042.

https://doi.org/10.1093/jac/dkf063

Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., & Torres, V. J. (2017).

Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments.

Pathogens and Disease, 75(1). https://doi.org/10.1093/femspd/ftx005

Baptista, I., Rocha, S. M., Cunha, Â., Saraiva, J. A., & Almeida, A. (2016).

Inactivation of Staphylococcus aureus by high pressure processing: An

overview. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 36, 128-

149. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2016.06.008

Barrionuevo, D. O. (1995). Presencia de cándidas y su relación con los valores

CD4 en pacientes con infección por VIH (Http://purl.org/dc/dcmitype/Text,

Universidad de Granada). Recuperado de

https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=121798

Batt, C. A. (2014). BACILLUS | Bacillus cereus. En Encyclopedia of Food

Microbiology (pp. 124-128). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384730-

0.00019-7

66

Bedout, C. de, Ayabaca, J., Vega, R., Méndez, M., Santiago, A. R., Pabón, M. L.,

… Newell, V. (2003). Evaluation of Candida species’ susceptibility to

fluconazole with the disk diffusion method. Biomédica, 23(1), 31-37.

https://doi.org/10.7705/biomedica.v23i1.1195

Bennington, J. L. (1991). Diccionario enciclopédico del laboratorio clínico. Ed.

Médica Panamericana.

Bhunia, A. (2008). Foodborne Microbial Pathogens: Mechanisms and

Pathogenesis. Recuperado de

https://www.springer.com/gp/book/9780387745367

Bot, T. (2018). Staphylococcaceae. En Wikipedia. Recuperado de

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Staphylococcaceae&oldid=831

513217

Brooks, Geo. F., Carroll, K. C., & Butel, J. S. (2000). Microbiología médica (25a.

Ed.). (25a ed.). Recuperado de

http://public.eblib.com/choice/publicfullrecord.aspx?p=3214978

Bustamante, G., & Carmita, M. (2017). Atención farmacéutica en pacientes

pediátricos tratados con antibióticos para disminuir la resistencia

bacteriana en la Clínica Santa Anita Santo Domingo (Universidad

Regional Autónoma de los Andes). Recuperado de

http://localhost:8080/xmlui/handle/123456789/6417

Castillo, M. del C. L. (2016). Desarrollo de nuevas formulaciones tópicas de

anfotericina B para el tratamiento de micosis

(Http://purl.org/dc/dcmitype/Text, Universidad Complutense de Madrid).

Recuperado de https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=126108

67

Contero, T., & Adriana, J. (2013). Determinación de la Actividad Antimicrobiana

de los Extractos Etanólico y Subextractos Clorofórmico y Etéreo de Senna

multijuga, Tagetes zipaquirensis y Coursetia dubia. Recuperado de

http://dspace.espoch.edu.ec/handle/123456789/2449

Costa, A. C. B. P., Pereira, C. A., Freire, F., Junqueira, J. C., & Jorge, A. O. C.

(2013). Methods for obtaining reliable and reproducible results in studies

of Candida biofilms formed in vitro. Mycoses, 56(6), 614-622.

https://doi.org/10.1111/myc.12092

Del Pozo, J. L., & Cantón, E. (2016). Candidiasis asociada a biopelículas. Revista

Iberoamericana de Micología, 33(3), 176-183.

https://doi.org/10.1016/j.riam.2015.06.004

Deleuze, G., & Guattari, F. (2010). Texto clásico del pensamiento del siglo XX y

bibliografía de consulta obligada de los seminarios de la maestría. El

modelo rizomático propuesto por Deleuze y Guattari ha resultado crucial

para la filosofía de la ciencia, la semiótica y la teoría de la com.

DIFCO [Inserto]. (2009, septiembre). Recuperado 7 de agosto de 2019, de

Francisco Soria Melguizo, S.A. website: http://f-

soria.es/Inform_soria/Difco%20Fichas%20tecnicas/PLACAS%20DIFCO

%20Y%20CROMOGENICAS%20BD/FT%20BAIRD%20PARKER%20A

GAR.pdf

DNAsa Agar. (2015, noviembre). Recuperado 7 de agosto de 2019, de Britania

website:

https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28220e

1b707.pdf

68

Durán, I. Y. S. (2011). UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA. 61.

Ehling-Schulz, M., Lereclus, D., & Koehler, T. M. (2019). The Bacillus cereus

Group: Bacillus Species with Pathogenic Potential. Microbiology

Spectrum, 7(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3-0032-2018

Fuentes Rueda Sandra Liliana, E. M. N. (2011). Perfil-bacillus-cereus.pdf.

Recuperado de

https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/IA/INS/

Perfil-bacillus-cereus.pdf

Gil, M. (2019a). Agar Sabouraud: Fundamento, preparación y usos. Recuperado

12 de agosto de 2019, de Lifeder website:

https://www.lifeder.com/ciencia/biologia/

Gil, M. (2019b, enero 3). Agar sangre: Fundamento, usos y preparación.

Recuperado 12 de agosto de 2019, de Lifeder website:

https://www.lifeder.com/agar-sangre/

González, J., Cuellar, A., de-Armas, T., Gómez, E., & Dopico, E. (2017).

EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA Y FITOQUÍMICA PRELIMINAR

DE SMILAX DOMINGENSIS WILLD. / PRELIMINARY

PHARMACOGNOSTICAL AND PHYTOCHEMICAL EVALUATION OF

SMILAX DOMINGENSIS WILLD. Revista de Ciencias Farmacéuticas y

Alimentarias, 3(2).

HAMID, A., & AIYELAAGBE, O. (2011). The Screening of Phytoconstituents,

Antibacterial and Antifungal. Obtenido de Department of Chemistry,

University of Ibadan, Ibadan-Nigeria.

69

Hiramatsu, K., Kayayama, Y., Matsuo, M., Aiba, Y., Saito, M., Hishinuma, T., &

Iwamoto, A. (2014). Vancomycin-intermediate resistance in

Staphylococcus aureus. Journal of Global Antimicrobial Resistance, 2(4),

213-224. https://doi.org/10.1016/j.jgar.2014.04.006

Insumolab. (s. f.). Recuperado 6 de agosto de 2019, de

Yhttps://www.insumolab.cl/index.html

Kumar, A., & Jha, A. (2017). Chapter 1—Introduction. En A. Kumar & A. Jha

(Eds.), Anticandidal Agents (pp. 1-5). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-

811311-0.00001-6

Laboratorios Britania S.A. (s. f.). Recuperado 6 de agosto de 2019, de

https://www.britanialab.com/home

Liu, D. (2015). Chapter 55—Enterotoxin-Producing Staphylococcus aureus. En

Y.-W. Tang, M. Sussman, D. Liu, I. Poxton, & J. Schwartzman (Eds.),

Molecular Medical Microbiology (Second Edition) (pp. 979-995).

https://doi.org/10.1016/B978-0-12-397169-2.00055-X

Lizcano, A., & Vergara, J. (2008). EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES

ESENCIALES DE LAS ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa,

Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata

FRENTE A MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

(PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA). Recuperado de

http://repository.javeriana.edu.co/handle/10554/8688

Llajaruna, G., & Pilar, S. del. (2015). Efecto antibacteriano In Vitro del aceite

esencial de pelargonium hortorum sobre la cepas de pseudomonas

aeruginosa atcc 27853 y staphylococcus aureus atcc25923 (Universidad

70

Privada Antenor Orrego - UPAO). Recuperado de

http://repositorio.upao.edu.pe/handle/upaorep/1309

López, B. (2018, septiembre 11). Bacillus cereus: Características, morfología,

hábitat. Recuperado 14 de agosto de 2019, de Lifeder website:

https://www.lifeder.com/bacillus-cereus/

López-Ávila, K., Dzul-Rosado, K. R., Lugo-Caballero, C., Arias-León, J. J., &

Zavala-Castro, J. E. (2016). Mecanismos de resistencia antifúngica de los

azoles en Candida albicans. Una revisión. Revista Biomédica, 27(3), 127-

136.

Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., & van Elsas, J. D. (2015). Ecology of Bacillaceae.

Microbiology Spectrum, 3(2). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.TBS-

0017-2013

Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los

principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas. Parte 2.

(2010). Medicina & Laboratorio, 16(09-10), 469-488.

Mayer, F. L., Wilson, D., & Hube, B. (2013). Candida albicans pathogenicity

mechanisms. Virulence, 4(2), 119-128. https://doi.org/10.4161/viru.22913

Medina-Morales, D. (2015). Resistencia a antibióticos, una crisis global. Revista

médica de Risaralda, Rev. Méd. Risaralda 2015;, 74.

Olea Barrionuevo, D. (2006). Presencia de Candida albicans y su relación con

los valores de CD4+ en pacientes con infección por VIH. Recuperado de

http://digibug.ugr.es/handle/10481/1325

Ordás, B., & Carmen, M. (2006). Epidemiología de la resistencia a meticilina en

cepas de «Staphylococcus aureus» aisladas en hospitales españoles.

Recuperado de http://diposit.ub.edu/dspace/handle/2445/42524

71

Ozcelik, B., & Citak, S. (2009). Evaluation of antibiotic resistance of Bacillus

cereus isolates in ice-cream samples sold in Ankara. Turkish Journal of

Pharmaceutical Sciences, 6, 231-238.

Park, K. M., Jeong, M., Park, K. J., & Koo, M. (2018, junio 25). Prevalence,

Enterotoxin Genes, and Antibiotic Resistance of Bacillus cereus Isolated

from Raw Vegetables in Korea. - PubMed—NCBI. 31 August 2018, 81,

1590–1597.

Parrales Cruz, A. A., & Villamar León, J. L. (2018). Estudio farmacognóstico y

fotoquímico Preliminar de las hojas de Smilax Purhampuy.

Patricia. (2014). Medicina & Laboratorio (Vol. 20). Recuperado de

https://www.edimeco.com/medicina-laboratorio/2014/articulos-de-

investigacion/item/314-deteccion-directa-de-genes-toxigenicos-de-

bacillus-cereus-en-fecula-de-maiz-y-harina-de-trigo-mediante-reaccion-

en-cadena-de-la-polimerasa-multiple-mpcr

Prajapati, J., Mukunda, B., & Bharti, L. (2014). Analgesic and Antibacterial Activity

of Methanolic Extract of Smilax lanceifolia. International Journal of

Pharmaceutical & Biological Archives. Obtenido de Department of Clinical

Microbiology, Institute of Medicine, TribhuvanUniverstiy, Nepal

Sabouraud Glucosado Agar sin antibióticos. (2019a).

https://www.britanialab.com/productos/producto/2/medios_de_cultivo_de

shidratados/-/-/740/sabouraud_glucosado_agar_sin_antibi_ticos_

Salazar, V., & Jhoselin, M. (2018). Actividad antimicrobiana del extracto

hidroalcohólico de la planta Cassia reticulata sobre Cándida Albicans.

72

Estudio In Vitro. Recuperado de

http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/14483

Sánchez, J., Correa, M., & Castañeda, L. (2016). Bacillus cereus un patógeno

importante en el control microbiológico de los alimentos: Um patógeno

importante no controle microbiológico dos alimentos. Revista Facultad

Nacional de Salud Pública, 34(2), 230-242.

https://doi.org/10.17533/udea.rfnsp.v34n2a12

Sangre Agar (Base Columbia). (2019b). Recuperado 12 de agosto de 2019, de

https://www.britanialab.com/productos/producto/25/medios_de_cultivo_li

stos_para_usar_en_placas/-/-/267/sangre_agar_base_columbia_

Seija, V. (2012). Temas de bacteriología y virología médica. Recuperado de

https://booksmedicos.org/temas-de-bacteriologia-y-virologia-medica/

Services, D. of H. & H. (s. f.). Antibiotic resistant bacteria.,

https://www.betterhealth.vic.gov.au:443/health/conditionsandtreatments/

antibiotic-resistant-bacteria

Shree, D., Ayesha, A., & Noorain, S. (15 de Julio de 2018). Preliminary

phytochemical analysis, antimicrobial and antioxidant activity of

SmilaxzeylanicaL. (Smilacaceae). Journal of Drug Delivery and

Therapeutics. Obtenido de Department of Microbiology, S.R.N.M.N

College of Applied Sciences, N.E.S campus, Balraj Urs Road,

Shivamogga-577201, Karnataka, India.

tankeshwar. (2013, agosto 13). Mannitol Salt Agar (MSA): Composition, uses and

colony characteristics. Recuperado 7 de agosto de 2019, de

Microbeonline website: https://microbeonline.com/mannitol-salt-agar-

msa-composition-uses-and-colony-characteristics/

73

Todar, K., & Bacteriology, P. U. of W. D. of. (2015). Staphylococcus. Recuperado

de http://metabase.uaem.mx/xmlui/handle/123456789/1239

Tripteína Soya Agar. (2019c). Recuperado 12 de agosto de 2019, de

https://www.britanialab.com/productos/producto/2/medios_de_cultivo_de

shidratados/-/-/276/tripte_na_soya_agar

Uddin, M. N., Ahmed, T., Pathan, S., Al-Amin, M. M., & Rana, M. S. (2015).

Antioxidant and cytotoxic activity of stems of Smilax zeylanica in vitro.

Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 26(5), 453-

463. https://doi.org/10.1515/jbcpp-2014-0114

Vademecum Nacional de Medicamentos. (s. f.). Recuperado 6 de agosto de

2019, de http://anmatvademecum.servicios.pami.org.ar/index.html

Villafuerte, V., & Boris, D. (2017). Evaluación de la actividad antimicrobiana,

antioxidante y citotoxicidad de los extractos etanólico y acuoso de Tagetes

multiflora kunth “chinche”. Recuperado de

http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/7372

Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwig, W., Rainey, F. A., …

Whitman, W. B. (2011). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology:

Volume 3: The Firmicutes. Springer Science & Business Media.

Xu, Z.-L., Li, S.-R., Fu, L., Zheng, L., Ye, J., & Li, J.-B. (2019). Candida albicans-

induced acute lung injury through activating several inflammatory signaling

pathways in mice. International Immunopharmacology, 72, 275-283.

https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.04.026

Yan, M.-S. K.-B. (12 de Octubre de 2011). Antioxidant and Antimicrobial Activities

of Smilax china Leaf Extracts. Obtenido de

file:///C:/Users/User/Downloads/SPOSBX_2011_v18n5_764.pdf

74

Zendejas-Manzo, G. S., Avalos-Flores, H., & Soto-Padilla, M. Y. (2014).

Microbiología general de Staphylococcus aureus: Generalidades,

patogenicidad y métodos de identificación. Revista Biomédica, 25(3), 129-

143.

75

ANEXOS

Anexo A. Lavado y cortado del rizoma de la Smilax purhampuy

Anexo B. Secado del rizoma de la Smilax purhampuy

76

Anexo C. Preparación de extractos (Etanólico y acuoso)

Muestra para Extracto Etanólico

Muestra para extracto Acuoso

Maceración de Extractos (Etanólico y Acuoso)

77

Filtración extracto Etanólico Filtración extracto Acuoso

Extracto Etanólico y Acuoso

Secado del extracto Etanólico

78

Extractos finales (concentración 100%)

Concentraciones (etanólica y acuosa) al 100%, 75%, 50% y 25%

79

Anexo D. Método Kirby-Bauer

Impregnación de discos con los extractos (etanólico y acuoso)

Siembra de cepas

80

Fijación de bacterias (3 - 5 Minutos)

81

Anexo E. Medición de halos

Halo del antibiótico Sulfametoxazol sobre Staphylococcus aureus

82

Halo del antibiótico Nystatina sobre Cándida albicans

Halo del antibiótico Vancomicina sobre Bacillus cereus

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