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1
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACION
Tema: “DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA, SUB-TIPIFICACIÓN DE
Escherichia coli O157:H7 EN PRODUCTOS CÁRNICOS MOLIDOS
EXPENDIDOS EN MERCADOS DE LA CIUDAD DE GUAYAQUIL”
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS.
AUTORES:
GUAMINGA GUAMAN JHON RENATO
TUTILLO ZAMBRANO DAMIAN ORLANDO.
TUTOR:
Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO, Mgs.
CO -TUTOR:
BLGO., GUSTAVO SAÚL ESCOBAR VALDIVIESO, MSc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018-2019
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
Dedicatoria
El presente trabajo investigativo lo dedicamos principalmente a Dios, por ser el
inspirador y darnos fuerza para continuar en este proceso de obtener uno de los
anhelos más deseados.
A nuestros padres, por su amor, trabajo y sacrificio en todos estos años, gracias
a ustedes hemos logrado llegar hasta aquí ́y convertirnos en lo que somos. Ha
sido el orgullo y el privilegio de ser sus hijos, son los mejores padres.
A nuestros hermanos (as) por estar siempre presentes, acompañándonos y por
el apoyo moral, que nos brindaron a lo largo de esta etapa de nuestras vidas.
A todas las personas que nos han apoyado y han hecho que el trabajo se realice
con éxito en especial a aquellos que nos abrieron las puertas y compartieron sus
conocimientos.
XIV
Agradecimiento
Agradecemos a Dios por bendecirnos la vida, por guiarnos a lo largo de nuestra
existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de
debilidad.
Gracias a nuestros padres: Héctor Tutillo y Rosaura Zambrano; y, Lorenzo
Guaminga y Zoila Guaman, por ser los principales promotores de nuestros
sueños, por confiar y creer en nuestras expectativas, por los consejos, valores y
principios que nos han inculcado.
Agradecemos a nuestros docentes de la Facultad de Química y Farmacia de la
Universidad de Guayaquil, por haber compartido sus conocimientos a lo largo de
la preparación de nuestra profesión, de manera especial, a la Dra. María
Auxiliadora Alarcón tutora de nuestro proyecto de investigación quien ha guiado
con su paciencia, y su rectitud como docente, y a nuestro cotutor el Blgo. Saúl
Escobar por su valioso aporte para nuestra investigación.
XV
INDICE DE CONTENIDO Resumen XIX
ABSTRACT XX
INTRODUCCIÓN 1
Antecedentes 4
CAPÍTULO I: 6
EL PROBLEMA 6
I.1. Justificación. 6
I.1 Formulación del Problema 6
I.2. Objetivos. 7
Objetivo general 7
Objetivos Específicos 7
I.3. Hipótesis 7
I.4. Variable de estudio: 7
Capítulo II 9
Marco Teórico 9
II.1. Carne 9
II.2. Composición Química 10
II.3. Consumo 11
II.4. Escherichia coli 12
II.4.1. Aspectos Morfológicos 13
II.4.2 E.Coli Patogenas 13
II.4.3. Características generales del grupo Coli. 14
II.4.4. Signos clínicos 21
II.4.5. Periodo de incubación 22
II.4.6. Duración de la enfermedad y tratamiento 22
II.4.7. Toxina Shiga 23
II.4.8. Locus Lee 24
II.4.9. Diversos factores de virulencia de ECEH. 25
II.5. Epidemiologia 26
II.6. Prevención 28
II.7. Tratamiento 29
II.8. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7 29
XVI
CAPITULO III 32
Materiales y Métodos 32
III.1. Metodología 32
III.2. Tipo de Investigación 32
III.3. Diseño de Investigación 32
III.4. Población y Muestra 32
III.5. Tiempo de Investigación. 33
III.6. Lugar de investigación 33
III.7. Materiales y Equipo 33
III.8. Flujograma para el aislamiento e identificación de O157:H7 35
III.9. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7 36
CAPÍTULO IV. 39
RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 39
IV.1. Técnica de recolección de información. 39
CAPITULO V. 44
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 44
BIBLIOGRAFÍA 46
ANEXOS 50
XVII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I: Composición Química de la Carne (FAO, 2015). ................................ 10
Tabla II: Identificación bioquímica de Escherichia Coli (Rodriguez, 2015). ...... 15
Tabla III: Reactivos, funciones y sus marcas. .................................................. 34
Tabla IV: Equipos ............................................................................................. 35
Tabla V: Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas ..... 39
Tabla VI: Escherichia Coli 0157:H7 obtenidas mediante el ensayo Wellcolex
Látex. ............................................................................................................... 41
Tabla VII: Conservación del producto .............................................................. 43
ÍNDICE DE FIGURAS
Gràfica: 1 Presencia de Coliformes Totales y E.coli en muestras de carne molida
bovina ............................................................................................................... 39
Gràfica: 2 Presencia de Coliformes Totales en carne molida expendida en el
mercado de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil ................. 40
Gráfica: 3: Serotipo O157:H7 encontrados en Cepas de Escherichia coli aisladas
......................................................................................................................... 42
Gráfica: 4 Evaluación de las condiciones de expendio de la carne molida en los
mercados de estudio. ....................................................................................... 42
XVIII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el mercado
de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la Ciudad de Guayaquil ........................................... 51
Anexo 2: Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta. ......................... 59
Anexo 3: Resultados de la serotipificación de Escherichia coli ................................... 61
Anexo 4: Tabla bioquimica de identificación de microoganismos mas comunes (Carpio,
2017). ......................................................................................................................... 65
Anexo 5: Preparación de agar agua de peptona ........................................................ 66
Anexo 6: Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta ...................................... 66
Anexo 7: Preparación de agar soya tripticasa. ............................................................ 67
Anexo 8: Preparación de agar SIM ............................................................................. 67
Anexo 9: Preparación de agar Citrato Simmons. ........................................................ 68
Anexo 10: Preparación de agar Ureasa. ..................................................................... 68
Anexo 11: Preparación y siembra de la muestra. ........................................................ 68
Anexo 12: Procedimiento de pruebas bioquímicas. .................................................... 70
Anexo 13: Homogenización de la muestra en agua peptonada. ................................. 72
Anexo 14: Preparación de Agar Rojo Bilis- Cristal Violeta .......................................... 72
Anexo 15: Pruebas Bioquímicas ................................................................................. 73
Anexo 16: Preparación de Agar Citrato Simmons ....................................................... 73
Anexo 17: Escherichia coli obtenidas .......................................................................... 74
XIX
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
“DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA, SUB-TIPIFICACIÓN DE Escherichia coli O157:H7
EN PRODUCTOS CÁRNICOS MOLIDOS EXPENDIDOS EN MERCADOS DE LA CIUDAD DE
GUAYAQUIL”
Autores
JHON RENATO GUAMINGA GUAMAN
DAMIAN ORLANDO TUTILLO ZAMBRANO
Tutora:
Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO.Mg
Resumen
Escherichia coli O157:H7 es un serotipo enterohemorrágico que representa una seria
amenaza para la salud pública ya que produce el Síndrome urémico hemolítico (SUH) y
fallas renales. En Ecuador no existen investigaciones que aseguren la presencia de
E.coli O157:H7. El presente trabajo se realizó con la finalidad de detectar la presencia
de Escherichia coli O157:H7 en carne bovina molida comercializada en los mercados
de la ciudad de Guayaquil. El diseño de estudio que se utilizó fue tipo descriptivo,
observacional con una investigación no experimental, se sembró en agar rojo bilis neutro
cristal violeta. Se procedió a la identificación de Microorganismo y la posterior sub-
tipificación de la Cepa O157H7. Detectándose del total de cepas identificados como
Escherichia coli, un 20% de cepas pertenecientes al sub tipo O157H7. Se pudo evaluar
mediante un Check List las condiciones de almacenamiento y venta de la carne molida.
Palabras Claves: Escherichia coli O157:H7, Verocitotoxina, Carne Molida Bovina,
Wellcolex Látex
XX
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA UNIDAD DE TITULACIÓN
“MICROBIOLOGICAL DETERMINATION, SUB-TIFICIFICATION OF Escherichia coli O157:
H7 IN MILLED MEAT PRODUCTS AVAILABLE IN THE CITY OF GUAYAQUIL MARKETS”
Authors:
JHON RENATO GUAMINGA GUAMAN
DAMIAN ORLANDO TUTILLO ZAMBRANO
Advisor:
Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO.Mg
ABSTRACT
Escherichia coli O157: H7 is an enterohemorrhagic serotype that represents a serious general
threat to public health and that produces hemolytic uremic syndrome (HUS) and renal failure. In
Ecuador there are no investigations to ensure the presence of E. coli O157: H7. The presence of
Escherichia coli O157: H7 in ground beef sold in the markets of the city of Guayaquil. The design
of a study that has been done is a type of descriptive, observational activity with a non-
experimental investigation, it was sown in neutral red crystal violet bile agar. We proceeded to
the identification of Microorganism and the subsequent sub-typification of the O157H7 strain.
Detection of total strains such as Escherichia coli, 20% of strains belonging to subtype O157H7.
The checklist of the conditions of storage and sale of ground beef
Key Words: Escherichia coli O157: H7, Verocitotoxin, Bovine Ground Beef, Wellcolex Latex
1
INTRODUCCIÓN
El microorganismo Escherichia coli es un bacilo Gram Negativo, móvil y
anaerobio facultativo pertenece al orden de las Eubacteriales, familia
Enterobacteriaceae, Tribu Escherichieae, genero Escherichia, especie coli. Es la
especie anaerobia facultativa más abundante de la flora normal del tracto
intestinal del hombre y de algunos animales siendo pionera entre las primeras
especies en colonizar. Alcanza un tamaño entre 1 y 1,8 µm por 2 a 6 µm, puede
aparecer en pares o aislados, la estructura está constituida por una pared,
fimbrias, flagelos peritricos y una membrana externa. Algunas cepas de E.coli
son capaces de adquirir genes de virulencia móviles localizados en islas de
patogenicidad, bacteriófagos integrados y/o plásmidos, por esto pueden volverse
patógenas (Sanchez, Carpio Klanian, Mariel, 2015).
Entre los microorganismos patógenos que representan un alto costo
económico a la sociedad de muchos países se encuentran Escherichia coli
productor de verocitotoxinas (VTEC) de los serogrupos O157. Más de 250
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) son originadas por el consumo
excesivo de productos alimenticios, especies, bebidas o agua que contienen
cantidades suficientes de sustancias tóxicas o gérmenes patógenos.
La Escherichia coli O157:H7 es transmitida por los alimentos y se logra
concebir como el agente causante de la colitis hemorrágica y Síndrome Urémico
Hemolítico (SUH) en seres humanos. Este microorganismo posee una
extraordinaria capacidad para conseguir transmitirse desde reservorios animales
(vacas, cabras y ovejas) a través de una variedad de vehículos alimentarios que
2
juega un papel crítico en su patogenicidad, emplea múltiples mecanismos para
la colonización a través de la adhesión a las superficies celulares. Se adhiere
fuertemente a la piel, las hojas de espinaca y raíces de brotes de alfalfa
(Sanchez-Solis et al, 2015).
Los productos cárnicos conforman una importante fuente de contaminación
en relación con este microorganismo que es considerado como un patógeno
emergente transmitido por alimentos. Se relaciona con las enfermedades
extraintestinales severa, caracterizada por anemia hemolítica microangiopática
y falla renal aguda. La carne de res es el principal reservorio de E. coli productor
de toxina Shiga (STEC) O157 y no-O157, los alimentos de origen cárnico son la
fuente de infección más importante para el hombre (Jure et al. 2015).
Escherichia coli es una bacteria que se alberga, se alberga en el intestino del
ser humano y de distintos animales de sangre caliente, se transmite por la
ingesta de alimentos y agua contaminada, productos cárnicos pocos cocidos.
Puede causar una enfermedad con un amplio espectro de gravedad, desde
diarrea acuosa y colitis hemorrágica síndrome urémico hemolítico a (SUH), una
condición que amenaza la vida. La infección se correlaciona con la ingestión de
carne o verduras contaminadas, pero también se transmite por el agua o incluso
por el contacto de persona a persona. Los brotes esporádicos o masivos se han
reportado en los países desarrollados, pero en Argentina, el síndrome urémico
hemolítico muestra un patrón endémico y representa un problema de salud
pública grave con altas tasas de mortalidad y morbilidad. Escherichia coli O157:
H7 es el serotipo STEC dominante asociada con SUH en Argentina y en el
3
mundo, aunque serogrupos no O157 STEC puede causar una enfermedad
similar (Fernandez-Brando, Gonzales, Castillo, 2017).
Escherichia coli diarreogénicas en las Enfermedades Diarreicas (EDAS) en la
población infantil según un estudio, un estudio realizado sobre E. coli
enteropatógenas, en el año 1997 reportó que las ECTS están asociadas a las
(EDAS) en la población infantil. En este estudio se reportaron cepas de ECTS
sorbitol negativas las cuales están asociadas al serotipo O157:H7. Cepas
O157:H7 negativas no se incluyeron en el estudio (Gómez, 2014).
4
Antecedentes
La base trascendental de los brotes de E. coli productora de toxina Shiga son
los productos de carne molida cruda o poco cocida, hortalizas y leche cruda
contaminadas por materia fecal, se transmite al hombre principalmente por el
consumo de alimentos contaminados. En el 2011, el serotipo O104:H4 fue el
principal causante de un brote multinacional importante en Europa. En varias
zonas geográficas de los Estados Unidos y Canadá, la infección por E.
coli O157:H7 llego a ser la causa más común de disentería que la shigelosis o la
salmonelosis. El informe de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron
un aumento de estudio a Nivel Mundial, a partir de su primera descripción en
1982, el primer caso de intoxicación por consumo de hamburguesas se dio en el
mismo año, provocando gastroenteritis en el paciente (Astudillo, 2014).
En el sur del continente específicamente en Argentina, muchos trabajos
determinaron la preponderancia de Escherichia coli productora de Toxina Shiga
(STEC) del 3,8% en carne molida fresca, el 32% en hamburguesas de carne
molida y 8,4% en hamburguesas supercongeladas (Ripodas Navarro, 2017).
La E. coli O157:H7 (ECEH O157:H7) ha sido reconocida como la causa de
este síndrome desde el siglo pasado, específicamente en el año 1980. Los
rumiantes son los principales reservorios de la ECEH O157:H7, en especial el
ganado bovino y las ovejas, que se infectan sin presentar síntomas y eliminan el
organismo en las heces.
Estudios realizados sobre E. coli en el Reino Unido, Irlanda, Dinamarca,
Noruega, Finlandia, EE.UU, Canadá y Japón entre 1982 y 2006 demostró que la
5
fuente de transmisión mediante alimentos, fue de un 42.2% siendo las causas
productos lácteos un 12.2%, contacto de animales un 7.8%, agua un 6.7%,
medio ambiente un 2.2%, y otros factores en un 28.9% (Gonzales, 2010).
La proliferación de bacterias en la carne durante la faena es el principal modo
de contagio de E. coli O157:H7 a los alimentos; los productos elaborados con
carne molida han estado implicados en la mayor parte de la manifestación de
brotes sustancialmente vinculados al consumo de hamburguesas.
Uno de los primeros aislamientos de E. coli O157:H7 fue en el ganado bovino
de la Argentina (1977), en un bovino de menos de un mes de edad con
colibacilosis (Martez, Rivas, Motter, 2014).
A partir de su aislamiento e identificación como agente patógeno en el humano
por primera vez en el año 1982 en los EE.UU. a raíz de un brote de diarrea
hemorrágica, producto del consumo excesivo de hamburguesas elaboradas con
carne bovina, se ha incrementado la cifra de notificaciones de brotes y casos en
el mundo; se ha verificado en su contagio la participación de la carne molida con
un tiempo muy corto de cocción, entre otros alimentos que de ellos derivan como
la leche, carne y aguas con residuos fecales de animales como los principales
vectores (Márquez, 2013).
6
I. CAPÍTULO I:
EL PROBLEMA
I.1. Justificación.
En la actualidad en la ciudad de Guayaquil no existe un control de Calidad
adecuado para la comercialización de carne bovina molida, ni estudios
realizados sobre la posible presencia del serotipo O157:H7 productora de Toxina
Shiga perteneciente a Escherichia coli. Este microorganismo patógeno es el
causante de muchas enfermedades diarreicas y renales especialmente viéndose
afectada la población infantil, por ende, se ha decidido iniciar el estudio
microbiológico y sub-tipificación de E. coli O157:H7 en productos cárnicos
molidos en mercados de la ciudad de Guayaquil seleccionados estratégicamente
según el índice de consumo masivo que presenta la ciudad.
I.1 Formulación del Problema
¿La carne molida bovina expendida en los Mercados de la zona 1, zona 2 y
zona 3 en la ciudad de Guayaquil presentan contaminación por E.coli O157:H7?
7
I.2. Objetivos.
Objetivo general
Evaluar la presencia de Escherichia Coli O157:H7 en carne molida
comercializada en los Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 en la Ciudad de
Guayaquil”
Objetivos Específicos
✓ Detectar la presencia de coliformes totales mediante el método oficial AOAC
991.14.
✓ Identificación de Escherichia coli en carnes molidas mediante ensayos
microbiológicos.
✓ Sub tipificación de Escherichia coli O157:H7 enterohemolítica en productos
cárnicos molidos mediante el Ensayo de Wellcolex Látex
I.3. Hipótesis
La carne expendida en los Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 presenta
E.coli O157:H7 productora de Toxina Shiga
I.4. Variable de estudio:
Variable independiente: Lugares de expendio de productos cárnicos.
Variable dependiente: Presencia de E. coli O157:H7 en carne molida.
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Conceptualización: Es un microrganismo de la familia Enterobacteriaceae que
se encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre
caliente. Algunas cepas de E.coli, incluyendo E.coli 0157:H7 producen las
toxinas Shiga llamada, por sus siglas en inglés, STEC.
Indicador: Presencia, Determinación
9
II. Capítulo II
Marco Teórico
II.1. Carne
El Codex Alimentarius precisa la carne como todas las extremidades de un
animal que han sido declaradas como inocuas y preparadas para el consumo
humano. Es la composición de varios tejidos: tejido muscular, tejido conjuntivo y
el tejido graso, sus cualidades (textura, color, sabor) depende de la distribución
y proporción relativos de los tejidos (Araneda, 2018).
La alteración de la carne se debe a su determinada composición y a su
interacción con varios factores físico-químicos. Los más comunes son
enranciamiento, enmohecimiento, putrefacción y coloraciones anormales.
Las fases más relevantes para el control de la carne en el matadero son:
El desollado, es trascendental e importante en la supervisión de la carne
de bovino, ya que la piel del animal suele presentarse sucia e insalubre.
El eviscerado, se debe tener cuidado de enlazar bien el esófago y los
intestinos para prevenir que el contenido intestinal contamine la canal.
La inspección veterinaria oficial, debe inspeccionar en todas las fases y
condiciones del trabajo, así como todas las canales de los animales y sus
vísceras (Velez, 2015).
10
El almacenamiento de las carnes crudas, ya sea en el matadero, industria o
carnicería debe hacerse en excelentes condiciones de higiene y es muy
importante que la cadena de frio se mantenga estable y no se rompa.
II.2. Composición Química
La carne está compuesta de agua, minerales, vitaminas, grasa, proteínas y
ácidos grasos, así como también trazas de carbohidratos y otros componentes
bioactivos,
Tabla I: Composición Química de la Carne (FAO, 2015).
Agua Proteína Grasas Cenizas Kj*
Carne de
vacuno
(magra)
75.0% 22.3 1.8 1.2 485
Según la FAO (2015) hace referencia que la composición química de la carne
tiene como consecuencia sus altos índices de proteínas de calidad, que está
compuesta por vitaminas de elevada biodisponibilidad aminoácidos y
minerales. La carne presenta hierro y vitamina B12 en abundancia, que no se
los encuentra sencillamente libres en las dietas vegetarianas. Los productos
cárnicos de bovinos en su composición principal se observan los siguientes
porcentajes: agua 75%, proteínas del 20-30% (miosina, actina, globinas,
elastina, colágeno, mioglobina, tropomiosina y troponinas), grasas del 1-5%
(incluye colesterol y vitaminas liposolubles), glúcidos, cuyo porcentaje oscila
entre el 0,1-0,5 y por último vitaminas y sales minerales (FAO, 2015).
11
II.3. Consumo
El consumo de carne de vacuno aumentará de manera preponderante durante
los próximos 10 años. Para 2026, y en relación con el periodo base, se espera
que dicho consumo crezca casi un 6% en los países desarrollados, entretanto
que en las regiones en desarrollo se espera que se aumente en alrededor del
17%. En términos per cápita, el consumo de carne de vacuno del mundo en
desarrollo permanece relativamente bajo en comparación con los países que son
potencias mundiales, en alrededor de la cuarta parte en términos de volumen.
Las elevadas cifras de la población de Asia siguen siendo un gran impulsor
del crecimiento, en combinación con la percepción positiva de los acreedores
asiáticos de que las carnes de bovino y ovino sean saludables y estén libres de
la mayor parte de enfermedades; como resultado, se estima que durante la
siguiente década en Asia se registrará un incremento de 44% en el consumo de
carne de vacuno.
Si bien se espera que la demanda de carne se restaurará durante el periodo
de las perspectivas, especialmente en el mundo en desarrollo, básicamente
generalizando las tasas aproximadas serán menores que en los últimos 10 años.
El auge de este producto provendrá en su mayor parte del incremento de los
ingresos y de la población, sobre todo en naciones con clases medias de grandes
magnitudes de Asia, América Latina y el Medio Oriente. En las naciones que son
potencias mundiales, en los que el nivel de consumo es ya alto, la demanda de
carne seguirá incrementándose, en especial los Estados Unidos, aunque a
magnitudes generalmente menores que las de los países en crecimiento, donde
12
el crecimiento de la población suele ser mayor (OECD and Food and Agriculture
Organization of the United Nations, 2017).
Los altos niveles de contaminación de la carne son los agentes
microbiológicos, ya que además de provocar su degradación, ocasionan
enfermedades a quienes la consumen, pudiendo mencionar los patógenos que
se destacan entre ellos: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus,
Clostridium botulinum, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp,
Clostridium perfringens , Lsteria spp, Salmonella spp (Romeu, 2012).
II.4. Escherichia coli
Es una bacteria que fue descubierta en 1885 por el pediatra alemán, El Dr.
Theodor Escherich, que se ha transformado en uno de los microrganismos más
estudiados en microbiología (Bettelheim, 2015).
Escherichia coli es una bacteria que se alberga en el intestino de los seres
vivos de sangre caliente. La mayoría de las cepas no provocan daños mayores,
algunas tienden a llegar a causar una grave enfermedad producida por el
contagio alimentario. La infección por E. coli se transfiere comúnmente por el
consumo de alimentos o agua contaminados, como productos cárnicos de poca
cocción y leche cruda.
Los indicios de la enfermedad incluyen diarrea y cólicos, que puede ser
sanguinolenta. También puede presentarse fiebre y vómitos. La mayor parte de
13
los pacientes se logran recuperar en el lapso de 10 días, aunque en algunos
casos la enfermedad puede causar la muerte (OMS, 2018).
II.4.1. Aspectos Morfológicos
Escherichia coli es un bacilo recto, móvil, mide entre 1 y 1,5 um por 2 a 6 um.
Su estructura está compuesta por una pared bacteriana, fimbrias, flagelos
peritricos y una membrana externa. El antígeno superficial somatico se
encuentra determinado por los azucares de las cadenas laterales del
lipopolisacarido (LPS) que conforman la membrana externa de las gram-
negativas. Se trata de un polisacárido con estabilidad térmica, haciendo de un
enmascaramiento por el antígeno K (capsular) en bacterias que tienen capsulas
(Campos, 2016).
II.4.2 E.Coli Patogenas
Varias cepas de E. Coli son capaces de alcanzar genes de virulencia móviles
que se localizan en bacteriófagos, integrados y/o plásmidos, por esto se vuelven
patógenas (Campos, 2016).
Los patotipos asociados a enfermedades entéricas se clasifican en 6 tipos,
según sus factores de virulencia y mecanismos de acción:
● E.coli de adeherencia difusiva (DAEC)
● E.coli enteroagregarivo (EAEC)
14
● E.coli enteroinvasivo (EIEC)
● E.coli enteropatogenico (EPEC)
● E.coli enterotoxigenico (ETEC)
● E.coli verototoxigenico (VTEC)
● E.coli productor de toxina Shiga (STEC)
II.4.3. Características generales del grupo Coli.
Escherichia coli habita en el intestino del hombre de 2 a 3 horas después del
nacimiento y se estima de flora normal, sin embargo hay detallado e investigado
seis grupos de E. coli productora de diarrea: enteroagregativa (EAEC) ,
enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena
(EPEC), adherencia difusa (DAEC) y enterotoxigénica (ETEC).
La bacteria se puede deportar y determinar con métodos tradicionales con
matriz en sus características serológicas o bioquímicas, entretanto también se
puede llevar a temas de estudio más a fondo sus sistemas de patogenicidad por
medio de ensayos en animales o cultivos celulares, previamente aplicando
técnicas de biología molecular que constatan la afluencia de genes involucrados
en estos mecanismos.
Escherichia coli es un anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae,
tribu Escherichia, un bacilo gram negativo cuyas principales peculiaridades
bioquímicas se describe a continuación (Campos, 2016).
15
Tabla II: Identificación bioquímica de Escherichia Coli (Rodriguez, 2015).
Identificación Bioquímica de Escherichia coli
Prueba Bioquímica % de positividad
Oxidasa 0
Producción de indol 98
Rojo de metilo 99
Voges-Proskauer 0
Citrato de Simmons 1
H2S (TSI) 1
Hidrolisis de urea 1
Utilizacion de malonato 0
Acido de glucosa 100
Gas de glucosa 95
Fenilalanina desaminasa 0
Arginina dihidrolasa 17
Ornitina descarboxilasa 65
Movilidad a 36 grados Celsius 95
Hidrolisis de gelatina a 22 grados celsius 0
KCN crecimiento en 3
Fermentación de lactosa 95
Fermentación de la sacarosa 50
Fermentación de D-manitol 98
Fermentación de D-sorbitol 94
Fermentación de mucato 95
Fermentación de dulcitol 60
16
E.coli enterotoxigénica
Las ETEC dominan la mucosa del intestino delgado por medio de fimbrias o
pilis que poseen distintas formas denominadas CFA (colonization factor antigens
por sus siglas en inglés), siendo su primordial sistema de patogenicidad la
producción de alguna o ambas enterotoxinas llamadas: toxina termoestable (ST)
y toxina termolábil (LT). Sus genes se alojan en un plásmido que también podría
tener información genética para los CFA´s, pese a que distintos genes de ST se
han hallado en transposones.
Las toxinas ST y LT incrementan el nivel intracelular de cAMP y cGMP
respectivamente, que se ubican en la membrana de las células intestinales,
consecuentemente incitando la salida de iones y agua.
Las ETEC tienden a ser más relevante en lactantes, particularmente en niños
menores de dos años, y principalmente durante los primeros seis meses de vida.
La frecuencia de aislamiento de este grupo patógeno de E. coli en niños con
disentería es de 10 a 30% (Farfán, 2016). En los infantes y en adultos mayores
puede ser poco frecuente y asintomática o producir la disentería del viajero. La
enfermedad tiene un tiempo de incubación de 14 a 50 horas. El cuadro clínico
tiene la característica por diarrea aguda, sin pus, sin moco y en pocos casos se
presentan fiebre, vómito y generalmente sin sangre. La disentería ocasionada
por ETEC puede ser ligera, momentánea y autolimitada pero también puede ser
grave (Ayala, 2015).
La propagación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección,
siendo la dosis infectiva de 10 UFC (unidades formadoras de colonias).
17
E. coli enterohemorrágica
La EHEC con brotes caracterizados por disentería acuosa hemorrágica y poco
o nada de fiebre, dolor abdominal cuadro al que se le llamó colitis hemorrágica
(CH) y que era debido al consumo de carne cruda o mal cocida. El microrganismo
aislado de todos los casos fue E. coli del serotipo O157:H7. Se la relaciono con
casos esporádicos de síndrome urémico hemolítico (SUH) caracterizado por
trombocitopenia, anemia hemolítica microangiopatica y daño renal aguda,
precedida por disentería con sangre, con la presencia en heces de E. coli
productora de una citotoxina con actividad en células Vero, por lo que se le
denomina verotoxina (VT), y a las cepas que tienen la capacidad de elaborar se
les denominó E. coli verotoxigénicas (VTEC). Además, se logró observar que la
citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella dysenteriae
tipo 1, por lo que también se le llamó "shiga-like toxin" o toxina semejante a shiga
(SLT) o "shiga toxin" (STX), y a las E. coli que son capaces de producirla se les
otorga el nombre de STEC (Rodriguez, 2015).
El desplazamiento toxigénico de las cepas es necesaria para que el paciente
evolucione diarrea con sangre y colitis hemorrágica, ya que la citotoxina STX es
el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su producción va de la
mano con la presencia del bacteriófago STX, que se encuentra insertado en el
genoma.
La STX tiene su acción a la altura de la síntesis de proteínas ya que se junta
a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales del
hospedero. En las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes STX1
18
y STX2 que son inmunológicamente distintas, de tal forma que se pueden aislar
bacterias que produzcan alguna de las toxinas o ambas. Por otra parte, en la
toxina, las EHEC tienen más mecanismos de patogenicidad como el fenómeno
de esfacelación (A/E) y adherencia, y presentan el gen cromosomal eae que
codifica para la proteína de membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kDa),
se denomina intimina, cuya expresión es frecuentada por genes plasmídicos; el
gene eae también se encuentra en las cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad
es el plásmido pO157, de 60 megadaltones (MDa), que codifica para la
enterohemolisina (Rodriguez, 2015).
Otras clasificaciones en función del serotipo:
A. Cepas E. coli O157:H7. Este serotipo no fermenta el D-sorbitol ni la
ramnosa y no produce ß-glocuronidasa; esta bacteria tiende a producir
principalmente Sindrome Uremico Hemolitico (SUH) y CH. E. coli
O157:H7 se encuentra en borregos, bovinos, cabras y con menor
regularidad en pollos y cerdos; su principal alojamiento es el intestino
de ganado bovino. También se pueden recuperar de vegetales y frutas
como alfalfa, rábanos y lechuga; además en productos procesados
como mayonesa y jugos de manzana y naranja no pasteurizados, aun
así, cuando estos productos tengan un pH de 3.4, condición en la que
sobreviven varios días.
La transmisión de E. coli O157:H7 se puede dar por ingerir carne cruda o mal
cocida, leche recién ordeñada o no pasteurizada, agua contaminada; también se
puede repercutir de persona a persona. Hay erudiciones que proponen la
19
importancia de la mosca doméstica (Musca domestica) como vector en la
transmisión de E. coli O157:H7, y b) cepas no-O157:H7 cuya regularidad de
aislamiento es hasta 4 veces mayor que las O157:H7.
E. coli enteroinvasiva
El grupo EIEC y Shigella spp están enlazados bioquímicamente y
genéticamente ya que pertenecen al grupo de las descarboxilasas no móviles y
lactosa negativas. El sistema de patogenicidad de EIEC es la proliferación del
epitelio del colon; para ello uno de los primeros pasos es la unión de la bacteria
a las diversas vellosidades de la mucosa adquiriendo mucinasa y adhesinas,
para después inducir por endocitosis a la célula, para después multiplicar la EIEC
dentro de la célula y diseminación a células sanas adyacentes
Los síntomas comunes en personas infectadas por EIEC son disentería con
sangre, acuosa y moco, pero en varios casos sólo presentan disentería o diarrea,
ésta oportunamente es indiferenciable de la que genera ETEC. Las cepas EIEC
se compaginan más con brotes que con casos aislados, en los cuales el contagio
puede ser de individuo a individuo, por consumo de agua contaminada y
alimentos, transformándose en un patógeno relevante y grave en niños mayores
de seis meses (Rodriguez, 2015).
20
E. coli enteropatógena
EPEC fue el grupo pionero que se identificó serológicamente y se observó
casos clínicos en los cuales provocaron diarrea en infantes, siendo la conexión
su principal factor de patogenicidad. El método de acogida íntima entre la
membrana y la bacteria de las células del epitelio intestinal seguida de la
devastación de la microvellosidad con polimerización de actina, que lleva a la
modificación del citoesqueleto en el sitio de la vinculación de la bacteria, en
deuda al incremento de los niveles de proteína cinasa C y de calcio intracelular,
ha sido nombrado esfacelamiento (A/E) y adherencia. La adherencia está
mediada por fimbrias rizadas que se denominan Bfp (bundle-forming pilus) cuya
información genética está descrita en un plásmido de 50-70MDa llamado EAF
(EPEC adherence factor) y de varios genes cromosomales.
E. coli de adherencia difusa
Las cepas de E. coli de adherencia difusa, no crean microcolonias cuando se
adjuntan a células Hep-2. Existen pocos estudios de su mecanismo de
patogenicidad, pero se ha descrito una fimbria de superficie, haciéndose llamar
como F1845, dentro en el fenómeno de adherencia difusa. Los genes que se
encriptan para esta fimbria se pueden descubrir en el plásmido o en un
cromosoma. El acontecimiento de adherencia difusa también se ha vinculado
con una proteína de membrana externa de 100 kDa, en una cepa del serotipo
0126:H27, en los cuales existen genes que se han secuenciado, pero sólo se
han encontrado en una menor cantidad de cepas aisladas (Rodriguez, 2015).
21
II.4.4. Signos clínicos
La infección en humanos por E. coli O157:H7 puede ser desde asintomática
(raramente) hasta capaz de desarrollar diarrea aguda acompañada con sangre,
calambres abdominales severos, y/o síndrome urémico hemolítico. En algunos
casos el infectado se recupera rápidamente en una semana, mientras que en
otros su cuadro clínico evoluciona desfavorablemente a colitis hemorrágica en
cuestión de días. Los principales síntomas causados por la infección de E.Coli
provocan: dolores abdominales, diarrea intensa, fiebre, vómitos y mareos
(MayoClinic, 2018).
Un elevado porcentaje de los pacientes se rehabilitan en diez días, aunque en
varios casos el paciente enfermo desarrolla el llamado Síndrome Hemolítico
Urémico (SHU), un problema que produce anemia por la destrucción de los
glóbulos rojos e insuficiencia renal súbita. El resultado puede ser un deterioro
renal crónico o incluso el fallecimiento.
Este síndrome se caracteriza porque produce insuficiencia renal,
trombocitopenia y anemia hemolítica. Se encuentra presente en el 16% de los
pacientes que experimentan colitis hemorrágica, siendo los niños (menores de 5
años), ancianos y personas inmunodeprimidas quienes son más propensos a
padecerla, las personas adultas también tienden a desarrollar síndrome urémico
hemolítico provocada por una infección de E. coli o de otro tipo.
Otros síntomas de tipo extra intestinal también han sido reportados, tales
como: Accidentes cerebro vascular, edema cerebral, convulsiones, derrame
pleural, sobrecarga de líquidos y síndrome disneico en adultos
22
La púrpura trombocitopenia trombótica (TTP) es otra consecuencia potencial
del contagio con un sistema productor de toxina Shiga. Es común en individuos
adultos (especialmente ancianos) y aunque sus síntomas son similares al SUH,
se diferencia de ésta en el grado relativo de insuficiencia renal, ya que es menos
probable que causen daño renal, pero afecta con mayor intensidad al SNC
(accidente cerebro vascular, convulsiones, coma) resultando en muchos casos
mortal para el individuo (Salgado, 2015).
II.4.5. Periodo de incubación
El periodo de incubación de la enfermedad provocada por la ECEH O157:H7
va de 1 a 16 días. La mayor parte de las infecciones se manifiestan después de
3 a 4 días; por otra parte, el tiempo medio de incubación fue de 8 días en un
brote sucedido en una institución (OMS, 2017).
II.4.6. Duración de la enfermedad y tratamiento
La enfermedad tiende a durar entre 5 a 10 días después del periodo de
incubación y se trata únicamente cuando los síntomas que presenta el paciente
son: fiebre leve o ausente, disentería intensidad variable y calambres
abdominales. Cuando el paciente desarrolla SUH o PTT su tiempo de duración
es de 1 a 2 semanas, pero no hay que descartar un tiempo de prolongación en
casos más severo.
Los antibióticos son controvertidos y, generalmente, se los evita:
aparentemente, no alivian los síntomas, no previenen las complicaciones ni
reduce la expansión, y tiende a incrementar el nivel de presentar SUH. El empleo
23
de agentes que reducen la motilidad (antidiarreicos) en la colitis hemorrágica
puede aumentar el riesgo de brotar SUH. Las personas con alteraciones pueden
requerir de forma inmediata cuidados intensivos, incluyendo transfusión, infusión
de plaquetas y diálisis (Carpio, 2014).
II.4.7. Toxina Shiga
Las cepas STEC son productoras de potentes citotoxinas las cuales se
denominan toxinas Shiga (también conocidas como vero citotoxinas) Stx1, Stx2,
las cuales una vez estén libres en el intestino acceden a la circulación sanguínea
y provocan daños a nivel del endotelio vascular. La gravedad de las
enfermedades originadas, particularmente cuando afectan a la niñez, y las bajas
dosis infecciosas que caracterizan no sólo a los brotes sino también a los casos
con poca frecuencia (menos de 100 UFC/g), ha permitido clasificarlo como uno
de los patógenos contaminantes por los alimentos de elevado riesgo para la
salud pública (Marcozza, Marucci, Sica, & Alvarez, 2006).
Stx corresponde a una familia de proteínas estructural y funciona en
vinculación con la toxina Shiga producida por la Shigella dysenteriae. Ellas son
nombradas por un número o una combinación de letras y números. La toxina
Shiga tipo 1 (Stx1) presenta inoportunamente un sólo aminoácido con la toxina
Shiga de S. dysenteriae, mientras que la tipo 2 (Stx2) tiene solo 56% de identidad
con Stx12. Además, existen variantes de Stx2 que son más virulentas en el ser
humano, como es el caso de Stx2c y varias formas de Stx2d, que podrían ser
activadas por la elastasa en el mucus humano, la producción de Stx2 aumenta
el riesgo de SUH.
24
Si una persona ingiere alimentos contaminados, la toxina shiga de este
patógeno se combina y entra en contacto con las células endoteliales, actuando
sobre los glóbulos blancos de la submucosa, generando una respuesta
inflamatoria y un aumento de la expresión del receptor (Gb3). Una vez que la
subunidad B se encuentra unido al receptor de membrana, la subunidad A de la
Stx se suma a la célula por pinocitosis.
Si bien la citotoxicidad de Stx está enlazada a la expresión del receptor Gb3
en la superficie celular, la sensibilidad de una célula a la toxina no sólo se enlaza
con la cantidad de Gb3 expresado en su superficie sino también con la estructura
del receptor (Pistote Creydt, Virginia; Nuñez, Pablo; Brccoli, Javier; Silberstein,
Claudia; Zotta, Elsa; Goldstein, Jorge; Ibarra, Cristina; 2006).
II.4.8. Locus Lee
El locus de borrado de enterocitos (LEE) es una isla de patogenicidad de 35.6
kb insertada en el genoma de algunas bacterias como Escherichia coli
enteropatógena, E. coli enterohemorragica, citrobacter, rodentium y Escherichia
coli. LEE abarca los genes responsables de causar lesiones adjuntas y borradas,
una lesión característica que implica la adhesión íntima de bacterias a los
enterocitos.
Está compuesto por 41 marcos de lectura abiertos y cinco operones
principales que codifican un aparato de sistema tipo tres, proteínas secretadas,
una adhesina, llamada intimina, y su receptor llamado receptor de intimina
translocado (Tir).
25
Estos locus están conformados por 5 operones, de las cuales el LEE1, LEE2
y LEE3 codifican para un sistema de secreción de tipo III “SST3” (Palma, 2015).
El sistema SST3 se encarga de transportar las diversas proteínas efectoras
hacia la célula diana. Este sistema está constituido por 20 genes no es único de
ECEH, sino de otras bacterias gram negativas como Hafnia Alvei y Citrobacter
rodentium que también lo usan para contagiar y conllevar a una infección a
plantas, humanos y animales. Poseen diversas series de chaperonas, las cuales
permiten a las proteínas efectoras ser más eficiente, de esta manera mejora el
reconocimiento y estabilidad del sustrato.
II.4.9. Diversos factores de virulencia de ECEH.
Existen otros factores que utilizan estas bacterias para afectar al ser humano,
pueden encontrarse codificados en el genoma bacteriano. Estos factores se
pueden dividir en 6 grupos: proteasas, toxinas, fimbrias, factores necrotizantes,
adhesinas no fimbriales y proteínas efectoras.
Toxinas: La enterohemolisina (HylA) es una toxina elaborada por las cepas
SETC, que tiene como función lisando los grupos hemos de las células
eucariotas.
Fimbrias: Estas presentan distintos tipos de fimbrias en E. coli las cuales
ayudan a colonizar la célula enteritica.
Factores necrotizantes: Existen tres tipos de factores necrotizante: CNF1,
CNF2 y CNF3 (Garcia, 2016).
26
Adhesinas no fimbrilares: dentro de las adhesinas no fimbriales se
encuentran: el factor inhibidor del ciclo celular (Cif), proteína capaz de bloquear
el ciclo celular.
Proteasas: Se describieron distintos tipos de proteasas, las cuales fueron: la
catalasa/peroxidasa (KatP), la metaloproteasa (StcE) o la serin proteasa (EspP).
II.5. Epidemiologia
La E.coli elabora grandes cantidades de una o más toxinas, las cuales causan
daños severos en la mucosa intestinal, la enfermedad aguda causada por la
bacteria Escherichia coli O157:H7 se denomina Colitis hemorrágica.
Su intoxicación generó una gran alerta a nivel internacional por la cantidad de
seres humanos afectados y por el sin número de formas de contagio ya
identificados (vegetales, aguas, alimentos ácidos, aguas de consumo), lo que
llevó a la Organización mundial de la salud a estimular y procrear campañas de
prevención y control.
Las EHEC constituyen más de 100 serotipos que son productoras de toxina
Shiga y toxinas similares a Shiga (E. coli productoras de toxina Shiga [STEC]).
La E. coli O157:H7 es la STEC básicamente más conocida en América del Norte.
Por otra parte, los serotipos de STEC no O157 (especialmente O26, O45, O91,
O103, O111, O113, O121, O128 y O145) tienden y/o pueden provocar
enfermedades enterohemorrágicas, sobre todo en los exteriores de los EE.UU.
La infección dada por E. coli O157:H7 es capaz de presentarse en seres
27
humanos de todas las edades, aunque los cuadros clínicos de mayor gravedad
son más regulares en niños y en ancianos.
La Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) es un serotipo de E. coli
patógenas, que provocan disentería o diarrea hemorrágica en las personas. En
ciertos casos, la disentería hemorrágica conlleva a provocar el síndrome urémico
hemolítico (SUH), un factor muy importante para causar insuficiencia renal aguda
en infantes, morbilidad y mortalidad en personas adultas. En las personas de la
tercera edad la tasa de letalidad por el SUH puede elevarse al 50%.
Las naciones en las que hay mayores problemas de estas infecciones por
ECEH, sobre todo el serotipo O157:H7, son EE.UU., Argentina y Nueva Zelanda.
Es posible que se deba a los malos hábitos alimenticios, tales como el
incremento diario en la dieta de cantidades abundantes de carnes rojas
(Argentina) o el exceso de las comidas rápidas (EEUU). Sin embargo, en la
última década se están infiltrando infecciones asociadas al consumo de
hortalizas.
En Australia las infecciones por ECEH no-O157, fundamentalmente O111,
son más comunes que las de O157. Respecto a Latinoamérica, en Colombia se
comunicó en forma preliminar que E. coli O157:H7 fue el patógeno responsable
del 7,2% de los casos de diarrea y que el 6,5% del ganado era portador de este
patógeno. En Chile y Argentina, ECEH O157 y no-O157 está asociado a casos
de colitis y SUH. Durante el año 2002, se informó el primer caso que vincula a E.
coli O157:H7 con episodios de diarrea sanguinolenta o SUH en Uruguay
(Astudillo, 2014).
28
II.6. Prevención
La prevención y control requieren un enfoque en la producción animal y vegetal,
así como enfoques relacionados en peligro a lo largo de la cadena de provisión
de alimentos. Éstos incluyen la aplicación de, Buenas Prácticas de Fabricación
(BPF), Buenas Prácticas Agrícolas (BPA), Análisis de Peligros y de Puntos
Críticos de Control (APPCC), Buenas Prácticas de Higiene (BPH), desde la
granja hasta llegar al consumidor.
La publicación conjunta FAO/FIL “Guía de Buenas Prácticas en Explotaciones
Lecheras” y el manual FAO “Buenas Prácticas para la Industria de la Carne”, así
como la fabricación de elementos de capacitación y programas de intervención
para la creación de capacitaciones en cuanto a la manipulación y la producción
de la leche y controles de calidad, son algunos ejemplos de las iniciativas de la
FAO para ayudar a evitar las infecciones por E. coli (Org, 2016).
Figura 1: Síndrome clínicos provocados por Eschercihia Coli patógenas (Molina, 2015).
29
Existen diferentes tipos de prevención de E.Coli:
La forma más sencilla para prevenir la propagación es un cuidadoso lavado
de las manos, antes de preparar los alimentos, después de manipular carne
cruda, después de la preparación de alimentos.
Cocción completa de todos los alimentos derivados de animales,
especialmente la carne molida.
Colocar un termómetro para afianzar que la temperatura interna de cocido es
correcta. La temperatura correcta es de 160 grados Fahrenheit para la carne
de res y cerdo, y de 185 grados para las aves.
II.7. Tratamiento
En la actualidad no existen tratamientos por la infección de E. coli, en la
mayoría de los casos el tratamiento consiste en: descanso y consumo excesivo
de agua para prevenir la deshidratación y la fatiga (Campos D. A., 2018).
Es prohibido el consumo de medicamentos antidiarreicos, pues desaceleran el
sistema digestivo y no le permiten al cuerpo deshacerse de las toxinas. En
términos generales no se recomiendan los antibióticos porque tienden a
aumentar el riesgo de complicaciones graves (Campos D. A., 2018).
II.8. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7
Wellcolex E.Coli O157:H7 es un ensayo de aglutinación de latex para la
posible identificación de los aislados de Escherichia coli O157:H7 en medios de
30
laboratorio. El ensayo contiene dos reactivos: el reactivo del ensayo O157 está
formado por partículas de látex de color rojo recubiertas de anticuerpos
específicos frente al E. coli tipo O157. Si se mezcla una gota del reactivo con
una suspensión de organismo de E. coli en una tarjeta de reacción (efecto), se
produce una aglutinación rápida debida a la interacción de las IgG específicas y
del antígeno lipopolisacarido del tipo O157.
De forma parecida, el reactivo del ensayo H7 está formado por partículas de
latex de azul recubiertas de anticuerpos específicos frente a E. coli tipo H7.
31
Glosario
Intoxicaciones alimentarias. - Son las manifestaciones clínicas de toxicidad
consecuente a la exposición a sustancias tóxicas transmitidas por alimentos tanto
sólidos como líquidos, la intoxicación ocurre tras la ingestión de alimentos contaminados
con sustancias orgánicas e inorgánicas, tales como: venenos, toxinas, agentes
biológicos patógenos, metales pesados, etc (Cortés, 2011).
Pinocitosis: Es un tipo de endocitosis que consiste en la captación de material del
espacio extracelular por invaginación de la membrana citoplasmática. Con desunión
hacia el interior celular de una vesícula que contiene líquido con posibles moléculas
disueltas o partículas sólidas en suspensión (Doctissimo, 2017).
Serotipo. - Tipo de microorganismo infeccioso clasificado según los antígenos que
presentan en su superficie celular. Los serotipos permiten diferenciar organismo nivel
de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología (Sánchez, 2013).
Síndrome urémico hemolítico. - Es un trastorno que ocurre generalmente cuando una
infección en el aparato digestivo produce sustancias toxicas. Estas sustancias toxicas
destruyen los glóbulos rojos, causando lesión a los riñones.
Serotipificación.- Proceso que permite determinar y distinguir las especies de bacterias
en antígenos que comparten.
32
III. CAPITULO III
Materiales y Métodos
III.1. Metodología
La realización del presente trabajo investigativo, corresponde a la
identificación de E.Coli O157:H7 en carne bovina molida expendida en los
Mercados de la zona 1, zona 2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil. Se
recolectaron un total de 100 muestras: 35 muestras de carne molida de res en
El Mercado de la zona 3, 15 muestras en el Supermercado de la zona 2 y 50
muestras en el Mercado de la zona 3.
III.2. Tipo de Investigación
Descriptivo con un enfoque cuantitativo.
III.3. Diseño de Investigación
El presente estudio es de tipo no experimental de corte transversal, debido a que
la recolección de los datos fue en un tiempo determinado.
III.4. Población y Muestra
La población y/o lugar de estudio se realizó en los mercados: de la zona 1, zona
2 y zona 3 de la ciudad de Guayaquil. El muestreo fue de tipo no aleatorio en los
meses: noviembre y diciembre del año 2018, recolectándose un total de 100
muestras durante este periodo de tiempo.
33
III.5. Tiempo de Investigación.
El presente trabajo de investigación fue realizado en 2 meses, específicamente
en los meses de noviembre y diciembre del año 2018.
III.6. Lugar de investigación
Se procedió con la recolección de las muestras en los mercados de la zona 1,
zona 2 y zona 3, trasladando las muestras para posterior investigación en el
laboratorio de microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad de Guayaquil.
III.7. Materiales y Equipo
Material de campo
● Fundas herméticas
● Hielera
● Rotulador (Marcador)
Materiales para el Laboratorio:
● Tubos de ensayo
● Cajas Petri
● Algodón
● Guantes
● Cofia
● Espátula
● Asa Microbiológica
● Mandil
34
Tabla III: Reactivos, funciones y sus marcas.
Reactivo Función Marca
Agar agua de
peptona
Medio de enriquecimiento no selectivo utilizado
para recuperar células de enterobacterias
dañadas
BD
Agar rojo-bilis
neutro cristal
violeta
Medio de cultivo de microorganismos, tanto
selectivo. Como diferencial. Que se usa para la
identificación y enumeración de coliformes
BD
Pruebas
bioquímicas
Medios utilizados para pruebas bioquímicas
aplicados a medios biológicos en los cuales es
conocida su reacción, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes.
BD
Agar TSI Medio universalmente empleado para la
diferenciación de enterobacterias
BD
Agar soya
tripticasa
Medio de cultivo recomendado para la
recuperación y aislamiento de toda clase de
bacterias, Gram-positivas t Gram-negativas
aerobias.
BD
Agua libre de
iones
Solvente empleado para disolver los medios de
cultivo.
--
Alcohol Potable Solvente utilizado para desinfectar el área de
trabajo
Ecuainsum
os
Fuente: Realizado por sus autores.
35
Tabla IV: Equipos
Equipo Función
Balanza digital Pesar muestra.
Incubadora Crecimiento y almacenamiento de cultivos
Bacterianos.
Micropipetas Empleado para absorber y transferir
Pequeños volúmenes de líquidos.
Vortex Homogenizador de soluciones.
III.8. Flujograma para el aislamiento e identificación de O157:H7
Pesar la muestra Homogenizacion de
la Muestra
Siembras en : Agar Rojo bilis Cristal-
Violeta
Cultivo en Agar TSIPruebas
Bioquimicas
Siembra de colonias de E.coli en Soja
Tripticasa
Identificacion de E.coli O157:H7
mediante el ensayo Wellcolex
Obtencion de Resultados
Figura 2: Secuencia de análisis.
36
Procedimiento.
La presente investigación sobre la E. coli O157:H7 causante del Síndrome
Urémico Hemolítico (SUH) y problemas renales se realizó en el laboratorio de
microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad de Guayaquil. Las muestras recolectadas fueron inicialmente
obtenidas y rotuladas de los 10 sitios de ventas del mercado de la Zona 1, Zona
2 y Zona 3. Posteriormente se las colocó en una hielera para el traslado al
laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad de Guayaquil. En el laboratorio se procedió a pesar la muestra,
realizar la dilución correspondiente en agua de peptona, homogenizar y sembrar
en agar rojo bilis neutro cristal violeta de acuerdo a la norma AOAC 991.14. Para
la posterior identificación y aislamiento de E. coli se realizaron pruebas
bioquímicas y se conservaron las cepas de E. coli en Agar soya tripticasa para
posterior sub-tipificacion la cual fue realizada en el Centro de Investigaciones
Microbiológica (CIM) del Dr. Henry Parra.
III.9. Wellcolex Latex de Identificación para el Serotipo 0157:H7
Wellcolex E.Coli O157:H7 es un ensayo de aglutinación de latex para la
posible identificación de los aislados de Escherichia coli O157:H7 en medios de
laboratorio. El ensayo contiene dos reactivos: el reactivo del ensayo O157 está
formado por partículas de látex de color rojo recubiertas de anticuerpos
específicos frente al E. coli tipo O157. Se mezcla una gota del reactivo con una
suspensión de organismo de E. coli en una tarjeta de reacción, se produce una
37
aglutinación rápida debida a la interacción de las IgG específicas y del antígeno
lipopolisacarido del tipo O157.
De forma parecida, el reactivo del ensayo H7 está formado por partículas de latex
de azul recubiertas de anticuerpos específicos frente a E. coli tipo H7.
Sensibilidad y Especificidad.
Se estimó que la sensibilidad del ensayo Wellcolex E. coli O157 con este grupo
de cultivos es del 100% (12/12) con un límite inferior de confianza del 95% -
98,8%.
Se estimó que la especificidad del ensayo Wellcolex E. coli O157 con este grupo
de cultivos es del 99,7% (12/12) con un límite superior e inferior de confianza de
95% del 98,2% y del 99,9%, respectivamente.
Limitaciones del Ensayo
● Solo se debe analizar colonias que estén bien aisladas. Los cultivos positivos se
deben identificar mediante pruebas bioquímicas para confirmar la presencia de
E. coli y se deben analizar para detectar la producción de verocitoxina.
● Ni el agar MacConkey con sorbitol, ni este ensayo pueden confirmar que un
aislado contenga una cepa que produce verocitotoxina. No todos los aislados
que producen Verocitotoxina pertenecen al serotipo O157 ni todos los aislados
O157 producen verocitototxina.
38
● Se debe tener cuidado cuando se analicen cultivos de E. coli O157 para detectar
el antígeno H7. Las E. coli varían en su expresión de los antígenos flagelares y
los aislados inicialmente negativos en un ensayo serológico para detectar el
antígeno H se debe volver a analizar después de haber estado en medios
apropiados para aumentar la motilidad antes de concluir que no expresan
sensibilidad y especificidad de la prueba.
39
IV. CAPÍTULO IV.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
IV.1. Técnica de recolección de información.
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa SPSS versión 22.
Gràfica: 1 Presencia de Coliformes Totales y E.coli en muestras de carne molida bovina
De acuerdo con la gráfica 3 se puede observar que, del total de muestras
analizadas un 12% corresponde a E. coli, mientras que el 88% restante pertenece a
otros microorganismos coliformes totales: Klebsiella pseumoniae, Klebsiella oxytoca,
Proteus mirabilis y Providencia morgani
Tabla V: Presencia de otros microorganismos en las muestras analizadas.
N: 100
Escherichia Coli 12%
Otros microorganismos
Klebsiella Pneumoniae 22%
Klebsiella oxytoca 30%
Proteus mirabilis 24%
Providencia morgani 12%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Escherichia Coli OtrosMicroorganismos
Escherichia Coli
40
Gràfica: 2 Presencia de Coliformes Totales en carne molida expendida en los
Mercados de la Zona 1, Zona 2 y Zona 3 de la Ciudad de Guayaquil
De acuerdo a la gráfica 2 en relación a la presencia de otros Microorganismos se
encontró que un 12% correspondió a Escherichia coli, un 88% restante pertenece a otras
bacterias como: Klebsiella pneumoniae (22%), Klebsiella oxytoca (30%), Proteus
mirabilis (24%) y Providencia morgani (12%).
Microorganismos
Escherichia Coli klebsiella pneumoniae
klebsiella oxytoca Proteus mirabilis
Providencia morgani
41
Tabla VI: Escherichia Coli 0157:H7 obtenidas mediante el ensayo Wellcolex
Látex.
Muestra Escherichia Coli Eschercihia Coli
O157:H7
21 + +
22 + -
23 + -
25 + +
54 + -
81 + -
82 + -
86 + -
91 + -
92 + -
94 + -
96 + +
De acuerdo a la tabla VI se aislaron 12 muestras de Escherichia coli, las cuales se
serotipificaron mediante el método Wellcolex látex, dando como resultados positivos
para E.coli O157:H7 las muestras: 21, 25 y 96. La muestra 21 y 25 pertenecían al
Supermercado de la zona 2 y la muestra 96 al Mercado de la zona 1.
42
La siguiente gráfica indica que las 3 cepas de E. Coli O157:H7 encontradas mediante el
ensayo de wellcolex látex representan en 20% y las cepas de E.coli representan un
80%.
Gráfica: 4 Evaluación de las condiciones de expendio de la carne molida en los
mercados de estudio.
100 93%
90
80
70
60
50
40
30
20 7%
10
0
Refrigeración (4°C) Temperatura ambiente
.
80%
20%
Escherichia coli
Escherichia coli Escherichia coli O157:H7
Gráfica: 3: Serotipo O157:H7 encontrados en Cepas de Escherichia coli aisladas
43
Tabla VII: Conservación del producto
Local Nº Nº de muestras a Nº de muestras a
4°C 28°C
1 7 3
2 0 10
3 0 10
4 0 10
5 0 10
6 0 10
7 0 10
8 0 10
9 0 10
10 0 10
En la presente tabla VII se observa las condiciones de venta de la carne
de Acuerdo a la temperatura de exposición, 1 de 10 locales expende carne a 4
℃, mientras que los locales restantes, expenden carne a temperatura Ambiente,
el 93% de los locales expenden las carnes a temperatura ambiente.
44
CAPITULO V.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
V.1. Conclusiones
En el presente trabajo de investigación se pudo detectar la presencia de
coliformes totales, utilizando el método oficial AOAC 991.14. De las 100
muestras analizadas se detectó el siguiente porcentaje de microorganismos: un
12% corresponde a Escherichia coli, mientras que el 88% restante pertenece a
otros microorganismos coliformes totales: Klebsiella pseumoniae (22%),
Klebsiella oxytoca (30%), Proteus mirabilis (24%) y Providencia morgani (12%).
De las muestras analizadas en su totalidad estaban compuestas de
coliformes totales, por ende el estudio detectó una frecuencia alta de agentes
microbianos, principalmente Escherichia coli, y otras bacterias como: Klebsiella
pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis y Providencia morgani.
Se obtuvieron 12 cepas positivas para E. coli las cuales posteriormente se
procedieron a un análisis de serotipificacion – subtipificacion, dando como
resultados 3 cepas positivas para E. coli O157:H7.
45
V.2. Recomendaciones
Al haberse detectado por primera ocasión en el país, una cepa de E.coli
O157:H7 en alimentos se hace necesario continuar con el estudio y proceder con
el análisis molecular para la determinación de la producción de la verotoxina,
causante del Síndrome urémico hemolítico y daño renal.
Una vez confirmada por Biología Molecular la presencia de Verotoxina en las
cepas de E.coli O157H7, proceder a reportar a las autoridades de Salud, la
presencia en el País de la cepa E.coli O157H7, para establecer las BPM como
Norma Obligatoria para este Microorganis
Se debe implementar la vigilancia, rigurosidad y el control de las autoridades
pertinentes para evaluar los lugares de expendio y evitar incidencia del síndrome
urémico hemolítico (SUH) y problemas renales en el País.
Se podría continuar con el estudio, analizando la posible relación que pueda
existir en los casos de insuficiencia renal con la ingesta de carnes contaminadas
y mal cocidas.
46
V. BIBLIOGRAFÍA
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50
ANEXOS
51
TSI SIM
UREA Bacteria Muestras
Pico/ Fondo Producción Movilidad Indol Producción
de Citrato
de SH2 Identificada
Nº
Gas
SH2
Simmons
1 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
2 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
3 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
4 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
5 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
6 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
7 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
8 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
9 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
10 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
Anexo 1. Tabla de los resultados del análisis microbiológico para E. coli en el mercado Caraguay, El Coral y Sauces IX de la Ciudad de Guayaquil
52
11 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
12 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
13 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
14 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
15 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
16 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
17 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
18 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
19 Alcalino/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
20 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
21 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
22 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
23 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
53
24 Ácido/ Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
25 Ácido/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
26 Ácido/ Ácido + + + - + + + Proteus mirabilis
27 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
28 Ácido/Ácido + + + + - + + Proteus mirabilis
29 Alcalino/Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
30 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
31 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
32 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
33 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
34 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
35 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
54
36 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
37 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
38 Ácido/ Ácido - - + + + - +
Providencia
morgani
39 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
40 Ácido/ Ácido - - + + + - + Providencia
morgani
41 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
42 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
43 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
44 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
45 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
46 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
47 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
55
48 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
49 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
50 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
51 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
52 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
53 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
54 Alcalino/Ácido + - - + + - - Escherichia coli
55 Alcalino/Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
56 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
57 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
58 Alcalino/Ácido + - + - - - + Providencia morgani
59 Alcalino/Ácido + - + - - - + Proteus mirabilis
60 Ácido/ Ácido + - + - - - + Klebsiella pneumoniae
61 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
56
62 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
63 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
64 Ácido/ Ácido + - + - - - - Klebsiella pneumoniae
65 Ácido/ Ácido + - + - - - - Klebsiella pneumoniae
66 Ácido/ Ácido + - + - - - - Klebsiella pneumoniae
67 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
68 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
69 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
70 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
71 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
72 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
73 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
74 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
75 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
57
76 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
77 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
78 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
79 Alcalino/Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
80 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
81 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
82 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
83 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
84 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
85 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
86 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
87 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
88 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
89 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
58
90 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
91 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
92 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
93 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
94 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
95 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
96 Ácido/ Ácido + - - + + - + Escherichia coli
97 Ácido/ Ácido + - - + + - - Escherichia coli
98 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
99 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
100 Ácido/ Ácido + - + - + - + Klebsiella oxytoca
59
Anexo 1: Lista de chequeo para la inspección de los sitios de venta.
Mercado: Zona 1 Fecha: 9/11/2018
Local Nº
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Los operadores utilizan mandil visualmente limpio
X
Los mesones están en buen estado para expender la carne
X
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
X
Existe suficiente espacio para almacenar la mercadería que ingresa
X
La carne molida se mantiene en refrigeración
X
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
X
Los desagües y cañerías aparentan estar en buen estado
X
Los utensilios y/o maquinarias para moler la carne están debidamente aseadas y aptas para el proceso
X
60
Mercado:Zona 2 Fecha: 13/11/2018
Local Nº
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Los operadores utilizan mandil visualmente limpio
X
Los mesones están en buen estado para expender la carne
X
Las instalaciones se encuentran en buenas condiciones y limpias
X
Existe suficiente espacio para almacenar la mercadería que ingresa
X
La carne molida se mantiene en refrigeración
X
El personal que manipula la carne molida utiliza guantes y/o mascarilla
X
Los desagües y cañerías aparentan estar en buen estado
X
Los utensilios y/o maquinarias para moler la carne están debidamente aseadas y aptas para el proceso
x
61
Anexo 2: Resultados de la serotipificación de Escherichia coli
62
63
64
65
Anexo 3: Tabla bioquímica de identificación de microrganismos más comunes (Carpio, 2017).
66
Protocolo de trabajo para la preparación de medios de cultivo
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable...
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Disolver 25,5g de agar agua de peptona en 1 L de agua destilada.
4. Agitar hasta disolución completa.
5. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva
por un minuto para disolver completamente el medio
6. Distribuir volúmenes de 90 ml y 9 ml en recipientes apropiados.
7. Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Suspenda 9.77 g del medio en 255 ml de agua esterilizada.
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva
por un minuto para disolver completamente el medio.
5. NO COLOQUE EN EL AUTOCLAVE.
6. Permita el enfriamiento del medio hasta que alcance una
temperatura entre 45–50°C y dispénselo en placas estériles.
Anexo 5: Preparación de agar bilis rojo neutro cristal violeta
Anexo 4: Preparación de agar agua de peptona
67
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen
3. Suspenda 3.6 g de agar soya tripticasa en 90 ml de agua destilada
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva
por un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo
que el agar tome forma de pico de flauta.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Disolver 2.79 g de agar SIM en 90 ml de agua destilada.
4. Caliente manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva
por un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo
que el agar tome forma de pico de flauta.
Anexo 6: Preparación de agar soya tripticasa.
Anexo 7: Preparación de agar SIM
68
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen.
3. Suspender 2.07g de agar Citrato Simmons en 90 ml de agua destilada
4. Calentar manteniendo una agitación frecuente y permita que hierva
por un minuto para disolver completamente el medio.
5. Trasvasar la solución a una fiola de 100 ml.
6. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
7. Añadir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de modo
que el agar tome forma de pico de flauta.
1. Suspenda 3,87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua
destilada.
2. Disolver sin calentar y autoclavar a 121ºC por 15 minutos
3. Transferir 3 ml de agar en tubos de vidrio estériles e inclinarlo de
modo que el agar tome forma de pico de flauta.
1. Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol potable.
2. Encender el mechero de Bunsen
3. Suspender 10 g de carne molida en 90 ml de agua de peptona
4. Agitar constantemente por 1 minuto
Anexo 8: Preparación de agar Citrato Simmons.
Anexo 9: Preparación de agar Ureasa.
Anexo 10: Preparación y siembra de la muestra.
69
5. Transferir alícuotas de 1 ml en tubos que contengan 9 ml de agua
de peptona.
6. Agitar los tubos de ensayo y colocar 1 ml de la dilución en una caja
Petri, estando cerca del mechero.
7. Añadir el medio de cultivo bilis rojo neutro cristal violeta cuando este
haya alcanzado los 40ºC.
8. Agitar por rotación la caja petri y dejar solidificar el agar antes de
incubarla por 12 horas a 37ºC.
9. Sembrar por picadura y estría colonias rojas con halos en Agar TSI
10. Incubar los tubos por 12 horas a 37ºC.
11. En caso de algún crecimiento de colonias presuntivas, sembrar en
pruebas bioquímicas para su diferenciación y confirmación: Úrea
(Siembra por picadura y estría), Citrato (Siembra por picadura y
estría) y Sim (Siembra por Picadura).
12. Incubar de 35 a 37ºC por 24 horas.
13. Analizar los tubos con la ayuda de la tabla de pruebas bioquímicas
para Enterobacterias (Anexo 1)
14. Una vez analizados los resultados, los tubos con presencia
presuntiva de E. coli se siembran por picadura y estría en agar soya
tripticasa para posterior análisis en el Sistema BBL Crystal.
70
Prueba de motilidad: -
1. Tomar una colonia aislada sospechosa de ser Escherichia coli con
un asa estéril.
2. Introducir sobre el centro del tubo con medio de movilidad y formar
una línea de inoculación, hasta una tercera parte del medio.
3. Incubar de 24-48 horas y observar si presenta enturbiamiento.
Producción de indol: Incorporar 2 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interna del tubo (la reacción es inmediata). La formación de un halo rosado
es indicativa de reacción positiva.
Prueba de citrato:
1. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser
Escherichia coli en la superficie del medio (pico de flauta).
2. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.
Nota: Si el medio se torna de color azul es indicativo de reacción positiva.
Prueba de Urea.
1. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser
Escherichia coli en la superficie del medio (pico de flauta).
2. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.
Nota: Si el medio se torna de color rojo rosado es indicativo de reacción
positiva.
Anexo 11: Procedimiento de pruebas bioquímicas.
71
Prueba de citrato:
3. Inocular en estría una colonia aislada sospechosa de ser
Escherichia coli en la superficie del medio (pico de flauta).
4. Incubar a 35ºC durante 24-48hr.
Nota: Si el medio se torna de color azul es indicativo de reacción positiva.
Nota: Si el medio se torna de color rojo rosado es indicativo de reacción positiva
72
Anexo 12: Homogenización de la muestra
en agua peptonada.
Anexo 13: Preparación de Agar Rojo Bilis- Cristal Violeta
73
Anexo 14: Pruebas Bioquímicas
Anexo 15: Preparación de Agar Citrato Simmons
74
Anexo 16: Escherichia coli obtenidas.