Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila melanogaster

MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE BIOQUIMICO

PABLO ANDRES MAJOO MORGADO

DIRECTOR: DRA. JIMENA SIERRALTA

Santiago, Chile 2008

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

i

“Gracias a Dios. A mi familia, quienes me han

entregado todo y son mi ejemplo. A Carla por

apoyarme incondicionalmente y por tenerme en su

corazón y a mis amigos que estando lejos o cerca se

preocupan por mi”.

ii

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Jimena Sierralta por su confianza, por la paciencia, la buena voluntad, por

guiarme y escucharme.

A la Dra. Daniela Seelenfreund por la gran disposición y por ayudarme a ordenar mis

palabras.

Al Dr. Pablo Moya, por enseñarme las técnicas de Biología Molecular y por la amistad.

Al Dr. Alvaro Glavic, por enseñarme a inyectar embriones de mosca, y por los consejos.

A Carlos Oliva, Francisco Urra y Valeria Albornoz por enseñarme a disectar, y a

realizar experimentos de inmunofluorescencia.

A Angélica Figueroa por su calidad humana y por cocinar la comida de mis moscas.

A Fernando Vergara por su sentido del humor y su buena disposición.

A Rebeca Baeza por preocuparse de que nunca falte nada

A todo el grupo del laboratorio por los buenos momentos, por soportar mi humor negro,

por los consejos y por su amistad.

iii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA........................................................................................................................I

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. II

ÍNDICE DE CONTENIDOS ..................................................................................................... III

ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. V

ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................ VII

ABREVIATURAS ...................................................................................................................... VIII

RESUMEN .................................................................................................................................. X

SUMMARY................................................................................................................................. XII

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1

1.1 Secuencias regulatorias de la transcripción en eucariontes.................................................................................................. 1

1.2 Factores transcripcionales ........................................................................ 4 1.3 Estudio de zonas regulatorias de la transcripción

en Drosophila.............................................................................................. 4 1.4 Proteínas de andamio ................................................................................ 6 1.5 Discs-large (dlg) ......................................................................................... 6 1.6 Función de dlg en el epitelio y en el sistema

nervioso....................................................................................................... 8 1.7 dlg y sus variantes de procesamiento alternativo ................................... 8 1.8 DLGS97 en el sistema nervioso ................................................................ 10 1.9 Objetivo general......................................................................................... 11 1.10 Objetivos específicos.................................................................................. 11

2. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 12

A Materiales................................................................................................... 12 2.1 Biología molecular ..................................................................................... 12 2.2 Transgénesis en Drosophila. ..................................................................... 13 2.3 Inmunohistoquímica.................................................................................. 14 2.4 Anticuerpos ................................................................................................ 15 2.5 Cepas de Drosophila melanogaster ........................................................... 16 B. Métodos ...................................................................................................... 18 2.6 Vectores de expresión pH-Pelican y pH-Stinger..................................... 18

iv

2.7 Estrategia de clonamiento en los vectores de inyección ..................................................................................................... 20

2.8 Transgénesis en Drosophila por inyección .............................................. 23 2.9 Inmunohistoquímica de embriones.......................................................... 25 2.10 Inmunohistoquímica de cerebro de larva................................................ 26 2.11 Inmunohistoquímica de cerebro de mosca adulta.................................. 26

2.12 Deconvolución de imágenes.......................................................................27

3. RESULTADOS.................................................................................................................. 28

3.1. Elección de dos posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg. .................................................................................. 28

3.2. Clonamiento de las posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg ......................................................................... 30

3.3. Inyección y mapeo de las secuencias........................................................ 32 3.4. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el estadio

embrionario de Drosophila melanogaster. ............................................... 36 3.5. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de

larva de Drosophila melanogaster ............................................................ 38 3.6. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de

Drosophila melanogaster adulto................................................................ 40

4. DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 42

5. CONCLUSIONES............................................................................................................. 48

6. PROYECCIONES……………………………………………………………………….49

7. REFERENCIAS................................................................................................................ 50

v

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1. Ubicación del promotor y de los elementos distales de la transcripción..................................................................................................... 1

Fig. 2. Intercacción entre un potenciador transcripcional y un promotor. ......................................................................................................... 3

Fig. 3. Familia de proteínas MAGUK similares a DLG de Drosophila........................................................................................................ 7

Fig. 4. Variantes originadas del locus dlg………………….…………………..………9

Fig. 5. Esquema del ciclo de vida de Drosophila melanogaster ................................. 17

Fig. 6. Vectores pH-Pelican y pH-Stinger................................................................... 19

Fig. 7. Ubicación de los partidores de las zonas escogidas para el estudio de la regulación de la transcripción de dlg ...................................... 21

Fig. 8. Estrategia de clonamiento de las secuencias. ................................................... 22

Fig. 9. Protocolo de inyección en embriones de Drosophila ...................................... 24

Fig. 10. Criterios para la selección de posibles zonas regulatorias de la transcripción ........................................................................ 29

Fig. 11. Visualización de las construcciones generadas a partir de las zonas regulatorias................................................................................... 31

Fig. 12. Construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 en pH-Stinger digeridas con Eco RI ........................................................................................ 33

Fig. 13. Determinación de la ubicación cromosómica de la inserción del elemento P .................................................................................. 34

Fig. 14. Expresión de algunas de las líneas transgénicas en cerebro de larva ................................................................................................ 35

Fig. 15. Inmunofluorescencia de dlg 1/2 y dlg 5/10 en embriones de Drosophila melanogaster .......................................................... 37

vi

Fig. 16. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de larva de Drosophila melanogaster ................................................................................ 39

Fig. 17. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el cerebro de

Drosophila melanogaste adulto ...................................................................... 41

Fig. 18. Modelo de regulación de la transcripción de las isoformas de dlg ............................................................................................... 47

vii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Secuencias de partidores para las construcciones

realizadas.......................................................................................................... 21

Tabla 2. Anticuerpos utilizados en experimentos de inmunohistoquímica. ........................................................................................ 26

Tabla 3. Tamaños esperados de las construcciones generadas y patrón de corte resultante de la digestión con Eco RI en el vector pBluescript SK .................................................................................. 30

Tabla 4. Líneas obtenidas y cromosomas en que se insertó el elemento P........................................................................................................ 35

viii

ABREVIATURAS BAC: Cromosoma artificial bacteriano

Cyo: Curly of Ester

dsRNA:

RNA de doble hebra

DEPC: Dietilpirocarbonato.

Dlg: Disc large.

dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato

dsRNA: RNA de doble hebra.

DTT: Ditiotreitol.

EST: EGFP:

“Expresed sequence tag”. Secuencia marcada expresada “Enhanced green fluorescent protein”. Proteína fluorescente verde incrementada

F:

Generación filial

Fas II: Fasciclina II

GFP: “Green fluorescent protein”. Proteína fluorescente verde

GK: “Guanylate kinase”. Guanilato quinasa

GMC: Célula madre ganglionar

Hsp70: Proteína de shock térmico de 70 KDa

Kb: Kilobases

LB: Medio Luria Bertani

Lgl: “Lethal giant larvae”. Larva letal gigante

L27: Lin 27

MAGUK: ”Membrane asociated guanylate kinase”. Guanilato quinasa asociada a membrana

PAF: Fijador de paraformaldehido al 4%.

Pb:

Pares de bases.

ix

PBS:

PBTG:

PCR:

PDZ:

Tampón fosfato salino.

Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%, suero de cabra 5%.

“Polymerase chain reaction” Reacción en cadena de la polimerasa.

PSD-95, Discs large y ZO-1.

PSD: Proteína de la densidad postsináptica.

PEM: PIPES, EGTA y MgSO4

PT: Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%.

TAE: tampón tris-acetato-EDTA

SAP: “Sinapsis asociated protein”. Proteína asociada a sinapsis

SH3: Dominio de homología src tipo 3.

SOP:

Yw:

Órganos sensoriales periféricos

Yellow-white

x

RESUMEN

Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila melanogaster

La diferenciación celular ocurre debido a la regulación de la expresión de distintos

genes en un patrón espacial y temporal definido. Entre los elementos regulatorios de la

expresión a nivel de transcripción de genes se encuentran los promotores, que poseen

elementos basales para la transcripción, elementos proximales que la regulan río arriba de

este, y los elementos distales que son capaces de regular la expresión de un gen aún estando

muy lejos del promotor, incluso río abajo de éste. Los elementos basales de los promotores

son capaces de unir factores de transcripción generales en todas las células, en cambio los

elementos distales unen factores específicos de cada célula, regulando de esta manera la

expresión tejido específica.

Las proteínas de andamio participan en funciones vitales, como el mantenimiento de la

localización adecuada de las proteínas de membrana en células pre y post sinápticas, para que

ocurra la neurotransmisión o para mantener la estabilidad de polaridad epitelial. La proteína

DLG o Discs large es miembro de una familia de proteínas asociadas a membrana homólogas

a guanilato kinasa (MAGUK). A través de sus dominios, las proteínas MAGUK reclutan

receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas

del citoesqueleto.

El producto del gen dlg, identificado como supresor de tumores en Drosophila

melanogaster cumple un rol fundamental tanto en células epiteliales como en células

neuronales. En las células epiteliales mantiene la polaridad ápico-basal y controla la

proliferación, y en la sinapsis regula la estructura de los botones sinápticos durante el

xi

desarrollo. Se han localizado diversos dominios codificados por dlg en tipos celulares

diferentes, como lo es S97N, que se expresa predominantemente en el cordón ventral y en la

unión neuromuscular de embriones y larvas tardías, pero no en las células epiteliales. La

variante de expresión no neural corresponde a DLGA.

Debido a que existen transcritos de expresión tejido específica de dlg, resulta

interesante identificar las secuencias que determinan los productos epiteliales o bien

neuronales. Para esto identificamos dos posibles zonas regulatorias que podrían definir esta

diferenciación basándonos en la conservación de su secuencia entre especies, y su

susceptibilidad a la inserción de elementos P. Una de estas zonas es una secuencia de 4200 pb

que se ubica río arriba de DLGS97 y la otra es una secuencia de 1900 pb que está río arriba de

DLGA. Luego de amplificarlas por PCR se clonaron estas regiones en vectores para producir

organismos transgénicos de Drosophila.

Tras un análisis por inmunohistoquímica de estas moscas modificadas

genéticamente, encontramos que la secuencia río arriba del inicio de transcripción de DLGA

dirige la expresión neuronal en todo el cerebro, y que la secuencia río arriba del inicio de

transcripción de DLGS97 dirige la expresión no neuronal, en zonas muy acotadas del cerebro.

Ambas secuencias dirigieron la expresión desde el estadio larval, expresión que se mantuvo

en el adulto.

Dado que estas secuencias fueron capaces de dirigir la transcripción del gen

reportero que codifica la proteína fluorescente verde (GFP), las calificamos como “enhancers”

o potenciadores de la transcripción.

xii

SUMMARY

Identification of regulatory regions of the dlg gene of Drosophila melanogaster

Cellular differentiation occurs due to the regulation of the gene expression in a defined

temporal and spatial pattern. Among the gene expression regulatory elements at

transcriptional level, are the promoters, which posses basal transcriptional elements,

proximal upstream elements that regulate the activity of the promoter, and distant elements

that are capable to regulate the gene expression far from the promoter and even downstream

of the promoter. Basal elements of promoters bind general transcription factors in all cells,

on the other hand, while distant elements bind specific factors of each cell type, regulating

tissue specific expression in this way.

Scaffold proteins are required for vital functions, such as maintaining the localization

of membrane proteins in pre and post-synaptic cells, for neurotransmission or for epithelial

polarity stability. DLG or Discs Large protein is a member of membrane associated proteins

homologous to guanylate kinase (MAGUK). By means of their interaction domains

MAGUK proteins recruit receptors, ionic channels, signals transduction cascade components

and cytoskeleton proteins.

The product of the dlg gene was identified as a tumour suppressor in Drosophila

melanogaster, and has a fundamental role in epithelial cells and in neurons. In epithelial

cells DLG protein controls apico-basal polarity and proliferation, and in synapses it

regulates the synaptic button structure during development. Many domains encoded by dlg

in different cell types have been identified, as S97N, which is predominantly expressed in

the ventral cord and in the neuromuscular junction in embryos and late larval stages, but not

in epithelial cells. The non-neural variant corresponds to DLGA.

xiii

The existence of tissue specific transcripts, makes it interesting to identify regulatory

sequences that determine epithelial or neuronal products. We identified two possible regions

based on their inter species sequence conservation, and their susceptibility to harbour P

elements insertion. One sequence (4200 pb) is upstream of DLGS97 and the other (1900 pb)

is upstream of DLGA. We amplified these sequences by PCR, and cloned them in vectors

suitable to produce transgenic flies.

After immuno-histochemical analysis of the transgenic flies we found that the

sequence upstream of the transcriptional start of DLGA directs partially neuronal expression

in all the brain, and that the sequence upstream of DLGS97 directs non-neuronal expression,

in a small region of the brain. Both sequences directed expression in the brain from larval

stageto adult brain.

Since these sequences were capable to direct GFP transcription we assigned them a

transcriptional enhancer role.

1

INTRODUCCION

Todas las células de un individuo poseen el mismo tipo y cantidad de DNA, a excepción de

las células germinales, y la diferenciación celular ocurre debido a la regulación de la expresión de

distintos genes en un patrón espacial y temporal definido. Por lo tanto, la identidad de los distintos

tipos celulares en un organismo multicelular está dado por el arreglo particular de proteínas que se

expresa en un tejido y momento del desarrollo. Entre los mecanismos de regulación están aquellos

que involucran el silenciamiento y activación de la expresión de genes por la unión de factores de

transcripción a secuencias determinadas. Estas secuencias generalmente se encuentran cercanas a

los genes que codifican para productos tejido-específicos, de modo de activar (o reprimir) la

expresión de los productos que son necesarios para cada tipo celular en un individuo.

1.1.-Secuencias regulatorias de la transcripción en eucariontes

En genes eucariontes que codifican RNA mensajero se han descubierto distintos tipos de

secuencias regulatorias de DNA que influencian la transcripción de genes dependiendo del tipo de

célula (Weil y cols., 1979). Estas secuencias corresponden a los elementos de un promotor, que está

formado por el promotor mínimo y por los elementos proximales y distales (Figura 1).

Figura 1: Ubicación del promotor y de los elementos distales de la trancripción De 5´a 3´ se muestran los elementos distales a una distancia mayor a 1kpb, la región, que comprende los elementos proximales a -2oo pb (con cajas GC, CAAT y SDE, entre otros o elementos distales), y el promotor mínimo ( con cajas TATA, el elemento de respuesta BRE y la secuencia iniciadora Inr (esquema extraído de la página http://av.bmbquma.es)

2

Los promotores reconocidos por la RNA polimerasa II están localizados inmediatamente río

arriba del sitio de inicio de la transcripción y contienen elementos basales de la transcripción y

elementos proximales. Los elementos basales se componen de una caja TATA, de una secuencia

iniciadora (Inr), y de un elemento de respuesta al TFIIB (factor de transcripción general tipo IIB

que define el inicio de la transcripción), llamado BRE (Butler y Kadonaga, 2002). La función de la

caja TATA es indicar el sitio preciso en el que se iniciará la transcripción, pero no determina el

sentido de la transcripción debido a la simetría de su secuencia; este sentido es indicado por la

secuencia BRE. Los elementos proximales, por su cercanía a los elementos del promotor mínimo y

por la capacidad de regular la transcripción sólo río arriba de un gen, también se consideran parte

del promotor. Estos elementos se componen de la caja CAAT, la caja GC y las secuencias distales

específicas (SDE). La caja CAAT se puede encontrar en muchas posiciones y su papel es

proporcionar eficacia al promotor, pero, curiosamente, no siempre está presente, al igual que la caja

TATA. La caja GC puede encontrarse tanto delante como detrás de la caja CAAT y es más

frecuente en promotores sin caja TATA, como la mayoría de los genes de mantenimiento. Su

función es permitir una expresión constante, pero baja. Las secuencias distales específicas (SDE) se

encuentran más alejadas (-100 a -200 pb) y son reconocidas por proteínas específicas (Corden y

cols., 1980). Los elementos distales, que funcionan como secuencias regulatorias de la

transcripción, aparecen en los genes inducibles y se encuentran muy alejados de los elementos

anteriores, tanto en la región 5’ como 3’ del gen, y funcionan independientemente de su orientación.

Con frecuencia no se les considera parte del gen, y aunque están lejos, se acercan al promotor basal

debido a curvaturas en el DNA por la unión de múltiples proteínas (Li y cols., 1991) (Figura 2).

Estos elementos se subdividen en potenciadotes y silenciadores (Ogbourne y Antalis, 1998). Los

silenciadores o inhibidores impiden que se transcriba el gen sin cambiar el grado de

empaquetamiento de la cromatina. Se describieron inicialmente en las levaduras, y se han

encontrado en otros organismos.

3

Los potenciadores o “enhancers” son secuencias de DNA que pueden activar el uso del

promotor basal, controlando la eficiencia y la tasa de transcripción desde ese promotor (Struhl,

1982). Los enhancers pueden activar promotores del mismo cromosoma desde distancias tan

grandes como 50 kilobases sin necesidad de estar localizados río arriba de un gen, pudiendo estar en

el extremo 3´, en los intrones, o incluso en la hebra complementaria de DNA (Shih y cols., 2000).

En los eucariontes pueden haber más de un promotor para un mismo gen, los cuáles permitirán la

transcripción diferencial de distintos tipos de isoformas con propiedades diferentes que permitirán

una expresión específica en el tiempo, en los distintos tejidos, en la localización celular y con

capacidad funcional diferencial (Behr y weinbauer, 2001) (Figura 4 A).

Figura 2: Interacción entre un potenciador transcripcional y un promotor.

Micrografía que muestra la interacción entre la zona de un promotor de un DNA artificial que une el factor de transcripción Sp1 (rojo), e interacciona con la proteína E2 al estar ésta unida al potenciador (azul). A pesar de estar tan distantes el promotor del potenciador (1860 pb) se observa que son capaces de interactuar (Adaptado de Li y cols., 1991).

4

1.2.-Factores transcripcionales

Tanto los elementos basales de un promotor como los elementos distales de estos unen

factores transcripcionales. Los elementos basales son reconocidos por los factores generales, los

cuales, al reconocer las secuencias más conservadas, son a su vez, los más conservados. Promueven

la formación del complejo de inicio, mediando el reclutamiento de la RNA polimerasa II y el

correcto punto de inicio de la transcripción (Nikolov, 1997).

A diferencia de los factores transcripcionales de un promotor mínimo, los factores

transcripcionales de las zonas regulatorias son específicos de cada tipo celular y de cada período

específico de desarrollo (Yoshiaki y cols., 1986), o incluso un estado general del organismo

específico (estado nutricional, respuesta a un estresor o factor ambiental). En un organismo, los

factores de transcripción pueden regular la transcripción de las distintas isoformas de un gen tal

como dlg, de modo tejido específico, reconociendo las zonas potenciadoras de la transcripción en

cada tipo celular, dando origen a expresiones diferenciales de un gen.

1.3.-Estudio de zonas regulatorias de la transcripción en Drosophila

Una estrategia apropiada para el estudio de secuencias regulatorias de la transcripción en

Drosophila es el uso de elementos P. Estos elementos son secuencias móviles de DNA que poseen

señales de reconocimiento que les permiten insertarse en distintas zonas del genoma, ya sean inter o

intragénicas (O´Hare y Rubin., 1983). Este proceso es catalizado por una enzima llamada

transposasa que está codificada en el propio elemento P (Rio y cols., 1988). Por los conocimientos

de genética y por los avances en biología molecular se han ideado estrategias de estudio mediante el

uso de vectores que funcionan como elementos P en Drosophila. La estrategia de estos estudios es

crear moscas transgénicas, es decir, moscas que han incorporado en el genoma de sus células

germinales genes antes ausentes en ella, como por ejemplo un gen reportero cuya expresión esté

dirigida por las secuencias regulatorias que se deseen estudiar. Se ha construido vectores tales como

pH-Stinger y pH-Pelican, que corresponden a elementos P que poseen las zonas de reconocimiento,

5

pero que no codifican la transposasa, la que es reemplazada por un gen marcador. Al no codificar la

transposasa, una vez insertado el elemento P, éste no puede movilizarse y por lo tanto es estable en

el genoma. Uno de los genes que usualmente reemplaza al de la transposasa es un gen visible en el

fenotipo, por ejemplo, el gen white que codifica para un transportador de pigmentos que otorga

color rojo en los ojos. Además estos vectores codifican un gen reportero ausente en la mosca

silvestre, como egfp (derivado de gfp de Aequario victoria) en pH-Stinger y lac z (de E. coli) en pH-

Pelican, respectivamente. Además poseen un promotor mínimo río arriba de estos genes, que no es

capaz de reclutar la maquinaria de transcripción por sí solo (Barolo y cols., 2000). Estos vectores se

inyectan en líneas de embriones en estado de preblastodermo, en líneas de Drosophila que carezcan

del gen marcador de expresión fenotípica que posee el elemento P (en el caso del ejemplo citado,

moscas con una mutación en el gen white y que por lo tanto poseen ojos blancos). La inyección de

estos vectores se debe realizar junto a un vector llamado ayudante (o P Helper) que codifica la

transposasa, la cual cataliza el proceso y luego se degrada (Robertson y cols., 1988). Es importante

inyectar los embriones en la etapa de preblastodermo, ya que en esta etapa el embrión es un sincicio

y el DNA inyectado entra fácilmente a los núcleos. La inyección se dirige a regiones posteriores del

embrión, donde más tarde se formarán las células germinales (Spradling, 1986). Por lo tanto, si se

inserta el vector en éstas células se restaurará el color rojo en los ojos de la descendencia del

embrión inyectado. Más aún, si las secuencias insertadas efectivamente son regulatorias de la

transcripción serán capaces de dirigir la expresión de los genes reporteros en un patrón equivalente

al del gen estudiado (Brivanlou y Darnell, 2002).

1.4.-Proteínas de andamio

En numerosos procesos fundamentales en organismos pluricelulares, como la diferenciación

celular, la formación de tejidos y la transducción de señales, se requiere de sitios de asociación que

posibiliten el contacto entre células. Dichos sitios de asociación se constituirán gracias a las

proteínas de andamio, que se caracterizan por poseer dominios modulares de interacción proteína-

6

proteína, por formar complejos proteicos de alto peso molecular, y por estar ancladas a regiones de

la membrana plasmática a través de su interacción con proteínas de membrana (Garner y cols.,

2000a). De este modo se organizarán con especificidad y eficiencia complejos proteicos

macromoleculares en los sitios de unión celular. Dichas organizaciones presentan reversibilidad en

respuesta a señales externas o propias del desarrollo (Koh y cols., 1999).

Una familia de proteínas de andamio de gran importancia en el desarrollo y fisiología de

numerosos tejidos corresponde a las proteínas MAGUK (“Membrane Associated Guanylate

Kinase”), involucradas en las uniones estrechas de epitelios, zonas activas presinápticas y

densidades postsinápticas (Garner y cols., 2000b).

1.5.-Discs-large (dlg)

Discs-large (dlg) de Drosophila melanogaster fue el primer gen descrito que codifica para

una proteína de la familia MAGUK (Woods y cols., 1989). El gen dlg codifica para una proteína

que se define como supresora de tumores, debido a que sus mutantes presentan un crecimiento

neoplásico del epitelio de los discos imaginales de larva. Estos discos son los responsables de

generar las distintas estructuras del adulto (Woods y Bryant, 1991). Las mutantes de este gen

mueren en estadios larvarios o al alcanzar el estado pupario tardío dependiendo de la severidad de

los alelos portadores (Woods y Bryant, 1989).

En vertebrados se han descrito cuatro proteínas MAGUK del tipo DLG: SAP-97, PSD-93,

SAP-102 y PSD-95 (Figura 3). Estas proteínas se expresan en las sinapsis centrales y periféricas y

regulan la organización y plasticidad sináptica al interactuar con receptores de glutamato, moléculas

de adhesión y elementos del citoesqueleto. Por ello son llamadas proteínas de la densidad post

sináptica (PSD) o proteínas asociadas a sinapsis (SAP) (Fanning y Anderson, 1999). SAP-97 es la

proteína homóloga de DLG de Drosophila, tanto por secuencia como por la reversión del fenotipo

mutante de Drosophila en epitelio, como en la unión neuromuscular (Thomas y cols., 1997).

7

FIGURA 3: Familia de proteínas MAGUK similares a DLG de Drosophila

Esquema de la estructura proteica de los miembros de la familia MAGUK tipo DLG y sus dominios proteicos característicos. ( ) representa los dominios PDZ, que se unen a la región carboxilo terminal de proteínas de membrana, permitiendo que éstas se localicen en regiones particulares de la célula a través de la unión al citoesqueleto) . ( ), dominio SH3. ( ), dominio guanilato quinasa (GK), sin actividad catalítica y ( ), dominio L27, que es un dominio variable en la región amino terminal (Adaptado de Funke y cols., 2005).

MAGUKs Mamífero Drosophila

8

1.6.-Función de dlg en el epitelio y en el sistema nervioso

dlg se expresa en las células epiteliales donde es responsable del mantenimiento de la

polaridad, formando parte de las uniones septadas de insectos, que son equivalentes funcionales de

las uniones estrechas entre células de los organismos cordados. En estas uniones dlg es importante

para su mantención y para la localización de otras proteínas propias de esta estructura (Tepass y

cols., 2001, Woods y cols., 1996).

En el sistema nervioso, se ha descrito que la pérdida completa de dlg (componente materno

y cigótico) conlleva a graves defectos en la neurogénesis y en el establecimiento de la conectividad

neuronal del sistema nervioso del embrión (Perrimon, 1988).

Durante la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apico-basal del

epitelio embrionario, en la división de los precursores neurales o neuroblastos (Ohshiro y cols.,

2000, Peng y cols., 2000), y en la asimetría planar de las células precursoras de los órganos

sensoriales periféricos de la larva y el adulto (células SOP), (Bellaiche y cols., 2001). En la sinapsis

neuromuscular de la larva dlg tiene un rol en el mantenimiento estructural y funcional de la sinapsis

neuromuscular (Budnik y cols., 1996), la que se ha aceptado como modelo de sinapsis central por

ser glutamatérgica.

1.7.-dlg y sus variantes de procesamiento alternativo

Debido a que las diversas técnicas experimentales han sido dirigidas hacia los dominios

SH3-GK y los dominios PDZ1-PDZ2, las funciones descritas de dlg han sido atribuidas sólo a

DLGA (Woods y cols., 1991, Koh y cols., 1999). Sin embargo, se ha demostrado que dlg presenta

al menos cinco transcritos de diferente tamaño molecular, cuyos sitios de inserción de exones

alternativos son los mismos que se han descrito en vertebrados (Figura 4). (Wu y cols., 2000).

Un grupo de transcritos codifica para un dominio amino terminal ausente en DLGA llamado

L27, que sirve como una plataforma para la formación de grandes complejos moleculares (Feng y

9

cols., 2004, Doerks y cols., 2000). Es así como a partir del uso alternativo de diferentes promotores

en un mismo gen se pueden obtener distintos productos.

A)

B)

Figura 4. Variantes originadas del locus dlg. A). Estructura genómica de dlg. Los círculos grises indican los exones ausentes en el transcrito DLGA. Las flechas verticales negras marcan las putativas posiciones de los sitios de inicio de la transcripción deducidos de los extremos 5’ terminal de varios grupos de clones EST y cDNA. El cuadrado rojo es la porción 3´ del gen tim8. Las barras azules son exones y las flechas naranjas son exones de gran tamaño. La secuencia fue obtenida de www.flybase.org y analizada en el programa Vector NTi.

B). Composición de los transcritos de dlg aislados, incluyendo DLGA. Cada caja enumerada representa un exon traducido, mientras que las cajas con letras muestran los exones no traducidos. Las cajas sombreadas indican las secuencias nuevas que están ausentes en el transcrito DLGA Las barras rosadas indican la región del cDNA utilizada para la generación de los anticuerpos anti-DlgPDZ1-2 (Koh y cols., 1999) y anti- DlgS97N.. Debajo de cada transcrito se indica la estructura de la proteína deducida (dominios característicos) y su masa molecular (MW) calculada (Mendoza y cols., 2003).

10

1.8.-DLGS97 en el sistema nervioso

A diferencia de la expresión de DLGA, que se expresa en el epitelio, neuronas y músculo,

DLGS97 se expresa en forma creciente, durante el desarrollo en tejido neuronal y músculo

somático, pero está ausente en el epitelio. Su expresión comienza a evidenciarse desde estadios

embrionarios tardíos (estadio 12) descartando una contribución materna. En este estadio la

expresión aparece en lo que será en el futuro el cordón ventral, que se confirma en el estadio 13

donde posteriormente DLGS97 se expresa en el cerebro. En el cerebro del adulto en comparación al

de la larva, la expresión aumenta en los lóbulos ópticos, estructuras donde su expresión es débil en

la larva. No se observa expresión de DLGS97 en células gliales de cerebro de larva, ni de adulto

(Albornoz y cols., 2007).

Esta expresión creciente de DLGS97 da cuenta de su requerimiento a medida que se

desarrolla el sistema nervioso.

Dado que existen distintas isoformas tejido específicas originadas de dlg y que no se sabe

cómo se regula la expresión de dlg, nos hemos planteado la siguiente hipótesis:

En Drosophila melanogaster existen zonas regulatorias de la transcripción del gen dlg

que son responsables de la expresión tejido específica de este gen y que dirigen su expresión

en neuronas y en células epiteliales.

11

OBJETIVOS

1.7 OBJETIVO GENERAL

Identificar secuencias regulatorias que determinan que los productos del gen dlg se

expresen diferencialmente en células epiteliales o neuronales.

1.8. OBJETIVOS ESPECIFICOS

1.- Identificar por métodos informáticos posibles regiones regulatorias en regiones del

gen dlg.

2.- Amplificar estas zonas por PCR y clonar y subclonar las secuencias escogidas en

vectores apropiados para la inyección en embriones.

3.- Inyectar embriones con DNA plasmidial e identificar las moscas que tengan

inserciones. Determinar el cromosoma en que se incorporó el transgen mediante mapeo.

4.- Observar los patrones de expresión de EGFP en las cepas transgénicas.

12

MATERIALES Y METODOS

A.- Materiales

2.1.- Biología molecular

-Cloroformo (Merck, Darmstadt, Alemania).

-Alcohol isopropílico (Merck, Darmstadt, Alemania).

-Etanol (Merck, Darmstadt, Alemania).

-DEPC, Dietilpirocarbonato (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).

-Oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).

-dNTPs, desoxinucleotidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Boehringer, Mannheim,

Alemania).

-MgCl2 50Mm. (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).

-DNA Polimerasa Taq (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).

-Agarosa ultrapura (Fisher Scientific, Bridgewater, New Jersey, EE.UU).

-Bromuro de Etidio (GIBCO BRL, Carlsbad, California, EE.UU).

-Aceite Mineral (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).

-1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).

-Amortiguador de electroforesis TAE 1X (Tris-acetato/EDTA): tris-acetato.

-Ampicilina (Fisher Scientific, Bridgewater, New Jersey, EE.UU).

-Placas de LB y Cultivos líquido de LB.

-Cloruro de Calcio (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).

-Enzima de restricción Sac II (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Enzima de restricción Sal I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Enzima de restricción Sac II (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Enzima de restricción Xho I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Enzima de restricción Kpn I (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Enzima de restricción Eco RI (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

13

-Vector pH-Stinger (Barolo y cols., 2000 ).

-Vector pH-Pelican (Barolo y cols., 2000).

-Vector pGemT easy (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Vector pbluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.).

-QIAgen Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).

-QIAgen maxiprep (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).

-Promega wizard (Promega, Madison; Wisconsin, EE.UU.).

-Miniprep extracción de geles (QIAGEN, Stanford, California, EE.UU.).

-Cromosoma artificial bacteriano (BAC) con el gen dlg (www.fly base.org).

2.2.- Transgénesis en Drosophila

-Vector helper p∆2-3 (Gentileza del Dr. Alvaro Glavic, Laboratorio de Biología del Desarrollo,

Facultad de Ciencias, Universidad de Chile).

-Portaobjetos (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Alemania).

-Estirador de capilares (Sutter Instrument Co., Novato, California, EEUU).

-Capilares de borosilicato con filamento (Sutter Instrument Co, Novato, California, EEUU).

-Aceite Halocarbonado (Halocarbon Products Corp., New Jersey, EE.UU.).

-Placas de recolección para embriones.

-Levadura (Lefersa SA., Santiago, Chile)

-Microscopio campo claro Olympus CX31 (Olympus, Center Valley, Pennsylvania, EE.UU).

-Microscopio de epifluerescencia Nikon eclipse e400 (Nikon Instruments, Melvilla, Nueva York,

EE.UU.).

-Cinta adhesiva doble faz (3M, St Paul, Minnesota, EE.UU.).

-Inyector picopump (Word Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).

-Hipoclorito de Sodio (Clorinda S.A., Santiago, Chile).

14

2.3.- Inmunohistoquímica

-Paraformaldehido (PAF) (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).

-Tritón X-100 (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU).

-PEM (100 mM PIPES como sal disódica, 2 mM EGTA y 1 mM MgSO4) (Stock del laboratorio

de neurobiología celular y molecular).

-Suero de cabra (GIBCO BRL, MD, California, EE.UU).

-Amortiguador fosfato de sodio 0,1 M (Na2HPO4 0,2 M, NaH2PO4 0,2 M, H2O pH 7,2).

-PT: Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%.

-PBTG: Amortiguador fosfato de sodio, Triton X-100 0,3%, suero de cabra 5%.

-Metanol (Merck, Darmstadt,Alemania).

-n-heptano (Merck, Darmstadt,Alemania).

-Glicerol (Merck, Darmstadt,Alemania).

-Elastomero de silicona Sylgard 184, para placas de disección de larvas y adultos (Dow Corning

Corporation, Midland, Michigan, EE.UU).

-Pinzas N°5 Dumoxel no magnéticas (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).

-Tijeras quirúrgicas. (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).

-Alambres de tungsteno. (World Precision Instruments, Sarasota, Florida, EE.UU.).

-Medio de montaje para fluorescencia Vecta Shield (Vector Lab, Burlingame, California,

EE.UU).

-Microscopio confocal Zeiss LSM Meta 510.

-Microscopio spinning disc Olympus DS-BXWI100 (Olympus, Center Valley, PA, EE.UU).

15

2.4.-Anticuerpos

Anticuerpos primarios:

-Anti-GFP. Anticuerpo monoclonal de ratón especial para localización inmunohistoquímica de

GFP. Número de catálogo A-11120 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.).

-Anti-GFP. Anticuerpo policlonal de conejo. Número de catálogo A-11122 (Molecular Probes,

Eugene, Oregon, EE.UU.).

-Anti-Elav. Anticuerpo monoclonal de rata que reconoce la proteína Elav de Drosophila.

Número de catálogo 7E8A10 (Hybridoma Bank, Iowa City, Iowa, EE.UU).

-Anti-Repo. Reconoce la proteína Repo, factor de transcripción requerido para la diferenciación

de la Glia. Número de catálogo 8D12 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.).

Anticuerpos secundarios:

-Anti-IgG (H+L) de conejo conjugado con FITC. Número de catálogo 711-095-152. (Jackson

InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).

-Anti-IgG (H+L) de rata conjugado con Cy3 Número de catálogo 112-165-068. (Jackson

InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).

-Anti-IgG (H+L) de ratón conjugado con Rodamina Cy3 Número de catálogo 115-295-166

(Jackson InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).

-Anti-IgG (H+L) de ratón conjugado con FITC. Número de catálogo 115-195-150 (Jackson

InmunoResearch Labs, West Grove, Pensilvania, EE.UU).

16

2.5.-Cepas de Drosophila melanogaster

Las cepas usadas de moscas fueron mantenidas a 18ºC en botellas o viales con medio de

cultivo preparado en base a levadura fresca, glucosa, harina y agar. Trabajamos con las siguientes

cepas:

-Yw (yellow-white): Esta línea de moscas posee una mutación del gen white. Este gen se denomina

así porque su ausencia se refleja en el fenotipo de ojos blancos, en lugar de los ojos rojos de la

mosca silvestre. Al inyectar en esta línea los vectores de transgénesis podemos reconocer la

inserción por un cambio en el fenotipo.

-Cyo/If ; Mkrs/ Tm6b: Posee dos cromosomas marcadores con mutaciones visibles en el fenotipo,

estos son If (irregular facet) que en el fenotipo se manifiesta con ojos de facetas irregulares o

rugosos, y Mkrs (Mn (minute), kar(karmoisina), ry(rosy), sb(stubble ), que se manifiesta con quetas

notoriamente más cortas y gruesas que la mosca silvestre. Posee dos cromosomas balanceadores,

los que tienen inversiones importantes que impiden la recombinación; estos cromosomas

balanceadores son letales en homocigocis, y son visibles en el fenotipo como Cyo (curly oyster),

que manifiesta alas curvas, y Tm6b (third multiple 6b), que muestra un exceso de quetas en la

región del húmero. Estas cepas se utilizan para mapear una inserción, es decir, identificar el

cromosoma en el que ocurrió, mediante cruzas con la mosca transgénica (ver resultados, figura 13)

-Líneas transgénicas: Fueron generadas mediante la inserción de los vectores pH-Pelican y pH-

Stinger con las secuencias escogidas clonadas en ellos (ver secuencias escogidas en la figura 7), en

embriones yw en estadio de pre-blastodermo. La localización de la inserción se mapeó mediante

cruzas con Cyo/If; Mkrs/ Tm6b y se estudiaron los embriones, los cerebros de las larvas del tercer

estadio y los cerebros de las moscas adultas (Figura 5).

17

Fig 5. Esquema del ciclo de vida de Drosophila melanogaster Etapas del desarrollo desde el embrión hasta la mosca adulta. Barra 1000: µm

18

B.-Métodos

2.6.-Vectores de expresión pH-Pelican y pH-Stinger

Los vectores pH-Pelican y pH-Stinger se utilizaron para integrar las construcciones

generadas al genoma de la mosca. La incorporación al genoma ocurre debido a que estos vectores

poseen secuencias repetidas invertidas que permiten su inserción en el genoma en un proceso

catalizado por la enzima transposasa. La enzima no es codificada por el vector y debe ser

coinyectada en otro vector. Es decir, la transposasa se incorpora como un elemento P y la

integración ocurre al expresarse el gen del vector que codifica la transposasa.

Para reconocer la incorporación en el genoma, estos vectores cuentan con el gen white que

produce la restauración del fenotipo de color de ojo rojo al integrarse en el genoma de la mosca

white(-) que será inyectada. La región genómica es clonada río arriba del promotor mínimo HSP 70

seguido por la secuencia del gen lacZ que codifica una β-galactosidasa citosólica que por lo tanto

muestra contornos celulares (vector pH-Pelican) o la secuencia que codifica para EGFP (“enhanced

green fluorescent protein”) con una secuencia de localización nuclear (pH-Stinger). Toda esta

construcción está flanqueada por secuencias aislantes (Geyer, 1997), de modo de reducir el efecto

de la heterocromatina y bloquear promotores y silenciadores que pudieran encontrarse en la región

de inserción del vector (Figura 6).

Si las secuencias escogidas se comportan como activadoras de la expresión serán capaces de

dirigir la expresión de lac Z o egfp en el patrón de expresión de dlg.

19

Figura 6: Vectores pH-Pelican y pH-Singer Las cajas negras con la letra P representan secuencias de transposición de elementos P, los círculos con la letra I a las secuencias aisladoras de la transcripción. El rectángulo pequeño adayacente a la primera secuencia aisladora de izquierda a derecha para ambos vectores refiere el sitio de múltiple clonamiento. Las flechas indican el sentido de la transcripción del gen. La cabeza de flecha negra indica secuencias de localización nuclear (Adaptado de Barolo y cols., 2000).

20

2.7.- Estrategia de clonamiento de las secuencias a los vectores de inyección

Las zonas escogidas (Figura 7), candidatas a ser reguladoras de la transcripción de dlg y

subzonas de las mismas, se amplificaron a partir de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que

contenía la región cromosomal de dlg, mediante la reacción de polimerasa en cadena (PCR) con

partidores diseñados para estas zonas (Tabla1). Los once fragmentos amplificados se aislaron y

separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Luego

se ligaron al vector de productos de PCR pGEM-Teasy que provee sitios de restricción Sac II y Sal

I. Luego se transformaron células E. coli XL1 y se subclonaron posteriormente en pBluescript SK

ligando los insertos obtenidos mediante las digestiones SacII y Sal I (Figura 8). Se usaron estos dos

vectores para obtener los sitios de restricción adecuados para trabajar con enzimas que no cortaran

las secuencias. Se extrajo este vector de las células bacterianas, se transformaron y clonaron los

fragmentos a los vectores pH-Pelican y pH-Stinger siguiendo una estrategia de restricción común

para todos los fragmentos. Esta consiste en digerir el vector pBluescript con Sac II y Xho I y ligar

los insertos a los vectores de inyección digeridos con las mismas enzimas. Este procedimiento se

repitió en todos los casos, excepto para dos de las construcciones debido a que poseen sitios

internos Xho I (Figura 8), los cuáles fueron digeridos con Sac II y Kpn I y ligados a los vectores de

inyección digeridos con estas enzimas. Los plasmidios pH-Pelican y pH-Stinger fueron inyectados a

embriones de estadio de pre blastodermo de Drosophila, que poseen todos los elementos necesarios

para insertarse en el genoma de la mosca, excepto la enzima transposasa, que catalizó el proceso.

Esta se debió coinyectar con un plasmidio “helper” p∆2-3 que la codifica.

21

Figura 7: Ubicación de los partidores de las zonas escogidas para el estudio de la regulación de la transcripción de dlg Esquema del gen dlg completo. En azul se muestran los exones más pequeños y en naranja, los de mayor tamaño. En verde se muestran las posiciones en el gen de los partidores usados. (b) y c) son ampliaciones de a), de las zonas del gen en las cuales se diseñaron los partidores. Las flechas azules muestran los amplicones obtenidos al combinar los partidores. La secuencia fue obtenida de www.flybase.org y analizada en el programa Vector NTi.

Tabla 1. Secuencias partidores para las construcciones realizadas

Nombre partidor Secuencia Orientación

dlg1 CACTTACACAGACATACCCAAACGC 5´-3´

dlg2 TCCGTGACGATCGATAGGTGG 3´-5´

dlg3 GCTTCTTATTTGACTTGTTCGTTGG 5´-3´

dlg4 TGACCACATGGTGATCGTTCAGT 3´-5´

dlg5 TAGATTTGTTCGCTTAATCGACACC 5´-3´

dlg6 TGGAGAAGGTTTGAGGAACACG 3´-5´

dlg7 CCTATTTTTATGGTCCACGAGTCCT 3´-5´

dlg8 CCGCTTGGTCAGTGTTCACTG 5´-3´

dlg9 AATGCATTGTGTTGTAATCCTTTGC 5´-3´

dlg10 GCAGTGCCTTTGGCTTGATAACTT 3´-5´

22

Figura 8: Estrategia de clonamiento de las secuencias De arriba hacia abajo se muestra el sentido en que se clonaron las secuencias amplificadas por PCR, las que se clonaron a pGem-T easy y subclonaron en pBluescript SK previas a ser clonadas en los vectores pH-Pelican y pH-Stinger

23

2.8.- Transgénesis en Drosophila por inyección

Para los experimentos de transgénesis por inyección se realizaron cambios de las placas de

recolección de embriones yw (carentes de gen white que codifica para el color de ojo rojo de la

mosca) cada una hora, 4 veces previo al inicio de la inyección, mientras se preparaba la mezcla de

vector de transgénesis junto al plasmidio “helper” que se inyecta el mismo día. Se centrifugó una

alícuota de esta mezcla a 12.000 x g durante 30 min (generalmente unos 5 µl) mantenida a –20º C

en tampón de inyección, se separó el sobrenadante, y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 min, de

modo de no arrastrar impurezas que puedan tapar la aguja. La mezcla se mantuvo a 4º C previa a

ser inyectada. Se prepararon las agujas para la microinyección con un estirador de capilares con

capilares de borosilicato con filamento y llenadas con alrededor de 2 µl de la mezcla. Para las

inyecciones se recolectaron los embriones por periodos de 30 min a temperatura ambiente, lo que se

repite hasta tener doscientos embriones inyectados exitosamente, es decir que no dejen escapar

citoplasma al ser inyectados. Luego se descorionaron con solución de hipoclorito de sodio al 50%

durante 3 min, y se alinearon sobre una placa de agar (Figura 9A y B) y se eliminaron los no

alineados pues como no se inyectan pueden desarrollarse sin ser transgénicos (9C). Se adhirieron en

una placa portaobjeto con cinta adhesiva doble faz (Figura 9D), y se secaron entre 3-6 minutos en

silicagel, tiempo determinado empíricamente cada día de la inyección. Luego se cubrieron con

aceite halocarbonado y se inyectaron utilizando un inyector Picopump por el extremo posterior en

estadio de una célula o pre blastodermo con el mínimo volumen necesario para observar una

aclaración de la parte posterior del embrión en el microscopio. Este cambio de aspecto refleja la

incorporación del líquido al embrión independiente a que se inserte o no (Figura 9E). Los

embriones que no estaban en el estadio de una célula no se inyectaron y se destruyeron. Los

embriones inyectados se dejaron a alrededor de 22 ºC en una cámara húmeda hasta alcanzar el

estadio de larva (Figura 9F), aproximadamente luego de unas 45 horas post inyección, y luego se

rescataron y traspasaron a viales con comida para moscas. (Spradling, 1986).

24

Figura 9: Protocolo de inyección de embriones de Drosophila A) Muestra de embriones descorionados, los que se movilizan sobre una placa de agar con un asa de tungsteno. B) Fila de embriones ordenados con la parte posterior hacia el mismo lado. C) Se remueven todos los embriones que no fueron alineados y que no serán inyectados (D) La cinta adhesiva permite inmovilizar a los embriones que serán inyectados. E) la flecha blanca muestra una aguja ingresando a la parte posterior de un embrión, F) Cámara (que debe mantenerse en un ambiente húmedo) donde se depositan los embriones inyectados y se cubren con aceite halocarbonado. Barra: 1000µm.

A B C

D E F

25

2.9.- Inmunohistoquímica de embriones

Recolectamos en una placa los embriones depositados durante toda la noche a 25ºC por

moscas adultas. Luego se descorionaron los embriones con una solución de hipoclorito de sodio

50% durante tres minutos y se lavaron posteriormente con agua destilada. Luego se preparó una

solución que contiene 162 µl de PAF 37%, 338 µl de PEM 1X y 500 µl de n-heptano, se agitó

vigorosamente durante 30 segundos y con ayuda de un pincel se introdujeron los embriones en ella

desde la placa, y se incubaron durante veinte minutos. Luego se eliminó la fase inferior y se agregó

metanol hasta alcanzar un volumen de 1 ml y se agitó vigorosamente durante treinta segundos, lo

que permite que caigan al fondo los embriones fijados y desvitelizados. Se descartó la fase superior,

se lavó tres veces con metanol y se realizaron tres lavados con agitación de 10 minutos cada uno

con PT. Luego se realizó el bloqueo con PBTG durante una hora sin agitar, para posteriormente

incubar toda la noche a 4ºC y con agitación suave con los anticuerpos primarios Anti-GFP (ratón) y

Anti-Elav (rata), que marca las células del sistema nervioso central y periférico en todas las etapas

del desarrollo, una vez que se han diferenciado a neuronas (Tabla 2). Al día siguiente se lavó tres

veces con PT bloqueando posteriormente con PBTG, y se incubó con los anticuerpos secundarios

fluorescentes Anti-ratón y Anti-rata, respectivamente (Tabla 2) durante una hora a temperatura

ambiente. Posteriormente se lavó tres veces durante 15 minutos con PT con agitación, se agregó

glicerol 50% y se incubó durante media hora, luego se agregó glicerol 70% y se incubó nuevamente

durante media hora. Finalmente se montó la suspensión de embriones en medio de montaje para

fluorescencia y se guardó a -20 ºC en oscuridad para observar posteriormente. (Sullivan y cols.,

2000)

26

2.10.- Inmunohistoquímica de cerebro de larva

Se disectaron las larvas de tercer estadio en placas de Petri de 60 mm mantenidas en hielo y

cubiertas con elastómero de silicona Sylgard 184, que contenían amortiguador fosfato de sodio pH

7,2. Utilizando pinzas y agujas de tungsteno se desprendieron los cerebros del resto de la larva,

mediante su tracción. Los cerebros así dispuestos se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 30

minutos a temperatura ambiente. Después de lavar el tejido 3 veces durante 15 minutos con PT, los

cerebros se incubaron a 4°C durante toda la noche con los anticuerpos primarios Anti-GFP (ratón) y

Anti-Elav (rata), o bién con los anticuerpos Anti-GFP (conejo) y Anti-Repo (ratón) diluido en PT.

Luego se lavó 3 veces durante 10 minutos con PT y se incubó 2 horas a temperatura ambiente con

los anticuerpos secundarios fluorescentes Anti-ratón y Anti-rata, o bién Anti-ratón y Anti-conejo,

respectivamente. Finalmente se realizó el último lavado y los cerebros se montaron en medio de

montaje sobre un portaobjeto. Las muestras se guardaron a –20°C para su posterior análisis

(Sullivan y cols., 2000).

Tabla 2: Anticuerpos utilizados en experimentos de inmunohistoquímica

Anticuerpo primario, procedencia

Dilución Anticuerpo Secundario Dilución

Anti-Elav (Rata) 1:10 Anti-Rata 1:200

Anti-Repo (Ratón) 1:10 Anti-Ratón 1:200

Anti-GFP (Ratón) 1:200 Anti-conejo 1:200

Anti-GFP (Conejo) 1:1000

2.11.- Inmunohistoquímica de cerebro de mosca adulta

Se retiraron los cerebros de la cabeza abriendo ésta con pinzas desde los pliegues de la

probosis. Luego se fijaron 20 minutos en PAF al 4% y se lavaron tres veces durante 20 minutos con

PT, bloqueando luego con PBTG para luego incubar con los anticuerpos primarios Anti-GFP

(ratón) y Anti-Elav (rata) 4ºC durante dos días. Al término de esta incubación se lavaron con PT

tres veces durante 20 minutos y se incubaron con los anticuerpos secundarios fluorescentes Anti-

27

ratón y Anti-rata durante dos horas, lavando posteriormente con PT durante 20 minutos tres veces y

luego se aclararon en glicerol 70% durante una hora para trasladarlos al medio de montaje en un

portaobjetos. Las muestras se guardaron a –20°C para su posterior análisis (Sullivan y cols., 2000).

2.12.-Deconvolución de imágenes.

Se empleó el sistema Huygens profesional (Scientific volume imaging, Hilversum, Holanda)

para las imágenes obtenidas por microscopía de disco giratorio.

La deconvolución es una operación matemática. Se usa en restauración de señales para

recuperar datos que han sido degradados por un proceso físico que puede describirse

matemáticamente mediante la operación inversa, una convolución. Es el caso de imágenes de

dispositivos ópticos como los empleados en microscopía o astronomía, pero también en otros tipos

de sensores como los de medidas sísmicas.

En microscopía, la convolución modela matemáticamente el proceso de formación de una

imagen que sufre degradación por desenfoque y ruido. El desenfoque, aún en las mejores

condiciones, aparece inevitablemente en el límite de resolución del dispositivo debido a la

difracción en las lentes. Incluso con la mejor electrónica y gran habilidad del operador, las

variaciones de flujo inherentes a las propiedades estadísticas de los fotones producen imágenes

ruidosas, sobre todo en los límites de baja intensidad en que habitualmente se realiza la microscopía

de fluorescencia.

La restauración mediante deconvolución aplica el proceso inverso a la imagen degradada

para obtener una mejor representación del objeto real (Cheng, 2006)

28

RESULTADOS

3.1. Elección de dos posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg

Para escoger las posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg consideramos que este

tipo de zonas son susceptibles a la inserción de elementos P (Shen y Hirsh, 1994) (Figura 10 A) y

que además debería existir conservación entre especies para estas (Figura 10 B). Basándonos en

estos principios encontramos dos grandes regiones con estos criterios, una de ellas ubicada entre el

extremo 3´ del gen tim8 y el exón 1 de dlg, y la otra zona ubicada entre el inicio del exón 7, y el

exón 8. La primera zona mencionada es de 4894 pb y la denominamos dlg 5/6; la otra zona de 1899

pb la llamamos dlg 1/2 de acuerdo a los partidores diseñados que marcan el comienzo y el final de

la zona de dlg amplificada, respectivamente.

Nuestro interés se basó en encontrar las zonas regulatorias de la transcripción de dlg

acotadas que dirijan a la expresión de la isoforma neuronal (DLGS97) o a la epitelial (DLGA). Por

lo tanto, para las dos zonas anteriores encontradas se sintetizaron partidores dirigidos hacia

secuencias ubicadas dentro de estas zonas, de modo de obtener una gran cantidad de productos

amplificados que al ser inyectados en embriones de Drosophila nos den indicio de la capacidad

regulatoria de cada una de estas subzonas, y así poder definir acotadamente las zonas regulatorias

de la transcripción de dlg.

De esta manera obtuvimos once secuencias, tres de ellas pertenecientes a la zona dlg 1/2 y el resto

pertenecientes a dlg 5/6 (Tabla 3).

29

A)

B)

Figura 10: criterios para la selección de posibles zonas regulatorias de la transcripción A.- Muestra el esquema del gen dlg con elementos P (triángulos), capaces de insertarse en el gen. Las dos zonas con mayor susceptibilidad a elementos P aparecen con triángulos rojos y azules, y están incluidas en las zonas escogidas para estudiar. (Esquema modificado de http://flybase.bio.indiana.edu/)

B.- Muestra el análisis de la zona escogida de mayor tamaño, correspondiente a dlg 5/6. Una vez identificada esta zona como susceptible a la incorporación de elementos P (A), fue comparada con Drosophila pseudooscura secuenciada en distintos años (1 y 2) y con Drosophila yakuba (3). Los picos son las zonas conservadas entre especies, los rojos corresponden a intrones, los azules a exones y los celestes a exones no traducidos (análisis realizado en la página http://pipeline.lbl.gov/serlet)

30

3.2. Clonamiento de las posibles zonas regulatorias de la transcripción de dlg

Las once secuencias regulatorias fueron amplificadas por PCR a partir de un cromosoma

artificial bacteriano que posee el gen dlg y clonadas en el vector para productos de PCR

pGemTeasy. Por análisis informáticos realizados con el programa Vector Nti encontramos los sitios

de restricción en las secuencias y de este modo pudimos constatar su correcta amplificación en

función de su patrón de restricción para la enzima Eco RI (Tabla 3, Figura 11). Los sitios presentes

en las secuencias nos permitieron diseñar una estrategia para subclonar nuestras construcciones en

los vectores de inyección pH-Pelican y pH-Stinger, con una construcción intermedia en el vector

pBluescript SK. (Materiales y métodos, Figura 8). Todas las construcciones fueron secuenciadas

parcialmente (aproximadamente 600 pb) desde el vector pBluescript SK y comparadas con la

secuencia de dlg en la página www.flybase.org para comprobar su identidad.

Finalmente se utilizaron los vectores, pH-Pelican y pH-Stinger para integrar las

construcciones generadas al genoma de la mosca.

Tabla 3: Tamaños esperados de las construcciones generadas y patrón de corte resultante de la digestión con Eco RI en el vector pBluescript SK. (Análisis realizado en el programa Vector NTi)

Construcción Tamaño (pb)

Tamaños linealizados

en pBluescript (pb)

Tamaños de fragmentos de las

construcciones digeridas con Eco RI (pb)

dlg 1/2 1899 4899 1219, 386, 294

dlg 1/4 1615 4615 935, 386, 294

dlg 3/2 640 3640 640

dlg 5/7 2238 5238 1655, 583

dlg 5/10 4217 7217 1975, 1659, 583

dlg 8/6 2717 5717 2236, 356

dlg 8/10 2015 5015 1659, 356

dlg 9/6 4586 7586 2336, 1975, 275

dlg 9/7 1975 4975 1655, 275

dlg 9/10 3920 7920 1975, 1659, 275

dlg 5/6 4894 7894 2336, 1975, 583

31

Figura 11: Visualización de las construcciones generadas a partir de las zonas regulatorias

Se muestran las bandas resultantes de la digestión con Eco RI para cada construcción clonada en pBluescript. La banda

de 3000 pb corresponde al vector linearizado. Las bandas de los fragmentos obtenidos (Tabla 3) son coincidentes con

los resultados esperados.

1Kb ladder dlg-1/2 dlg-1/4 dlg-3/2 dlg-5/7 dlg-5/10 dlg-8/6

1Kb ladder dlg-8/10 dlg-9/6 dlg-9/7 dlg-9/10 dlg-5/6

pBluescript

32

3.3. Inyección y mapeo de las secuencias

Inyectamos las construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 clonadas en el vector pH-Stinger. dlg 1/2

abarca la totalidad de la región escogida entre el exón 7 y 8 y dlg 5/10 abarca casi la totalidad de dlg

5/6 la zona 5´ escogida como regulatoria de dlg (Figura 7). Previo a ser inyectadas, verificamos que

las construcciones en el vector pH-Stinger fueran las esperadas mediante digestiones con Eco RI,

las que posteriormente se analizan en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 12).

Las moscas inyectadas pueden o no haber sufrido la inserción del elemento P, sin embargo

en la primera generación (F0) no se observan cambios fenotípicos en las moscas que nacen de los

embriones inyectados. Por esta razón, para obtener una línea transgénica, el elemento P se debe

incorporar en las células precursoras de la línea germinal con su gen marcador white y su gen

reportero egfp. Por lo tanto, el marcador sólo se podrá observar en la siguiente generación (F1)

proveniente de la cruza entre las moscas F0 y moscas yw. En esta descendencia habrán moscas de

ojos rojos y moscas de ojos blancos, siendo las de ojos rojos de nuestro interés, pues indicarán la

incorporación del elemento P.

Una vez identificadas las líneas transgénicas con inserciones, es importante determinar el

cromosoma en el cual ocurrió la inserción, para tener la posibilidad de estudiar líneas distintas en

homocigosis o incluso aumentar el número de copias de la inserción. Para esto se cruzan las moscas

F1 con moscas balanceadoras, las cuales al tener inversiones en sus cromosomas (marcados además

con mutaciones viables que dan un fenotipo visible) impiden la recombinación, resultando una

generación F2 con la inserción incorporada en forma estable. Las líneas balanceadoras poseen la

mutación white que da un fenotipo de ojos blancos que hace posible seguir la presencia en el

genoma de un cromosoma con un elemento P en la descendencia. De esta cruza sólo interesan las

moscas que manifiesten el balanceador para el cromosoma 2 (Cyo) en el fenotipo (alas curvas) y

que posean la inserción del elemento P (ojos rojos) para el cromosoma 3 (Tm6b). Cruzando

posteriormente F2 con moscas yw, se puede determinar el cromosoma en que se insertó el elemento

P mediante el análisis de los fenotipos obtenidos (Figura 13).

33

Para ambas construcciones inyectadas encontramos varias líneas, las que fueron mapeadas.

Se analizó líneas con inserciones en los tres cromosomas principales (X, 2 y 3), y observamos que

todas las líneas analizadas para cada construcción presentaron una expresión característica, muy

similar entre sí, reflejando que esta expresión es proveniente de las zonas clonadas en el vector, y

no depende del lugar de inserción. Conservamos las líneas que expresaron EGFP con mayor

intensidad (Tabla 4, Figura 14). Estas líneas corresponden a la cepa 15 para dlg 5/10, y a la cepa 2

para dlg 1/2. Con estas líneas escogidas se realizaron posteriormente los análisis de microscopía

confocal de los estudios de inmunofluorescencia realizados en estadios tardíos de embriones, en

cerebros de larvas y en cerebros de las moscas adultas.

Figura 12: Construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 en pH-Stinger digeridas con Eco RI. En el gel de agarosa 0,8% se muestran las bandas resultantes al digerir las construcciones dlg 1/2 y dlg 5/10 clonadas en el vector pH-Stinger con la enzima de restricción Eco RI. Las bandas de 11500pb corresponden al vector pH-Stinger y las otras bandas concuerdan con datos de la digestión con esta enzima arrojados por el programa Vector NTi (Tabla 3).

1Kb ladder dlg-1/2 1Kb ladder dlg-5/10

pH-Stinger

34

Figura 13. Determinación de la ubicación cromosómica de la inserción del elemento P Este esquema ejemplifica la manera de mapear una mutación en Drosophila melanogaster.

Se muestra en Fo una mosca transgénica macho cuya inserción no es visible en el fenotipo (encerrada en un rectángulo con la letra P que indica incorporación del elemento P) proveniente de un embrión inyectado, que se cruza con yw hembra (x/x; 2/2 ;3/3). En F1 la descendencia de la cruza anterior con ojos rojos (encerrada en un rectángulo) se cruza con la doble balanceadora. En F2 se muestra las moscas doble balanceadas y transgénicas (encerradas en un rectángulo) las que se deben cruzar con hembras yw. En F3 se muestran los genotipos visualizables en los fenotipos esperados. Por análisis de estos fenotipos se puede concluir que la inserción del elemento P ocurrió en el cromosoma 2.

33;

22; P

YX

33;

22;

XX

33;

22; P

YX

X bTmMkrs

IfCyo

XX

6;;

36;

2; bTm

PCyo

YX

X33;

22;

XX

36;

2; bTmCyo

YX

33;

22;PY

X36;

22; bTmP

YX

Fo Genotipo transgénico

F1 Genotipo transgénico

F2 Utilizar las de fenotipo

ojos rojos y doble

F3 No se observarán

moscas de ojos rojos

Mutación en cromosoma 2

X

33;

2; Cyo

YX

35

Figura 14. Expresión de algunas de las líneas transgénicas en cerebro de larva Se observa la expresión de EGFP de algunas de las líneas encontradas tanto como para dlg 5/10 (cuadros superiores) como para dlg 1/2 (cuadros inferiores). Se observa que la expresión de EGFP es más fuerte en la línea 15 para dlg 5/10 y en la línea 2 en el caso de dlg 1/2. Barra: 200µm.

Tabla 4: Líneas obtenidas y cromosomas en que se insertó el elemento P Se muestran las distintas líneas transgénicas obtenidas para cada construcción. Tras analizar la expresión de cada línea. Las construcciones indicadas en rojo corresponden a las líneas que expresaron GFP con mayor intensidad, las que conservamos.

Construcción Cepa Cromosoma

dlg1-2 29 2.

dlg1-2 32 2.

dlg1-2 8 3.

dlg1-2 2 2.

dlg1-2 24 3.

dlg1-2 12 2.

dlg5-10 3 2.

dlg5-10 5 X

dlg5-10 15 3.

dlg5-10 19 3.

dlg5-10 38 X

36

3.4. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en el estadio embrionario de Drosophila melanogaster

Debido a que en la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apico-

basal de la división de los precursores neurales o neuroblastos, hicimos experimentos de

inmunofluorescencia en estadios tardíos del desarrollo embrionario para observar la expresión de

EGFP nuclear dirigida por nuestras construcciones. Para ello los embriones fueron recolectados y

descorionados para la penetración de los anticuerpos.

Comparamos la expresión del anticuerpo Anti-GFP (verde) con el Anti-Elav (rojo) (Figura

15 A y D). Este anticuerpo está dirigido contra Elav, un factor de transcripción que se expresa en

todas las neuronas (Robinow y cols., 1988).

No hubo expresión de EGFP en estadio embrionario para dlg 1/2 (Figura 15 B) ni para dlg

5/10 (Figura 15 E) en la etapa embrionaria, a pesar de que los antecedentes atribuyen funciones a

dlg en este estadio. Este resultado corresponde a la totalidad de una de las zonas escogidas, dlg 1/2,

y a 680 pb menos de dlg 5/6, la otra gran zona más río arriba de dlg, lo que sugiere diferentes

explicaciones. Las regiones escogidas podrían tal vez no estar dirigiendo la expresión a causa de ser

zonas regulatorias tardías, o bien, dentro de las mismas zonas existan zonas represoras de la

transcripción. En el caso de dlg 5/10, esta secuencia podría ser una secuencia interrumpida de un

regulador de mayor tamaño, sin descartar el resto de las posibilidades.

37

Figura 15: Inmunofluorescencia de dlg1/2 y dlg5/10 en embriones de Drosophila melanogaster A y D: Inmunofluorescencia con anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).

B y E: Inmunofluorescencia con anticuerpo Anti-GFP.

A-C: dlg 1/2

D-F: dlg 5/10

C: Colocalización de (A + B)

F: Colocalización de (D + E).

Barra: 200 µm.

38

3.5. Expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de larva de Drosophila melanogaster

A pesar que en estadio embrionario no encontramos expresión de EGFP dirigida por dlg 1/2

ni por dlg 5/10, decidimos investigar si durante el desarrollo hay cambios en la expresión dirigidos

por nuestras secuencias.

Se seleccionaron larvas del tercer estadio, a las cuales se les extrajo el cerebro unido al

cordón ventral para realizar experimentos de inmunoflorescencia usando los mismos anticuerpos al

igual que en estado embrionario.

En el caso de dlg 1/2 observamos en un microscopio de disco giratorio que hay expresión

generalizada en las células cerebrales; esta expresión es predominantemente neuronal, pues en las

zonas donde hay núcleos bien definidos en los cerebros marcados con Anti-Elav y Anti-GFP se

observa gran colocalización (Figura 16 D), a diferencia de otras regiones del cerebro donde la

marca de los anticuerpos es más difusa y se podría atribuir a que los anticuerpos no penetraron en

las células. No observamos colocalización en células gliales (Figura 16 O).

Para dlg 5/10 la expresión fue mucho más acotada que la expresión de dlg 1/2, dirigiendo la

expresión en muy pocas células del cerebro y en el cordón ventral (Figura 16 F y J). Tanto en

cerebro como en el cordón ventral se observó un patrón de expresión simétrico.

La expresión de dlg 5/10 no mostró colocalización con la expresión de Elav (Figura 16 G y

H), ni mostró colocalización mediante microscopía confocal con el anticuerpo Anti-Repo (Figura

16 K y L), un marcador nuclear de células gliales. Estos resultados indican que dlg 5/10 es una

secuencia que dirige la expresión en epitelio, a pesar de ser la zona río arriba de la isoforma S97N,

que se localiza en el sistema nervioso.

Los resultados obtenidos muestran expresión tardía de ambas posibles secuencias

regulatorias, y sólo la construcción dlg 5/10 dirigió la expresión de un tipo celular no perteneciente

al sistema nervioso, a pesar de ser muy acotado, a diferencia de dlg1/2 que dirige la expresión en

células neuronales al colocalizar con Elav que es un marcador panneuronal.

39

Figura 16: Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en cerebro de larva de Drosophila melanogaster Se muestran experimentos de inmunofluorescencia para larvas de tercer estadio de Drosophila melanogaster.

De A a H: Imágenes obtenidas mediante microscopio disco giratorio.

De I a O: Imágenes obtenidas mediante microscopio confocal.

A y E: Marca con el anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).

B y F: Marca con el anticuerpo Anti-GFP para dlg 1/2 y dlg 5/10, respectivamente.

C y D: Colocalización de (A+ B). G y H: Colocalización de (E + F).

I y M: Anticuerpo Anti-Repo (marcador de célula de la glia).

J y N: Anticuerpo Anti-GFP para dlg 5/10 y dlg 1/2, respectivamente.

K y L: Colocalización de (I+ J).

Ñ y O: Colocalización de (M + N).

Barra: 50 µm.

D

A B C D

E

I

M

F

J

N

G

K

Ñ

H

L

O

40

3.6. Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en el cerebro de Drosophila Melanogaster adulto.

En la siguiente etapa decidimos evaluar si los patrones encontrados con ambas

construcciones en el cerebro de larva se mantienen o modifican en el cerebro de adulto. Para ello

analizamos la expresión de dlg 1/2 y dlg 5/10 en cerebro de mosca adulta mediante reacciones de

inmunoflorescencia con los mismos anticuerpos Anti-GFP y Anti-Elav.

Al extraer los cerebros de adulto no es posible extraer junto con éste el cordón ventral como

en el caso de la larva, pero de todos modos en el cerebro de adulto es posible analizar mantenciones

o modificaciones del patrón de expresión.

Para ambas construcciones se conservó el patrón de expresión encontrado en estadios

larvales. En la Figura 17 C y D se observa que la expresión de dlg1/2 ocurre en el cerebro completo

al igual que en estadios larvarios, y se observa una amplia colocalización con el marcador neuronal

Elav en las células de Kenyon, mientras que dlg5/10 no dirigió la expresión hacia células

neuronales (Figura 17 G y H), manteniendo el patrón acotado de expresión encontrado en el cerebro

de larva.

41

Figura 17: Expresión de dlg1/2 y dlg5/10 en el cerebro de Drosophila melanogaster adulto. Se muestran experimentos de inmunofluorescencia para cerebros de mosca adulta.

A y E: Marca con el anticuerpo Anti-Elav (marcador neuronal).

B y F : Marca con el anticuerpo Anti-GFP para dlg 1/2 y dlg 5/10, respectivamente.

C y D: Colocalización de (A+ B).

G y H: Colocalización de (E + F).

Barra: 50 µm.

A B C

E F G H

D

42

DISCUSIÓN

El gen dlg produce diversas isoformas de localización tejido específico, en un proceso que

involucra el uso alternativo de promotores a partir de del reclutamiento de factores de transcripción

tejido específicos. En este trabajo estudiamos el rol regulatorio de zonas de este gen. Para ello

insertamos estas posibles secuencias regulatorias en el vector pH-Stinger y luego analizamos su rol

regulatorio mediante la capacidad de dirigir la expresión del gen reportero EGFP.

dlg 1/2 y dlg 5/10 dirigen la expresión de EGFP

Podemos atribuir un rol regulatorio a las secuencias inyectadas, pues observamos expresión

de EGFP dirigida por ellas, lo que se evidencia con la expresión similar para las distintas líneas que

poseen la misma construcción. Otra evidencia que apoya esta función regulatoria es la expresión

diferencial de las líneas que poseen construcciones diferentes, independiente de la región del

genoma en que fueron insertadas (Tabla 4, Figura 14). Aunque la región donde se insertó del

elemento P no influenció la expresión de las secuencias inyectadas, pudimos constatar que la región

donde se inserta el elemento P sí es importante, puesto que también obtuvimos líneas estériles

(datos no mostrados). Por otra parte, no pudimos obtener líneas homocigotas para las secuencias

dlg 1/2 ni dlg 5/10, diseñadas para observar mayor expresión de EGFP, lo que nos indica que la

inserción en estos casos pudo haber interrumpido genes importantes para la mosca. Por la expresión

diferencial observada para cada construcción, se puede descartar que la producción de EGFP se

deba al promotor mínimo del vector. Además hay evidencia de que la expresión dirigida por el

promotor mínimo del vector de inyección ocurre sólo en glándulas salivales de larva. (Zhu y

Halfon, 2007). Ambas secuencias clonadas en el vector pH Stinger fueron capaces de reclutar

entonces los factores de transcripción presentes en los distintos tipos celulares para dirigir la

producción de EGFP. La orientación en que se incorporaron nuestras secuencias al vector no

debería afectar su poder regulatorio, puesto que se ha descrito que los enhancers contienen

elementos bidireccionales que asisten la transcripción (Muller y cols., 1988).

43

dlg 1/2 dirige la expresión exclusivamente en el tejido nervioso

Hemos encontrado que la zona dlg 1/2 dirige la expresión en células neuronales desde

estadios larvarios. En el cerebro de la larva la expresión de EGFP inducida por esta construcción es

casi exclusivamente neuronal (Figura 16 A y B), ya que se observó una co-localización casi

completa con el marcador panneuronal Elav (Figura 16 C y D). En la inmunofluorescencia del

cerebro de larva con el Anticuerpo Anti Elav y Anti GFP se puede observar que para ambos casos

existen marcas difusas de los anticuerpos. Estas marcas se descartaron por ser inespecíficas, puesto

que ELAV es un factor transcripcional de localización nuclear, por lo que la marca principal debería

estar sólo en el núcleo. En la Figura 16 C y D resaltamos la zona en la cual los núcleos se visualizan

bien definidos para ambas marcas mediante la técnica de inmunofluorescencia. Utilizando los

mismos anticuerpos e inmunofluorescencia en el cerebro de mosca adulta, la amplia co-localización

se manifiesta mejor, puesto que los núcleos se marcaron de forma más definida. Sin embargo, aún

en este caso, a pesar de ser muy amplia la co-localización no fue total, al igual que en el cerebro de

larva (Figura 17 C y D). Esto podría deberse tal vez a que EGFP, a pesar de tener una señal de

localización nuclear, también se encuentre en el citoplasma y que por esto aparezca como marca

difusa en el corte óptico por microscopía confocal, a diferencia de Elav que es un marcador nuclear

por excelencia.

En el experimento de inmunofluorescencia de cerebro de larva con los anticuerpos Anti-

GFP y Anti-Repo no se observó co-localización alguna en ninguno de los planos del eje z de las

imágenes obtenidas por microscopía confocal (Figura 16 Ñ y O). Esto descarta que la secuencia dlg

1/2 dirija la expresión en células gliales, y es concordante con resultados recientes de nuestro

laboratorio en los cuáles no se observa expresión de DLGS97, la isoforma neuronal, en las células

de la glia (Albornoz y cols., 2007). En el gen dlg la secuencia dlg 1/2 se encuentra río arriba del

inicio de transcripción de la proteína Dlg-A, que, como se ha descrito, es la isoforma de dlg

epitelial.

44

dlg 5/10 dirige la expresión en un grupo celular reducido no neuronal

Para el caso de la construcción dlg 5/10, ésta no dirige la expresión en el sistema nervioso,

dado que no co-localizó con el marcador neuronal (Figura 16 G y H), ni el glial en el cerebro de

larva (Figura 16 K y L). La expresión de EGFP dirigida por dlg 5/10 mantuvo el mismo patrón en el

cerebro del adulto, donde tampoco se observó co-localización con ELAV (Figura 17 G y H). Esta

expresión se presentó sólo en grupos acotados de células, tanto en cerebro de larva como de adulto.

Similar al caso de dlg 1/2, la expresión no se evidenció desde el estadio embrionario. Esta secuencia

corresponde a la zona río arriba de la isoforma neuronal de dlg.

La expresión dirigida por dlg 1/2 en células neuronales y la expresión dirigida por dlg 5/10

en un grupo de células acotado sin identidad con neuronas ni células de la glia, así como la ausencia

de expresión en estadios embrionarios dirigidos por ambas secuencias y la ubicación en el gen dlg

de ambas secuencias, nos permiten postular distintas explicaciones:

Ambas secuencias se comportan como enhancers

Dado que dlg 1/2 dirigió la síntesis en sistema nervioso, y que dlg 5/10 dirigió la síntesis

parcial en células no neuronales, podemos sugerir que ambas secuencias podrían actuar como

enhancers a distancia para activar al promotor de las distintas isoformas de dlg. Se ha descrito que

los enhancers pueden encontrarse tanto río arriba como río abajo del inicio de transcripción de un

gen, y que pueden actuar a distancias que van desde 200 pb hasta varios Kpb, reclutando factores de

transcripción y produciendo cambios conformacionales en el DNA para acercarse a la zona

promotora y ayudar a la transcripción de genes. Tiene sentido entonces pensar que ambas

secuencias regularían la transcripción de ambas isoformas de dlg a larga distancia.

45

Ambas secuencias podrían estar reclutando parcialmente factores de transcripción

Se ha descrito que una de las diferencias entre un promotor y un potenciador, además de la

distancia del inicio de transcripción desde la que están ejerciendo su función, es la complejidad de

factores de transcripción que debe reclutar una zona potenciadora para realizar su rol (Lodish y

cols., 2004). Tal vez la capacidad de reclutamiento de estos factores en nuestras secuencias

regulatorias está siendo disminuida, tal vez por omisión de nucleótidos al momento de escogerlas,

dando como resultado una expresión acotada de EGFP para el caso de dlg 5/10, y ausente en

embriones tanto para dlg 1/2 como dlg 5/10. Como planteamos en la introducción, hay evidencia

que en la embriogénesis dlg actúa en el establecimiento de la polaridad apico-basal de la división de

los precursores neurales o neuroblastos (Ohshiro y cols., 2000, Peng y cols., 2000). Es necesario

considerar que tal vez en nuestras líneas transgénicas están ausentes los sitios de unión de factores

de transcripción que posibilitan la transcripción de EGFP en estadios embrionarios, descartando la

posibilidad de que sean enhancers de actividad tardía en el desarrollo. Es por ello que la expresión

obtenida con las dos secuencias estudiadas (de las cuales dlg 1/2 es la de mayor tamaño de una de

las zonas, y dlg 5/10 es parte de dlg 5/6, que es la secuencia de mayor tamaño de la región hacia 5´

de dlg), no basta para ser concluyente respecto del rol regulatorio de las zonas escogidas. Para el

caso de dlg 1/2 sería importante definir una zona más acotada, y que además fuera capaz de dirigir

la expresión de EGFP en embriones. Por ahora sólo podemos acotar la secuencia regulatoria

abarcada por dlg 1/2, ya que para encontrar expresión en embriones deberíamos tal vez incluir

secuencias no consideradas en los extremos 5´ó 3´ de dlg 1/2. Como se muestra en la Figura 7 C,

diseñamos partidores para zonas incluidas en dlg 1/2, como por ejemplo dlg 1/4 que abarca la zona

5´ en dlg 1/2, y dlg 3/2 que abarca la zona 3´ en dlg 1/2, de modo que si generamos transgénicos

con estas zonas, podremos comparar su expresión con la de dlg 1/2 y observar si persiste la

regulación de la expresión de EGFP.

Con nuestros resultados, junto con lo conocido acerca de la transcripción en eucariontes,

podemos plantear que para que ocurra la transcripción de las distintas isoformas de dlg, es necesaria

46

la unión de los factores transcripcionales tejido específicos a las zonas regulatorias de la

transcripción de este gen, lejanas al promotor de cada isoforma, causando un cambio

conformacional en el DNA que producirá el contacto con la RNA polimerasa II, mediado por un co-

activador, incrementando la transcripción del mRNA correspondiente tejido epitelial y al neuronal,

produciendo así las isoformas características de cada tipo celular.

47

Figura 18: Modelo de regulación de la transcripción de las isoformas de dlg

A.- Muestra la secuencia dlg 5/10 uniendo factores transcripcion ( , y )interactuando con la RNA polimerasa II ( ) mediante un coactivador ( ) y transcribiendo la isoforma no neuronal.

B.- Muestra la secuencia dlg 1/2 uniendo factores transcripcionales ( , y ) interactuando con la RNA polimeras II ( )mediante un coactivador ( ) y transcribiendo la isoforma neuronal.

A) Rol regulatorio de dlg

B) Rol regulatorio de dlg

48

CONCLUSIONES

1.- Hemos identificado secuencias del gen dlg capaces de dirigir la transcripción de EGFP en el

vector pH-Stinger, por lo que las podemos clasificar como zonas regulatorias.

2.- Se clonaron dos posibles regiones reguladoras del gen dlg que definen la destinación epitelial

o neuronal en D. melanogaster.

3.- Se obtuvieron moscas adultas transgénicas que presentaron las inserciones dlg 5/10 y dlg 1/2,

las cuáles fueron analizadas en este trabajo.

4.- La zona regulatoria dlg 1/2 dirigió la expresión en células neuronales, extendidas por el cerebro

de larva y mosca adulta, pero no se expresó en embriones. Por su lejanía de la isoforma neuronal,

podemos clasificar a esta zona como potenciadora de la transcripción de DLGS97.

5.- La zona regulatoria dlg 5/10 dirigió la expresión en células no neuronales, desde estadíos

larvarios, estando ausente en embriones. Esta zona no es clasificable por la expresión acotada que

presentó.

6- Debido a la ausencia de expresión en embriones para dlg 1/2 y para dlg 5/10, y a la acotada

expresión de dlg 5/10 en larvas y en adultos, podemos concluir que estas zonas están

interrumpidas en su funcionalidad para dirigir la expresión de las distintas isoformas de dlg.

49

PROYECCIONES

1.- Encontrar a partir de estas secuencias, la zona regulatoria más acotada.

2.- Identificar los elementos que son capaces de unirse a estas zonas.

3.-Identificar a qué grupo pertenecen las células que expresaron nuestras construcciones.

4.- Buscar otras zonas en el gen que tengan un carácter regulatorio.

50

REFERENCIAS

Albornoz V., Mendoza-Topaz C., Oliva C., Tello J., Olguín P. y Sierralta J. (2007).

Temporal y spatial expresión of Drosophila DLGS97 during development. Gene Exp. Patt..

Manuscrito

Barolo S., Carver L. and Posakony J.W. (2000). GFP and β-Galactosidase. Transformation

Vectors for Promoter/Enhancer Analysis in Drosophila BioTechniques 29: 726-732.

Behr R. y Weinbauer G. (2001). cAmp response element rerulator (CREM): an essential factor

for spermatogenesis in primates?. Internac. Journal of androl. 24: 126-135.

Bellaiche Y., Radovic A., Woods D.F., Hough C.D., Parmentier M.L., O'Kane C.J., Bryant

P.J. y Schweisguth F. (2001). The Partner of inscuteable/discs-large complex is required to

establish planar polarity during asymmetric cell division in Drosophila. Cell 106: 355-366.

Brivanlou A. y Darnell J. (2002). Signal transduction of signals and control of gene expresión.

Science 295: 813-818.

Butler J., Kadonaga J. (2002). The RNA polymerase II core promoter: a key component in the

regulation of gene expression. Genes dev. 16: 2583-2592

Budnik V., Koh Y-H., Guan B., Haugh C., Woods D. y Gorczyca M. (1996). Regulation of

synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron 17: 627-

640.

Chen P. (2006). Handbook of biological confocal microscopy. Pawley J.B. ed. Tercera edición.

189-190

51

Corden J, Wasylyk B, Buchwalder A, Sassone-Corsi P, Kedinger C, Chambon P. (1980).

Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes. Science. 209(4463): 1406–1414.

Doerks T., Bork P., Kamberov E., Makarova O., Muecke S. y Margolis B. (2000). L27, a

novel heterodimerization domain in receptor targeting proteins Lin-2 and Lin-7. Trends

Biochem. Sci. 25: 317-318.

Fanning A.S. y Anderson J.M. (1999). Protein modules as organizers of membrane structure.

Curr. Opin. Cell Biol. 11: 432-439.

Feng W., Long J.F., Fan J.S., Suetake T. y Zhang M. (2004). The tetrameric L27 domain

complex as an organization platform for supramolecular assemblies. Nat. Struct. Mol. Biol. 11:

475-80.

Funke L., Dakoji S. y Bredt D.S. (2005). Membrane-Associated Guanylate Kinases regulate

adhesion and plasticity at cell junctions. Annu. Rev. Biochem. 74: 219–45.

Garner C.C., Nash J. y Huganir R.L. (2000a). PDZ domains in synapse assembly and

signalling. Trends Cell Biol. 10: 274-280.

Garner C.C., Kindler S. y Gundelfinger E.D. (2000b). Molecular determinants of presynaptic

active zones. Curr. Opin. Neurobiol. 10: 321-327.

Geyer P. (1997).The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr.

Opin. Genes and dev. 7: 242-248

Koh Y.H., Popova E., Thomas U., Griffith L.C. y Budnik V. (1999). Regulation of DLG

localization at synapses by CaMKII-dependent phosphorylation. Cell 98: 353–363.

52

Li R., Knight J., Jackson S., Tjian R. y Botchan M. (1991). Direct interaction between Sp1

and the BPV enhancer E2 protein mediates synergistic activation of transcription. Cell 65: 493-

505.

Lodish H., Kaiser C., Berk A., Krieger M., Matsudaira P., Scott M. (2004). Molecular cell

biology. W.H. Freeman and company. Capítulo 4

Mendoza C., Olguín P., Lafferte G., Thomas U., Ebitsch S., Gundelfinger E., Kukuljan M.

y Sierralta J. (2003). Novel isoforms of DLG are fundamental for neuronal development in

Drosophila. The Journal of Neurosci. 23: 2093-2101.

Muller M.M., Gerster T. y Schaffner W.(1988). Enhancer sequences and the regulation of

gene transcription. Eur. J. Biochem. 176: 485-495.

Nikolov D. and Burley S. (1997). RNA polymerase II transcription initiation: A structural view.

Proc Natl Acad Sci U S A 7: 15-22.

Ogbourne S. and. Antalis T. (1998). Transcriptional control and the role of silencers in

transcriptional regulation in eukaryotes. Biochem. J. 331: 1-14.

O'Hare, K. and G. M. Rubin. (1983). Structure of P transposable elements and their sites of

insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome. Cell 34: 25-35.

Ohshiro T., Yagami T., Zhang C. y Matsuzaki F. (2000). Role of cortical tumoursuppressor

proteins in asymmetric division of Drosophila neuroblast. Nature 408: 593-596.

Peng C., Manning L., Albertson R. y Doe C.Q. (2000). The tumour suppressor genes lgl and

dlg regulate basal protein targeting in Drosophila neuroblasts. Nature 408: 596-600.

53

Perrimon N. (1988). The maternal effect of lethal(1) discs-large-1: a recessive oncogen of

Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 127: 392-407.

Rio, D.C. and G. M. Rubin. (1988). Identification and purification of a Drosophila protein that

binds to the terminal 31-base-pair repeats of the P transposable element. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 85: 8929-8933.

Robertson, H. M., C. R. Preston, R. W. Phillis, D. Johnson-Schlitz, W. K. Benz and W. R.

Engels. (1988). A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.

Genetics 118: 461-470.

Robinow S., Campos A., Yao K., White K. (1988). The elav gene product of Drosophila,

required in neurons, has three RNP consensus motifs. Sci. 242: 1570-1572.

Shen J., Hirsh J. (1994). cis-Regulatory Sequences Responsible for Alternative Splicing of the

Drosophila dopa decarboxylase Gene. Mol Cell Biol. 14: 7385-7393.

Shih S., Allan C., Grehan S., Tse E., Moran C. and Taylor J. (2000). Duplicated Downstream

Enhancers control expression of the Human apolipoprotein e gene in macrophages and adipose

tissue J. Biol. Chem. 275: 31567-31572.

Spradling A.C. (1986). Pelement-mediated transformation in Drosphila. A practical approach.

Oxford, IRL Press: 175-197.

Struhl K., (1982) Regulatory sites for his3 gene expression in yeast. Nature 300: 284 – 287

Sullivan W., Ashburner M. y Hawley R.S. (2000). Drosophila protocols. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, capítulo 9.

54

Tepass U., Tanentzapf G., Ward R. y Fehon R. (2001). Epithelial cell polarity and cell

junctions in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 35: 747–784.

Thomas U., Kim E., Kuhlendahl S., Koh Y.-H., Gundelfinger E.D., Sheng M., Garner C.C.

y Budnik V. (1997). Synaptic clustering of the cell adhesion molecule fasciclin II by discs-large

and its role in the regulation of presynaptic structure. Neuron 19: 787-799.

Weil PA, Luse DS, Segall J, Roeder RG. (1979). Selective and accurate initiation of

transcription at the Ad2 major late promotor in a soluble system dependent on purified RNA

polymerase II and DNA. Cell 18(2): 469–484

Woods D.F. y Bryant P.J. (1989). Molecular cloning of the lethal (1) Discs large-1 oncogene of

Drosophila. Dev. Biol. 134: 222-235.

Woods D.F. y Bryant P.J. (1991). The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila

encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell 66: 451-64.

Woods D.F., Hough C., Peel D., Callaini G. y Bryant P.J. (1996). Dlg protein is required for

junction structure, cell polarity, and proliferation control in Drosophila epithelia. J. Cell Biol.

134: 1469-82.

Wu H., Reissner C., Kuhlendahl S., Coblentz B., Reuver S., Kindler S., Gundelfinger E.D.

y Garner C.C. (2000). Intramolecular interactions regulate SAP97 binding to GKAP. EMBO J.

19: 5740-5741.

Yoshiaki S., Masaaki T., Shigeharu T., Susumu H., Etsuko S., Mayumi K., y Osamu N.

(1986). Tissue-specific transcription enhancement of the fibroin gene characterized by cell-free

systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9522-9526.

55

Zhu Q., Halfon M. (2007). Vector-dependent gene expression driven by insulated p-element

reporter vectors. Fly 1: 55-56.