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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Aislamiento y Serotipificación de Salmonella en carcasas de pollo
en percha en la ciudad de Quito.
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de Médico
Veterinario y Zootecnista.
AUTORA:
Mariuxi Elizabeth Japón Guevara
TUTOR
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos PhD.
Quito, 17 de abril del 2019
ii
DERECHO DE AUTOR
Yo, Mariuxi Elizabeth Japón Guevara, en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación “Aislamiento y
Serotipificación de Salmonella en carcasas de pollo en percha en la ciudad
de Quito”, modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el Art.
114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor
de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y
no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos, conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra,
establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central de Ecuador para que realice
la digitalización y publicación de este trabajo en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 114 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original
en forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros,
asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera
presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda
responsabilidad.
Mariuxi Elizabeth Japón Guevara
CC. 0706087863
iii
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por la señorita
Mariuxi Elizabeth Japón Guevara, para optar el Título o Grado de Médico
Veterinario y Zootecnista cuyo título es AISLAMIENTO Y
SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA EN CARCASAS DE POLLO EN
PERCHA EN LA CIUDAD DE QUITO”. Considero que dicho trabajo reúne
todos los requisitos y méritos para ser sometido a la presentación pública y
evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito a los 13 días del mes de marzo del 2018.
FIRMA
Dr. Christian Vinueza PhD.
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dr. Javier Vargas, Dr. Alfonso Molina, Dr.
Eduardo Aragón
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título (o grado académico) de: MÉDICO VETERINARIO Y
ZOOTECNISTA.
Presentado por la señorita: Mariuxi Elizabeth Japón Guevara.
Con el título: “Aislamiento y Serotipificación de Salmonella en carcasas de
pollo en percha en la ciudad de Quito”.
Emite el siguiente veredicto (aprobado/reprobado) _____________
Fecha __________________
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y apellido Calificación Firma
Presidente _________________ _____ ______________
Vocal 1: _________________ _____ ______________
Vocal 2: _________________ _____ ______________
v
DEDICATORIA
A mi papá Celso que han sabido guiarme y apoyarme incondicionalmente
en cada etapa de mi vida.
A mis hermanos Andrea, Nicole, Bernardo y Víctor, los cuales me han
apoyado en todo momento.
A mi madre Elvia que desde donde esté siempre guía mis pasos.
A Liz por todo el apoyo y cariño que me ha brindado desde el momento que
me conoció.
A mi familia que siempre me ha dado su apoyo y amor en los buenos y
malos momentos de mi vida.
Mariuxi Japón Guevara
vi
AGRADECIMIENTOS
A mis padres Celso y Elvia, a mis hermanos Andrea, Nicole, Bernardo y
Víctor, a Liz por estar conmigo en este camino llamado vida, son mi
inspiración y la razón de mi felicidad.
A la Dra. María Inés Baquero, por darme la oportunidad de ingresar al
Laboratorio de Bacteriología y Micología, siempre será mi ejemplo para
seguir.
Al Dr. Christian Vinueza PhD. por darme la oportunidad de estar dentro del
proyecto, por sus enseñanzas y su paciencia para la realización de este
trabajo.
Al Dr. Carlos Gómez, al cual le agradezco sus enseñanzas y su paciencia.
A José, Sofi, Cris, Janina y Andrés que con su apoyo incondicional y sus
consejos siempre estuvieron presentes.
A las diferentes empresas que financiaron mi proyecto, Advisory Group on
Integrated Surveilance of Antimicrobial Resistance (AGISAR),
Organización Mundial de la Salud (OMS), a la Unidad de Investigación de
Enfermedades Transmitidas por los Alimentos y Resistencia a los
antimicrobianos (UNIETAR), y al Laboratorio de Bacteriología y Micología
de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad
Central del Ecuador, sin su apoyo no hubiera podido realizar mi
investigación.
vii
CONTENIDO
LISTA DE TABLAS .................................................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... x
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................... xi
RESUMEN ................................................................................................................. xii
ABSTRACT ............................................................................................................... xiii
INTRODUCCIÓN......................................................................................................... 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................................... 3
OBJETIVOS ................................................................................................................. 5
General ......................................................................................................................... 5
Específicos ................................................................................................................... 5
CAPITULO II ................................................................................................................ 6
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 6
2.1 Generalidades ....................................................................................................... 6
2.2 Taxonomía ............................................................................................................. 7
2.3 Epidemiología ........................................................................................................ 8
2.4 Patogenicidad ........................................................................................................ 9
2.5 Métodos de Diagnóstico .................................................................................... 11
2.6 Reservorios de Salmonella ................................................................................ 15
2.7 Transmisión de Salmonella ............................................................................... 15
2.8 Fuentes de Contaminación ................................................................................ 16
2.9. Resistencia a los Antimicrobianos ................................................................... 16
CAPÍTULO III ............................................................................................................. 18
MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................... 18
3.1. METODOLOGÍA ................................................................................................ 18
3.1.1Tipo de Investigación ....................................................................................... 18
viii
3.1.2 Descripción de la zona de estudio ................................................................ 18
3.1.3 Descripción de la investigación ..................................................................... 18
3.1.5 Manejo del estudio .......................................................................................... 20
3.1.5.1 Fase de Campo ............................................................................................ 20
3.1.5.2 Fase de Laboratorio ..................................................................................... 20
a) Recolección de la muestra ............................................................................... 20
b) Pre-enriquecimiento no selectivo .................................................................... 20
c) Enriquecimiento selectivo ................................................................................. 20
d) Siembra en medio selectivo ............................................................................. 21
e) Siembra de pruebas bioquímicas .................................................................... 21
f) Respaldo y lisado de cepas ............................................................................. 21
3.1.6 Serotipificación ................................................................................................. 22
3.1.7 Electroforesis ................................................................................................... 23
3.1.8 Registro y almacenamiento de datos ........................................................... 24
3.1.9 Análisis estadístico. ......................................................................................... 24
CAPITULO IV............................................................................................................ 25
4.1 Resultados ........................................................................................................... 25
4.1.1 Análisis Estadístico ......................................................................................... 26
4.1.2 Serotipificación ................................................................................................. 28
CONCLUSIONES ...................................................................................................... 32
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 33
ANEXOS ..................................................................................................................... 42
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Características bioquímicas para identificación fenotípica de Salmonella.
........................................................................................................................................... 6
Tabla 2: Clasificación de Salmonella con su número de serovares. ....................... 8
Tabla 3: Características de las colonias y selectividad en medios utilizados para
el aislamiento de Salmonella. ...................................................................................... 13
Tabla 4 : Características de las pruebas bioquímicas utilizadas para la
identificación de Salmonella. ....................................................................................... 14
Tabla 5: Ejemplos de la definición antigénica de serotipos de Salmonella. ......... 15
Tabla 6: Representación del total de carcasas tomadas en el muestreo tanto en
segmentos de mercado como en sectores de la ciudad .......................................... 19
Tabla 7: Características del muestreo realizado en el estudio basado en el
proyecto WHO- AGISAR .............................................................................................. 19
Tabla 8: Secuenciación y tamaño de los primers utilizados en la serotipificación
de Salmonella Infantis .................................................................................................. 22
Tabla 9: Secuenciación y tamaño de los primers utilizados en la serotipificación
de S. Enteritidis. ............................................................................................................ 23
Tabla 10: Programa del termociclador para S. Infantis y S. Enteritidis ................. 23
Tabla 11: Número total y porcentaje de muestras positivas de Salmonella en
carcasas de pollo en percha en supermercados, tiendas y mercados en las dos
zonas de la ciudad de Quito (norte y sur). ................................................................. 25
Tabla 12: Análisis estadístico basado en X2 para determinar diferencias
estadísticas entre sectores de la ciudad. ................................................................... 26
Tabla 13: Análisis estadístico basado en X2 para determinar diferencias
estadísticas entre segmentos de mercados. ............................................................. 27
Tabla 14: Análisis estadístico basado en X2 para determinar diferencias
estadísticas entre mercados (norte y sur).................................................................. 27
Tabla 15: Análisis estadístico basado en X2 para determinar diferencias
estadísticas entre supermercados (norte y sur). ....................................................... 27
Tabla 16: Análisis estadístico basado en X2 para determinar diferencias
estadísticas entre tiendas (norte y sur). ..................................................................... 28
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representación de resultados positivos de Salmonella tanto en sectores
de la ciudad como segmentos de mercado. .............................................................. 26
Figura 2: Representación de PCR Multiplex de Salmonella Infantis ..................... 28
xi
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1: Protocolo de PCR Multiplex de Salmonella Infantis. ............................. 42
Anexos 2: Protocolo PCR Multiplex Salmonella Enteritidis. .................................. 43
Anexos 3: Esquema de identificación de Salmonella. ........................................... 44
Anexos 4: Tabla de resultados. ................................................................................ 45
Anexos 5: Toma de muestras de carcasas ............................................................. 49
Anexos 6: Procesamiento de carcasas. ................................................................... 50
Anexos 7: Procesamiento de lisados y serotipificación. ........................................ 51
Anexos 8: Evidencia fotográfica de PCR realizados para serotipificación. ......... 51
xii
Autora: Mariuxi Elizabeth Japón Guevara
RESUMEN
Salmonella es uno de los principales patógenos causantes de infecciones
alimentarias a nivel mundial. Salmonelosis es transmitido principalmente
por alimentos contaminados por Salmonella como la carne de pollo, el cual
ha sido descrito como reservorio. El objetivo del estudio fue aislar y
serotipificar a Salmonella por PCR Multiplex a carcasas de pollo en percha
en Quito. Durante 20 semanas, un total de 159 muestras fueron compradas
en tiendas, mercados y supermercados en el norte y sur de la ciudad, 91
(57.2%) muestras fueron positivas a Salmonella. No se encontró diferencias
significativas en la prevalencia de Salmonella entre los 3 segmentos de
mercado y los sitios de muestreo en la ciudad. S. Infantis fue el serotipo
más prevalente con el 98.9% (n=90). Nuestros resultados contrastan con
estudios en otros países donde S. Enteritidis y S. Typhimurium son los
serotipos más prevalentes. Sin embargo, la epidemiología de S. Infantis en
Perú tiene concordancia con nuestras observaciones. La alta prevalencia
de Salmonella reportada en este estudio es de gran preocupación para
salud pública. Por lo cual, futuros estudios son recomendados.
PALABRAS CLAVES: SALMONELLA / CARCASAS DE POLLO / SEROTIPO / INFANTIS / QUITO.
TÍTULO: Aislamiento y Serotipificación de Salmonella en carcasas de
pollo en percha en la ciudad de Quito
Tutor: Dr. Christian Vinueza Burgos PhD
xiii
Author: Mariuxi Elizabeth Japón Guevara
Tutor: Dr. Christian Vinueza PhD.
ABSTRACT
Salmonella is one of the main pathogens causing food infections worldwide.
Salmonellosis is transmitted mainly by foods contaminated by Salmonella such as
chicken meat, which has been described as a reservoir. The objective of the study
was to isolate and serotype Salmonella by Multiplex to chicken carcasses on
counters in Quito. During 20 weeks, 159 samples were purchased in stores,
markets and supermarkets at the north and south of the city. Ninety-one (57, 2%)
of the samples were positive for Salmonella. No significant differences were found
in the prevalence of Salmonella between three market segments and the sampling
sites in the city. S. Infantis was the most prevalent serotype, 98.9% (n=90). The
results contrast with studies in other countries were S. Enteritidis and S.
Typhimurium are the most prevalent serotypes. However, the epidemiology of S.
Infantis in Peru is consistent with the observations. The high prevalence of
Salmonella spp. reported in this study is a great concern for public health.
Therefore, further studies are recommended.
KEYWORDS: SALMONELLA / CHICKEN CARCASSES / SEROTYPE / INFANTIS / QUITO.
TITLE: Isolation and Serotyping of Salmonella in chicken
carcasses in counters in the city of Quito
INTRODUCCIÓN
Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs), son causadas por
la presencia de microorganismos como virus, parásitos y bacterias siendo
las últimas las responsables de la mayoría de los casos (OMS, 2017; Soto
Varela, Pérez Lavalle, & Estrada Alvarado, 2016). Los principales agentes
causantes de ETAs son Campylobacter spp, Escherichia coli, Listeria spp,
Salmonella spp, Yersinia spp entre otras (OMS, 2017).
La presentación de las ETAs está condicionada a ciertas variables entre las
que se destacan el inóculo necesario para que se presente la infección, las
condiciones intrínsecas del hospedador, y la patogenicidad de la cepa
infectante (PAHO, 2016).
Las ETAs pueden afectar a toda la población, siendo más propensos los
niños, lactantes y adultos mayores. La Organización Mundial de la Salud
(OMS) determinó que de entre todos los casos de ETAs, un 40%
pertenecen a niños menores de 5 años (OMS, 2017; Parra, Durango, &
Máttar, 2002)
Dentro de los principales causantes de ETAs se atribuye a Salmonella spp
como la segunda causa de este tipo de infección a nivel mundial (OMS,
2018).
Salmonella se presenta tanto en casos aislados como en brotes que
pueden afectar a poblaciones completas, es considerada como una de las
principales causas de enfermedades diarreicas en el mundo. Presenta
manifestaciones clínicas como gastroenteritis, bacteremia, infecciones
localizadas y fiebre entérica (OMS, 2018; Uribe & Suárez, 2006).
Salmonella es ubicua en el medio ambiente y también coloniza el intestino
de humanos y animales. Ha sido reportada también en huevos, carne de
pollo y cerdo considerándolos como reservorios (Herrera & Jabib, 2015;
Varela, Lavalle, & Alvarado, 2016).
2
La producción avícola es un sector que ha ido creciendo e
industrializandose en el mundo logrando aumentar la demanda de carne
avícola de 9 a 120 millones de toneladas entre 1961 a 2016 al igual que
los huevos que en las tres últimas décadas ha aumentado en un 150 %
(FAO, 2018).
La producción avícola en Ecuador en el 2016 fue de 220 millones de pollos
de engorde mientras que el consumo per cápita de carne de pollo fue de
33.1 kg/persona/año (Vinueza, 2017).
3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Salmonella se sitúa como la segunda causa más común de ETAs a nivel
mundial por lo cual se precisa realizar la vigilancia en toda la cadena
alimentaria para lograr reducir los efectos causados por este tipo de
enfermedades (CDC, 2016; Luquez, 2016).
La salmonelosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria
más común a nivel mundial, reportando en Estados Unidos 1 millón de
casos cada año (CDC, 2018) los cuales pueden tornarse severos si se
presenta en niños, ancianos e individuos con sistemas inmunes
comprometidos (CFSPH, 2006).
La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria reporta alrededor de
100.000 casos de salmonelosis al año. En 2016 se confirmaron 94.530
casos (ECDC & EFSA, 2016; EFSA, 2018).
En Latinoamérica las ETAs han sido reportadas en varios países. Colombia
en 2017 reportó alrededor de 3900 casos (INS, 2018) en Chile 5572 casos
(MINSAL, 2018) mientras que en Ecuador se reportaron 2041 casos de
salmonelosis con la mayor cantidad de casos en Manabí (MSP, 2017).
Salmonella puede contaminar toda la cadena de producción desde el
alimento que consumen los animales hasta el producto final obtenido para
la venta. La salmonelosis es causada por el consumo de alimentos ya sean
de origen animal como vegetal contaminados con Salmonella (OMS, 2018;
Varela et al., 2016).
El alto consumo de carne de pollo, huevos y subproductos aumenta el
riesgo de infección por Salmonella, por lo que el manejo de las carcasas
es importante para disminuir la contaminación bacteriana (OMS, 2018;
Uribe & Suárez, 2006).
El presente estudio se enfoca en la determinación de Salmonella a nivel de
carcasas de pollo en percha considerando el alto consumo de carne de
4
pollo en la población ecuatoriana y los posibles riesgos que podrían
implicar.
5
OBJETIVOS
General
• Tipificar aislados de Salmonella en carcasas de pollo en percha en
supermercados, mercados abiertos y tiendas en la ciudad de Quito
Específicos
• Aislar Salmonella de carcasas de pollo expendidas al minoreo en la
ciudad de Quito.
• Identificar los serotipos de los aislados de Salmonella mediante
PCR.
6
CAPITULO II
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Generalidades
Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, es una bacteria gram
negativa, anaerobia facultativa y móvil gracias a la presencia de flagelos
peritricos. Presentan crecimiento a temperaturas que van desde 7 °C a 45
°C, un de pH de 6.5 a 7.5 y una actividad de agua (aw) de 0.94 (Caffer,
Terragno, & Binsztein, 2008; Quinn et al., 2011).
Las pruebas bioquímicas que se realizan para identificar a la bacteria son
la fermentación de glucosa, manitol, maltosa y sorbitol, producción de
sulfuro de hidrógeno y enzima lisina descarboxilasa, así como la
incapacidad de fermentar lactosa, hidrolizar urea y producir indol (Ver Tabla
1) (Caffer, Terragno, et al., 2008; Herrera & Jabib, 2015; Quinn et al., 2011).
La bacteria está presente tanto en animales domésticos como salvajes.
Entre las especies domésticas es más prevalente en aves de corral,
porcinos y bovinos (OMS, 2018).
Tabla 1: Características bioquímicas para identificación fenotípica de Salmonella.
Prueba Bioquímica Resultado
Glucosa Positivo
Lactosa Negativo
Indol Negativo
H2S Positivo
Urea Negativo
Citrato Negativo
Lisindescarboxilasa Positivo
Sacarosa Negativo
Voges-Proskauer Negativo
7
2.2 Taxonomía
La clasificación de Salmonella antiguamente se basó en manifestaciones
clínicas, hospedadores, reacciones bioquímicas y epidemiologia, pero en
la actualidad la misma se realiza detectando antígenos somáticos,
flagelares y de superficie (O y H y K respectivamente) a través del esquema
de Kauffman y White planteado en 1966 (Agbaje, Begum, Oyekunle, Ojo,
& Adenubi, 2011; Parra et al., 2002).
El antígeno O está presente en la pared bacteriana derivado de un
polisacárido, el antígeno H está compuesto por una proteína llamada
flagelina y el antígeno K se expresa a través de 2 genes (ViA y ViB) el cual
hace imposible la aglutinación de sueros anti O (Parra et al., 2002).
Mediante el esquema de Kauffman y White se han identificado
aproximadamente 2500 serotipos de Salmonella que se encuentran tanto
en animales de sangre caliente y fría notándose así su amplia cantidad de
huéspedes. Basándose en la adaptabilidad de dichos huéspedes se
clasifica en 3 grupos importantes desde el punto de vista epidemiológico:
(Agbaje et al., 2011).
• Grupo 1: Salmonella adaptada al hombre y primates superiores
como S. Typhumurium y Paratyphi A, B y C.
• Grupo 2: Salmonella adaptada a animales que con poca frecuencia
se presenta en humanos como S. Dublin en bovinos y Salmonella
gallinarum en aves de corral.
• Grupo 3: Formado por Salmonella que no tienen un hospedador
especifico por lo cual produce infección tanto en animales como en
el hombre como Salmonella Enteritidis (Agbaje et al., 2011).
Hasta 1983 se aceptaban múltiples especies de Salmonella, pero en la
actualidad este género consta de 2 especies: S. enterica y S. bongori
aunque en 2005 se describió una tercera especie S. subterranea la misma
que poco después se demostró que no pertenecía al género (Chlebicz &
Śliżewska, 2018; Parra et al., 2002).
8
Salmonella enterica se divide en 6 subespecies: enterica, salamae,
arizonae, diarizonae, houtenae e indica (Ver tabla 2). La mayoría de los
casos de salmonelosis en el mundo que afectan a humanos y animales de
sangre caliente están causados por la especie enterica subespecie enterica
por lo cual es considerada importante para la salud pública, por otro lado
S. bongori se diagnostica pocos casos en humanos y ha sido descrita en el
medio ambiente y en animales de sangre fría (Agbaje et al., 2011; Chlebicz
& Śliżewska, 2018; Quinn et al., 2011).
Los serovares que pertenecen a S. enterica subespecie enterica son
designados dependiendo del lugar geográfico donde se aisló por primera
vez, el cual será escrito la primera letra en mayúsculas y sin cursiva (Junod,
2010).
Tabla 2: Clasificación de Salmonella con su número de serovares.
2.3 Epidemiología
Salmonella fue descrita por primera vez por Daniel Salmon y Theobald
Smith en Estados Unidos en 1885. En un estudio realizado en busca del
causante de cólera porcino se describió a una bacteria que denominaron
Bacillus cholerasuis y posteriormente Joseph León Marcel Ligniéres en
1900 nombró a este grupo de bacterias como Salmonella (Chlebicz &
Śliżewska, 2018; Villar, 2011).
Salmonella se presenta tanto en casos aislados como en brotes que
pueden afectar poblaciones completas, es considerada una de las
principales agentes causales de enfermedades diarreicas en el mundo.
Presenta manifestaciones clínicas como gastroenteritis, bacteremia,
infecciones localizadas y fiebre entérica (OMS, 2018; Uribe & Suárez,
2006).
Especie Salmonella enterica Salmonella
bongori Subespecie enterica salamea arizonae diarizonae houtenae indica
Número de
serovares
1531 505 99 336 73 13 22
9
La fiebre entérica es causada por S. Typhi y Paratyphi y afecta
exclusivamente al hombre. Los demás serovares son considerados
zoonóticos y son causantes de fiebre no tifoidea (Uribe & Suárez, 2006). A
nivel mundial se estima anualmente 93.8 millones de casos de
gastroenteritis de los cuales 80.3 millones corresponden a los ocasionados
por Salmonella (Majowicz et al., 2010).
En Estados Unidos se estima que cada año Salmonella causa 1.2 millones
de casos con 23.000 hospitalizaciones y 450 muertes siendo la infección
por alimentos contaminados la principal causa de casos de salmonelosis
(CDC, 2018). En Ecuador se reportó 2041 casos de salmonelosis en el año
2017 con un porcentaje mayor de casos en Manabí (16.6%) (MSP, 2017).
Los diferentes serotipos de Salmonella están distribuidos a nivel mundial,
dependiendo del país o región algunos se encuentran en mayor o menor
proporción, es así que en Estados Unidos y Europa en 2017 se reportó a
los serotipos Enteritidis y Typhimurium como prevalente. En países como
Brasil y Chile se reportó a S. Enteritidis como prevalente para casos de
salmonelosis mientras que en Ecuador en estudios realizados el serotipo
más prevalente es Infantis (CDC, 2017; EFSA, 2018; Villagomez, 2015;
Vinueza, 2017).
2.4 Patogenicidad
Salmonella ingresa al organismo por vía oral al consumir alimentos
contaminados con una cantidad mínima infectante (106 a 109
microrganismos), luego atraviesa la barrera intestinal para interactuar con
las células del sistema inmune pudiendo sobrevivir en el fagosoma y actuar
como una bacteria intracelular produciendo una infección sistémica en el
huésped (Herrera & Jabib, 2015; Martínez, 2007).
La salmonelosis se produce con la presencia de diversos factores como:
cantidad mínima infectante, capacidad para atravesar barreras defensivas
y capacidad invasiva del patógeno. Las barreras defensivas corresponden
a acidez gástrica, peristaltismo intestinal, presencia de microbiota intestinal
e inmunidad especifica del huésped (Martínez, 2007).
10
2.4.1 Factores de virulencia
La bacteria puede distinguir 2 grupos de factores de virulencia, las
estructuras superficiales consideradas células diana del sistema inmune en
el hospedador y por otro lado los genes de virulencia que se encuentran en
el cromosoma o plásmido donde se describen las islas de patogenicidad
(Martínez, 2007).
De esta manera dentro de las estructuras superficiales se incluyen los
lipopolisacáridos que cumple con una actividad tóxica representada por el
lípido A; los flagelos encargados de dirigir al microorganismos al epitelio
intestinal mediante quimiotaxis y por último las fimbrias encargadas de la
unión de las bacterias a los receptores específicos del hospedador
(Figueroa Ochoa & Verdugo Rodríguez, 2005; Martínez, 2007).
2.4.2 Mecanismos de adherencia
El mecanismo de adherencia es necesario para la supervivencia de
Salmonella, la misma que depende de un receptor en la célula del huésped
y de la presencia de adhesina las cuales son capaces de una cadena de
respuestas biológicas como la capacidad de activar a linfocitos B,
neutrófilos y la secreción de citocinas (Carbó, 2015).
Las bacterias gram negativas presentan adhesinas como: fimbrias,
flagelos, lipopolisacáridos y cápsula en el caso de. Salmonella enterica
serovar Typhy, Paratyphi y Dublin. (Carbó, 2015; Figueroa Ochoa &
Verdugo Rodríguez, 2005).
2.4.3 Mecanismo de invasión
El alimento ingerido contaminado con Salmonella entra al organismo para
comenzar el ciclo comenzando en el tejido linfoide y dirigiéndose a las
llamadas células hospedadoras que no las fagocitan (Carbó, 2015).
La bacteria realiza una invasión segura en la superficie de la capa mucosa
de las células epiteliales que reciben señales para provocar cambios
estructurales y de esta manera colonizar a la mucosa intestinal que es
11
necesaria para causar su infección en el huésped (Carbó, 2015; Figueroa
Ochoa & Verdugo Rodríguez, 2005).
2.4.4 Islas de patogenicidad
Las islas de patogenicidad son largas agrupaciones de genes cuya función
es codificar factores específicos de virulencia que se expresan en el
proceso infectivo, que en el caso de las bacterias que están dentro de la
familia de las enterobacterias basta que se adquiera una isla de
patogenicidad para que el microorganismo pase de comensal a patógeno.
(Carbó, 2015; Martínez, 2007).
Salmonella cuenta con 5 islas de patogenicidad, teniendo cada una su
función:
• SPI -1: Determinan la invasión de células del hospedador no
fagocíticas y apoptosis de macrófagos.
• SPI -2 y SPI -3: Regulan supervivencia y replicación bacteriana en
compartimientos intracelulares de fagocitos y células epiteliales
• SPI -4: Codifica el sistema de secreción y adaptación en ambientes
intracelulares.
• SPI -5: Codifica factores involucrados en la secreción fluida y
reacción inflamatoria en la mucosa intestinal (Figueroa Ochoa &
Verdugo Rodríguez, 2005).
2.5 Métodos de Diagnóstico
El método de diagnóstico gold estándar para la detección de Salmonella es
el cultivo microbiológico seguido de confirmación serológica (Kang et al.,
2017). Además se han descrito otros métodos como aglutinación de látex,
Inmunoensayo enzimático (EIA) y ensayos de reacción en cadena (PCR)
así como métodos moleculares descritos en la actualidad como MALDI-
TOF MS que identifica a Salmonella a nivel de especie (Dieckmann &
Malorny, 2011; Gonzalez, Pereira, Soto, Hernández, & Villareal, 2014).
12
2.5.1 Diagnóstico Microbiológico de Salmonella
El diagnóstico microbiológico de Salmonella es una técnica cuyo resultado
se expresa cualitativamente, determinando la presencia o ausencia en las
muestras analizadas. En este método se utiliza medios de cultivo selectivos
para su posterior caracterización a través de pruebas bioquímicas y
serológicas. (Gonzalez et al., 2014)
El cultivo microbiológico estándar detecta a Salmonella desde 1 a 2 UFC
(unidades formadores de colonia) en un tiempo de 4 a 5 días en el cual se
realiza un proceso que consta de distintas etapas las cuales están basadas
en la Norma INEN 6579 (Gonzalez et al., 2014; OIE, 2016).
2.5.1.1 Medios de pre-enriquecimiento
La cantidad de Salmonella en heces de animales asintomáticos, muestras
ambientales, piensos y alimentos humanos suele ser bajo, por lo que es
necesario utilizar medios para pre-enriquecimiento tales como agua
peptonada tamponada o caldo nutritivo, permitiendo la multiplicación de la
escasa población de la bacteria. Para que se de este proceso es necesario
una incubación a 37º Celsius durante 18 a 24 horas (Gonzalez et al., 2014;
OIE, 2016).
2.5.1.2 Medios de enriquecimiento selectivo
Esta etapa estimula y favorece el crecimiento de Salmonella inhibiendo el
crecimiento otras bacterias. Los medios de cultivo utilizados para el
enriquecimiento selectivo son caldo Tetrationato, caldo Müller-Kauffmann,
caldo Verde Brillante, Selenito-cistina, caldo Rappaport-Vassiliadis y agar
Rappaport-Vassiliadis semisólido modificado (MRSV). A este tipo de
medios se puede añadir aditivos como es el caso de la novobiocina que
ayuda a la inhibición de bacterias gram positivas u otras gram negativas
como Proteus (Gonzalez et al., 2014).
Algunos componentes de los medios utilizados para el enriquecimiento
selectivo son tóxicos para ciertas serovariedades es así que el selenito
inhibe a S. Cholerasuis y el verde brillante inhibe a S. Dublin (OIE, 2016).
13
Para el crecimiento de Salmonella se utilizan temperaturas altas (43°C)
para aumentar la selectividad de la prueba. Según la NORMA ISO 6579 se
recomienda utilizar 41.5°C especialmente para medios selectivos por
movilidad como es el caso de MSRV (OIE, 2016).
2.5.1.3 Medios selectivos en placa
En esta etapa se permite la diferenciación de colonias de Salmonella de
otras bacterias, la misma se basa en la composición de los distintos medios
que permiten el crecimiento de las colonias con aspectos característicos.
Los medios más utilizados para esta etapa son Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato (XLD), Agar Salmonella Shigella (SS), Agar Hektoen (HE)
agar verde brillante (VB) entre otros los cuales se obtienen resultados
después de 24 horas de cultivo a 37°C (Caffer, Lucero, & Pichel, 2008;
Gonzalez et al., 2014; OIE, 2016).
Tabla 3: Características de las colonias y selectividad en medios utilizados para el aislamiento de Salmonella.
Medio de cultivo Selectividad Aspecto
Agar XLD Alta Rojas con centro negro
Agar SS Alta Incoloras con centro negro
Agar HE Alta Verde azuladas con centro negro
Agar VB Alta Rosa pálidas
2.5.1.4 Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas diferencian las bacterias por su actividad
metabólica de esta manera la identificación o confirmación de las colonias
presuntivas de Salmonella, se lleva a cabo en varios medios diferenciales
usados simultáneamente como el agar triple azúcar hierro (TSI), el agar
lisina hierro (LIA), la producción de urea e indol y la utilización de citrato
14
(Ver tabla 4) (Gonzalez et al., 2014; Koneman, Allen, Janda,
Schreckenberger, & Winn, 2004; Pachón, 2009).
Tabla 4 : Características de las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de Salmonella.
* Depende de los serotipos.
2.5.2 Serotipificación
La serotipificación es considerada como un complemento del diagnóstico
microbiológico. Es importante porque desde el punto de vista
epidemiológico permite determinar la prevalencia de un serovar en distintas
zonas geográficas (Caffer, Lucero, et al., 2008; Pachón, 2009).
La técnica emplea diferentes antígenos: antígenos de superficie (LPS,
antígenos O), antígenos flagelares (proteínas, antígenos H) y en algunas
cepas el antígeno capsular (Vi) los cuales son identificados con anticuerpos
monovalentes y polivalentes mediante aglutinación en lámina. Teniendo así
unos ejemplos que se observan en la Tabla 5.
El esquema de Kauffmann-White publicado por la Organización Mundial de
la Salud (OMS) dentro del Centro de Referencia e Investigación de
Salmonella del Instituto Pasteur de Paris está diseñado para clasificar a la
Prueba Resultado
Lisina descarboxilasa (LIA) Positivo
Producción de urea Negativo
SIM
S: Formación de ácido sulfhídrico
I: Producción de indol
M: Motilidad
S: Positivo
I: Negativo
M: Positivo
TSI (Fermentación de azúcares
glucosa, sacarosa y lactosa,
producción de gas y H2S)
K/A + gas + H2S
Citrato Positivo*
15
bacteria considerando determinantes antigénicas en el antígeno O que
determinan la existencia de grupos y serogrupos, así como los antígenos
flagelares en fase 1 determinan el serotipo (Pachón, 2009).
Tabla 5: Ejemplos de la definición antigénica de serotipos de Salmonella.
2.6 Reservorios de Salmonella
Los reservorios de Salmonella incluyen animales domésticos y silvestres,
como aves de corral, porcinos y vacunos así también iguanas, tortugas,
roedores, perros y gatos. Se consideran como reservorios secundarios a
aguas de pozos, camas para crianza y carcasas donde el microorganismo
puede sobrevivir durante períodos largos de tiempo pero no se multiplican
normalmente como lo hacen en el sistema digestivo de sus hospedadores
principales (OMS, 2018; Uribe & Suárez, 2006).
Salmonella puede sobrevivir en productos con altas cargas de proteína y
grasa especialmente en productos cárnicos por lo cual se recomienda
realizar la correcta cocción para así evitar contraer la infección (Carbó,
2015; Uribe & Suárez, 2006).
Los humanos que contraen la infección con frecuencia son portadores,
especialmente cuando son casos no identificados en los que actúan como
reservorios (Uribe & Suárez, 2006).
2.7 Transmisión de Salmonella
La transmisión de Salmonella principalmente se realiza por vía fecal-oral
(CFSPH, 2005). En el humano la transmisión se da por ingestión de
Serovar Antígeno O Antígeno Flagelar H
Fase 1 Fase 2
Salmonella Enteritidis 1,9,12 Gm -
Salmonella Typhimurium 1,4,5,12 I 1,2
Salmonella Infantis 6,7,14 R 1,5
16
alimentos contaminados o por el contacto de heces de un animal o persona
infectada (Uribe & Suárez, 2006).
En animales la transmisión se realiza por consumir piensos, pasturas y
agua contaminada o por el contacto con un animal infectado. (Uribe &
Suárez, 2006).
La transmisión vertical ocurre en aves por contaminación de la membrana
vitelina, albumen y posiblemente la yema de huevo, además Salmonella se
puede propagar por medio de vectores (insectos) y fómites (CFSPH, 2005).
Salmonella puede sobrevivir durante períodos prolongados en el ambiente
de manera especial cuando es cálido y húmedo y puede resistir la
deshidratación tanto en las heces como en los alimentos para el consumo
tanto animal como humano (CFSPH, 2005; Uribe & Suárez, 2006).
2.8 Fuentes de Contaminación
Los alimentos más comúnmente contaminados con Salmonella son
huevos, carnes y sus derivados incluyendo también agua, frutas y verduras
que en la actualidad han producido algunos de los brotes reportados
(Hoelzer, Moreno, & Wiedmann, 2011; OMS, 2018; Uribe & Suárez, 2006).
En el tracto digestivo de diferentes mamíferos, especialmente en aves se
encuentra a la bacteria Salmonella por lo cual al momento del sacrificio por
la ruptura de las vísceras es probable que ocurra contaminación en la
carcasa para luego extenderse a la carne al momento del despiece.
(Rodríguez Ceniceros, Gómez Hernández, & Vázquez Sandoval, 2016).
2.9. Resistencia a los Antimicrobianos
La salmonelosis es considerada una enfermedad autolimitante por lo cual
no necesita un tratamiento antibiótico (Junod, 2010) . El tratamiento que se
debe utilizar según recomendaciones de la Organización Mundial de la
Salud es la reposición de electrolitos y rehidratación que se pierden por la
diarrea y vómito causada por esta enfermedad (OMS, 2018).
17
La utilización de antibióticos en salmonelosis se da en caso que afecte a
los grupos de riesgo como son ancianos, niños y pacientes
inmunocomprometidos (OMS, 2018). Los antibióticos recomendados para
salmonelosis son ampicilina, amoxicilina, gentamicina, trimetropin-
sulfametoxazol y fluroquinolonas (CFSPH, 2005).
La resistencia a antimicrobianos en la actualidad es un problema que va
creciendo a nivel mundial debido al uso indiscriminado e inadecuado de
antibióticos tanto en medicina humana como veterinaria (Junod, 2010;
Uribe & Suárez, 2006).
Para evitar la resistencia es recomendable realizar pruebas de sensibilidad
antes de elegir el antibiótico ideal para el tratamiento de la enfermedad
(CFSPH, 2005).
La estimación de infecciones causadas por microorganismos resistentes
provenientes de alimentos y animales es de alrededor 1 de cada 5 personas
infectadas (CDC, 2013).
18
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. METODOLOGÍA
3.1.1Tipo de Investigación
La investigación fue de tipo no experimental.
3.1.2 Descripción de la zona de estudio
El estudio se realizó en la ciudad de Quito ubicada a 2830 m.s.n.m con un
área de 4183 Km2, temperatura que oscila entre 10 a 25°C con una
población aproximada de 2.6 millones de habitantes (INEC, 2010).
Las muestras fueron recolectadas en supermercados, mercados y tiendas
del norte y sur de la ciudad de Quito, en los sectores de Cotocollao y
Chillogallo respectivamente.
3.1.3 Descripción de la investigación
El diseño del estudio fue observacional transversal y descriptivo. Las
muestras de carcasas de pollo fueron recolectadas al azar en los diferentes
segmentos de mercado.
El muestreo se realizó por conveniencia siguiendo el protocolo de muestreo
del proyecto WHO AGISAR, tomando en cuenta el consumo de carne de
pollo (120 millones de pollos al año) y número de habitantes en la ciudad
de Quito (2,6 millones de habitantes según el INEC) (Tabla 6).
Las muestras de carcasas de pollo entero en percha en supermercados,
mercados y tiendas se recolectaron durante 20 semanas consecutivas
tanto en el norte como sur de la ciudad de Quito. Al final de este periodo de
tiempo, la población de estudio estuvo conformada por 159 carcasas,
provenientes de 4 supermercados, 3 mercados locales y 5 tiendas del norte
y 5 al sur de la ciudad (Tabla 7).
Las carcasas tomadas en supermercados pertenecieron a 4 marcas de
pollo diferentes, mientras que en mercados y tiendas se tomaron en cuenta
pollos con marca y sin marca Las muestras se identificaron mediante
códigos alfanuméricos a la llegada al laboratorio, las mismas que luego
fueron procesadas, para lo cual se colectó un segmento de piel de 25
19
gramos, correspondiente al área pectoral de la carcasa de la cual se realizó
el aislamiento de Salmonella. Posteriormente, las muestras positivas fueron
respaldadas en Caldo Tripticasa Soya (TSB); además, a la par se realizó
un lisado celular en solución TE 1X (Tris + EDTA) para obtener el ADN que
fue utilizado para la serotipificación. Cada respaldo y lisado de ADN fue
cifrado y almacenado a -80°C y -20°C respectivamente.
Tabla 6: Muestras de carcasas de pollo recolectadas por segmentos de mercado y sectores de la ciudad
Tabla 7: Características del muestreo realizado en el estudio basado en el proyecto WHO- AGISAR.
Lugar de Muestreo Norte Sur Total
Supermercados 29 30 59
Mercados 20 20 40
Tienda 30 30 60
Total 79 80 159
Muestreo Número Observaciones
Tamaño de la muestra 159 Confianza 0.9
Número de marcas de muestreo 4 4 marcas de pollo empacado
Tiendas 10 5 Cotocollao
5 Chillogallo
Mercados 3 2 mercados (Sector Chillogallo)
Mercado Cotocollao
Muestras en supermercados 60 (35%) Dos cadenas de supermercados
Muestras en tiendas y
mercados
100 (65%) 60 muestras de tiendas
40 muestras de mercado
20
3.1.5 Manejo del estudio
3.1.5.1 Fase de Campo
La recolección de muestras se realizó mediante la adquisición de carcasas
de pollos en perchas en supermercados, tiendas y supermercados en la
ciudad de Quito. Las muestras fueron transportaron en fundas individuales
etiquetadas, manteniendo la cadena de frío hasta su llegada al laboratorio
de la Unidad de Investigación de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
y Resistencia a los Antimicrobianos (UNIETAR) de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
Se recolectaron 8 muestras cada semana a excepción de la segunda
semana, en la que se tomaron 7 muestras: 3 de supermercado, 3 de tiendas
y 2 de mercados en el norte y sur de la ciudad de Quito. Finalmente, se
incluyeron 59 muestras de supermercado, 60 de tienda y 40 de mercado.
3.1.5.2 Fase de Laboratorio
El aislamiento y serotipificación de Salmonella en carcasas de pollo en
percha se basó en la Norma ISO 6579:2007 para “Microbiología de los
alimentos para consumo humano y alimentación animal”.
a) Recolección de la muestra
Para la recolección de las muestras, por cada carcasa se cortaron 25
gramos de piel de pechuga que se colocaron en una funda de Stomacher,
en forma individual.
b) Pre-enriquecimiento no selectivo
Se agregaron 225 ml de agua peptonada a cada muestra, hasta que se
obtuvo una relación 1:10, luego se agitó la muestra en el Stomacher
durante 60 segundos, para luego incubar a 37°C por 24 horas.
c) Enriquecimiento selectivo
Después de 24 horas en incubación, se realizó el sembrado de 150 μl en 3
puntos equidistantes en el Medio Rappaport Vassiliadis semisólido
modificado (MSRV) el mismo que se incubó a 42°C por 48 horas.
21
d) Siembra en medio selectivo
Las muestras positivas al medio MSRV (presencia de halo blanco alrededor
del inóculo) se sembraron por estriación en el medio Xilosa Lisina
Desoxicolato (XLD) tomando solo la parte periférica del halo de crecimiento.
Las muestras se incubaron a 37°C por 24 horas.
e) Siembra de pruebas bioquímicas
A las 24 horas se revisó el crecimiento en el medio XLD. Si se obtuvieron
colonias con centro negro y halo rojizo, se realizaron las siguientes pruebas
bioquímicas para la identificación de Salmonella: Triple Sugar Iron (TSI),
Urea, Citrato, Lisina y Sulfide Indole Motility (SIM). Las muestras
sembradas se incubaron a 37°C por 24 horas.
Se consideró positiva a Salmonella cuando se observaron los siguientes
resultados:
• TSI: K/A producción de H2S y producción de gas.
• Urea: Negativo, sin cambio de color.
• Citrato: Negativo, sin cambio de color.
• SIM:
i. Sulfato: Positivo, producción de H2S.
ii. Indol: Negativo, se revela con reactivo de Kovacs,
formación de un anillo amarillo.
iii. Motilidad: Depende de la cepa aislada.
• Lisina: Positivo, sin cambio de color.
f) Respaldo y lisado de cepas
Las cepas consideradas positivas después de realizado todo el proceso de
identificación de Salmonella fueron respaldadas en tubos de 1.5 ml con 500
µl de TSB, las mismas que se incubaron a 37°C por 24 horas; una vez
transcurrido las 24 horas, se colocaron 1000 µl de glicerol, se homogenizó
y se almacenó en condiciones de crio congelación (-80°C).
El lisado de las cepas se realizó en un tubo de 1.5 ml con 300 µl de Tris
EDTA (TE 10X) en el cual se inoculó una cantidad de muestra tomada por
el asa, luego se agitó a 95°C por 20 minutos, para posteriormente
22
centrifugar a 13300 rpm durante 3 minutos. Se transfirieron 200 µl a otro
tubo de 1.5 ml, previamente rotulado, para ser conservado a – 20°C. Este
material genético fue utilizado para la serotipificación.
3.1.6 Serotipificación
Para la serotipificación de Salmonella se utilizaron los primers descritos en
Akiba, Mashiro y Taketoshi (2011) para S. Infantis y Enteritidis (Tabla 8 y
9). Se preparó un master mix con un volumen final de 15 µl (13 µl de master
mix + 2 µl de templado de ADN) (ANEXO 1 y 2). Posteriormente, fue
sometido al programa de amplificación específico para cada serotipo (Tabla
10).
Tabla 8: Primers utilizados y tamaño del fragmento amplificado en la
serotipificación de Salmonella Infantis
Nombre del primer Secuencia Tamaño (pb)
invAF 5′-AAACCTAAAACCAGCAAAGG 605
Invar 5′-TGTACCGTGGCATGTCTGAG 605
IMP1F 5′-GGTCATTGTCGGAAACCTGC 95
IMP1R 5′-ACATTCCCCCTTCCACTGCC 95
IMP2F 5′-CGCGAAGAAGTGCATAAACC 198
IMP2R 5′-CGCCACTTTCGTTATCTGAG 198
IMP3F 5′-ACCTACTACTATCCCTGATG
304
IMP3R 5′-GCGAATTTTGCTACTTGAAG 304
(Akiba Masato; Masahiro Kusumoto; Taketoshi Iwata, 2011).
23
Tabla 9: Primers utilizados y tamaño del fragmento amplificado en la serotipificación de S. Enteritidis.
(Akiba Masato; Masahiro Kusumoto; Taketoshi Iwata, 2011).
Tabla 10: Protocolo de amplificación de los fragmentos correspondientes para S. Infantis y Enteritidis.
3.1.7 Electroforesis
Los amplicones se identificaron en un gel de agarosa al 2%, teñidos con 1
µl de Sybr safe® por cada 10ml de la solución, con un voltaje de 100 V/ 500
mA/ durante 65 min. Los resultados se visualizaron en un transiluminador
y se documentaron en un sistema digital fotográfico.
Nombre del primer Secuencia Tamaño (pb)
invAF 5′-AAACCTAAAACCAGCAAAGG 605
Invar 5′-TGTACCGTGGCATGTCTGAG 605
EMP1F 5′-AATACAGCCTCAACCAGCTA 101
EMP1R 5′-ATTGGTTCACCCGTTGCAAT 101
EMP2F 5′-AGATAAGCCCTCCCTGCTTA 203
EMP2R 5′-CCCTCCTTTCACTGCAAGTC 203
EMP3F 5′-CCCTCCTTTCACTGCAAGTC 299
EMP3R 5′-TTTCTCCGCCTGTTTTCGTT 299
Etapa Temperatura °C Número
de ciclos
Tiempo min: seg
Desnaturalización inicial de
ADN
95 1 2:00
Desnaturalización del ADN 95
35
0:15
Hibridación de los primers 58 0:30
Extensión de la cadena 72 0:30
Elongación final 72 1 10:00
Conservación de los
amplicones
4 1 ∞
24
3.1.8 Registro y almacenamiento de datos
Los datos obtenidos al momento de realizar el muestreo, procesamiento,
aislamiento de colonias, respaldo de cepas, extracción de ADN y resultados
de PCR multiplex de las muestras de carcasas de pollo en se ingresaron
en una hoja de cálculo de Microsoft Excel® para mantener un respaldo y
realizar de manera sencilla una comparación de los resultados tanto entre
los segmentos como sectores de muestreo.
Los parámetros tomados en el muestro y procesamiento incluyeron:
número de muestra, procedencia, aislamiento, temperatura, tipo de
empaque, fecha de vencimiento e identificación molecular del serotipo de
Salmonella.
3.1.9 Análisis estadístico.
Se aplicó estadística básica descriptiva para determinar las diferencias
entre segmentos de mercado (supermercado, tienda y mercado) y sectores
de muestreo (norte y sur). Se utilizó pruebas estadísticas no paramétricas:
Chi cuadrado (X2) y Prueba Z utilizando el programa estadístico IBM®
SPSS® Statistics Versión 23.
25
CAPITULO IV
4.1 Resultados
Durante 20 semanas se tomaron 159 carcasas de pollo en 2 cadenas de
supermercados y mercados al igual que tiendas ubicadas alrededor de la
zona de muestreo en el norte y sur de la ciudad de Quito (Chillogallo y
Cotocollao). Se analizaron 159 carcasas en 20 semanas de estudio
(n=159), 79 al norte (n=29 en supermercados, n=20 en mercados y n=30
en tiendas) y 80 al sur (n=30 en supermercados, n=20 en mercados y n=30
en tiendas). Se registraron 91 muestras positivas en el aislamiento de
Salmonella, representando 57.2 % de todos los aislados.
De un total de 91 muestras positivas a Salmonella (n=91), 45 corresponden
al sector norte (n=16 supermercados, n=13 mercados y n=16 tiendas) y 46
en el sur (n=16 supermercados, n=12 en mercados y n=18 en tiendas).
(Tabla 11 y Figura 1).
Tabla 11: Muestras positivas para Salmonella en carcasas de pollo en
percha en supermercados, tiendas y mercados en las dos zonas de la
ciudad de Quito (norte y sur).
Sectores/
Segmentos
Positivos/N (%)
Supermercados Tiendas Mercados Total
Norte 16/29 (55.1%) 16/30 (53.3%) 13/20 (65%) 45/79 (56.9%)
Sur 16/30 (53.3%) 18/30 (60%) 12/20 (60%) 46/80 (57.5%)
Total 32/59 (54.2%) 34/60 (56.7%) 25/40 (62.5%) 91/159 (57.2%)
26
Figura 1: Representación en porcentajes de los resultados positivos y
negativos de Salmonella tanto en sectores de la ciudad como segmentos
de mercado. El color azul representa el porcentaje positivo, y el naranja
representa porcentajes negativos.
4.1.1 Análisis Estadístico
No se encontraron diferencias significativas tanto entre sectores de
muestreo como en segmentos de mercado. Los resultados del análisis
estadístico se muestran en las tablas 12, 13, 14, 15 y 16.
Tabla 12: Prueba de X2 para sectores de la ciudad.
Número de muestras (%)
Sector Negativo Positivo Total
p*
Norte 34 (43%) 45 (57%) 79 (49.7%)
0.537 Sur 34 (42.5%) 46 (57.5%) 80 (50.3%)
Total 68 (42.8%) 91 (57.2%) 159 (100%)
*No existe diferencia significativa entre sectores de la ciudad.
55,1% 53,3% 53,3%60%
65%60%
44,9% 46,7% 46,7% 40% 35% 40%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Norte Sur Norte Sur Norte Sur
Supermercados Tiendas Mercados
Po
rcen
taje
de
aisl
amie
nto
Segmentos de mercado
Positivos Negativos
27
Tabla 13: Prueba X2 para segmentos de mercados.
Número de muestras (%)
Segmentos Negativo Positivo Total
p*
Supermercados 27 (45.8%) 32 (54.2%) 59 (37.1%)
0.713 Tiendas 26 (43.3%) 34 (56.7%) 60 (37.7%)
Mercados 15(37.5%) 25 (62.5%) 40 (25.2%)
Total 68 (42.8%) 91 (57.2%) 159 (100%)
*No existe diferencia significativa entre segmentos de mercado.
Tabla 14: Prueba de X2 para mercados (norte y sur).
Número de muestras (%)
Localización del mercado Negativo Positivo Total
p*
Norte 7 (35%) 13 (65%) 20 (50%)
0.500 Sur 8 (40%) 12 (60%) 20 (50%)
Total 15 (37.5%) 25 (62.5%) 40 (100%)
*No existe diferencia significativa entre mercados y sectores de muestreo
(norte y sur).
Tabla 15: Prueba de X2 para supermercados (norte y sur).
Número de muestras (%)
Localización del
supermercado
Negativo Positivo Total
p*
Norte 13 (44.8%) 16 (55.2%) 29 (49.2%)
0.548 Sur 14 (46.7%) 16 (53.3%) 30 (50.8%)
Total 27 (45.8%) 32 (54.2%) 59 (100%)
*No existe diferencia significativa entre supermercados y sectores de
muestreo (norte y sur).
28
Tabla 16: Prueba de X2 para tiendas (norte y sur).
Número de muestras (%)
Localización de
tiendas Negativo Positivo
Total
p*
Norte 14 (46.7%) 16 (53.3%) 30 (50%)
0.397 Sur 12 (40%) 18 (60%) 30 (50%)
Total 26(43.3%) 34 (56.7%) 60 (100%)
*No hay diferencias significativas entre tiendas y sectores de muestreo
(norte y sur).
4.1.2 Serotipificación
De 91 aislados de Salmonella, 98.9 % (90/91) corresponden a Salmonella
Infantis con bandas específicas de 605, 95, 198 y 304 (pb)
correspondientes a InvA, IMP1, IMP2 e IMP3 respectivamente (Figura 2).
El 1.1 % (1/91) de aislados de Salmonella generaron resultados positivos
para Salmonella Enteritidis con bandas específicas de 605, 101,203 y 299
pb correspondientes a InvA, EMP1, EMP2 y EMP3 respectivamente.
Figura 2: Representación de dos muestras y el control positivo de la
amplificación de los fragmentos InvA, IMP1, IMP2 e IMP3 en el gel de
agarosa, correspondientes a Salmonella Infantis.
29
4.2 Discusión
El objetivo del presente estudio fue aislar y serotipificar Salmonella en
carcasas de pollo en percha en supermercados, mercados y tiendas. La
prevalencia de Salmonella en carcasas de pollo en percha fue de 57.2%
(n=159). En otros países de Latinoamérica se han encontrado prevalencias
menores que van del 2.7 al 34.3% (Donado-Godoy et al., 2012; Jarquin et
al., 2015; Molina, Milan, & Araque, 2010; Nunes Medeiros, Nunes de
Oliveira, Prazeres Rodrigues, & Coradi de Freitas, 2011). Sin embargo,
investigaciones realizadas en México 63% (n=76) y Japón 54% (n=100)
determinaron prevalencias similares a la presente investigación (Furukawa
et al., 2017; Rodríguez Ceniceros et al., 2016). Por otro lado, Estados
Unidos y Europa han publicado estudios con prevalencias del 4.2% (n=212)
y 4.85% (n=36.079) de Salmonella en pollo en percha (EFSA & ECDC,
2017; Zhao et al., 2001).
Las diferencias en las prevalencias de Salmonella en diferentes regiones
pueden estar relacionadas a factores de riesgo como el nivel de
industrialización e higiene en el momento de la manipulación de las
carcasas (Donado-Godoy et al., 2012; Realpe-Delgado et al., 2016;
Rodríguez Ceniceros et al., 2016). Los procesos de escaldado, desplume,
eviscerado y despresado están implicados en los altos índices de
contaminación en carcasa relacionados a la falta de higiene (Realpe-
Delgado et al., 2016).
En esta investigación no se detectaron diferencias estadísticamente
significativas tanto en los segmentos de mercado como en los sectores
norte y sur de la ciudad. Estudios realizados en Colombia, Vietnam y China
tampoco presentaron diferencias entre segmentos de mercado
corroborando de esta manera nuestros hallazgos (Donado-Godoy et al.,
2012; Ta, Yen T. Nguyen et al., 2012; Yang et al., 2011). Sin embargo
Jarquín et., al (2015) notificó en Guatemala diferencias entre segmentos de
mercado. Estas diferencias podrían estar relacionada a factores de riesgo
como la manipulación de la carcasa al momento de la venta, temperaturas
30
de conservación y la presencia o falta de empaque de la carcasa en los
sitios de expendio (Yang et al., 2011). Es importante indicar que aunque
no exista diferencia significativa en los aislamientos de Salmonella, si se ha
reportado diferencias significativas en otras bacterias causantes de ETAs y
asociadas a Salmonella como Escherichia coli y Campylobacter (Furukawa
et al., 2017; Lucas, Morales Cauti, Salazar Jiménez, Eslava Campos, &
Alvarado, 2016; Realpe-Delgado et al., 2016). También hay que tomar en
cuenta que la sensibilidad (1 UFC en 25 gramos) y el carácter cualitativo
de la prueba de diagnóstico de Salmonella no permite identificar diferencias
cuantitativas entre carcasas con diferentes niveles de contaminación
(Gonzalez et al., 2014).
La prevalencia de Salmonella Infantis en carcasas de pollo representó el
98.9% (n=91). El serotipo reportado es el mismo encontrado a lo largo de
la cadena productiva de pollos broiler en nuestro país (Villagomez, 2015;
Vinueza, 2017). Es importante considerar que alrededor del 90% de la
producción de pollo broiler en Ecuador proviene de integraciones avícolas
(Vinueza, 2017). Esto podría estar relacionado con la alta prevalencia de
este serotipo en las carcasas de pollo estudiadas.
Otros países mencionan serotipos diferentes. Así, Estados Unidos indican
a los serotipos Enteritidis, Newport y Typhimurium como los más
prevalentes (Marder et al., 2017). Por otro lado, en varios países de Europa
S. Enteritidis y S. Typhimurium son los serotipos más frecuentemente
aislados (EFSA & ECDC, 2017). De igual manera, varios estudios
realizados en Latinoamérica han identificado otros serotipos de Salmonella.
Es así que en Guatemala y Colombia identificaron a S.Paratyphi B y S.
Heidelberg como serotipos más prevalentes (Donado-Godoy et al., 2012;
Jarquin et al., 2015) mientras que en Venezuela S. Heidelberg se reportó
con más frecuencia (Molina et al., 2010). Sin embargo, en Perú, el Servicio
Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) en 2014, describió a S. Infantis
como el serotipo más prevalente en granjas de carne (91%;n=140)
(Valderrama, Pastor, Mantilla, & Ortiz, 2014). Tomando en cuenta que
31
nuestro país ha realizado importación de huevos fértiles y pollitos Bb en los
últimos años (MINAGRI, 2015), podríamos suponer que la epidemiología
de S. Infantis en Ecuador y Perú están relacionadas. Sin embargo, estudios
complementarios son necesarios para verificar esta hipótesis.
La presente investigación es la primera realizada en Ecuador en la cual se
determina la presencia de Salmonella en carcasas de pollo en percha. Este
estudio servirá de línea base para identificar y evaluar factores de riesgo
asociados a la contaminación de Salmonella en pollos en percha.
32
CONCLUSIONES
• Se identificó la presencia de Salmonella en carcasas de pollo en
percha, obteniendo de esta manera una prevalencia de 57.2%,
• Se aisló un total de 35.1 % de Salmonella en las carcasas de pollo
en supermercados, 37.4% en tiendas y 27.5% en mercados,
concluyendo de esta manera la presencia de Salmonella en todos
los segmentos de mercado.
• El serotipo más prevalente en carcasas de pollo en percha fue
Infantis con el 98.9 %, el mismo que ha sido reportado en toda la
cadena productiva en nuestro país.
33
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ANEXOS
Anexo 1: Protocolo de PCR Multiplex de Salmonella Infantis.
Salmonella Infantis Multiplex Fecha: Volumen Final (µl): 15 Número de muestras: 10
Reactivo VF
Mastermix (µl)
C. inicial C. final Volumen para una reacción
VOLUMEN TOTAL DE MASTERMIX (µl)
cantidad unidad cantidad unidad cantidad unidad
Agua 30,25 - - 3,025 µl 30,25
Template 2 µl 20
Buffer 30 5 x 1 x 3 µl 30
dNTP Mix 6 10 mM 0,4 mM 0,6 µl 6
MgCl2 15 25 mM 2,5 mM 1,5 µl 15
invAF 7,5 10 µM/µl 0,5 µM 0,75 µl 7,5
invAR 7,5 10 µM/µl 0,5 µM 0,75 µl 7,5
IMP3 F 7,5 10 µM/µl 0,5 µM 0,75 µl 7,5
IMP3 R 7,5 10 µM/µl 0,5 µM 0,75 µl 7,5
IMP1 F 4,5 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 4,5
IMP1 R 4,5 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 4,5
IMP2 F 4,5 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 4,5
IMP 2 R 4,5 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 4,5
Taq 0,75 5 U/µl 0,025 U/µl 0,075 µl 0,75
Total 15 µl 150
PCR Programa Reacción Muestra Resultados
N° ciclos Temperatura °C Tiempo min:seg 1
1 95 2:00 2
35
95 0:15 3
58 0:30 4
72 0:30 5
1 72 10:00 6
1 12 ∞ 7 Control +
8 Control -
1µl Syber Safe/10ml TAE 0,5
2 µl ladder+ 3µl Dye 6X
10 µl de muestra
X65 minutos
Agarosa 2%
43
Anexos 2: Protocolo PCR Multiplex Salmonella Enteritidis.
Salmonella Enteritidis Multiplex Fecha: Volumen Final (µl): 15 Número de muestras: 5
PCR Programa Reacción Muestra Resultados
N° ciclos Temperatura °C Tiempo min:seg 1
1 95 2:00 2
35
95 0:15 3
58 0:30 4
72 0:30 5
1 72 10:00 6
1 12 ∞ 7 Control +
8 Control -
1µl Syber Safe/10ml TAE 0,5
2 µl ladder+ 3µl Dye 6X
10 µl de muestra
X65 minutos
Agarosa 2%
Reactivo VF
Mastermix (µl)
C. inicial C. final Volumen para una reacción VOLUMEN TOTAL DE
MASTERMIX (µl)
cantidad unidad
cantidad unidad
cantidad unidad
Agua 15,90 - - 3,18 µl 15,9
Template 3 µl 15
Buffer 15 5 x 1 x 3 µl 15
dNTP Mix 3 10 mM 0,4 mM 0,6 µl 3
MgCl2 7,5 25 mM 2,5 mM 1,5 µl 7,5
invAF 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
invAR 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP2F 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP2R 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP1F 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP1R 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP3F 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
EMP3R 2,25 10 µM/µl 0,3 µM 0,45 µl 2,25
Taq 0,6 5 U/µl 0,04 U/µl 0,12 µl 0,6
Total 15 µl 75
44
Anexos 3: Esquema de identificación de Salmonella.
25 gramos de piel de carcasas de pollo
Agitar en el Stomacher por 60 segundos. Incubar a 37°C por 24 horas.
Sembrar 150 µl de la muestra incubada en el agar MSRV
POSITIVA Formación de un halo blanco
alrededor del inóculo)
NEGATIVA
Tomar una asada del extremo del halo y sembrar
POSITIVA (Presencia de colonias
transparentes con centro negro)
NEGATIVA
Incubar por 24 a 48 horas a 42°C
Incubar de 24 - 48h
a 37°C
PRUEBAS
TSI Urea
Indol
Lisina
Incubar a 37°C por 24 horas
NEGATIVA
POSITIVA
AUTOCLAVAR
Tomar dos asadas desde TSI y
colocarlos en un tubo epperdorff
con 500 µl de TSB
Incubar a 37°C por 24 horas
Adicionar 1000 µl de glicerol y
guardar los tubos a -80°C
TSI K/A+G
Urea (-)
Indol
(-)
Lisina (+)
Adicionar en relación 1/10 agua peptonada tamponada. Agregando 225 ml.
45
Anexos 4: Tabla de resultados.
Muestra ID
Sector o zona de Muestreo
Tipo de Muestra (Origen)
Tipo de Minoreo Resultado
(1/0) Serotipo/Especie
U113s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U114s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Enteritidis
U115s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U116s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U117s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U118s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U119s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U120s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U121s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U122s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U123s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U124s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U125s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U126s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U127s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U218s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U219s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U220s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U221s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U222s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U223s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U224s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U225s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U633s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U634s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U635s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U636s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U637s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U638s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U639s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U640s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U651s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U652s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U653s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U654s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U655s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U656s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U657s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U658s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U663s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U664s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U665s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U666s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U667s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
46
U668s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U669s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U670s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U676s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U677s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U678s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U679s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U680s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U681s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U682s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U683s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U687s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U688s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U689s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U690s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U691s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U692s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U693s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U694s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U709s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U710s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U711s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U712s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U713s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U714s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U715s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U716s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U720s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U721s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U722s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U723s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U724s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U725s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U726s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U727s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U756eb Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U757s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U758s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U759s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U760s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U761s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U762s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U763s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U766s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U767s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U768s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U769s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U770s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
47
U771s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U772s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U773s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U802s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U803s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U804s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U805s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U806s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U807s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U808s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U809s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U812s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U813s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U814s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U815s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U816s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U817s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U818s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U819s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U856s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U857s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U858s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U859s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U860s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U861s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U862s Norte Piel de Carcasas MERCADO 0
U863s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U867s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U868s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U869s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U870s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U871s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U872s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U873s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U874s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U879s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U880s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U881s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U882s Norte Piel de Carcasas TIENDA 0
U883s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U884s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U885s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U886s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U893s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U894s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U895s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U896s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U897s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
48
U898s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U899s Sur Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U900s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U970s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U971s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U972s Norte Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U973s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U974s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U975s Norte Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U976s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U977s Norte Piel de Carcasas MERCADO 1 S. Infantis
U983s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U984s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 0
U985s Sur Piel de Carcasas SUPERMERCADO 1 S. Infantis
U986s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U987s Sur Piel de Carcasas TIENDA 0
U988s Sur Piel de Carcasas TIENDA 1 S. Infantis
U989s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
U990s Sur Piel de Carcasas MERCADO 0
49
Anexos 5: Toma de muestras de carcasas
Muestreo en mercado Muestreo en supermercado
Fuente: La autora Fuente: La autora
Toma de temperatura
Fuente: La autora
50
Anexos 6: Procesamiento de carcasas.
Toma muestra de piel Dilución en agua peptonada Fuente: La autora Fuente: La autora
Medio MSRV positivo
Fuente: La autora Medio XLD positivo
Fuente: La autora
Respaldo y lisado de cepas.
Fuente: La autora
51
Anexos 7: Procesamiento de lisados y serotipificación.
Termobloque para lisados
Fuente: La autora
Preparación de Máster Mix
Fuente: La autora
Adición de ADN
Fuente: La autora
Termociclador
Fuente: La autora
Resultados con transiluminador
Fuente: La autora
52
Anexos 8: Evidencia fotográfica de PCR realizados para serotipificación.