UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICASESCUELA DE BIOQUÍMICACARRERA DE ALIMENTOS

AISLAMIENTO, SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN, Y CONSERVACIÓN DE L O S M E J O R E S M I C R O O R G A N I S M O S F I J A D O R E S D E N I T R Ó G E N O , SOLUBILIZADORES DE FÓSFORO Y ANTAGONISTAS ( con t r a hongos f i t o p a t ó g e n o s ) , A I S L A D O S D E S U E L O S , R A Í C E S Y D E U N BIOINOCULANTE APLICADO EN LOS CULTIVOS DE UNA FLORÍCOLA.

Plan de Tesis para optar por el Título Profesional de Químico en Alimentos 

Autor: Del Hierro Valencia Pablo Israel Tutor: Dra. Bravo Blanca Estela

Quito, Mayo del 2010

 

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICACARRERA DE ALIMENTOS

ACEPTACIÓN DEL TUTORPor la presente, dejo constancia que he participado en la elaboración del Plande Tesis presentado por el Señor Pablo Israel Del Hierro Valencia para optar  por el título profesional Químico de Alimentos cuyo tema es AISLAMIENTO,SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN, Y CONSERVACIÓN DE LOS MEJORES MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRÓGENO, SOLUBILIZADORESD E F Ó S F O R O Y A N T A G O N I S T A S ( c o n t r a h o n g o s f i t o p a t ó g e n o s ) , AISLADOS DE SUELOS, RAÍCES Y DE UN BIOINOCULANTE APLICADOEN LOS CULTIVOS DE UNA FLORÍCOLA; y en tal virtud, acepto asesorar ale s t u d i a n t e , e n c a l i d a d d e t u t o r , d u r a n t e l a e t a p a d e l d e s a r r o l l o d e l a investigación hasta su presentación y sustentación.En la ciudad de Quito, a los días del mes de Mayo de 2010

Dra. Blanca Esthela Bravo·#Cedula:

  INDICE DE CONTENIDOS...........................................................................................................................................1UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR............................................................1FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.....................................................................1ESCUELA DE BIOQUÍMICA.......................................................................................1CARRERA DE ALIMENTOS........................................................................................1Plan de Tesis para optar por el Título Profesional de Químico en Alimentos...................1FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.....................................................................2ESCUELA DE BIOQUÍMICA.......................................................................................2CARRERA DE ALIMENTOS........................................................................................2CAPITULO I ...................................................................................................................61.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................................................61.2 FORMULACION DEL PROBLEMA....................................................................................71.3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION...............................................................................71.3.1 Objetivo

General:...........................................................................................................71.3.2 Objetivos Específicos:..................................................................................................71.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION...........................................8CAPITULO II................................................................................................................112.1ANTECEDENTES..............................................................................................................11 ................................................................................................................................................142.2 DEFINICIONES CONCEPTUALES .................................................................................142.2.1 Inoculantes biológicos................................................................................................142.2.1.1 Bioinoculantes..........................................................................................................142.2.1.2 Bioinoculante EMAS.................................................................................................152.2.1.3 Microorganismos autóctonos..................................................................................162.2.2 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno.................................................................162.2.2.1 Generalidades...........................................................................................................162.2.2.2 Aislamiento ...............................................................................................................17

  2.2.2.3 Selección...................................................................................................................182.2.2.4 Antagonismo.............................................................................................................192.2.2.5 Identificación.............................................................................................................192.2.2.6 Preservación.............................................................................................................202.2.2.7 Microorganismos Relacionados..............................................................................20................................................................................................................................................212.2.3 Microorganismos Solubilizadores de Fósforo..........................................................212.2.3.1 Generalidades...........................................................................................................212.2.3.2 Aislamiento de Microorganismos............................................................................232.2.3.3 Selección de Microorganismos ..............................................................................242.2.3.4 Antagonismo.............................................................................................................252.2.3.5 Identificación.............................................................................................................252.2.3.6 Preservación.............................................................................................................262.2.3.7 Microorganismos Relacionados..............................................................................262.2.4 Microorganismos Antagonistas..................................................................................272.2.4.1 Introducción..............................................................................................................27Mecanismos de acción.........................................................................................................28Competencia.........................................................................................................................282.2.4.2

Aislamiento de Microorganismos............................................................................302.2.4.3 Selección de Microorganismos ..............................................................................302.2.4.4 Antagonismo.............................................................................................................312.2.4.5 Identificación............................................................................................................312.2.4.6 Preservación.............................................................................................................322.2.4.7 Microorganismos Implicados.................................................................................32CAPITULO III..............................................................................................................333.1 TIPO DE INVESTIGACION..............................................................................................333.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN...................................................................................333.3 FACTOR EN ESTUDIO....................................................................................................353.4 VARIABLES.....................................................................................................................353.4.1 Variables Independientes............................................................................................353.4.2 VARIABLE DEPENDIENTE..........................................................................................353.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS ANALITICOS................................................................363.5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS......................................................................363.5.1.1 UBICACIÓN................................................................................................................363.5.1.2 MUESTREO ...............................................................................................................363.5.1.2.1 Tipo de Muestreo...................................................................................................363.5.1.2.2 Programa de Muestreo..........................................................................................36

  3.5.1.2.3 Toma de Muestras..................................................................................................373.5.1.2.3.1 Toma de Muestra en la Captura.........................................................................373.5.1.2.3.2 Toma de Muestra en la Solución Madre y Solución de Propagación ............373.5.1.2.3.3 Toma de Muestras de Raíces.............................................................................383.5.1.2.3.4 Toma de Muestra de Suelos...............................................................................383.5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS....................................................................383.5.2.1 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno..............................................................383.5.2.1.1 Aislamiento.............................................................................................................383.5.2.1.2 Selección................................................................................................................393.5.2.1.3 Antagonismo..........................................................................................................393.5.2.1.4 Identificación.........................................................................................................393.5.2.1.5 Preservación..........................................................................................................403.5.2.2 Microorganismos Solubilizadores de

Fosforo.......................................................403.5.2.2.1 Aislamiento.............................................................................................................403.5.2.2.2 Selección................................................................................................................413.5.2.2.3 Antagonismo..........................................................................................................413.5.2.2.4 Identificación.........................................................................................................413.5.2.2.5 Preservación.........................................................................................................423.5.2.3 Microorganismos Antagonistas...............................................................................423.5.2.3.1 Aislamiento.............................................................................................................423.5.2.3.2 Selección ...............................................................................................................433.5.2.3.3 Antagonismo..........................................................................................................433.5.2.3.4 Identificación.........................................................................................................443.5.2.3.5 Preservación..........................................................................................................44CAPITULO IV...............................................................................................................454.1 Recursos..........................................................................................................................454.2 Presupuesto....................................................................................................................484.3 Cronograma.....................................................................................................................485. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................496. ANEXOS.....................................................................................................................54CAPITULO I3.5.1.2.3 Toma de Muestras..................................................................................................373.5.1.2.3.1 Toma de Muestra en la Captura.........................................................................373.5.1.2.3.2 Toma de Muestra en la Solución Madre y Solución de Propagación ............373.5.1.2.3.3 Toma de Muestras de Raíces.............................................................................383.5.1.2.3.4 Toma de Muestra de Suelos...............................................................................383.5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS....................................................................383.5.2.1 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno..............................................................383.5.2.1.1 Aislamiento.............................................................................................................383.5.2.1.2 Selección................................................................................................................393.5.2.1.3 Antagonismo..........................................................................................................393.5.2.1.4 Identificación.........................................................................................................393.5.2.1.5 Preservación..........................................................................................................403.5.2.2

Microorganismos Solubilizadores de Fosforo.......................................................403.5.2.2.1 Aislamiento.............................................................................................................403.5.2.2.2 Selección................................................................................................................413.5.2.2.3 Antagonismo..........................................................................................................413.5.2.2.4 Identificación.........................................................................................................413.5.2.2.5 Preservación.........................................................................................................423.5.2.3 Microorganismos Antagonistas...............................................................................423.5.2.3.1 Aislamiento.............................................................................................................423.5.2.3.2 Selección ...............................................................................................................433.5.2.3.3 Antagonismo..........................................................................................................433.5.2.3.4 Identificación.........................................................................................................443.5.2.3.5 Preservación..........................................................................................................44CAPITULO IV...............................................................................................................454.1 Recursos..........................................................................................................................454.2 Presupuesto....................................................................................................................484.3 Cronograma.....................................................................................................................485. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................496. ANEXOS.....................................................................................................................54CAPITULO I

  1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMALa Empresa Florícola ha venido utilizando y aplicando a sus cultivos por másde un año un Bioinoculante basado en el uso de microorganismos autóctonostomados del suelo rizosférico de su propia hacienda, que gracias al uso de unmed io de cu l t i vo ha pe rmi t i do su mu l t i p l i c ac ión y e l abo rac ión ; e l cua l e su t i l i z ado en su s cu l t i vos de f l o r e s en f a se de en ra i zamien to a s í como de producción de camas.18Por sondeo a los responsables de dicho proceso se conoce que la produccióndel bioinoculante se ha venido dando con el afán de disminuir en un 30% deuso de fertilizantes y plaguicidas y de ayudar de una manera biológica al suelo,teniendo un costo anual aproximado de 4000 dólares, aplicando un litro por  semana a cada cama logrando aparentemente plantas más vigorosas y nocausando inconvenientes a los cultivos.19Los métodos, técnicas y procedimientos que se realizan para la obtención delos microorganismos son de forma artesanal, los cuales no permiten evaluar

losrendimientos por carecer de caracterizaciones cualitativas y cuantitativas de laflora autóctona responsable del fitomejoramiento de los cultivos.En e s t e con t ex to no s e ob t i ene l o s da to s r e a l e s de r end imien to s y demásca rac t e r í s t i c a s de l a f l o r a r e sponsab l e r e l a c ionada apa ren t emen te con l a n u t r i c i ó n y c o n t r o l v e g e t a l , m i e n t r a s q u e s i s e u t i l i z a c e p a s p r e v i a m e n t e ca rac t e r i z adas con func iones e spec í f i c a s como f i j ado re s de n i t r ógeno , solubilizadores de fósforo y antagonistas para control de hongos fitopatógenos,que f avo recen su ap l i c ac ión como inocu l an t e s y que p rop i c i an un e f ec to positivo en los cultivos agrícolas como promotores de crecimiento.1.2 FORMULACION DEL PROBLEMA18 Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 200819Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 2009

  ¿ C a r a c t e r i z a r l a f l o r a a u t ó c t o n a d e l b i o i n o c u l a n t e e n s u e l a b o r a c i ó n y propagación mediante la aplicación de técnicas microbiológicas de aislamiento,selección, identificación y conservación de microorganismos fijadores libres denitrógeno, solubilizadores de fósforo inorgánico y antagonistas (contra hongosfitopatógenos) para la elaboración posterior de inoculantes biológicos?1.3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION1.3.1 Objetivo General:Aislar, seleccionar, identificar, y conservar los mejores microorganismosfijadores de nitrógeno, solubilizadores de fósforo y antagonistas (contrahongos fitopatógenos), aislados del suelo, raíces y del bioinoculanteq u e s e r á n u t i l i z a d o s e n t r a b a j o s p o s t e r i o r e s e n l a e l a b o r a c i ó n d e inoculantes.1.3.2 Objetivos Específicos:Elaborar el Bioinoculante.Realizar un muestreo del Bioinoculante en la fase de captura, soluciónmadre y solución de propagación.Realizar un muestreo de suelos y raíces de los bloques 8 y 9 donde seaplica el bioinoculante.A i s l a r m i c r o o r g a n i s m o s f i j a d o r e s d e n i t r ó g e n o , s o l u b i l i z a d o r e s d e fósforo, y antagonistas.S e l e c c i o n a r l o s m e j o r e s m i c r o o r g a n i s m o s f i j a d o r e s d e n i t r ó g e n o , solubilizadores de fosforo y antagonistas.Evaluar el antagonismo entre las cepas seleccionadas de cada grupoCaracterizar las cepas evaluadas por género

  C o n s e r v a r l o s m e j o r e s m i c r o o r g a n i s m o s f i j a d o r e s d e n i t r ó g e n o , solubilizadores de fósforo y antagonistas.1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACIONEn el uso y manejo de bioinoculantes, uno de los principales problemas es eldesconocimiento de las especies presentes en los agroecosistemas, para suposible utilización eficiente. Desde el punto de vista ecológico, es importantec o n o c e r l o s i n t e g r a n t e s d e l a c o m u n i d a d b a c t e r i a n a q u e f a v o r e c e n s u ap l i c ac ión como inocu l an t e s y p rop i c i an un e f ec to pos i t i vo en l o s cu l t i vos agrícolas.43P o r l o c u a l e l a i s l a m i e n t o d e m i c r o o r g a n i s m o s c o n p o t e n c i a l p a r a s e r   promotores de crecimiento vegetal, aquellos capaces de establecerse en els u e l o , a p o r t a n d o n u t r i e n t e s e s e n c i a l e s c o m o e l f ó s f o r o y n i t r ó g e n o , transformando sus formas no asimilables en asimilables para las plantas y quegeneran a la par un control biológico, que en la última década, se ha convertidoes una estrategia importante para el desarrollo de bioinsumos.9El estudio de estos microorganismos es útil para posteriores ensayos y paraestablecer un cepario con microorganismos promisorios, aislados de suelos,con el fin de generar alternativas viables en la producción de biofertilizantesútiles en la actividad agrícola y explorar la biodiversidad microbiana.9Por esto el desarrollo de biotecnologías alternativas como los biofertilizantes,requieren de estrategias y procesos de investigación e innovación a corto ym e d i a n o p l a z o , l o s c u a l e s i n c l u y e n a i s l a m i e n t o s d e c e p a s , e v a l u a c i ó n ,43 http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=23515919 CASTELLANOS, Diana. CUBILLOS, Ricardo , Selección de Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (ÁcidoIndol Acético) a partir de Muestras de Suelo Rizosférico, como Primera Etapa en el Desarrollo de un Biofertilizante, PontificiaUniversidad Javeriana

  selección, multiplicación y producción.25Así el aprovechamiento de los microorganismos presentes en la naturaleza,p e r m i t e n s u s t i t u i r l o s p r o d u c t o s q u í m i c o s . S e e s t i m a q u e e l u s o d e l o s biofertilizantes contribuya a sustituir en un 70% el uso de fertilizantes fosfóricosy entre un 30%-50% de nitrogenados; mejorando así los cultivos.

22Efectos relacionados con el uso de biofertilizantes han aportado sustancialesdatos para su estudio y aplicación en campo, en cultivos de gran importanciaag r í co l a en l o s cua l e s s e ha demos t r ado r end imien to s f avo rab l e s p o r s u aplicación21:Maíz:Mejora de rendimiento de 20,1 %. (Kg/Ha)Sorgo:Mejora de rendimiento de 58,7 % (Kg/Ha)25 López Marisol, Efecto de biofertilizantes bacterianos sobre el crecimiento de un cultivar de maíz en dos suelos contrastantes, Centro Nacional deInvestigaciones Agropecuarias (CENIAP), Maracay, estado Aragua. Venezuela.22 Introducción, Rentabilidad De Las Empresas Productoras De Bioinsumos Registradas Ante El ICA21 GREEN QUALITY | F.A.Q, mejoras enrendimientosa campo respecto de un control sin Biofertilizar ,Gráficos derendimiento

  Trigo:Mejora en rendimiento de 12,3 % en Trigo. (Kg/Ha)Girasol:Mejora en rendimiento de 19,7 %.

  Soja:Mejora en rendimiento de 11,7 %.CAPITULO II2 . 1 A N T E C E D E N T E SDe acuerdo con diferentes estudios realizados y sus resultados, junto con latoma de conciencia sobre los efectos adversos de los pesticidas químicos

  propiciaron el surgimiento a escala mundial de la investigación sobre el usode inoculantes bacterianos para controlar patógenos y mejorar el crecimientovegetal.La revista Colombiana de Biotecnología, vol. VII N: 2, Diciembre 2005, publicael tema, “Microorganismos Benéficos como biofertilizantes eficientes parael cultivo del Tomate (Lycopersicon esculentum, Mill),esta investigación sed e s a r r o l l o c o n e l o b j e t i v o d e e v a l u a r l a e f e c t i v i d a d a g r o b i o l ó g i c a d e Azospirillum sp, en el crecimiento,

desarrollo, y rendimiento en el cultivo detomate. Para ello, se partió de seleccionar el género microbiano predominantee n l a r i z ó s f e r a d e l c u l t i v o y p o s t e r i o r m e n t e s e e v a l u ó e l e f e c t o d e s u inoculación a partir de la respuesta del cultivo. Los resultados demostraron queAzospirillum sp era el género dominante. Y que inoculación artificial causo une fec to pos i t i vo sob re e l c r ec imien to de l a s p l án tu l a s , con un r end imien to superior al 11%.16La revista Chilena del Bosque, 2006, publica el tema, “Selección de hongosan t agon i s t a s pa r a e l con t ro l b io lóg i co deBotrytis cinereaen viverosforestales en Chile”,E l ob j e t i vo de e s t e e s t ud io fue s e l ecc iona r hongos antagonistas deB. cinerea, mediante ensayosin v i t r oy de i nve rnade ro , y determinar su capacidad como agentes biocontroladores de este hongo enviveros forestales. Donde se evaluó su capacidad para reducir la colonizacióny esporulación del patógeno en ensayosin vitro, mediante bioensayos. Estosresultados permitieron concluir el potencial de los antagonistas seleccionadosen el control deB. cinerea7.16 Elein Terry Alfonso, Microorganismos Benéficos como biofertilizantes eficientes para el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum, Mill), RevistaColombiana de Biotecnología, volumen VII N: 2, Diciembre 2005, pág. 47-547 BORRERO, C. A, Efectos de Trichoderma (in vitro) en los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica de un suelo oxisolclase IV del piedemonte llanero, Ingeniería Agronómica de la Unillanos, VOLUMEN 9 Nº 2 ,2005

  EnVenezuelase han r ea l i z ado i nves t i gac iones po r e l Centro Nacional deInvestigaciones Agropecuarias (CENIAP), López, M, con el tema

“Efecto deBiofertilizantes Bacterianos sobre el Crecimiento de un Cultivar de Maízen dos Suelos Contrastantes Venezolanos”,se evaluó el efecto de cepasnativas fijadoras de N2 (FN) de forma asociativa y solubilizadoras de fósforo(SF) sobre el crecimiento de maíz. Hubo efecto EPR (rizobacterias promotorasde l a emergenc i a ) con l a c epa FN en e l sue lo A , l og rándose 30% más de germinación y 24% más de plantas con primera hoja verdadera a los 6 días. Ene l s u e l o B e l e f e c t o f u e m á s t a r d í o . L a e v a l u a c i ó n d e a l t u r a d e l a p l a n t a , diámetro del tallo, largo y ancho de la hoja y biomasa de raíces y partes aéreaspuso de manifiesto la efectividad de la inoculación con bacterias FN en ambossuelos y la de SF en el suelo de baja fertilidad (B).26Es por esto que países como Cuba, Colombia, Chile, Venezuela entre otros;demostraron que con la utilización de microorganismos eran capaces demejorar la disponibilidad de nutrientes y generar alternativas amigables con elambiente y aumentar el rendimiento agrícola.2.2 DEFINICIONES CONCEPTUALES2.2.1 Inoculantes biológicos2.2.1.1 BioinoculantesE l u so de b io inocu l an t e s b io lóg i cos en l o s s i s t emas p roduc t i vos , e s una a l t e r n a t i v a v i a b l e e i m p o r t a n t e p a r a l o g r a r u n d e s a r r o l l o a g r í c o l a ecológicamente sostenible, ya que permite una producción a bajo costo, no26 López M, Evaluación de un Medio de Cultivo no comercial para la producción de un bioinoculante empleado en un cultivo de flores, Carrera deMicrobiología Industrial, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006

  contamina el ambiente, y mantiene al suelo desde el punto de vista de fertilidady biodiversidad (ICA, 2004).D e n t r o d e l o s b e n e f i c i o s q u e p r e s e n t a e l u s o d e m i c r o o r g a n i s m o s e n l a a g r i c u l t u r a e s t á n s u c a p a c i d a d d e f i j a r n i t r ó g e n o a t m o s f é r i c o , l a descomposición de residuos orgánicos, la detoxificación de plaguicidas, elcontrol de las enfermedades de las plantas, el aporte de nutrientes al suelo, y lap roducc ión de compues to s b ioac t i vos como v i t aminas y ho rmonas que estimulan el crecimiento de la plantas (Loredo et al., 2004); del mismo modo esi m p o r t a n t e i n c e n t i v a r e s t u d i o s p a r a l a b ú s q u e d a d e n u e v a s f u e n t e s d e bioinoculantes y por supuesto nuevas aplicaciones.En la actualidad el uso de bioinoculantes, aplicados como inoculantes dentrod e l o s s i s t e m a s d e p r o d u c c i ó n a g r í c o l a , e s t á t e n i e n d o u n g r a n a u g e , especialmente para lograr una mayor disponibilidad de nutrientes que permitanun r end imien to so s t en ib l e de l o s cu l t i vos , con l a conse rvac ión de l med io ambiente y una mayor producción.292.2.1.2 Bioinoculante EMASEl b io inócu lo EMAS e s un i n sumo l í qu ido imp lemen tado en f l o r i cu l t u r a y actualmente es producido por la Florícola Hacienda Santa Fe. La composicióngeneral del medio consta de melaza, harina de pescado, leche, sal y agua,

losc u a l e s s o n f e r m e n t a d o s e n t a n q u e s d e 2 0 0 l i t r o s , d o n d e s e o b t i e n e u n compuesto, cuya función principal se basa en el aporte de microorganismosbenéficos para las rosas tanto en fase de enraizamiento como de producciónen camas. Su uso se combina con la aplicación de compost, bioles y aditivosquímicos (Hacienda Santa Fe, 2008).La p roducc ión s e hace en t r e s e t apa s : 1 ) Cap tu ra de mic roo rgan i smos , 2 ) Solución Madre, 3) Solución de Propagación; este proceso dura 58 días. Este29 Mantilla Cardenas Miguel Eduardo, Evaluación de la Acción de un Bioinoculante sobre un Cultivo de Crisantemo en Periodo de Enraizamiento,Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007

  bioinoculante poco tecnificado ha sido empleado especialmente para promover y mantener el crecimiento y la calidad de las flores que cultivan proporcionandouna fuente de nutrientes solubles obtenida a través de la acción metabólicaejercida por los microorganismos allí presentes.182.2.1.3 Microorganismos autóctonosEl término “microorganismos autóctonos” ha sido atribuido por productoresagrícolas a la combinación de microorganismos presentes en un área de cultivodeterminada, los cuales han sido “capturados” mediante procesos artesanalessencillos y potenciados posteriormente con soluciones de azúcares y proteínas.El microorganismo autóctono es efectivo, puesto que al pertenecer al mismosuelo donde se realiza el cultivo, no necesita ser reactivado con anticipación, ysu adaptación al ecosistema del suelo es completa.42.2.2 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno2.2.2.1 GeneralidadesE l n i t r ó g e n o m o l e c u l a r N2q u e e x i s t e e n l a a t m ó s f e r a n o e s f á c i l m e n t e asimilable por las plantas debido a que el triple enlace que une a los átomosque forman la molécula es difícil de romper, la única forma de aprovechar elnitrógeno atmosférico es mediante el proceso metabólico conocido como laF i j a c ión B io lóg i ca de N i t rógeno FBN, l o cua l a s egu ra l a d i spon ib i l i dad de nitrógeno en los ecosistemas naturales (Zuberer, 1998).18 Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 20084 Arias Vega Carlos Aurelio , Estudio de 2 Grupos de Microorganismos como Agentes Aceleradores de Descomposición de los DesechosSólidos Orgánicos Originados en los Comedores de ESPOL, Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción, ESPOL,Guayaquil. 2007

 

E l p r o c e s o e s l l e v a d o a c a b o c i e r t o s m i c r o o r g a n i s m o s d e l s u e l o q u e s e c o n o c e n c o m o m i c r o o r g a n i s m o s f i j a d o r e s d e n i t r ó g e n o , t o d o s l o s microorganismos que convierten el nitrógeno en amoniaco lo hacen gracias a laactividad del complejo enzimático llamado nitrogenasa que está constituido por dos metaloprotreinas, la proteína (I) llamada: hierro-molibdato-proteína, y laproteína (II): llamada hierro- proteína( Baca et ál, 2000), la enzima requiere laco l abo rac ión de o t r a s dos p ro t e ína s f e r rodox ina y f l avodox ina , que ac túan como donadores de electrones y reductores naturales de la nitrogenasa. Loselectrones son trasportados a la nitrogenasa por la ferrodoxina y llegan a lahierro-proteína, esta activa a la Mo-Fe- proteína y se produce la reducción delnitrógeno, y luego siendo fijado como compuesto aminado (Hernández, 1998).2462.2.2.2 Aislamiento24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), RevistaColombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-146 bnLec33, pdf 

  2003).24El cual se basa en la formación de un compuesto azul intenso de indofenol, yque resulta de la reacción de ión amonio (NH4+), con compuestos fenólicos enp r e s e n c i a d e u n a g e n t e o x i d a n t e e l c u a l p u e d e s e r h i p o c l o r i t o d e s o d i o (Scheiner, 1976; Van Staden y Taljaard, 1997) u o-fenilfenol (Kanda, 1995); ytambién se utilizan catalizadores, principalmente nitroprusiato de sodio (Kanda,1995 ; S t anda rd Me thods , 1998 ) , o f e r roc i ana to de po t a s io (Ve rdouw e t á l , 1977). El cual es cuantificado a 633 nm en un espectrofotómetro UV-Vis.242.2.2.4 AntagonismoCon el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladasfueron sometidas a prueba, que se realizaron en el medio diseñado, mediantela técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967). El criterio dela eliminación de las cepas se determino por la presencia de halos de inhibiciónd e c r e c i m i e n t o c o n h a l o s m a y o r e s a 5 m m e n t r e l a c e p a s e m b r a d a masivamente y la cepa enfrentada.52.2.2.5 IdentificaciónSe ba sa p r i nc ipa lmen t e en e l e s t ud io de l a s c a r ac t e r í s t i c a s mor fo lóg i ca s , fisiológicas, bioquímicas, patogénicas e inmunológicas del microorganismo, esdecir aquellos aspectos que constituyen el fenotipo bacteriano y que toma encuenta los siguientes aspectos:

Tipo de reacción a tinción Gram y otras coloraciones empleadas para laobservación microscópica.24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), RevistaColombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-145 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir deCompost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008

  Tipo de metabolismo.Forma y características del crecimiento en el medio de cultivo.Determinación del perfil bioquímico mediante pruebas de diagnostico.2.2.2.6 PreservaciónLos objetivos de la conservación de los cultivos son los siguientes:Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de suspropiedades bioquímicas.Preservar los niveles de su productividad inicialLograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.Los métodos de preservación de cepas se basan en los cambios observablesc o m o p i g m e n t a c i ó n , m o r f o l o g í a , r e a c c i o n e s f e r m e n t a t i v a s , p r o p i e d a d e s microscópicas; brindan la información necesaria para la correcta evaluación dela técnica de conservación a elegir.Los métodos más importantes son los siguientes:SubcultivosMantenimiento bajo una capa de aceiteMantenimiento en agua destilada estéril.CriopreservaciónCultivos en tierraPreservación en celulosa2.2.2.7 Microorganismos Relacionados

  2.2.3 Microorganismos Solubilizadores de Fósforo2.2.3.1 Generalidades

El fó s fo ro e s , de spués de l n i t r ógeno , e l e l emen to nu t r i c i ona l m ine ra l más importante para el crecimiento de plantas y microorganismos, incluso puede ser limitante en muchos ecosistemas forestales (Attiwill y Adams, 1993). Formaparte de los ácidos nucleicos, y constituye una parte esencial de la molécula deATP, además se encuentra en los fosfolípidos, componentes esenciales de lasmembranas biológicas (Atlas y Bartha, 1987). La mayoría del fósforo total delsuelo se encuentra en la materia orgánica (Speir y Ross, 1978) en forma denucleótidos, fosfolípidos o inositol fosfato (Anderson, 1975).

  No obstante, las plantas sólo pueden usar la forma inorgánica en forma de iónortofosfato (PO3-4) (Raoet al., 1996). Dichos iones son liberados a la solucióndel suelo como consecuencia de la mineralización del fósforo orgánico, procesocatalizado por las enzimas fosfatasas. La presencia en el suelo de otros ionescomo Ca, Fe, Al y Mg junto con el pH del suelo va a condicionar la solubilidaddel ión ortofosfato (Beever y Burns, 1980).Los compues to s i no rgán i cos de fó s fo ro de l sue lo pueden ag rupa r se en : 1 ) fosfatos de calcio, 2) fosfatos de hierro y 3) fosfatos de aluminio. Los fosfatosmonocá l c i co y b i cá l c i co son so lub l e s ( aunque e l b i c á l c i co e s

pa rc i a lmen t e in so lub l e ) , s i endo a s imi l ab l e s po r l a s p l an t a s pe ro s e combinan con o t ro s compuestos haciéndose insolubles. El fosfato tricálcico es insoluble por lo queno está disponible para las plantas. Por tanto, la mayoría del fósforo del suelo,deb ido a su i n so lub i l i dad , no e s a s im i l ab l e po r l a s p l an t a s . So l amen te e s absorbido un 0.1% del total (Scheffer y Schachtschabel, 1992).L o s m i c r o o r g a n i s m o s c a p a c e s d e m i n e r a l i z a r e l f ó s f o r o i n o r g á n i c o s o n considerados microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPR).Estos microorganismos convierten los compuestos minerales insolubles ensolubles que pueden ser absorbidos (solubilización de fósforo); mineralizan elfósforo orgánico en fósforo mineral asimilable; transforman el fósforo mineral inasimilable en fósforo orgánico (mineralización), transforman el fósforo mineralen fó s fo ro o rgán i co , cuando t oman e l f ó s fo ro pa r a cons t i t u i r su s p rop io s cuerpos (inmovilización). Este fósforo volverá a mineralizarse cuando estosmicroorganismos mueran (Fuentes Yagüe, 1989).Los principales mecanismos de solubilización de fosfato en el suelo llevados acabo por estos microorganismos son:1. Producción de ácidos orgánicos:El metabolismo microbiano, la descomposición de la materia orgánica ylos exudados radicales van a producir una serie de ácidos orgánicos de

  nutrición vegetal como por las limitaciones en su determinación.Existen varios métodos para su determinación y por lo general son métodoscolorimétricos.El Método Mo – Blue o método del Molibdato, es utilizado para determinaciónd e f ó s f o r o e n s o l u c i ó n a c u o s a , s e b a s a e n l a f o r m a c i ó n d e l á c i d o fosfoantimolibdeno azul en la presencia de ácido ascórbico (Murphy y Riley,1962 ) ; en so luc ión su l fú r i c a l o s i ones o r t o fo s f a to r e acc ionan con l o s i ones molibdato, dando ácido molibdofosfórico, el cual con ácido ascórbico, se reducea azul de fosfomolibdeno presentando al cabo de 5 minutos una coloraciónazul, y cuantificándose espectrofotométricamente a 660nm.52.2.3.4 AntagonismoCon el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladasfueron sometidas a prueba, que se realizaron en el medio diseñado, mediantela técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967). El criterio dela eliminación de las cepas se determino por la presencia de halos de inhibiciónd e c r e c i m i e n t o c o n h a l o s m a y o r e s a 5 m m e n t r e l a c e p a s e m b r a d a masivamente y la cepa enfrentada.52.2.3.5 IdentificaciónSe ba sa p r i nc ipa lmen t e en e l e s t ud io de l a s c a r ac t e r í s t i c a s mor fo lóg i ca s , fisiológicas, bioquímicas, patogénicas e inmunológicas del microorganismo, es5 

Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir deCompost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 20085 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir deCompost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008

  decir aquellos aspectos que constituyen el fenotipo bacteriano y que toma encuenta los siguientes aspectos:Tipo de reacción a tinción Gram y otras coloraciones empleadas para laobservación microscópica.Tipo de metabolismo.Forma y características del crecimiento en el medio de cultivo.Determinación del perfil bioquímica mediante pruebas de diagnostico.2.2.3.6 PreservaciónLos objetivos de la conservación de los cultivos son los siguientes:Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de suspropiedades bioquímicas.Preservar los niveles de su productividad inicialLograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.Los métodos de preservación de cepas se basan en los cambios observablesc o m o p i g m e n t a c i ó n , m o r f o l o g í a , r e a c c i o n e s f e r m e n t a t i v a s , p r o p i e d a d e s microscópicas; brindan la información necesaria para la correcta evaluación dela técnica de conservación a elegir.Los métodos más importantes son los siguientes:SubcultivosMantenimiento bajo una capa de aceiteMantenimiento en agua destilada estéril.CriopreservaciónCultivos en tierraPreservación en celulosa2.2.3.7 Microorganismos Relacionados

  BACTERIASB a c i l l u s S e r r a t i a P s e u d o m o n a s

A c i n e t o b a c t e r ChryseomonasA e r o b a c t er R a l s t o n i a E r w i n i a S p h i n g o m o n a s A l c a l i g e n e s M i c r o c o c c u s A c h r o m o b a c t e r R h i z o b i u m A g r o b a c t e r i u m F l a v o b a c t e r i u m E s c h e r i c h i a E n t e r o b a c t e r KlebsiellaHONGOSA s p e r g i ll u s F u s a r i u m P e n i c i l l i u m T r i c h o d e r m a MonesporiumCephalosporiumScopulariopsis2.2.4 Microorganismos Antagonistas2.2.4.1 IntroducciónEx i s t e un g rupo impor t an t e de hongos y bac t e r i a s que p r e sen t an e f ec to s antagónicos con otros microorganismos y esta acción puede ser aprovechadacomo una forma de control biológico de patógenos vegetales.Entre los microorganismos más importantes se encuentran las bacterias de losgéne ros Pseudomonas y Bac i l l u s y h o n g o s d e l o s g é n e r o s G l i o c l a d i u m y Trichoderma.En e l mundo b io lóg i co ex i s t e una i n t e r acc ión con t i nua en t r e l o s pa tógenos potenciales y sus antagonistas, de forma tal que estos últimos contribuyen aque en la mayoría de los casos no se desarrolle la enfermedad. En condicionesnaturales los microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficiede las plantas.Las en fe rmedades p roduc ida s po r o rgan i smos f i t opa tógenos t a l e s como bacterias, nematodos, u hongos constituyen generalmente la mayor causa de

  pérdidas en la producción agrícola (Benítez et al., 2004). Dentro de éstos, loshongos comprenden uno de los principales grupos tanto por la diversidad comopor l a s pé rd ida s que o r i g inan a n ive l e conómico (Ben í t e z e t a l . , 2000 ) . La persistencia de varias especies de hongos fitopatógenos tales como Phythium,Phytophthora, Brotrytis, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solana y Fusariumhan aumen tado du ran t e l o s ú l t imos años deb ido a l o s

cambios que s e han presentado en las prácticas agrícolas; principalmente por el uso indiscriminadode qu ímicos y t amb ién po r l a con t aminac ión que s e o r i g ina a c ausa de su empleo, con efectos perjudiciales no solo sobre los cultivos de importanciaeconómica sino sobre los demás organismos, a través de la adquisición der e s i s t e n c i a a l a s e s t r a t e g i a s d e s a r r o l l a d a s e n l o s ú l t i m o s a ñ o s p a r a s u control(Benítez et al., 2000).•Mecanismos de acciónS e h a n d e s c r i t o v a r i o s m e c a n i s m o s d e a c c i ó n d e l o s a n t a g o n i s t a s p a r a controlar el desarrollo de patógenos.Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o por nutrimentos,interacciones directas con el patógeno (mico parasitismo y lisis enzimática) e inducción de resistencia.No es fácil determinar con precisión los mecanismos que intervienen en lasinteracciones entre los antagonistas y los patógenos en la planta .En general,los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de estoses una característica importante para su selección como agentes de controlbiológico.S i e l a n t a g o n i s t a p o s e e v a r i o s m o d o s d e a c c i ó n r e d u c e l o s r i e s g o s d e desarrollo de resistencia en el patógeno. Este riesgo de resistencia también sereduce mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modode acción.•Competencia

  del hongo antagonista como del hongo patógeno. Los cuales son colocados enplatos Petri contentivos de (PDA) uno frente al otro de manera equidistante.Las observaciones se realizaron cada 24 horas por siete días consecutivos a 25oC , y s e eva lúa e l c r ec imien to r ad i a l ( cm/d í a ) de l a s co lon i a s de ambos h o n g o s . C o n e s t o s d a t o s s e d e t e r m i n ó e l p o r c e n t a j e d e i n h i b i c i ó n d e crecimiento (PIC).El porcentaje de inhibición se determinó utilizando la fórmula:J. M. Vincent, empleada por Latiegue (1990).PIC = 100 (C –T)/CDonde:PIC:Porcentaje de Inhibición de Crecimiento del fitopatógenoC:Crecimiento del ControlT:Crecimiento del TratamientoPara las bacterias se utilizo el mismo método de enfrentamiento pero utilizandocomo medio de crecimiento agar Topping.2.2.4.4 AntagonismoSe realizan pruebas de enfrentamiento.Se procede a tomar discos de 1cm dediámetro, colonizados con el micelio de los hongos a enfrentar. Los cuales seco locan en p l a to s Pe t r i con t en t i vos de (PDA) uno f r en t e a l o t ro de mane ra equidistante. Las observaciones se realizaron cada 24 horas por siete díasconsecutivos a 25o

C, y se evaluó el crecimiento radial (cm/día) de las coloniasde ambos hongos.2.2.4.5 Identificación•Observación del tiempo(velocidad) de crecimiento de la colonia, desdeque se siembra.

  •Examen macroscópico de la colonia:color (tanto en el anverso como enel reverso), radial, producción de pigmentos y exudados.•Examen microscópico de la colonia:s e l l eva a c abo po r t é cn i ca s de tinción con azul de lactofenol.•Tipo de micelio, la presencia o no de septos, esporas.302.2.4.6 Preservación•Conservación por suspensión en agua destilada estérilEs un método alternativo muy utilizado y que altos porcentajes de viabilidad enespecies de Phytophthora, Pythium, Ascomicetos, Basidiomicetos, y hongosmitospóricos (Smith & Onions, 1994); han alcanzando viabilidades entre dos ysiete años (Jong & Birmingham, 2001).Cons i s t e en su spende r en agua e s t é r i l c é lu l a s de l cu l t i vo como con id i a s , esporas picnidios, esclerocidos, etc.11 2.2.4.7 Microorganismos Implicados30 Micología, Características generales de los hongos, pdf 1 Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de laPontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006

  INICIOCAPITULO III3.1 TIPO DE INVESTIGACIONEl tipo de investigación para este proyecto es del tipo experimental ya que ser e a l i z a r á e n c o n d i c i o n e s d e l a b o r a t o r i o r e a l i z a n d o a n á l i s i s d e t i p o m i c r o b i o l ó g i c o e i n s t r u m e n t a l c o n l a a p l i c a c i ó n d e e q u i p o s y t é c n i c a s a d e c u a d a s , y e n c o n t r a n d o r e s u l t a d o s a c o r d e c o n l a m e t o d o l o g í a d e l a investigación.3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

BACTERIASAgrobacteriumAgrobacter Pseudomona fluorescensBurkbolderia cepaciaBacillus subtilisPseudomonas sppSerratia sppHONGOSGliocladium virensTrichoderma haziariumTrichoderma virideTOMA DEMUESTRAMateriales deRecolección

3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Materiales deRecolecciónTº, tiempoMuestrasDilucionesCepas útilesCepas no útilesC e a s n o ú t i l e s Medios de Cultivo,materiales y reactivosCepas con bajaactividadCepas SeleccionadasTº, tiempoMedios de Cultivo,materiales y reactivosMedios de Cultivo,materiales y reactivosMedios de Cultivo,materiales y reactivosTº, tiempo

3.3 FACTOR EN ESTUDIOEl Factor de estudio es el aislamiento, selección, identificación, y conservaciónd e l a s m e j o r e s c e p a s d e l o s g r u p o s m i c r o b i a n o s f i j a d o r e s d e n i t r ó g e n o , solubilizadores de Fósforo y antagonistas (contra hongos fitopatógenos).

3.4 VARIABLES3.

4.1 Variables Independientes•Métodos de Aislamiento, Selección, y Antagonismo de microorganismosfijadores de nitrógeno, solubilizadores de fosforo y antagonistas (contrahongos fitopatógenos).3.4.2 VARIABLE DEPENDIENTE IDENTIFICACIÓN Cepas EvaluadasCepas IdentificadasTº, tiempoMedios de Cultivo,materiales y reactivosMedios de Cultivo,materiales y reactivos

  •Las mejores cepas Fijadoras de Nitrógeno.•Las mejores cepas solubilizadoras de Fósforo.•Las mejores cepas Antagonistas contra hongos fitopatógenos.

3.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS ANALITICOS3.5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS3.5.1.1 UBICACIÓNLa f a se expe r imen t a l de l abo ra to r i o s e l l eva rá a c abo en e l l abo ra to r i o de Microbiología General, Alimentos y Biotecnología de la Facultad de CienciasQ u í m i c a s ( U C E ) . L a s m u e s t r a s d e l b i o i n o c u l a n t e , s u e l o s y r a í c e s s e r á n suministradas por la Florícola Hacienda Santa Fe ubicada en Sigsipamba –Pifo.3.5.1.2 MUESTREO3.5.1.2.1 Tipo de MuestreoNo probabilístico, de tipo selección intencional o de juicio.3.5.1.2.2 Programa de MuestreoN o C ó d i g o U b i c a c ió n C a n t i d a d Fecha deMuestreo1C 1 C a p t u ra 2 5 0 g 17-02-092C 2 C a p t u ra 2 5 0 g 17-02-093C 3 C a p t u ra 2 5 0 g 17-02-094

S M 1 S o l u c i ó n M a d r e 2 5 0 m l 19-03-09

  med io min ima l s i n fuen t e de n i t r ógeno (med io L ipman o Ashby Saca rosa - Anexo 3), se incubó durante 7 días a 30ºC.3.5.2.1.2 SelecciónMétodo de Cuan t i f i c ac ión de l a p roducc ión de l i ón amon io a pa r t i r de aislados microbianoSe preparó, a partir de una solución estándar de 80 ppm de NH4Cl, y el rangode trabajo de 0,8 – 5,6 ppm. Para evaluar la capacidad fijadora de nitrógeno del a s pob l ac iones a i s l ada s , s e i nocu l a c ada cepa en 25 ml de med io l i b r e de nitrógeno (Park, et ál, 2005), durante 72 horas en agitación constante a 180r p m a 3 0oC y s e u t i l i z a e l m é t o d o i n d i r e c t o d e v a l o r a c i ó n d e l i ó n a m o n i o e m p l e a n d o l a T é c n i c a c o l o r i m é t r i c a d e B e r t h e l o t ( f e n o l - h i p o c l o r i t o ) (Weatherburn, 1967; Martínez, 2003), a 633 nm en un espectrofotómetro UV-Vis.243.5.2.1.3 AntagonismoCon el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladasson sometidas a prueba de antagonismo, que se realiza en el medio diseñado,mediante la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967).53.5.2.1.4 IdentificaciónIdentificación Macroscópica: se realizo una identificación macroscópica queconsistió en observar forma, elevación, margen, superficie y opacidad de cadacolonia de las cepas seleccionadas.24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), RevistaColombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-145 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir deCompost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008

 

Identificación Microscópica: Tinción Gram, realizada a través de métodosestándar de cada cepa seleccionada.Biotipo: c o n l o s r e s u l t a d o s a n t e r i o r e s s e p u d o i d e n t i f i c a r l a s p r u e b a s b ioqu ímica s que s e r e a l i z a ron a c ada cepa , e s t a s p ruebas son co lo r de pigmentos utilizando medios específicos, producción de ácidos indicado por elc amb io de co lo r en e l med io , p ruebas de a s im i l ac ión u t i l i z ando d i f e r en t e s fuen t e s de ca rbono , t e s t de c a t a l a sa , ox ida sa y de sn i t r i f i c ac ión en ca ldo nitrato.243.5.2.1.5 PreservaciónS e c o n s e r v a l a s c e p a s a - 8 0 º C , e n v i a l e s c o n m e d i o c r i o p r o t e c t o r   (M.L.Muruaga, N.I.Perotti y M.E. Lucca; 2001).Se utiliza la técnica de conservación en viales con crioprotector y provenientesde un cultivo joven en placa.13.5.2.2 Microorganismos Solubilizadores de Fosforo3.5.2.2.1 AislamientoTécnica de diluciones seriadas:se toman 10 ml o 10 g de cada muestra, loscuales son adicionados a 90 ml de agua de peptona estéril, tomando esta comola dilución 101, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0,1 mlhasta el factor 10-8.Técnica de enriquecimiento selectivo: De las diluciones 10-4, 10-6, 10-8se24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), RevistaColombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-141 Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de laPontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006

  pasaron inóculos a un medio sólido por el método de estriación en placa8

en elmedio minimal con fosfato tricálcico como fuente de fósforo (medio PVK- Anexo4) , s e i ncubó du ran t e 7 d í a s a 30 ºC , con l a obse rvac ión d i a r i a en busca de halos claros alrededor de la colonia.3.5.2.2.2 SelecciónDeterminación Cuantitativa de fósforo solubleS e p r e p a r o , a p a r t i r d e u n a s o l u c i ó n e s t á n d a r d e f o s f a t o h i d r ó g e n o monopotásico (100 mg/L), un set de soluciones con diferentes concentraciones:0; 0,4; 1; 2; 3 y 5 ppm de P. Para la medición del P solubilizado, de cada cepase homogenizan a 0,3 de absorbancia en caldo peptona y se agrego 1000 μl am a t r a c e s c o n 1 0 0 m l d e c a l d o P V K , y s e d e t e r m i n o P s o l u b i l i z a d o colorimétricamente, con el método de Murphy y Riley (1962), cada día, por 7días.53.5.2.2.3 AntagonismoCon el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladasf u e r o n s o m e t i d a s a p r u e b a d e a n t a g o n i s m o , q u e s e r e a l i z a e n e l m e d i o diseñado, mediante la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze,1967).53.5.2.2.4 IdentificaciónIdentificación Macroscópica: se realizo una identificación macroscópica que  Se r ea l i z a a pa r t i r de t ubos de 7 d í a s de c r ec imien to de cada a c epa ; s e adicionan 10 ml de agua destilada esterilizada tres veces en autoclave a 121oCa 15 libras de presión por 15 minutos. Para la separación de las conidias seutilizó un agitador vortex; a partir de la suspensión de conidias obtenidas setoma 1.8 ml el cual se coloca en frascos ambar de tapa rosca en condicionesde esterilidad. Seguidamente se rotulan y se colocan en refrigeración a 4oC.1CAPITULO IV4.1RecursosMateriales:C A N T I D A D V A L O R U N I T A R I O V A L O R T O T A L MATERIALESM a t r az 1 0 0 0 m l 3 7 ,0 0 2 1 ,0 0 M a tr a z 5 0 0 m l 8 3 ,9 2 3 1 ,3 6 M a t

r a z 2 5 0 m l 4 3 ,3 5 1 3 ,4 0 M a tr a z 1 0 0 m l 2 1 ,7 3 3 , 46 A s a d e i n o c u la c i ó n 71 , 5 1 1 0, 5 7 A g u ja d e i n o c u l ac i ó n 2 1 ,2 4 2 , 4 8 As a d e d i s g r as k y 8 2 ,0 0 1 6 , 00 C a j a s p e t r i 15 0 0 0 , 15 2 2 5 , 00 P i p et a 1 0 m l 15 1 , 6 72 5 , 0 5P i p e ta 1 m l 2 01 , 2 5 25 , 0 0 Pi p e t a s p a s t e ur 1 0 0 0 ,1 1 0 , 0 0P i p e ta 0 , 1 m l1 0 1 , 50 1 5 , 00 T u b o s d e e n s a y o ( 1 0 x 1 ) 6 0

0 0 , 0 8 4 8 ,0 0 T u b os n e s s l er 5 1 2 , 50 1 2 7 , 50 P i p e t a V o l u m é t ri c a 2 5 m l 1 1 5 , 0 01 5 , 0 0 B a lo n e s a f o r a d o s 2 5 m l 1 0 4 , 5 04 5 , 0 0 B a ló n a f o r a d o d e 1 0 0 0 m l 1 2 0 , 0 02 0 , 0 0 B a lo n e s a f o r a d o s 5 0 m l 2 7 , 2 51 4 , 5 0 Go t e ro s 3 0, 6 0 1, 8 0 Fu n d a s b l a n c a s (p a q u e t e )2 0 , 4 0 0 , 80 F u n d a s n e g r a ( p a q u e te ) 2 0 , 5 01 , 0 0 F u n da s p l á s t i c a s e s t é r i l e s2 0 0 , 0 5 1 , 00

  F r a s c o s p l á s t i c o s e s t é r i l e s 21 7 0 , 2 0 4 3 , 40 K o hl e r1 2 ,5 0 2, 5 0P a p e l a l u m i n i o ( 1 0 0 m ) 1 ,5 1 1 , 2 7 1 6, 9 1 A l g od ó n c a r g a do 1 2 , 2 02 , 2 0 J ab ó n l í q u i d o( v a j i l l a) 1 1 , 5 0 1, 5 0 J a b ó

n l í q u i d o( m a n o s )1 1 , 1 0 1 ,1 0 B a j a le n g u a s (p a q u e t e) 1 1 , 2 0 1, 2 0 F ó s fo r o s ( pa q u e t e) 1 1 , 2 01 , 2 0 Pi o la 1 0, 8 00 , 80 C i nt a A d h e si v a 1 0, 8 0 0 ,8 0 M a r c ad o r e s p e r m a n e nt e s 2 0 , 6 01 , 2 0 C a pi l l o p a r a t u b o s 10 , 3 0 0 ,3 0 C a p il l o p a r a m a t r a z1 0 , 6 0 0, 6 0 P a pe l e m p a q ue 1 1 0 , 00 1 0 , 0 0G a sa 1 2, 5 02 , 50 T ij e r as 1 0 ,3 5 0 ,3 5 P a

p e l a b s o r be n t e 1 3, 2 0 3 , 20 A l co h o l2 0 , 80 1 , 60 C u b r e y p o r t a o bj e t o s 1 50 , 1 0 1 , 50 G u an t e s5 0 , 20 1 , 00 C of i a1 0 ,5 0 0, 5 0M a n di l 1 15 , 0 01 5 , 00 M a sc a r il l a 10 , 5 00 , 5 0f r a s c o d e v i d r i o1 0 0 0 , 25 2 5 , 0 0G r a di l l a8 2 , 50 2 0 ,0 0 F r a sc o s d e c o n s e r v ac i ó n 1 6 0 ,3 9 6 , 2 4 Cr i o v ia l e s 50 1 , 1 25 6 , 0 0M a t e r i a l d e

I d e n t i f i c a c i ón * * … … . . 2 5 0 , 0 02 5 0 , 0 0 P r e p . D e l o s b i o i n o c u l a n t es * * … … . . 1 0 0 , 00 1 0 0 , 0 0 REACTIVOSS ac a r o s a ( g ) 5 00 0 , 0 84 0 , 0 0F o s f a t o m o n o p o t ás i c o ( g ) 1 0 0 , 25 2 , 5 0 S u lf a t o d e m a g n e s i o ( g ) 2 0 0 , 75 1 5 , 0 0 C lo r u r o f é r r i c o ( g ) 1 0 0 ,7 5 7 , 5 0 Gl u c o sa ( g ) 5 00 0 , 1 26 0 , 0 0C l o r u r o d e m a g n e s io ( g ) 1 0 0 , 55 , 0 0 S u lf a t o d e a m o n i o ( g ) 2 0 0 ,1 2 2 , 4 0 Fo s f a t o d i p o t á s ic o ( g ) 1 0 0 , 25 2 , 5 0 C lo r u r o d e c a l c i o ( g ) 1 0 0 ,5 0 5 , 0 0 M

o l i b d a t o d e s o d i o ( g ) 1 0 1 , 20 1 2 , 0 0 C ar b o n a t o d e c a l c i o ( g ) 2 0 0 , 05 1 , 0 0 F o sf a t o t r i c á l c ic o ( g ) 2 0 0 0 ,0 3 6 , 0 0 C lo r u r o d e s o d i o ( g ) 2 0 0 ,0 8 1 , 6 0 Cl o r u r o d e p o t a s i o ( g ) 2 0 0 ,1 2 2 , 4 0 Su l f a t o d e m a n g a n e so ( g ) 1 0 0 , 80 8 , 0 0 S u lf a t o d e h i e r r o ( g ) 1 0 0 ,8 0 8 , 0 0 Fe n o l ( g ) 40 0 , 20 8 , 00   N i t r o pr u s i a t o d e s o d i o ( g ) 1 0 1 , 0 01 0 , 0 0

  C i t r a t o d e s o d i o ( g ) 1 0 0 0, 1 0 1 0 , 00 H i d r ó x i do d e s o d i o 1 , 5 N ( m l ) 2 0 0 , 10 2 , 0 0 H i d ró x i d o d e s o d i o ( g ) 1 0 0 0 ,0 8 8 , 0 0 H ip o c l o r i t o d e s o d i o ( m l ) 1 0 0 0 ,0 6 6 , 0 0 M ol i b d a t o d e a m o n i o ( g ) 5 0 0 , 25 1 2 , 5 0 T a rt r a t o d e s o d i o y p o t a s i o ( g ) 1 0 0 , 7 5 7, 5 0 A c i d o S u l f ú r ic o ( g ) 5 0 0 0, 0 3 1 2 , 50 A c i d o A s c ó r b ic o ( g ) 5 0 0 ,1 0 5 , 0 0 Cl o r u r o d e a m o n i o ( g ) 1 0 0 ,1 0 1 , 0 0 Ag u a d e s t i l a d a ( l i t r o s ) 10 0 0 , 8 5 8 5, 0 0 OTROS MATERIALES Y EXTRASI m p r e s

i o n e s B / N * * 4 0 0 0 ,1 4 0 , 0 0 Im p r e s i on e s c o l o r * *5 0 0 , 2 5 12 , 5 0 H o ja s d e p a p e l b o n d 1 0 00 , 0 3 3 , 00 I n t er n e t 40 0 0 , 72 8 0 , 00 T r a n s po r t e c i u d a d 48 0 0 , 2 5 12 0 , 0 0 T r an s p o r t e f u e r a d e l a c i u d a d 4 0 0 ,5 5 2 2 , 0 0 S ub s i s t en c i a 2 40 1 , 5 0 36 0 , 0 0MEDIOS DE CULTIVOA g a r n u t r i t i v o ( 5 0 0 g - f r a s c o ) 1 5 2, 2 9 5 2 , 2 9 A ga r P D A ( 5 0 0 g - f r a s c o ) 16 0 , 3 6 6 0 ,3 6 G l i ce r o l ( m l ) 20 0 , 2 55 , 0 0 Ca l d o T S A ( m l ) 90 0 , 2 5

2 2 , 5 A gu a d e p e p t o n a ( g ) 1 0 0 0, 0 9 9 , 0 0E x t r a c t o d e l e v a d u r a ( g ) 1 0 0 0 , 11 1 1 , 0 0 P ep t o n a ( g ) 2 00 , 1 5 3, 0 0 A g ar - A g a r ( 5 0 0 g - f r a s c o ) 1 71 , 4 5 7 1 , 3 5SUBTOTAL2658,42IMPREVISTOS 5%132,92TOTAL2791,34Equipos•Cocineta•Balanza 0,1g•Incubadora 25°C, 30°C, 37°C•Shaker orbital 30°C, 180 rpm•Refrigeradora 10°C± 1°C

  •Congelador -80°C± 1°C•Mechero•Autoclave 121°C, 30 min•Baño de agua 45± 1°C

•Centrifuga•Microscopio•Espectrofotómetro, etc.4.2 PresupuestoE l p r e supues to pa r a l a i nves t i gac ión s e r á p ropo rc ionado po r l a F lo r í co l a Hacienda Santa Fe y con recursos propios, que podría llegar a un costo de2800 dólares aproximadamente.4.3CronogramaM e s e s1 2 3 4 56 7 8 9 10 1 1 1 2ActividadRecolección deinformaciónAprobaciónToma demuestrasSiembraAislamientoSelecciónIdentificaciónConservaciónDefensa delPlan de Tesis

  14.Cruz Martínez Lina Carolina, Estandarización del Proceso de Producciónmasiva del Hongo Trichoderma Koningii Th003 Mediante FermentaciónBifásica a escala piloto, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007.15.Difco, Manual Difco, Medios de cultivo deshidratados y reactivos paramicrobiología, Madrid, 198416.Elein Terry Alfonso, Microorganismos Benéficos como biofertilizanteseficientes para el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum, Mill),Rev i s t a Co lombiana de B io t ecno log í a , vo lumen VI I N : 2 , D ic i embre 2005, pág. 47-5417.

Fernández Orietta / Larrea Vega, Microorganismos antagonistas para elcontrol Fitosanitario, Manejo Integrado de Plagas, Costa Rica, No. 62 p ,pág. 96 - 100 , 200118.Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha,200819.Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha,200920.Guzmán Jessica, Control de la pudrición carbonosa en caraota causadapor el hongo Macrophomina phaseolina, Agroca.21.GREEN QUALITY | F.A.Q, mejoras enrendimientosa campo respectode un control sinBiofertilizar ,Gráficos derendimiento

  22.I n t r o d u c c i ó n , R e n t a b i l i d a d D e L a s E m p r e s a s P r o d u c t o r a s D e Bioinsumos Registradas Ante El ICA23.J iménez Ave l l a D iego J av i e r , Ca rac t e r i z ac ión Molecu l a r de Cepas N a t i v a s C o l o m b i a n a s d e A z o t o b a c t e r s p p M e d i a n t e e l A n á l i s i s d e Restricción del ADN Ribosomal 16S, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias,2007.24.Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de lazona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista Colombianade Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-1425.López Marisol, Efecto de biofertilizantes bacterianos sobre el crecimientode un cultivar de maíz en dos suelos contrastantes, Centro Nacional deInves t i gac iones Agropecua r i a s (CENIAP) , Maracay , e s t ado Aragua . Venezuela.2 6 . L ó p e z M , E v a l u a c i ó n d e u n M e d i o d e C u l t i v o n o c o m e r c i a l p a r a l a p r o d u c c i ó n d e u n b i o i n o c u l a n t e e m p l e a d o e n u n c u l t i v o d e f l o r e s , Carrera de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, PUJ, 200627.Los Microorganismos Eficientes Autóctonos (EMA), Florícola HaciendaSanta Fe, 20092 8 . M . A . O s o r i o N i l a / L . M V á s q u e z G a r c í a / M . L S a l g a d o S i c l á n / C . E González Esquivel, Efecto de Dos Enmiendas Orgánicas y Trichodermas p , p a r a C o n t r o l a r S c l e r o t i n i a s p e n L e c h u g a , C h a p i n g o - M é x i c o , Universidad Autónoma Chapingo, 2005, pág. 203-208.

  29.Man t i l l a Ca rdenas Migue l Edua rdo , Eva luac ión de l a Acc ión de un B i o i n o c u l a n t e s o b r e u n C u l t i v o d e C r i s a n t e m o e n P e r i o d o d e Enraizamiento, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007.30.

Micología, Características generales de los hongos, pdf 31.M. Planes-Leyva, la biofertilización como herramienta biotecnológica dela agricultura sostenible, Centro Universitario de Guantánamo, Cuba32.Noceti, Juan J. Ing. Quim.,Biofertilizantes - Un nuevo desafio en nuestro país y en la región.33.O r e s t e s E l ó s e g u i C l a r o , M é t o d o s A r t e s a n a l e s d e P r o d u c c i ó n d e Bioplaguicidas a Partir de Hongos Entomopatógenos y Antagonistas,Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) , Ciudad de LaHabana, Cuba ,2006.34.STEFANOVA N. , M. 1998 . Mé todos de ap l i c ac ión y e f ec t i v idad de Trichoderma sp. Como antagonista de hongos fitopatógenos. Cursointernacional de control biológico BIOSAV- 4. Instituto de investigacionesde Sanidad Vegetal. La habana-Cuba.35.www.fao.org 36.www.monografías.com37.www.inia.cl   38.www.fondef.cl   39.www.infoagro.com/flores/flores/rosas.htmt

 

40.www.ute.edu.ec/posgrados/dia_de_campo.html   41.www.inta.gov.ar/barrow/info/documentos/agricultura/Maiz/informe_inocul     _solubiliz.p df   42.www.upch.edu.pe/.../Hormonas%20vegetales%201y2+Otros.ppt43.http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=23515916. ANEXOSAnexo 1

  Anexo 2Anexo 3Medio Lipman o Ashby - SacarosaF U E N T E C O M P U E S T O C A N TI D A D

  Fuente de C yenergíaS a c a r o s a 2 0 gBase mineralFosfato dipotásico0.05 gFosfatomonopotásico0.15 gC l o r u r o d e c a l c i o 0 . 0 1 g Sulfato demagnesio0.2 gMolibdato desodio0.002 gC l o r u r o f é r r i c o 0 . 0 1 g Carbonato decalcio0.1 gAguaA g u a d e s t i l a d a 1 0 0 0 m lpH = 7Anexo 5Medio PikovskayaF U E N T E C O M P U E S T O C A N T I DA D Fuente de C yenergíaG l u c o s a 1 0 gBase mineralCa3(PO4)

40.05 g(NH4)2SO40.15 gN a C l 0 . 0 1 g MgSO4.7H2O 0 . 2 g K C l 0 . 0 0 2 g E x t . L e v a d u r a 0 . 0 1 g MnSO4.H2OFeSO4.H2O0.1 gAguaA g u a d e s t i l a d a 1 0 0 0 m lpH = 7

Anexo 6Procedimiento para la toma de muestras de suelosHéctor M. Coraspe*; Sergio Tejera**El análisis de suelos es una herramienta muy importante en nuestra agricultura, utilizado como unareferencia excelente para el uso correcto, tanto de fertilizantes químicos y orgánicos, como de enmiendas.El costo actual de los fertilizantes obliga a su empleo en las dosis adecuadas y balanceadas, en funciónde los nutrimentos que contienen, principalmente en aquellos que deben ser importados, ya que elloocas iona una fuga de d iv i s a s pa r a e l pa í s . Todav í a e s t a p r ác t i c a no e s u sada amp l i amen te po r l o s productores,

motivado, en parte, al desconocimiento que existe sobre la manera correcta de tomar lasmuestras para el análisis, falta de información sobre la disponibilidad de laboratorios y el relativo bajop rec io que po r muchos años p r e sen t a ron l o s f e r t i l i z an t e s y enmiendas , deb ido a l o s subs id io s que recibían.El análisis de suelos será tan bueno como la calidad de las muestras tomadas, pues la muestra enviada allaboratorio, de 0,5 a 1,0 kg, representa millones de kilogramos de suelo.Por este motivo, una torna de muestra cuidadosa asegura unos resultados de análisis correctos y de granutilidad. 1. Pasos a seguir en el muestreo de suelos1.1. Delimitación de las áreasRecorra la finca y haga un plano o croquis sencillo de las superficies más o menos homogéneas, encuanto al tipo de suelo, apariencia física y clase de manejo recibido anteriormente, donde ubique losdetalles más importantes de la finca como lo son partes altas o bajas, planas o inclinadas, coloración delsuelo, si es arenoso o pesado, vegetación alta, media o baja, riesgo de aguachinamiento, áreas que no sehan trabajado ni fertilizado, y áreas trabajadas y fertilizadas. En todo caso, procure tomar siempre enforma separada, muestras de áreas que usted ha observado le producen diferentemente.1.2. Herramientas y materiales necesariosPara la toma de muestra en cada lote utilice los implementos necesarios como barreno, pala, bolsaplástica, y balde.1.3. Toma de la muestraRecorra los lotes al azar en forma de zig-zag y cada 15 o 30 pasos tome una submuestra, limpiando lasuperficie del terreno y depositándola en el balde. Las submuestras deben ser tomadas entre 20 y 30 cmde p ro fund idad . Luego de t ene r t odas l a s submues t r a s en e l ba lde (de 15 a 20 po r ha ) s e mezc l an homogéneamente y se toma 1 kg aproximadamente. Esta es la muestra compuesta requerida para elanálisis. El proceso se ilustra en las siete figuras que acompañan este artículo.

  1.4. Identificación de la muestraPara identificar la muestra se debe colocar: el nombre del propietario, nombre de la finca, ubicacióng e o g r á f i c a , n ú m e r o d e m u e s t r a y l o t e , s u p e r f i c i e q u e r e p r e s e n t a y a l g u n a s i n f o r m a c i o n e s complementarias como lo son: pendiente del terreno, riesgo de aguachinamiento, color del suelo, tipo devegetación, cultivo anterior, rendimiento obtenido, disponibilidad de residuos, tipo de fertilizante usado, siencaló y forma y época de aplicación.2. Factores a considerar en el muestreo de suelos2.1. Tamaño de la unidad de muestreoEl tamaño dependerá de la variabilidad del terreno y de la intensidad y tipo de uso del lote. En áreas muyuniformes, con el mismo uso agrícola y vegetación, el lote puede estar representado por 10 ha. En áreasde uso muy intensivo con fuertes aplicaciones de fertilizantes, abonos orgánicos y con riego (hortalizas yfrutales) el lote no debe ser mayor de dos hectáreas.2. 2. Número de submuestrasDependerá del tamaño del lote de muestreo y de la intensidad de uso. Mientras mayor sea el lote, mayor número de submues t r a s s e r án nece sa r i a s . E l m ín imo puede s e r en t r e 15 20 y l o i dea l en t r e 30 40 submuestras.2. 3. Precauciones a tornar cuando se tomen muestras para análisis de suelos•Evite muestrear suelos muy mojados.• Use bolsas plásticas nuevas y limpias, no de papel.

  • No fume durante la recolección de muestras, para evitar contaminarlas con las cenizas del cigarro, ricasen potasio.• No tome muestras en áreas recién fertilizadas, sitios próximos a viviendas, galpones, corrales, cercas,caminos, lugares pantanosos o

erosionados, áreas quemadas, lugares donde se amontonan estiércol,fertilizantes, cal u otras sustancias que pueden contaminar la muestra.

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