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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICACIÓN DE Salmonella enterica DE INTERÉS ZOONÓSICO
SEROVARIEDADES Enteritidis, Typhimurium e Infantis EN POLLO BEBE
DE UN DÍA DE EDAD EN UN SISTEMA PRODUCTIVO DE POLLO DE
ENGORDE EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA.
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de
Médico Veterinario Y Zootecnista.
AUTOR:
Diego Alexander Melo Durán
TUTORA:
Dra. María Belén Cevallos MSc.
Quito, 30 de Marzo, 2015
ii
DEDICATORIA
A mi Madre por su amor incondicional y esfuerzo diario por sus hijos.
A mi Padre por enseñarme a perseguir mis sueños hasta alcanzarlos, por
compartirme su visión de vida y ayudarme a generar la mía.
A mis hermanos por todo el apoyo otorgado a lo largo del arduo camino para
conseguir esta meta.
A Sandra por su amor, apoyo y paciencia durante estos años juntos.
Diego Melo Duran
iii
AGRADECIMIENTO
A toda mi familia por la confianza, apoyo y amor puesto en mí durante todo el
camino recorrido.
Al Dr. Marco Cisneros por la oportunidad, sus conocimientos y su confianza
durante este periodo.
A mi tutora la Dra. María Belén Cevallos por la oportunidad, sus enseñanzas
y el apoyo durante la elaboración de este trabajo.
A todos los integrantes del Laboratorio de Bacteriología y del Proyecto ETAS
de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Central; Dr.
Christian Vinueza, Dr. Carlos Gómez, Marquito, Vero, Cris por su ayuda
incondicional.
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ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO pp LISTA DE CUADROS ................................................................................................................. viii
LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................................... ix
RESUMEN ...................................................................................................................................x
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ................................................................................................................................ 2
EL PROBLEMA ............................................................................................................................ 2
Planteamiento del Problema ................................................................................................ 2
Justificación ........................................................................................................................... 4
Objetivos ............................................................................................................................... 7
CAPÍTULO II ............................................................................................................................... 8
MARCO TEÓRICO ...................................................................................................................... 8
Antecedentes de la investigación ......................................................................................... 8
Fundamentación Teórica ...................................................................................................... 9
CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 34
METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 34
Determinación de Métodos a utilizar ................................................................................. 34
Diseño de la investigación................................................................................................... 34
CAPÍTULO IV ........................................................................................................................... 43
RESULTADOS ........................................................................................................................... 43
Presentación de Resultados ................................................................................................ 43
Discusión de Resultados ..................................................................................................... 45
CAPÍTULO V............................................................................................................................. 49
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.................................................................................. 49
Conclusiones ....................................................................................................................... 49
Recomendaciones ............................................................................................................... 50
REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS ............................................................................................... 51
ANEXOS ................................................................................................................................... 57
viii
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Serotipos y su prevalencia según el reporte 2012 del CDC y ECDC ......................... 3
Cuadro 2. Clasificación científica de Salmonelosis ................................................................. 10
Cuadro 3. Especies de Salmonella y enfermedades que causan en seres humanos y pollos 12
Cuadro 4. Proceso de producción primaria y puntos de control ................................................
................................................................................................................................................ 16
Cuadro 5. Esquema de Kauffmann-White de los serotipos Enteritidis, Typhimurium e Infantis
................................................................................................................................................ 31
Cuadro 6. Número de muestras por semana y total de papeles tomados en el muestreo .. 35
Cuadro 7. Proporcion de aves representadas en el pool de diez papeles ............................. 36
Cuadro 8. Registro de Resultados aglutinación en placa y tubo ........................................... 42
Cuadro 9. Resultados Obtenidos. ........................................................................................... 45
ix
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Tasas de incidencia y notificaciones de fiebre enterica y salmonelosis en
diferentes partes del mundo .................................................................................................... 14
Gráfico 2. Puntos criticos de contaminación de Salmonella .................................................... 17
Gráfico 3. Estructuras antigenicas de la superficie de Salmonella ........................................... 21
Gráfico 4. Esquema de infección por Salmonella spp. ............................................................. 22
Gráfico 5. Resutado de Muestras Positivas. ............................................................................. 43
Gráfico 6. Resultados de Granjas Positivas. .............................................................................. 44
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICACIÓN DE Salmonella enterica DE INTERÉS ZOONOSICO SEROVARIEDADES Enteritidis, Typhimurium e Infantis EN POLLO BEBE DE UN DÍA DE EDAD EN UN SISTEMA PRODUCTIVO DE POLLO DE ENGORDE EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA
Autor: Diego Alexander Melo Duran Tutora: Dra. María Belén Cevallos M.Sc.
Fecha: 30 de Marzo, 2015
RESUMEN
La salmonelosis es una enfermedad entérica en seres humanos, que en la mayoría de casos se asocia a los serotipos de la especie Salmonella enterica, los principales serotipos identificados han sido Enteritidis, Typhimurum e Infantis como agentes causales de esta enfermedad, siendo las aves el principal reservorio de estas bacterias. El objetivo de este estudio fue aislar y tipificar serológicamente S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis en papel de las cajas de transporte de los pollos de un día de edad de una empresa productora de pollos de engorde en la provincia de Pichincha, Ecuador, mediante métodos microbiológicos y serológicos. Durante la recepción de los pollitos de un día de edad en las granjas de engorde se tomó 10 papeles de las cajas de transporte. Finalizado las 9 semanas de muestreo, se obtuvo 28 muestras. Las muestras fueron pre-enriquecidas, enriquecidas de forma selectiva y aisladas según la norma ISO 6579. De las 28 muestras 1 (3,6%) fueron positivas a Salmonella spp. Los resultados de la tipificación serológica para identificar las especies de S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis fueron: negativos para las tres especies esperadas mas se logró determinar que la cepa pertenece al Grupo D del esquema de Kauffmann-White. Este estudio realizó el aislamiento de Salmonella mediante la toma de los papeles de las cajas de transporte y el uso de la norma ISO 6579 método de monitoreo que permitió alcanzar los objetivos planteados. Motivo por el cual otros estudios que permitan obtener más datos sobre, la contaminación de Salmonella en pollos de un día de edad así como los distintos puntos de contaminación de los sistemas productivos de pollo de engorde en el Ecuador deben ser realizados.
Descriptores:
Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis/ pollos de un día de edad/
Pichincha/ aislamiento/ serotipificación.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICATION Salmonella enterica ZOONOTIC INTEREST, SEROVARS Enteritidis Typhimurium and Infantis IN BABY CHICKS OF A OLD DAY IN A PRODUCTION SYSTEM OF BROILER IN THE PROVINCE OF PICHINCHA. ABSTRACT Salmonellosis is an enteric disease in humans, which in most cases is associated with serotypes of Salmonella enterica species, major serotypes have been identified Enteritidis and Infantis Typhimurum as causative agents of this disease, being the main birds these bacteria reservoir. The aim of this study was to isolate and characterize serologically S. Enteritidis, S. Typhimurium and S. Infantis paper boxes transport of chickens a day old a producer of broilers in the province of Pichincha, Ecuador, by microbiological and serological methods. While receiving chicks day-old broiler farms in 10 papers transport boxes was taken. I completed 9 weeks of sampling, 28 samples were obtained. The samples were pre-enriched, selectively enriched and isolated according to standard ISO 6579. Of the 28 samples 1 (3.6%) were positive for Salmonella spp. The results of serological typing to identify the species of S. Enteritidis, S. Typhimurium and S. Infantis were negative for all three species expected but it was determined that the strain belongs to Group D of the Kauffmann-White scheme. This study performed the isolation of Salmonella by taking the roles of carrying cases and the use of ISO 6579 monitoring method that allowed achieve the objectives. Why other studies to learn more about the contamination of Salmonella in broiler day old and the different points of contamination of production systems broiler in Ecuador must be performed.
KEYWORDS
Salmonella Enteritidis, Typhimurium and Infantis / one-day-old-chicks / Pichincha / isolation / serotyping.
1
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos del género Salmonella son bacilos, Gran negativos,
anaerobios facultativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y
causantes de la salmonelosis, enfermedad infecciosa del hombre y los
animales (OIE, 2008), considerada una de las enfermedades de transmisión
alimentaria (ETA) más común y ampliamente extendida, que cada año
provoca decenas de millones de casos en todo el mundo. La gravedad de la
enfermedad depende de factores propios del huésped y de la cepa de
Salmonella en cuestión (OMS, 2013).
Una amplia gama de productos alimenticios se reconocen como posibles
fuentes de infección de Salmonella humana, pero los productos de aves de
corral han sido identificados como la vía de transmisión más importante
(Kimura et al., 2004).
La gran mayoría de las infecciones producidas por Salmonella en los seres
humanos son causadas por los serotipos S. Enteritidis y S. Typhimurium. Los
serotipos de Salmonella y la prevalencia pueden variar considerablemente
entre localidades, distritos, regiones y países (OIE, 2010). Así el caso de S.
Infantis que se encuentra principalmente en las parvadas de granjas de
pollos de engorde en Europa y por lo tanto, la vigilancia y la identificación de
los serotipos prevalentes en los humanos y las aves de corral deben llevarse
a cabo para desarrollar un programa de control de la zona (Miller et al.,
2010).
El presente estudio aplicó las técnicas microbiológicas y de serotipificación
establecidas en el laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia para la identificación de Salmonella enterica
serovariedades Enteritidis, Typhimurium e Infantis en pollos bebe de un día
de edad en un sistema productivo de pollo de engorde en la Provincia de
Pichincha.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
La salmonelosis es una enfermedad gastrointestinal provocada por la
infección con Salmonella, se produce al ingerir productos alimentarios
contaminados por la bacteria y puede afectar al hombre como a los animales
(OIE, 2008). El reporte del Centro de Control y Prevención de Enfermedades
de los Estados Unidos del año 2012, indica que Salmonella es la ETA de
origen bacteriano de mayor prevalencia en este país, con un 20% del total de
reportes de enfermedades transmitidas por los alimentos (CDC, 2014). En
cuanto a la Unión Europea Salmonella ocupa el segundo lugar dentro de las
ETAs con 28% del total de reportes (ECDC, 2014).
Alimentos contaminados que sirven como fuente de la infección por
Salmonella en humanos incluyen huevos de mesa, seguido de cerca por la
carne de cerdo, mientras que los riesgos asociados con pollos y carne de
pavo son similares entre si y representan una fuente importante (ECDC,
2014). De acuerdo con Van Pelt et al. (1999), citado por Rasschaert (2007),
la carne de ave produce el 21% de la salmonelosis humana en el mundo.
En la Unión Europea y los Estados Unidos, S. Enteritidis y S. Typhimurium
son los serotipos más frecuentemente asociados con la enfermedad humana,
mientras que S. Infantis se encuentra en cuarto y séptimo lugar en
importancia de casos reportados respectivamente (ECDC; CDC, 2014) esto
se muestra en el Cuadro 1.
3
Cuadro 1. Serotipos y su prevalencia en el último reporte del CDC y ECDC.
SEROTIPO LUGAR
CDC % USA
LUGAR
ECDC % EU
S. ENTERITIDIS 1 14.5 1 41.3
S. TYPHIMURIUM 2 11.6 2 22.1
S. INFANTIS 7 2.3 4 2.5
Tomado de: ECDC, 2014: CDC, 2014.
Elaboración: El Autor
La contaminación de las aves de corral o de la carne de aves de corral se
puede producir a lo largo de toda la cadena de producción y factores de
riesgo importantes para la contaminación en cada etapa de este proceso han
sido identificados, la transmisión vertical de Salmonella de las parvadas de
reproductores y la contaminación del pollo de un día en la planta de
incubación a menudo se ha informado y ha sido implementado como
principal factor de control en muchos programas de erradicación (Heyndrickx
et al., 2003).
La salmonelosis es una de la zoonosis más frecuente a nivel mundial, una de
sus principales causas es el consumo de carne de pollo contaminada (ECDC,
2014), se ha considerado que uno de los posibles factores de riesgo y punto
crítico de control son los pollos bebe, ya que pueden ser el origen de la
contaminación con Salmonella del sistema productivo, sea por la posible
transmisión vertical por parte de los reproductores, contagio en la incubadora
o exposición en cualquier proceso previo a su llegada a la granja de engorde,
consideramos de gran interés su estudio, sobre todo al no existir en Ecuador
trabajos previos sobre la Identificación de Salmonella enterica de interés
zoonósico serovariedades Enteritidis, Typhimurium e Infantis, en pollo bebe
de un día de edad en los sistemas productivos de pollo de engorde.
4
Justificación
La Salmonelosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria de
las más comunes y ampliamente extendidas. Se estima que afecta
anualmente a decenas de millones de personas en todo el mundo y provoca
más de cien mil defunciones (OMS, 2013).
En la actualidad se han identificado más de 2 500 cepas diferentes (llamadas
“serotipos” o “variantes séricas”) de Salmonella spp., es una bacteria ubicua
y resistente que puede sobrevivir varias semanas en un entorno seco, y
varios meses en agua (OMS, 2013).
La infección por Salmonella se origina, por lo general, a través de
contaminantes secundarios de los alimentos, de origen animal y ambiental o,
frecuentemente, como consecuencia de la infección subclínica en animales
de abasto que provoca la contaminación de la carne, los huevos y la leche o
la contaminación secundaria de frutas y verduras que se han fertilizado o
regado con desechos orgánicos (OIE, 2008).
Una amplia gama de productos alimenticios se reconocen como posibles
fuentes de infección de salmonelosis humana, pero los productos de aves de
corral han sido identificados como la vía de transmisión más importante
(Kimura et al., 2004).
Históricamente a nivel mundial se ha determinado que la enfermedad
humana causada por la infección con Salmonella entérica serotipo Enteritidis
aumentó en todo el mundo de manera temprana a mediados de la década de
1970 y, para 1990, este serotipo fue desplazado por la Salmonella entérica
serotipo Typhimurium como la causa principal de la salmonelosis en el
mundo (Baumler et al., 2000).
A nivel europeo se establece el control respecto a S. Enteritidis y S.
Typhimurium de las explotaciones de más de 250 aves y de las incubadoras.
5
De acuerdo con la legislación adicional, S. Virchow, S. Infantis y S. Hadar
también se someterán a controles especiales (Unión Europea - Directiva de
Zoonosis, 2006).
Se ha determinado que los principales reservorios para Salmonella Infantis
son las poblaciones animales y sobre todo las aves de corral. Una encuesta
de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) en 2007 indica
que S. Enteritidis y S. Infantis se encuentran principalmente en las parvadas
de granjas de pollos de engorde en Europa (Miller et al., 2010).
La contaminación de las aves de corral o de la carne de las aves de corral se
puede producir a lo largo de toda la cadena de producción y los factores de
riesgo importantes para la contaminación en cada etapa de este proceso han
sido identificados (Heyndrick et al., 2003).
El reporte de la transmisión vertical de Salmonella desde ponedoras a
huevos comerciales y desde reproductoras a pollos bebe ha sido
implementado como un factor principal de control en muchos programas de
erradicación (Rasschaert et al., 2008).
Esta investigación se realizó en una empresa productora de pollo de
engorde, la cual necesita incluir en su plan de control de enfermedades, el
monitoreo de los pollos bebe que llegan a las granjas, buscando comprobar
la ausencia o presencia de Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis ya
que es uno de los posibles factores de riesgo de contaminación del sistema
productivo, radicando aquí la relevancia de este estudio.
La realización de este trabajo permitirá obtener datos sanitarios de
Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis, cepas zoonóticas
consideradas de alta importancia por su prevalencia a nivel mundial en las
explotaciones avícolas.
6
La información generada permitirá a las empresas la toma de decisiones de
control y erradicación de Salmonella en su sistema de producción, así
también tiene relevancia para los consumidores del producto garantizándoles
la mejora en la inocuidad del mismo, mediante la obtención de un producto
cárnico terminado que cumple con los requisitos sanitarios de estar libre de
Salmonella según la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1338:2010 Segunda
Revisión.
7
Objetivos
En el presente estudio se planteó los siguientes objetivos:
General
Identificar Salmonella enterica de interés zoonósico
serovariedades Enteritidis, Typhimurium e Infantis en pollo bebe
de un día de edad en una empresa productora de pollo en la
Provincia de Pichincha.
Específicos
o Identificar mediante cultivo bacteriológico y de enriquecimiento
Salmonella spp. en muestras de papel de transporte con heces
fecales de pollo bebe en una empresa productora de pollo de
engorde en la Provincia de Pichincha.
o Serotipificar cepas de Salmonella enterica serovariedades
Enteritidis, Tiphymurium e Infantis, obtenidas mediante cultivo,
por medio del esquema de Kauffman-White.
8
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes de la investigación
En el Ecuador el Ministerio de Salud Pública ha reportado dentro de las
enfermedades transmitidas por agua y los alimentos, en el año 2001 un total
de 18.772 casos, periodo desde el cual el número ha ido disminuyendo
paulatinamente con 3.286 casos en el 2008 (MSP/EPI, 2008).
En los últimos años la Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica del
Ministerio de Salud Pública del Ecuador reporta, dentro del monitoreo
nacional semanal que realiza, un total de 2793 casos en el año 2013 y 3373
casos confirmados en el año 2014 (MSP, 2014).
En Ecuador se han realizado pocos estudios sobre el aislamiento de
Salmonella en productos de origen animal, y los que existen son
principalmente en huevos comerciales (Sánchez, 2013; Estrada & Valencia,
2012).
En cuanto a carcasas de pollo como posible alimento contaminado con
Salmonella se encuentran estudios en marcha con resultados que evidencian
porcentajes importantes de Salmonella en dicho producto, uno de ellos
determina una prevalencia de Salmonella en la provincia de Pichincha de
8,45% en carcasa de pollo (Balseca et al., 2014).
En Ecuador no existen estudios publicados sobre la evaluación de los puntos
críticos de contaminación de la cadena de producción de pollos de engorde.
9
Dentro de este campo, la consideración de los pollos bebe como origen del
ingreso de la bacteria a la cadena productiva, que se verá reflejado en un
producto terminado contaminado. Convirtiéndose así en un posible reservorio
y fuente de transmisión para las personas, de esta manera es necesaria la
implementación de investigaciones que permitan tener una base de datos
actualizada sobre dichos puntos críticos.
Fundamentación Teórica
Historia de la Salmonella
En el año 1874, William Budd fue el primero en relacionar que las fiebres
tifoideas habían sido transmitidas por el agua y los alimentos. Salmonella
typhi, agente etiológico de la fiebre tifoidea fue descubierta en el año 1880
por Eberth y el microorganismo fue aislado en 1884 por Gaffky (Ledermann,
2003).
La Salmonella fue descrita inicialmente por Theobald Smith y por Daniel
Salmon en 1885 durante una investigación sobre el cólera porcino, publicado
en el segundo reporte anual del Bureau of Animal Industry de la USDA en
Estados Unidos y fue el bacteriólogo francés Joseph Léon Marcel Ligniéres
en 1900 el que sugirió que el grupo de todas estas bacterias se denominaran
Salmonellas (Trepat, 2002).
El género Salmonella se divide en dos especies: S. enterica (que comprende
seis subespecies) y S. bongori. Más del 99% de Salmonella spp. que afectan
a los humanos corresponden a S. enterica subespecie enterica (Bell &
Kyriakides 2001).
Según la (ICMSF) Comisión Internacional de Especificaciones
Microbiológicas para los Alimentos (1996), el primer aislamiento de
laboratorio que confirmó el brote de una ETA provocada por salmonelosis, se
vieron implicados 57 personas que comieron carne de animal enfermo.
10
Salmonella Enteritidis fue aislada de los órganos de una de las personas
fallecidas así como de la carne y la sangre del animal.
Taxonomía de Salmonella
La Salmonella es un género de bacteria perteneciente a la familia de las
Eubacteriáceas, hasta el presente se han identificado más de 2.500 cepas
diferentes (llamadas “serotipos” o “variantes séricas”) de Salmonella spp.
dicho género consta de sólo dos especies, S. bongori de bajo impacto
zoonósico y que afecta especialmente a los reptiles y S. enterica, que se
divide en seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae, indica. (Hoelzer et al., 2011; OMS, 2013).
Se ha propuesto también una supuesta tercera especie, S. subterranea, tras
el aislamiento de una única cepa ambiental poco usual (OIE, 2008).
Cuadro 2. Clasificación científica de Salmonella
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Salmonella
Tomado de: Diagnostico microbiológico de Koneman 6ta edición Elaboración: El Autor
Morfología
Las bacterias del género Salmonella son bacilos flagelados anaerobios
facultativos, bacterias Gram negativas que miden aproximadamente 2-3 x
0,4-0,6 micras de tamaño (Pui et al., 2011).
Las Salmonellas no son exigentes, ya que se pueden multiplicar en diversas
condiciones ambientales fuera de los hospedadores. No requieren cloruro
sódico para el crecimiento, pero pueden crecer en presencia de 0,4 a 4%. La
11
mayoría de los serotipos de Salmonella crecen a una temperatura desde los
5 hasta los 47 °C, con una óptima temperatura de 35 a 37 °C, pero algunos
pueden crecer a temperaturas tan bajas como 2 a 4°C o tan alto como 54 °C
(Gray & Fedorka-Cray, 2001).
Son sensibles al calor y a menudo mueren a una temperatura de 70 °C o
más. Salmonella puede crecer en un rango de pH de 4 a 9 con el óptimo
entre 6,5 y 7,5. Requieren alta actividad de agua (aw) entre 0,99 y 0,94 (aw
agua pura = 1,0) todavía pueden sobrevivir en aw <0,2 como en los alimentos
secos. La inhibición completa del crecimiento se produce a temperaturas <7 °
C, pH <3,8 o actividad de agua <0,94 (Pui et al., 2011).
Epidemiología
Salmonella spp. son microorganismos ubicuos geográfica y zoológicamente,
algunos serotipos son relativamente específicos de un hospedador (S.
Dublin-ganado; S. Typhisuis-porcina; S. pullorum-aves), mientras que otros,
sobre todo S. Typhimurium, S. Anatum, y S. Newport, afecta amplia gama de
hospedadores entre los que pájaros salvajes y roedores juegan un papel
importante en la difusión inter especie de la infección (Scott et a., 2009).
El grado de adaptación a los anfitriones varía entre los serotipos de
Salmonella y determina la patogenicidad. Los serotipos adaptados a los
humanos, tales como S. Typhi y S. Paratyphi A, B, C, causan fiebre tifoidea
sistémica. Estos serotipos no son patógenos para el animal. Del mismo
modo, S. Gallinarum y S. Abortusovis, que son específicamente adaptados a
las aves de corral y ovinos, respectivamente, son los responsables de las
infecciones sistémicas graves en estos animales. Sin embargo, S.
Choleraesuis, para el que los cerdos son los huéspedes primarios, también
causa una enfermedad sistémica grave en los seres humanos. Serotipos
ubicuos, como S. Enteritidis o S. Typhimurium, generalmente causan
infecciones gastrointestinales en los seres humanos, pero puede inducir a
otras enfermedades en los animales (Hoelzer et al., 2011).
12
S. enterica subespecie enterica es un importante problema de salud pública y
económico en todo el mundo e incluye más de 1.500 serotipos, que a pesar
de su alta similitud genética varían enormemente en su gama de huéspedes
y evolución de la enfermedad que van desde la enteritis a la fiebre tifoidea
que constituyen un grupo amplio y complejo (Wiedemann et al., 2015).
Los largos períodos de infección subclínica y convalescencia aseguran de
forma generalizada la distribución de los microrganismos sin control. Brotes
clínicos están correlacionados con los estados inmunes deprimidos, como en
los animales recién nacidos (por ejemplo, terneros y potros) animales adultos
bajo estrés, vacas recién paridas, equinos sometidos a cirugía y cerdos con
enfermedades virales sistémicas (Scott et al., 2009).
Cuadro 3. Especies de Salmonella y enfermedades que causan en seres
humanos y pollos.
SEROTIPOS ENFERMEDAD
EN HUMANOS
ENFERMEDAD EN
POLLOS
Salmonella Typhi Fiebre tifoidea No produce enfermedad
Salmonella Paratyphi Fiebre
paratifoidea No produce enfermedad
Salmonella Gallinarum No produce
enfermedad Tifoidea aviar
Salmonella Pollorum No produce
enfermedad Pullorosis
Salmonella Enteritidis Salmonelosis Paratifoidea aviar
(salmonelosis)
Salmonella Typhimurium Salmonelosis Paratifoidea Aviar
(Salmonelosis)
Salmonella Infantis Salmonelosis Paratifoidea Aviar
(Salmonelosis)
Tomado de: Barrow, 2000; OMS, 2010; OIE, 2008 Elaboración: El Autor
13
Distribución geográfica y reservorios
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales
causada por microorganismos de las dos especies de Salmonella, aunque
fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella está muy
distribuida en el ambiente y se encuentra con frecuencia en las aguas
residuales humanas, de granjas de producción y en cualquier material con
contaminación fecal. En todos los países existe salmonelosis, pero parece
ser más prevalente en áreas de producción animal intensiva, especialmente
de aves y cerdos (OIE, 2008).
La enfermedad en los mamíferos se produce después de la ingestión de
agua o alimentos contaminados. La infección por Salmonella de los animales
y los seres humanos depende de la capacidad de las bacterias para
sobrevivir a las duras condiciones del tracto gástrico antes de entrar en el
epitelio intestinal y, posteriormente, la colonización de los ganglios linfáticos
mesentéricos (Rosselin et al, 2011).
Los animales pueden contaminar directamente a las plantas o las aguas
superficiales, utilizadas para la irrigación y diluyentes de pesticidas o
fertilizantes, a través de las heces contaminadas (Wiedemann et al., 2015).
Una amplia gama de productos alimenticios se reconocen como posibles
fuentes de infección de Salmonella humana, pero los productos de aves de
corral han sido identificados como la vía de transmisión más importante.
(Kimura et al., 2004)
14
Figura 1. Tasas de incidencia y la notificación de fiebre entérica y
salmonelosis en diferentes partes del mundo.
Tomado de: Pui et al., 2011
Un total de 92.916 casos de salmonelosis fueron reportados por los 27
miembros de la Unión Europea, con 91.034 casos confirmados, dando una
tasa de notificación en la UE de 22,2 casos por 100.000 habitantes. Las
tasas de notificación más altas, en 2012, fueron reportados por la República
Checa y Eslovaquia (≥85 casos por 100.000) mientras que, las tasas más
bajas se registraron por Portugal, Grecia y Rumanía (≤4 por 100.000). La
proporción de casos nacionales frente a los casos asociados con el viaje
varió notablemente entre los países, con la mayor proporción de casos
relacionados con los viajes,> 70%, en los países nórdicos, Finlandia, Suecia
y Noruega. Las tasas de hospitalización más altos se registraron en Grecia,
Rumania, Chipre y Portugal (73-91% de los casos hospitalizados) (ECDC,
2014).
Estados Unidos (2005)
notificaciones
Salmonelosis: 13.6 por
cada 100.000 habitantes
(Hendriksen, 2010)
Noruega (2006) notificaciones
Salmonelosis: 39.1 por cada
100.000 habitantes (Norwegian
Institute of Public Health, 2007)
Pakistán (2008)
notificaciones
Fiebre Tifoidea:
451.7 por cada
100.000
habitantes
(Kothari et al.,
2008)
China (2008)
notificaciones
Fiebre Tifoidea:
15.3 por cada
100.000
habitantes
(Kothari et al.,
2008)
Vietnam (2008)
notificaciones
Fiebre Tifoidea:
21.3 por cada
100.000
habitantes
(Kothari et al.,
2008)
Unión Europea (2007)
notificaciones Fiebre
Tifoidea: 34.4 por cada
100.000 habitantes
(ECDC, 2009)
Singapur (2006)
notificaciones
Salmonelosis: 4.7 por
cada 100.000
habitantes (Ministerio
de Salud de Singapur,
2009) Sur África (2006)
notificaciones
Salmonelosis: 1.9 por
cada 100.000
habitantes (Hendriksen,
2010)
Indonesia (2008)
notificaciones Fiebre
Tifoidea:81.7 por cada
100.000 habitantes
(Kothari, 2006)
Nueva Zelanda (2009)
notificaciones
Salmonelosis:26.2 por
cada 100.000
habitantes (ESR, 2009)
India (2008)
notificaciones Fiebre
Tifoidea: 214.2 por cada
100.000 habitantes
(Kothari et al., 2006)
Malasia (2006)
notificaciones Fiebre
Tifoidea: 0.77 por cada
100.000 habitantes
(Hamdan et al., 2006)
Australia (2006)
notificaciones Fiebre
Tifoidea: 0.32 por cada
100.000 habitantes
(Queen et al., 2006)
California (2006)
notificaciones Fiebre
Tifoidea: 0.21 por cada
100.000 habitantes
(CDPH, 2008)
15
En Estados Unidos Salmonella fue la segunda enfermedad notificada, que
representa 106 (25%) brotes y 3366 (33%) casos. Entre los 101 brotes
confirmados de los 106 reportados se informaron los siguientes serotipos, S.
Enteritidis fueron los más frecuentes (26 brotes, 26%), seguido por S.
Typhimurium (13,13%), S. Newport (10, 10%), S. Javiana (7,7%), y S.
Heidelberg (6, 6%) (CDC, 2014).
A nivel nacional ya se ha señalado, en los últimos años la Dirección Nacional
de Vigilancia Epidemiológica del Ministerio de Salud Pública del Ecuador
reporta, dentro del monitoreo nacional semanal que realiza, un total de 2793
casos en el año 2013 y 3373 casos confirmados en el año 2014, en lo que
respecta al 2015 los casos reportados en el mes de enero son 26 (MSP,
2015).
Transmisión
Salmonella está ampliamente distribuida en la naturaleza y sobrevive en una
variedad de alimentos. Aves de corral, los huevos y los productos lácteos son
los vehículos más comunes de la salmonelosis en humanos (Bouchrif et al.,
2009).
El medio ambiente contaminado con Salmonella sirve como la fuente de
infección debido a que Salmonella puede sobrevivir en el medio ambiente por
un largo tiempo. Después de eso, la Salmonella se transmite a vectores
como ratas, moscas y aves donde Salmonella puede eliminarse en sus
heces durante semanas e incluso meses. Tras la transmisión directa,
moviéndose animales tales como porcinos, vacas y pollos actúan como el
factor de riesgo importante para la infección. Estos reservorios animales se
infectan por vía oral debido a Salmonella normalmente se origina en el
ambiente y piensos contaminados. El Humano se infecta al comer o beber
agua y alimentos contaminados con Salmonella a través de reservorios
animales. Sin embargo, Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A no tienen
reservorio animal, por lo tanto, la infección se puede pasar al consumir los
16
alimentos inadecuadamente manejados por individuos infectados (Newell et
al., 2010).
Las células de Salmonella pueden adherirse a las superficies en contacto
con alimentos tales como la tabla de cortar (plástico) en la que se puede
desarrollar un biofilm, y por lo tanto causar contaminación cruzada. En
consecuencia, la Salmonella puede entrar en la cadena alimentaria en
cualquier punto de la alimentación del ganado, a través de la fabricación de
alimentos, procesamiento y venta al por menor, así como la preparación de
comidas y alimentos en el hogar (Pui et al., 2011).
En cuanto a las aves la transmisión puede ser horizontal en los criaderos y
en la granja durante el período de cría, es en ciertos casos de mayor
importancia y conduce al aislamiento de una mayor variedad de serotipos de
Salmonella. La contaminación de los productos avícolas puede ocurrir a
través de toda la cadena de producción, pero hasta ahora, la mayoría de los
estudios se han centrado en la producción primaria. Varios factores de riesgo
de contaminación por Salmonella se han identificado en la granja, la
contaminación de los equipos en la planta de incubación, un pobre nivel de
higiene en la granja, la presencia de roedores e insectos en la granja,
limpieza inadecuada entre la rotación de parvadas y contaminación de la
alimentación y el agua potable (Rasschaert et al., 2007).
Cuadro 4. Proceso de producción primaria y puntos de control.
1. Manejo parvada abuelos
2. Transporte de huevos a la incubadora de reproductores
3. Incubadora reproductores
4. Transporte de pollos de un día de edad para las granjas de
reproductores
17
5. Manejo de parvada de reproductores
6. Transporte de huevos hacia la incubadora
7. Incubadora
8. Transporte de pollos de un día de edad para las granjas de
engorde
9. Manejo pollos
10. Despoblar (total o parcial)
11. Transporte al matadero
Fuente: Directrices para el control de y Salmonella en la carne de pollo, 2011.
Elaboración: El Autor.
La transmisión vertical de Salmonella de las parvadas de los reproductores
hacia el pollo de un día de edad a menudo se ha informado y ha sido
implementado como principal factor de control en muchos programas de
erradicación (Heyndrickx et al., 2002).
Figura 2. Puntos críticos de contaminación de Salmonella
Tomado de: A Salmonella Control Program CID LINES
Granja de Engorde
Cama del Galpón
Granja de engorde
Alimento y Agua
Pollitos de un Día
Pollos
Eliminación de la Mortalidad
El Hombre
Transporte
Granja de Engorde
Vectores
18
Patogenia y Factores de Virulencia
La Infección por Salmonella requiere diferentes etapas: fijación y adhesión a
las superficies de los hospedadores, y la producción de factores bacterianos,
que facilitan la invasión, la multiplicación inicial, y la capacidad de superar los
mecanismos de defensa del huésped (Wiedemann et al., 2015).
Adhesión a las superficies de los hospedadores
Uno de los primeros acontecimientos cruciales en la colonización exitosa por
Salmonella es la adherencia a los tejidos. Dos pasos se pueden distinguir en
el proceso de adhesión: una adhesión inicial que es reversible seguido por
una unión apretada que depende de factores bacterianos y que es
irreversible (Cevallos et al., 2012.). Este primer contacto es decisivo para la
infección del hospedador. En los animales, la adhesión bacteriana ocurre
cuando Salmonella interactúa con las células eucariotas antes de la invasión
o cuando las bacterias inician la formación del biofilm sobre superficies de
acogida, tales como el epitelio intestinal o cálculos biliares. Para adherirse
fuertemente a las superficies, serotipos de Salmonella utilizan varios
componentes de la superficie, dependiendo de la superficie a la que van a
adjuntar. Las diferentes estructuras adhesivas de Salmonella y su papel en la
interacción de Salmonella con los animales y las plantas (Wiedemann et al.,
2015).
Estructuras fimbriales
Las fimbrias son apéndices superficiales proteicos de 0,5-10 micras de
longitud y 2-8 nm de ancho, que tiene, en su parte distal, una proteína que
interactúa con su receptor de acogida. De este modo se da la mediación de
la adhesión de las bacterias a los hospedadores o superficies inertes. En la
actualidad son más de 10 operones fimbriales los que han sido identificados
en los genomas de Salmonella y el número y tipo de estos operones
fimbriales dependen del serotipo. Debido a las dificultades encontradas para
estudiar las fimbrias, su respectivo receptor de células y tipos celulares
específicos en sus hospedadores animales, las fimbrias son conocidas en
19
sólo pocos serotipos. La fimbria Tipo I, que contribuye a la colonización
intestinal del ratón, cerdo y pollo, se caracteriza por hemaglutinación,
aglutinación de levadura, y la unión a células eucariotas que expresan el
receptor α-D-manosa (Van Asten & Van Dijk, 2005).
Según Barak et al., (2007), citado en Wiedemann et al., (2015), algunas
fimbrias también contribuyen a la formación de biopelícula en los animales y
las plantas, sobre todo la fimbria curli. Se requiere estos tipos de fimbrias
para la formación de biopelícula en las células epiteliales intestinales y
superficies de pollo.
Adhesinas no fimbriales
Dos tipos de adhesinas no fimbriales se han descrito en Salmonella de
acuerdo con su vía de secreción: PABA y SIIE son secretadas por un sistema
de secreción de tipo 1; mientras que, ShdA, MisL, y SadA son de
autotransporte también conocidos como sistemas de secreción de tipo V (W).
PABA (386 kDa) y SIIE (595 kDa) son las mayores proteínas de Salmonella y
comparten las características de tener numerosos dominios de tipo
inmunoglobulina bacterianos. Los genes que codifican estas dos proteínas
están muy conservadas entre los serotipos de PABA ha demostrado estar
involucrado en la formación de biopelícula en S. Enteritidis (Wiedemann et
al., 2015).
Islas de patogenicidad
Salmonella spp, consta de cinco islas de patogenicidad, tres contienen genes
de virulencia (Marcus et al., 2000).
SPI-1: implicado en la penetración inicial de la bacteria a las células.
Codifica el sistema de secreción tipo III. Media a determinantes que
tienen que ver con la invasión de células del hospedero no fagocíticas
y apoptosis de macrófagos. Está presente en Salmonella bongori y
todas las especies de Salmonella enterica (Hensel, 2004; Ochoa et al.,
2005). Cuenta con dos genes:
20
o InvA gen: de invasión del tejido epitelial del intestino en
humanos y animales.
o Stn: causa efecto teratóxico en células epiteliales.
SPI-2: importante para los siguientes estadios de la infección
sistémica; se relaciona con la capacidad de la bacteria de sobrevivir
dentro de los macrófagos y de multiplicarse dentro de SVCs en los
fagocitos y en células eucariotas. Consta de 32 genes que regulan la
supervivencia y replicación bacteriana en los compartimentos
intracelulares de fagocitos y células epiteliales (Hensel, 2004).
SP1 – SPI2 están codificados por islas de patogenicidad distintas, que
juegan papeles diferentes pero importantes.
SPI-3: relacionada con la supervivencia intracelular en macrófagos.
Provee productos esenciales para el crecimiento en condiciones
limitadas de Mg2 (Hensel, 2004).
SPI- 4: no se tiene información tan detallada de estas islas. Se cree
participa en la adaptación de Salmonella al ambiente intracelular en
los macrófagos (Ochoa et al., 2005).
SPI-5: Codifica proteínas SPI1-SPI2; las proteínas efectoras
involucradas en la secreción fluida y reacción inflamatoria en la
mucosa intestinal (Ochoa et al., 2005) como: SopB (Fosfatasa
implicada en el desencadenamiento de la secreción de fluidos que
resulta en síntomas de diarrea) (Hensel, 2004).
Plásmidos de virulencia de Salmonella
Muchos serovares de Salmonella albergan plásmidos de virulencia
importantes para la infección sistémica de los animales de experimentación
después de la inoculación oral. El plásmido de virulencia de Salmonella varía
en tamaño, dependiendo del serovar: 95kb para S. Typhimurium; 60kb para
S. Enteritidis; 80kb para S. Dublin; y que van desde 50 hasta 110 kb para S.
21
Choleraesuis. La región spv parece promover la supervivencia y el
crecimiento rápido de la Salmonella en el hospedador, lo que aumenta la
virulencia. Sin embargo, varios grupos han estudiado el papel de spv in vitro
en los macrófagos, y no encontró ninguna relación entre la expresión de
genes spv y supervivencia intracelular. Por lo tanto, el papel del plásmido de
virulencia de Salmonella es más complejo de lo pensado y espera un mayor
estudio (Wiedemann et al., 2015).
Otras estructuras
Los flagelos y LPS son factores bacterianos cuya función principal es la de
mediar en la adhesión. Los flagelos confieren la motilidad, la quimiotaxis y el
estímulo de la respuesta inmune innata del hospedador (Wiedemann et al.,
2015). Los LPS son un componente principal de la membrana externa de la
mayoría de las bacterias Gram-negativas, y los protege de compuestos
tóxicos, tales como antibióticos o sales biliares. LPS están compuestos de
tres partes: el lípido A, que está incrustado en la membrana bacteriana, el
oligosacárido de núcleo, y lo más externo, el antígeno O. También es una
endotoxina responsable de shock séptico en los hospedadores animales y,
como flagelos que estimula la respuesta inmune innata (Marcus et al., 2000).
Las estructuras características de salmonella se pueden observar en el
Grafico 3.
Grafico 3. Estructuras antigénicas de la superficie de Salmonella.
Tomado de: Laboratórios TECLIMZA
Inv Apéndice de
Adherencia de Superficie
Codificado
()
Antígeno Capsular
(Vi)
Entero-toxina
(Diarrea)
()
Citotoxinas
()
Sideroforos
()
Endotoxinas
LPS
()
Proteínas Anti-
fagociticas
()
Fimbria Tipo 1
(adherencia)
()
Antígeno O
()
Flagelo
(Movilidad
Antígeno H)
()
22
Invasión
En los animales, Salmonella ha desarrollado diferentes mecanismos para
inducir su propia internalización en diferentes tipos de células con el fin de
sobrevivir, multiplicarse y propagarse a través del hospedador El sistema
centisome 63 se encarga de la secreción (SST3-1) codificada por Salmonella
isla de patogenicidad 1 (SPI1) que media invasión de las células epiteliales
por Salmonella entérica. Hasta hace poco, se asumió que Salmonella podría
entrar en las células utilizando su T3SS-1. Sin embargo, investigaciones
recientes han demostrado que la infección por Salmonella puede ocurrir
independientemente de la T3SS-1 (Rosselin et al., 2011).
Grafico 4. Esquema de infección por Salmonella spp.
Tomado de: Cossart et al., 2000
Multiplicación
Inicialmente se creía que la infección por Salmonella empezaba con la unión
de la bacteria al íleon y luego penetraba el intestino a través de la célula M,
sin embargo estudios determinaron que primero la infección se produce en el
intestino delgado y en parte del colon, especialmente la región cercana al
recto, según las últimas observaciones hechas en humanos y monos
23
Rhesus. En estudios con monos Rhesus, todo parece indicar que la entrada
del microorganismo se asocia más con las microvellosidades de los
enterocitos que con las células M, además la bacteria se puede encontrar en
los enterocitos varios días después de la infección. Este hecho demora la
entrada de la bacteria al torrente sanguíneo, permitiendo la acción de los
macrófagos activados para eliminar la bacteria. Los sistemas de secreción
tipo III, son un grupo de organelos especializados de los microrganismos
Gram negativos, cuya finalidad es la de introducir al citosol de las células
eucariótas proteínas efectoras que desequilibran la función celular
(Wiedemann et al., 2015; Marcus et al., 2000).
Síntomas
Humanos
Los resultados de la exposición a Salmonella spp. no tifoideas puede variar
desde no tener efecto, al colonizar el tracto gastrointestinal sin síntomas de
enfermedad (infección asintomática), o la colonización con los síntomas
típicos de la gastroenteritis aguda. Síntomas de gastroenteritis generalmente
son leves y pueden incluir dolor abdominal, náuseas, diarrea, fiebre leve,
vómitos, deshidratación, dolor de cabeza y / o postración. El período de
incubación es de 8 a 72 horas (generalmente 24-48 horas) y los síntomas
duran 2-7 días (OMS / FAO 2002). La enfermedad grave como la septicemia
a veces se desarrolla, sobre todo en personas inmunodeprimidas. Esto
ocurre cuando Salmonella spp. entra en el torrente sanguíneo, dando lugar a
síntomas como fiebre alta, letargo, dolor abdominal y torácico, escalofríos y
anorexia; pudiendo ser fatal. Un pequeño número de individuos al desarrollar
una condición crónica puede presentar secuelas como la artritis, la
apendicitis, meningitis o neumonía, como consecuencia de la infección.
Salmonella spp. se elimina en grandes cantidades en las heces de las
personas infectadas en el inicio de la enfermedad. En el caso de las
enfermedades no tifoideas, la excreción de la bacteria continúa durante
aproximadamente 4 semanas después de la enfermedad en adultos y 7
24
semanas en los niños. Se estima que el 0,5% de las personas con
salmonelosis no tifoidea se convierten en portadores a largo plazo y
continúan excretando la bacteria en forma permanente (OMS / FAO, 2002;
FDA, 2012).
Aves
Los signos clínicos y patológicos no son patognomónicos. Los signos se
asemejan a los de la pullorosis. Las lesiones macroscópicas incluyen yemas
coaguladas, hígado, bazo y ampollas cecales congestionados y con focos
necróticos. En la infección por S. Enteritidis, pericarditis y poliserositis
también son comunes. La artritis también puede ser una de las secuelas.
Para un diagnóstico completo el organismo debe ser aislado. Serología en
las aves, dependiendo de la edad, también puede ser indicativo (Barrow,
2000).
En las aves se puede presentar síntomas clínicos producidos por
Salmonellas Enteritidis y Tiphymurium (Paratifosis aviar), o como portadores
asintomáticos eliminando a través de las heces fecales al patógeno siendo
foco de contagio para la parvada, instrumental, materiales y equipos de los
galpones. Los síntomas que presentan las aves, van de acuerdo al serotipo
de Salmonella spp; y en lo que concierne a las cepas móviles: S. Enteritidis
generalmente no produce sintomatología clínica convirtiendo a las aves en
portadores asintomáticos. Pueden existir síntomas de manera ocasional:
depresión, anorexia, diarrea (OIE, 2008).
Las especies de Salmonella que afectan a las aves en ocasiones pueden
infectar a los ovarios, oviducto y huevo, y se transmite verticalmente a la
progenie (Poppe, 1999). Salmonella Enteritidis se puede transmitir a los
huevos a través de la infección oviducto que resulta en la contaminación de
la albúmina y contaminación de los huevos durante su formación (Desmidt et
al., 1997). También existe la posibilidad de que los huevos se contaminan
25
después de la formación de la cáscara contaminado por el contacto con las
heces en la cloaca o el medio ambiente (OIE, 2008).
En pollos bebe las lesiones observadas son: pericarditis fibrinosa,
aerosaculitis, perihepatitis, onfalitis, peritonitis e impactación cecal, sumando
a la sintomatología las diarreas profusas (Calnek et al., 2000). Las ponedoras
infectan a los huevos por vía ovárica, el huevo al contaminarse se daña, está
descolorido y congestionado. Este tipo de aves, al estar más expuestas al
estrés eliminan un mayor número de Salmonellas, contaminando en mayor
grado a los huevos (Parra et al., 2002).
Técnicas de Diagnóstico de Salmonella spp.
Aislamiento e Identificación de la bacteria
Los métodos estandarizados internacionalmente reconocidos para el
diagnóstico han sido bien documentados. La confirmación bacteriológica de
la infección debe utilizar métodos estándar. Estos pueden implicar una etapa
de pre-enriquecimiento en agua peptonada tamponada para mejorar la
viabilidad, seguido de enriquecimiento selectivo en medios líquidos tales
como selenito o caldos de tetrationato o medio MSRV. Medios de placas
estándar incluyen agar verde brillante y sus varias modificaciones y agar
desoxicolato. Las bacterias deben ser identificadas bioquímica y
serológicamente (Barrow, 2000).
Toma y Transporte de Muestra
Las muestras tomadas de las heces y meconio en los papeles de transporte
de las aves recibidas en la empresa se deben transportar de forma aséptica
y en temperaturas entre 2 y 4°C, siendo 25 gramos de papel con heces y
meconio suficiente para la detección de Salmonella spp. empleando la norma
ISO 6579. Las muestras se pueden procesar no más de 3 días después de la
toma de muestra (Larsen et al., 2014).
26
Aislamiento de Salmonella spp.
Existen muchos métodos para aislar Salmonella que son de uso universal.
Las técnicas y medios de cultivo con los mejores resultados en una situación
diagnóstica concreta dependen de una variedad de factores que incluyen el
tipo de Salmonella, el origen y tipo del ejemplar, la experiencia del
microbiólogo y la disponibilidad de medios de enriquecimiento selectivo y de
medios selectivos en placas (OIE, 2008; ISO 6579, 2007). Todos los medios
de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y permitir el
crecimiento del microorganismo sospechoso a partir de un inóculo pequeño.
El establecimiento progresivo de programas para la garantía externa de la
calidad, ha impulsado la utilización creciente de métodos estándar como la
norma ISO 6579:2002; que en los últimos años se ha elaborado y evaluado
como método estándar para la detección de Salmonella en la industria de
producción animal. Lo esencial del método estándar es el pre-
enriquecimiento en agua de peptonada tamponada, el enriquecimiento en
Rappaport–Vassiliadis (MSRV) semi-sólido modificado y el aislamiento en
agar xilosa-lisina-dexosicolato (XLD) (OIE, 2008; De Zutter et al., 2013).
Medios de pre-enriquecimiento
El número de salmonelas es normalmente bajo en las heces de los animales
asintomáticos, en muestras ambientales, en los alimentos para el ganado y
en los alimentos, por lo que es necesario utilizar medios de pre-
enriquecimiento para facilitar el aislamiento, como el agua de peptona
tamponada o el caldo universal de pre-enriquecimiento. Esto puede permitir
que un escaso número de Salmonellas se multipliquen sin que mueran por
los efectos tóxicos de los medios de enriquecimiento, o puede ayudar a la
recuperación de las que presentan daños subletales, como los debidos a la
congelación, el calentamiento, la exposición a las substancias microbicidas o
a la desecación.
27
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento son medios líquidos o semisólidos que
contienen substancias que permiten el crecimiento selectivo de las
Salmonellas a la vez que inhiben el crecimiento de otras bacterias. Algunos,
sin embargo, son también relativamente tóxicos para algunos serotipos de
Salmonella, por ejemplo, el selenito inhibe S. Cholerasuis, y el colorante
verde brillante es tóxico para muchas cepas de S. Dublin. También se han
utilizado las temperaturas elevadas para aumentar la selectividad del medio
de enriquecimiento. En algunos laboratorios se utiliza una temperatura de
43°C, aunque con algunos medios puede resultar inhibidora; por ejemplo, los
medios de tetrationato y de Rappaport–Vassiliadis inhiben las cepas
termosensibles, especialmente S. Dublin, y ahora se recomienda 41.5°C para
incubación en el medio semi-solido de Rappaport–Vassiliadis establecido en
la norma ISO 6579, 2002 / Amd 2007.
También se puede emplear el enriquecimiento selectivo por movilidad para
aumentar la sensibilidad del aislamiento de Salmonella y la utilización de
medios de enriquecimiento semisólidos, como MSRV o medio semisólido
para el diagnóstico de Salmonella (DIASALM), que pueden proporcionar
mayor sensibilidad. La composición del medio, que puede variar de un
proveedor a otro, o incluso en algunos casos de un lote a otro, la temperatura
y la duración de la incubación, y el volumen de las muestras utilizadas como
inóculo del medio, pueden servir para influir en la tasa de aislamiento, y se
deben tener siempre en cuenta estas variables. Ejemplos de medios
selectivos de enriquecimiento son el de tetrationato sódico, como en el caldo
de Muller–Kauffman, los caldos con selenito F, con selenito cisteína, con
verde brillante y el medio semisólido de Rappaport–Vassiliadis. Se pueden
añadir a los medios selectivos substancias como la Ferrioxamina E para
mejorar el aislamiento de Salmonella en muestras con limitación de hierro o
de nutrientes como los huevos, el agua o el suelo, o pueden añadirse
28
antibióticos para mejorar el aislamiento de las cepas resistentes a los
antimicrobianos.
Medios selectivos en placa
Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un
crecimiento diferencial en varios aspectos. Inhiben el crecimiento de
bacterias distintas a Salmonella y suministran información sobre algunas de
las principales características bioquímicas diferenciales, normalmente la
incapacidad de fermentar de la lactosa y la producción de sulfuro de
hidrógeno (H2S). Los resultados se obtienen después de 24 y 48 horas de
cultivo a 37°C. En dichos medios Salmonella forma colonias características
que son distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la
posible excepción de Proteus, Pseudomonas y Citrobacter. En ocasiones, se
pueden aislar Salmonellas fermentadoras de la lactosa y la producción de
sulfuro de hidrogeno puede ser variable. Se pueden detectar de modo más
eficaz tales cepas atípicas cuando se utilizan medios selectivos semisólidos.
Con respecto a esto, el medio DIASALM es particularmente útil ya que se
puede realizar una confirmación provisional por aglutinación en porta
utilizando antisueros polivalentes anti-O, anti-H o específicos, con líquido de
la zona de crecimiento de la placa. Salmonella Abortusovis es un serotipo de
crecimiento lento, y es normal incubar las placas durante 72 horas y utilizar el
medio no selectivo de agar-sangre. Ejemplos de medios selectivos sólidos
son el agar verde brillante, el agar xilosalisina-desoxicolato, el agar
desoxicolato/citrato, el agar Rambach, y el agar sulfito de bismuto, aunque
en la literatura y en los catálogos de medios pueden encontrarse muchos
más. Actualmente se dispone de una amplia variedad de medios sólidos.
Muchos de estos pueden servir de ayuda para la diferenciación entre
colonias sospechosas, pero deben ser validados para las matrices de
muestra, los sistemas de cultivo, y la gama de serotipos utilizados, ya que,
bajo ciertas condiciones, la sensibilidad puede ser pobre.
29
Identificación de colonias sospechosas
Las colonias sospechosas se subcultivan en medios sólidos selectivos y no
selectivos para asegurar la ausencia de posibles contaminantes como
Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las colonias
sospechosas se pueden probar por aglutinación en porta con sueros
polivalentes para la tipificación de Salmonella. En algunos casos, la colonia
sospechosa puede no aglutinar o autoaglutinar y es necesario entonces
utilizar pruebas bioquímicas para confirmar la identificación. Estas pruebas
se pueden realizar con azúcares en agua peptonada o con sistemas
comerciales (tales como el sistema Índice de Perfil Analítico [API]), la prueba
OBIS o en medios compuestos (tales como el agar triple azúcar-hierro [TSI]).
En caso de existir colonias aisladas se puede proceder a la confirmación
bioquímica inoculando directamente del medio selectivo en Agar TSI, Lisina,
Indol y Agar Urea.
(OIE, 2008; ISO 6579, 2002)
Identificación de especies de Salmonella
Se usan y comercializan numerosos métodos alternativos de detección de
Salmonella. Estos incluyen métodos basados en la conductancia/impedancia
eléctrica, en la separación inmunomagnética (IMS), en los
enzimoinmunoensayos (ELISA), métodos de la PCR con sondas génicas,
incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos
(NASBA) y en la PCR en tiempo real o cuantitativa. Muchos de estos
métodos no han sido validados para muestras fecales y ambientales, y
resultan más adecuados para el análisis de alimentos humanos. Los
métodos rápidos suelen ser más costosos que los cultivos convencionales,
pero pueden resultar económicamente viables para analizar materiales
donde se espera una prevalencia baja de contaminación o donde los
materiales, como los alimentos, están pendientes de una prueba negativa.
Un método de enriquecimiento/IMS en combinación con un ELISA o PCR
puede proporcionar resultados en 24 horas (OIE, 2010; ISO 6579, 2002).
30
Serotipificación
El Esquema de Kauffmann-White clasifica Salmonella según tres principales
determinantes antigénicos compuestas de antígenos H flagelar, antígenos O
somáticos y virulencia (Vi) antígenos capsular K, la fórmula de kaffmann-
white de los serotipos en estudio se muestra en el Cuadro 5. Este fue
adoptado por la Asociación Internacional de Microbiólogos en 1934. La
aglutinación de anticuerpos específicos para los diversos antígenos O se
emplea para agrupar salmonelas en las 6 serogrupos: A, B, C1, C2, D y E.
Por ejemplo, S. paratyphi A , B, C y S. Typhi expresa O antígenos de los
serogrupos A, B, C1 y D, respectivamente. Más del 99% de las cepas de
Salmonella causan infecciones en humanos pertenecen a Salmonella
enterica subespecie enterica. Aunque no es común, la reactividad cruzada
entre antígenos O de Salmonella y otros géneros de enterobacterias sí
ocurren. Por lo tanto, la clasificación adicional de los serotipos se basa en la
antigenicidad de los antígenos H flagelares que son altamente específicos
para Salmonella (Pui et al., 2011).
Cuadro 5. Esquema de Kauffman-White serotipos Enteritidis, Typhimurium e
Infantis.
SEROTIPO ANTÍGENO O ANTÍGENO DE FLAGELO H
Fase 1 Fase 2
S. Enteritidis 1, 9, 12 gm -
S. Typhimurium 1, 4, 5, 12 i 1, 2
S. Infantis 6, 7, 14 r 1, 5
Fuente: Caffer 2012
Elaboración: El Autor
Prevención
Exclusión Competitiva
En las aves de corral, la susceptibilidad a la infección por Salmonella puede
reducirse notablemente mediante un tratamiento oral o en aerosol – antes de
31
su exposición al microorganismo (es ideal en la eclosión del huevo) – con un
cultivo de microflora anaeróbica del ciego, que inhibe la colonización de
Salmonella, ocupando los sitios de la colonización intestinal, produciendo
ácidos y otras sustancias inhibidoras y estimulando las respuestas inmunes
generalizadas de tipo local y mucosal. En algunos países este tratamiento se
utiliza con frecuencia, pero en otros solo se emplea como ayuda para
descontaminar granjas con infección persistente. También es útil minimizar la
alteración de la flora intestinal tras el tratamiento microbiano o el estrés y
potenciar el efecto de las vacunas administradas a continuación. Al igual que
ocurría con el tratamiento que disminuye la prevalencia o las cantidades de
microorganismos de Salmonella excretados por grupos de animales
infectados, puede ocurrir alguna interferencia con programas de vigilancia y
puede tener que ajustarse el muestreo y la sensibilidad de la prueba para
compensar ese inconveniente (OIE, 2008).
Vacunación
Se utilizan muchas vacunas inactivadas contra la salmonelosis causada por
serotipos diferentes en varias especies animales, incluyendo una vacuna
combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium para el empleo en aves. La
inactivación se realiza normalmente por calentamiento o por tratamiento con
formalina y se suele utilizar un adyuvante, como el hidróxido de aluminio. En
varios países también se han utilizado vacunas vivas; estas incluyen las
cepas semi-rugosas, tales como la 9R para la tifosis aviar. Otras vacunas
atenuadas incluyen mutantes autotróficos y “de deriva metabólica”, que se
usan en Alemania para evitar infecciones por Salmonella en animales de
granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis y S. Typhimurium en aves de
corral. Se han desarrollado vacunas mutantes, atenuadas racionalmente por
supresión de genes mediante técnicas de biología molecular, para aves de
corral y para otras especies; estas comprenden los mutantes aroA y las
cepas con mutaciones en los genes que codifican la adenilato ciclasa (cya) y
la proteína receptora del adenosín monofosfato cíclico (crp), disponibles en
32
los EE.UU. Normalmente, en Europa no se permite el uso de vacunas con
microorganismos genéticamente modificados (OIE, 2008).
Uso de Antibióticos
Los antibióticos se utilizan para fines quimioterapéuticos y promotores del
crecimiento. Esto es eficaz, pero produce efectos secundarios adicionales, a
saber, la selección de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos y
promover la transferencia in vivo de resistencia a los antibióticos y, en
algunos casos, el aumento de la colonización intestinal y la excreción fecal
de Salmonella. Por tanto, estos aspectos negativos se deben considerar
cuando se utilizan estos productos químicos para el tratamiento de aves de
corral que pueda estar infectado con Salmonella (Barrow, 2000).
La administración de antibióticos en pollos de un día de edad y en ovo junto
con las vacunas recombinantes se ha generalizado a nivel mundial como una
práctica para el control de posibles infecciones que pueda provocar dicho
estrés después del nacimiento, más se debe recordar que el uso de los
antibióticos no es preventivo sino curativo, sumado al uso de antibióticos de
alta gama utilizados en medicina humana para infecciones complicadas deja
abierta la posibilidad de agotar el uso de los mismos en humanos; es así
que, el uso de los antibióticos en la industria del Reino Unido, según el
Consejo Avícola Británico, el uso de cefalosporinas de tercera y cuarta
generación no se usa en la cadena cárnica avícola debido a la importancia
que tienen para los seres humanos para evitar el riesgo de que las bacterias
desarrollen resistencia contra ellas.
Tratamiento
La aplicación temprana del tratamiento es fundamental para su éxito.
Existen dos tratamientos:
Sintomático, como por ejemplo, rehidratación del animal.
33
Específico con antibióticos para los animales ya enfermos, siendo
recomendable realizar un antibiograma de la Salmonella, debido a las
frecuentes resistencias y multirresistencias y al riesgo de prolongar el
estado de portador.
La evolución de las cepas resistentes a los antimicrobianos comúnmente
usados es un problema de preocupación significativo en veterinaria y en
salud pública. En aves el tratamiento antibiótico es de eficacia limitada en
aves, ya que se trata de una enfermedad de fácil cronificación y que produce
portadores asintomáticos (WHO, 2005).
34
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Determinación de Métodos a utilizar
Tipo de investigación
El tipo de investigación del cual se sustentó el presente proyecto es
observacional no probabilístico.
Diseño de la investigación
En el presente proyecto se utilizó un diseño transversal descriptivo, porque
no se manipuló deliberadamente las variables. Este estudio permitió
identificar Salmonella enterica de interés zoonósico serovariedades
Enteritidis, Typhimurium e Infantis en pollo bebe de un día de edad en una
empresa productora de pollo en la Provincia de Pichincha.
Descripción de la zona de estudio
El estudio se realizó en un empresa productora de pollo de engorde de la
Provincia de Pichincha, la misma cuenta con quince granjas distribuidas en
las parroquias de: San Antonio de Pichincha, Puembo, Amaguaña,
Pomasqui, Guayabamba y Nanegalito pertenecientes al cantón Quito y en las
parroquias de Mindo y San Miguel de los Bancos ambas pertenecientes al
cantón San Miguel de los Bancos.
35
El trabajo de laboratorio se realizó en el laboratorio de Bacteriología de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia parte de la Universidad Central
del Ecuador.
Población y muestra
La población en estudio fueron un total de veintiocho lotes de pollos bebe
que es el número de lotes que ingresó durante un ciclo completo de
recepciones de la empresa donde se realizó el estudio, cada lote fue
muestreado a su llegada a la granja correspondiente, la misma que fue
designada de acuerdo a la planificación de la empresa.
El nombre de esta empresa se mantuvo en absoluta reserva, ya que se
estableció un acuerdo de confidencialidad con dicha empresa, por lo cual
para identificar las muestras se estableció un código alfanumérico.
Muestra
El tipo de muestreo fue no probabilístico consecutivo ya que se intentó incluir
a todos los sujetos accesibles como parte de la muestra. Las unidades de
muestreo fueron los lotes de pollos bebes que se recibieron durante un ciclo
completo que duró nueve semanas y que constó de veintiocho recepciones,
repartidas en quince granjas que posee la empresa.
En la tabla número 6 se establece el número de muestreos por semana y el
total de papeles que fueron tomados.
Tabla 6. Número de Muestreos por Semana y Total de Papeles a Tomados.
Semanas de
Muestreo Muestreos / Semana
Papeles / Semana
(10 Por Muestreo)
1ra 1 10
2da 4 40
3ra 3 30
36
4ta 2 20
5ta 4 40
6ta 5 50
7ma 2 20
8va 4 40
9na 4 40
Total 28 280
Fuente: Programación de Recepciones Empresa Productora de Pollos.
Elaboración: Autor
La identificación de Salmonella enterica serovariedades Enteritidis,
Typhimurium e Infantis en este estudio fue mediante la toma de papeles
impregnados con heces de las cajas de transporte de los pollos de la
incubadora a la granja (USDA, 2012; Rocha et. al, 2003).
De la totalidad de las cajas se tomó un pool de diez papeles que en conjunto
fueron necesarios para alcanzar el peso de veinticinco gramos, los mismos
que eran requeridos para realizar este estudio de acuerdo a la norma ISO
6579:2002/Amd, 2007.
En la tabla número 7 se establece la proporción de aves representadas en el
pool de diez papeles.
Tabla 7. Proporción de Aves Representadas en el Pool de Diez Papeles
Papeles / Pool Pollitos que
Defecan / Papel
Pollitos / Pool
10 35 - 40 350 – 400
Fuente: Autor
Elaboración: Autor
37
Procedimiento de la Investigación
1. Fase de campo (muestreo)
La identificación de Salmonella enterica serovariedades Enteritidis,
Typhimurium e Infantis en este estudio fue mediante la toma de papeles
impregnados con heces de las cajas de transporte de los pollos de la
incubadora a la granja. (USDA, 2012; Rocha et al., 2003)
De la totalidad de las cajas se tomó un pool de diez papeles que en conjunto
fueron necesarios para alcanzar el peso de veinticinco gramos, los mismos
que eran requeridos para realizar este estudio de acuerdo a la norma ISO
6579:2002/Amd, 2007.
Las muestras fueron colocadas en fundas plásticas estériles, identificadas y
puestas en refrigeración para su transporte al Laboratorio de Bacteriología y
Micología de la FMVZ (Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia).
2. Fase de laboratorio.
a. Procesamiento
Las muestras (10 papeles con heces por recibimiento) fueron procesadas
recortando las partes que contenían impregnadas heces, reuniendo así un
pool de 25 gramos.
b. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo.
La proporción de agua peptonada para 25 gr de pool de papel impregnado
con heces es 225 ml de agua peptona tamponada (BPW) se inoculó a
temperatura ambiente con la porción de ensayo, después se incubará a 37 °
C ± 1 ° C durante 18 h ± 2 h. (ISO 6579:2002/Amd, 2007)
c. Enriquecimiento
En placas con el medio semisólido selectivo Modified Semi-solid Rappaport-
Vassiliadis (MSRV) se inoculó el cultivo obtenido en el pre-enriquecimiento.
Con un micropipeta se toman 100 ul (3 gotas) en el medio colocando de
38
manera equidistante el contenido formando un triángulo. Se incubo a 42°C
por 24± 3 horas. (ISO 6579:2002/Amd, 2007)
d. Cultivo: medio selectivo
Al ser la muestra positiva en el enriquecimiento, se realizó una siembra en
agar selectivo Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD), es un medio selectivo para
Shigella y Salmonella. Con el asa de platino se tomó el halo blanquecino del
MSRV, sembrándolo por estriaciones en la caja petri. Se incubó a 37°C por
24 horas.
Las colonias positivas a Salmonella presentaron un halo rosado con un
centro color negro por la producción de H2S, otras no producen gas
observando en el medio un halo rosa con el centro oscuro. Algunas
Salmonellas pueden ser lactosa +, sus colonias son de color amarillo y el
centro negro. (ISO 6579:2002/Amd, 2007)
e. Pruebas Bioquímicas
Las muestras positivas en el medio selectivo fueron sometidas a pruebas
bioquímicas que confirmaron el aislamiento de Salmonella spp. Las pruebas
que se utilizaron son: Triple azúcar más hierro (TSI), Urea, Lisina e Indol.
Cuyos resultados positivos son expresados en el Anexo1.
f. Respaldo de las cepas (Criocongelación)
Las muestras positivas en las pruebas bioquímicas fueron usadas para el
respaldo en caldo triptosa. Se tomó una asada de cultivo del medio TSI y
Urea colocando en un tubo Ependorf con 300 ul de caldo triptosa durante 24
horas a 37° centígrados usando un asa desechable. Posteriormente se
añadió 600 ul de glicerol para su congelación y conservación a -75° en cajas
criogénicas.
g. Tipificación serológica
La tipificación se realizó mediante el esquema de Kauffmann-White que
divide a este género bacteriano en serotipos.
39
Los antígenos Salmonella O son antígenos somáticos (O) termoestables y se
identifican primero. El antígeno Vi es un antígeno de envoltura termolábil que
puede rodear a la pared celular y enmascarar la actividad del antígeno
somático. Los microorganismos con el antígeno Vi no se aglutinan en
antisueros O. Para determinar el antígeno O de dichos cultivos, se debe
hervir una suspensión del organismo para destruir el antígeno de envoltura
termolábil y luego analizarse con antisueros O. Los antígenos flagelares (H)
son termolábiles y por lo general se asocian con la movilidad.
Análisis de la cepa aislada para determinar la autoaglutinación
1. A partir de un cultivo de prueba en medio no selectivo, transferir un
asa llena de crecimiento a una gota de solución salina estéril al 0,85%
en un portaobjetos limpio, y emulsionar el organismo.
2. Girar el portaobjetos durante 1 min y luego observar para determinar si
se ha producido aglutinación.
3. Si ocurre la aglutinación (autoaglutinación), el cultivo es rugoso y no
se podrá analizar. Realizar un subcultivo en agar no selectivo,
incubarlo y volver a analizar el organismo tal como se describe en los
pasos 1 y 2.
4. Si no ocurre ningún tipo de aglutinación, realizar el análisis del
organismo.
Método de prueba del portaobjetos Antisueros para Salmonella O y Vi
Utilizar este procedimiento para analizar el aislado con cada antisuero
seleccionado.
1. Colocar 1 gota (35 µL) de cada antisuero a ser analizado en un
portaobjetos de aglutinación.
2. Control negativo: Colocar 1 gota de solución de NaCI al 0,85% estéril
en un portaobjetos de aglutinación.
3. Desde un medio de agar sólido, transferir una parte de un asa de una
colonia aislada a cada área de reacción anterior y mezclar bien.
40
4. Control positivo: Colocar 1 gota de cada Difco Salmonella O Antiserum
a ser analizado en un portaobjetos de aglutinación. Añadir 1 gota de
Difco QC Antigen Salmonella apropiado o de cultivos de referencia de
identificación serológica conocida.
5. Girar el portaobjetos durante 1 min y efectuar la lectura para
determinar si se ha producido aglutinación. Los resultados se deben
leer en el plazo de 1 min.
En el anexo dos y tres se muestra el grafico esquema para el uso de
Salmonella O Poly A-I Y Vi, esquema para el uso de Salmonella O Poly
Grupos A,B,C,D,E,F y G respectivamente.
Procedimiento de prueba en tubo Antisueros para Salmonella H
1. Preparar un tubo de ensayo de 12 x 75 mm para cada muestra a
analizar.
2. Antisuero diluido: Dosificar 0,5 mL en cada tubo.
3. Aislado de prueba: Añadir 0,5 mL al tubo correspondiente.
4. Control positivo: Añadir 0,5 mL de control positivo de antígeno a un
tubo con 0,5 mL de antisuero.
5. Control negativo: Añadir 0,5 mL de solución de NaCI al 0,85% a un
tubo con 0,5 mL de aislado de prueba.
6. Incubar todos los tubos en baño María a 50 ± 2 °C durante 1 h.
7. Efectuar una lectura para determinar floculación (aglutinación).
8. Repetir la prueba en tubo con un organismo de prueba con fase
inversa.
Inversión de fase
1. Preparar medio de inversión de fase para Motility GI Medium según
las instrucciones.
2. Preparar el antisuero contrario a la fase deseada. Por ejemplo, la
incubación de Salmonella Typhimurium fase 1[i] en GI Motility Medium
41
con antisuero i permite el crecimiento y la propagación de S.
Typhimurium fase 2 [1,2].
3. Añadir 1 mL de una dilución 1:10 de antisuero a 25 mL de GI Motility
Medium estéril y mezclar bien. Verter en una placa de Petri estéril y
dejar solidificar.
4. Inocular perforando el borde del medio solidificado.
5. Incubar a 35 – 37 °C durante 24 h.
6. Transferir el crecimiento del borde de propagación frente al sitio de
inoculación a un medio líquido para análisis según los pasos en la
sección Procedimiento de prueba en tubo: Antisueros para Salmonella
H.
7. Si la movilidad no es aceptable, realizar otra pasada por el Motility GI
Medium.
Resultados de la prueba en portaobjetos
1. El control positivo debe indicar una aglutinación de 3+ o mayor.
2. El control negativo no debe mostrar ningún indicio de aglutinación.
3. Para las cepas aisladas del análisis, un valor de aglutinación de 3+ o
mayor indica un resultado positivo.
4. Una aglutinación parcial (menos de 3+) o demorada debe
considerarse como reacción negativa.
5. Si se requiere una identificación de antígeno de Salmonella H,
continuar en la sección siguiente.
Resultados de la prueba en tubo
1. El control positivo debe indicar una aglutinación de 3+ o mayor en la
dilución de prueba de rutina.
2. El control negativo no debe mostrar ningún indicio de aglutinación.
(Difco, 2012)
42
Tabla 8. Registro de resultados aglutinación en placa y tubo.
Calificación Interpretación
4+ 100% de aglutinación (fondo transparente a ligeramente
lechoso).
3+ 75% de aglutinación (fondo ligeramente turbio).
2+ 50% de aglutinación (fondo moderadamente turbio).
1+ 25% de aglutinación (fondo turbio).
- Sin aglutinación
Fuente: Difco manual Salmonella antisueros
Registro y Análisis de Datos
a. Registro de Datos
Los datos obtenidos de la fase de laboratorio fueron registrados en una base
de datos a través de Hojas de Excel, donde también se ingresó la
información obtenida al momento de la toma de la muestra incluyendo la
ubicación de la granja de recepción, incubadora de origen, número de aves
por lote y observaciones específicas de cada muestra.
b. Análisis de los Datos
Los datos obtenidos tanto del aislamiento de Salmonella spp. así como los
de la tipificación de los serotipos Enteritidis, Tiphymurium e Infantis se
representaron por medio de histogramas porcentuales, de la relación entre la
proporción de positivos con el total de las parvadas que fueron recibidas de
acuerdo a la programación de la empresa, lo que le permitirá establecer la
trazabilidad necesaria hasta las incubadoras proveedoras de cada parvada.
Para el análisis de los datos se utilizará Microsoft Excel®.
43
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Presentación de Resultados
El aislamiento de Salmonella spp. se realizó de acuerdo al protocolo
estandarizado establecido en la norma ISO 6579 que contempla el pre-
enriquecimiento (Agua Peptonada Buferada), enriquecimiento selectivo
(MSRV), el aislamiento en un medio selectivo (XLD) y la tipificación mediante
un batería bioquímica (TSI, Lisina, Urea, Indol). Durante las 9 semanas que
duró el muestreo, se obtuvo 28 muestras de 15 granjas de la empresa
productora de pollo. De las 28 muestras procesadas y analizadas durante
esta investigación, 1 (3,6%) fue positiva a Salmonella spp. como se muestra
en el Grafico 5 y 6.
Grafico 5. Resultado de muestras positivas a aislamiento de Salmonella spp.
en relación al número de muestras.
MUESTRAS % MUESTRAS N°
NEGATIVOS 96.4 27
POSITIVOS 3.6 1
0
20
40
60
80
100
120
Resultados Aislamiento Salmonella spp.
44
Grafico 6. Resultado de muestras positivas a aislamiento de Salmonella spp.
en relación al porcentaje y número de granjas.
En el caso del aislamiento bacteriológico se lo realizó en duplicado para la
siembra en el medio de enriquecimiento selectivo para disminuir la posible
falla en la siembra.
Para poder identificar el serotipo de Salmonella que fue aislada se utilizó la
serotipificación mediante el esquema de Kauffman-White con los antisueros
comerciales de la empresa Difco de los antígenos somáticos O y flagelares H
de los serotipos Enteritidis, Typhimurium e Infantis. Los resultados obtenidos
fueron que la cepa que se logró aislar pertenece al serogrupo D.
Al realizar la serotipificación a la cepa aislada de la muestra 21 que fue
positiva al cultivo bacteriológico se obtuvo el siguiente resultado: Salmonella
entérica subespecie entérica serogrupo D, ya que dio positivo a los antígenos
O grupo D 1,9,12 y negativo a los antígenos flagelares gm descartando a S.
Enteritidis, dejando como posible serotipo aislado a las restantes cepas
contenidas en el Grupo D. En la tabla 11 se puede observar los resultados
obtenidos.
GRANJAS % GRANJAS N°
NEGATIVAS 93.33 14
POSITIVAS 6.6 1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Resultados Granjas Aislamiento de Salmonella spp.
45
Tabla 9.- Resultados Obtenidos
LOTE NUMERO DE AVES DEL
LOTE INCUBADORA RESULTADO ESPECIE
SEROTIPIFICADA
1 53000 B NEGATIVO -
2 51000 B NEGATIVO -
3 53000 B NEGATIVO -
4 51000 B NEGATIVO -
5 60000 B NEGATIVO -
6 49000 C NEGATIVO -
7 44000 C NEGATIVO -
8 44000 C NEGATIVO -
9 49000 C NEGATIVO -
10 49000 C NEGATIVO -
11 80000 C NEGATIVO -
12 80000 C NEGATIVO -
13 48000 B NEGATIVO -
14 80000 C NEGATIVO -
15 46000 B NEGATIVO -
16 46000 B NEGATIVO -
17 80000 A NEGATIVO -
18 80000 A NEGATIVO -
19 44000 B NEGATIVO -
20 43000 B NEGATIVO -
21 44000 B POSITIVO Salmonella Grupo D
22 44000 B NEGATIVO -
23 60000 A NEGATIVO -
24 70000 A NEGATIVO -
25 90000 C NEGATIVO -
26 90000 C NEGATIVO -
27 51000 A NEGATIVO -
28 51000 C NEGATIVO -
Elaboración: El Autor
Discusión de Resultados
El objetivo del presente estudio fue identificar Salmonella enterica de interés
zoonósico serovariedades Enteritidis, Typhimurium e Infantis en pollo bebe
de un día de edad en una empresa productora de pollo, utilizando como
46
muestra el papel de las cajas de transporte en las que llegan los pollitos a las
granjas de la empresa. El resultado del aislamiento de Salmonella spp. que
fue la primera parte del estudio proporcionó como resultado 1 (3,6%) muestra
positiva, mediante la utilización del papel como herramienta de muestreo, lo
que disminuye los costos del monitoreo y contribuye al bienestar animal,
evitando el sacrificio de los pollitos a la recepción. En cuanto a la segunda
parte del estudio que consistía en la serotipificación de los aislamientos
obtenidos, la muestra 21 que resultó positiva y representa el 100% de las
muestras aisladas, fue sometida a la serotipificación mediante el esquema de
Kauffmann-White que dio como resultado que dicha cepa pertenecía al
Grupo D dando positivos a los antígenos somáticos O 1,9,12 y negativo a los
antígenos flagelares H gm descartando a S. Enteritidis y dejando la
posibilidad de ser una de las cepas restantes del Grupo D, donde se
encuentran un gran número de cepas zoonóticas.
En estudios similares en los que se ha utilizado muestras de papel de
transporte de pollo se ha reportado la presencia de Salmonella spp., es así
que en un estudio en Goiás, Brasil de tres empresas productoras de pollo de
engorde el 50% de muestras de papel de transporte de pollos de un día fue
positivo a Salmonella spp., de las cuales el 92,3% fueron del serotipo
Enteritidis (Rocha et al., 2003), de igual manera en San Paulo-Brasil, un
estudio en el papel de cajas de transporte de pollos de un día de edad
provenientes de reproductoras pesadas y livianas se encontró una
contaminación de 77,1 % y 44,4%, respectivamente, siendo S. Heidelberg
con 83.33% la cepa más aislada en las reproductoras pesadas y S.
Enteritidis con un 60% en las reproductoras livianas (Zancan, 1998). En
Georgia-Estados Unidos, se aisló Salmonella en tres incubadoras mediante
muestras de papel de cajas de transporte de pollos de un día de edad, un
74% las muestras fueron positivas (Cox et al., 1990); mientras que, en otro
estudio realizado en Estados Unidos se obtuvo una presencia de 12% en
seis incubadoras con la toma de papel de las cajas de transporte (Cox et al.,
47
1991). Froyman et al. (1997), en 79 lotes de pollos de engorde mediante el
análisis llevados a cabo en la sala de incubación con hisopos de superficie
de papeles de cajas de transporte, reveló que 55 lotes fueron positivos,
correspondiendo al 69,6%.
Salmonella spp. se pueden transmitir a los huevos a través de la infección
del oviducto, lo que resulta en la contaminación de la albúmina y huevos
durante su formación (Desmidt et al., 1997). También existe la posibilidad de
que los huevos se contaminen después de la formación de la cáscara,
contaminada por el contacto con las heces en la cloaca o el medio ambiente
(McIlroy et al., 1989).
Los huevos para incubar pueden contaminarse con Salmonella después de
la puesta todavía en los nidos en cobertizos matrices, camiones y criadero
propio, con la transmisión horizontal del microorganismo. En incubadoras, las
condiciones de temperatura y humedad promueven la proliferación de
Salmonella (Cox et al., 2000). Según Cox et al. (1991), los embriones pueden
ser contaminados en la incubadora y con mayor frecuencia en las cámaras
de nacimiento, durante el volteo para incubar.
Otros autores también mencionan la posibilidad de contaminación durante el
transporte de los pollos a la granja. La contaminación puede dar lugar a
exposición en el criadero de pollos recién nacidos de Salmonella, momento
en el que las aves son más susceptibles a la colonización del tracto intestinal
(Bailey et al., 1994; Byrd, et al., 1998).
Un factor a considerar en el análisis de estos resultados es el uso de
antibióticos de la familia de las cefalosporinas específicamente Ceftiofur
Sódico en los pollitos de un día de edad o in ovo como parte del uso de
vacunas recombinantes. En este caso en particular las incubadoras que
proveen a la empresa productora de pollo de engorde utilizan dicho
antibiótico de manera conjunta con la vacuna recombinante contra la
enfermedad de Gumboro, de esta manera se puede considerar como una de
48
las posibles causas para la no obtención de un porcentaje mayor de
aislamientos positivos en el estudio; así también, se puede argumentar que
la cepa aislada sea resistente a este antibiótico ya que a pesar de la
administración del mismo la muestra fue positiva, por lo que posteriores
estudios sobre la resistencia a antimicrobianos pudieran ser realizados para
estimar el potencial riesgo de estas bacterias en la salud de la población.
49
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
El porcentaje de aislamiento de Salmonella spp. en el papel de
transporte de los pollos bebe (3,6%) sugiere transmisión vertical de
la misma y demuestra que los pollos de un día de edad son un
importante punto de control ya que representan una posible fuente
de contaminación del sistema productivo de pollos de engorde.
En el presente estudio se determinó la presencia de Salmonella del
serogrupo D en el cual se encuentran algunas cepas de interés
zoonótico.
La administración de Ceftiofur sódico con la vacuna recombinante
de Gumboro, administrada en las incubadoras, sugiere tener una
relación a los bajos porcentajes de Salmonella en los pollitos bebe.
50
Recomendaciones
Se sugiere monitorear los restantes puntos críticos de posible
contaminación con Salmonella spp. del sistema productivo de
pollos de engorde para asegurar un control completo sobre la
cadena de producción.
Replicar el estudio en otros sistemas de producción con el fin de
determinar la importancia que tienen los pollos de un día de edad
en la contaminación con Salmonella spp. del sistema de
producción de pollos de engorde.
Investigar sobre resistencia antimicrobiana en la cepa aislada en
estudio en granja y en carne de pollo, para obtener información
que pueda ayudar a establecer el uso adecuado de antibióticos
tanto en animales como en seres humanos.
Realizar pruebas complementarias de serotipificación en la cepa
aislada para determinar el serotipo y la correlación en el producto
terminado para conocer su importancia en la industria avícola
nacional.
Realizar pruebas de aislamiento y serotipificación en el producto
terminado para poder determinar los serotipos prevalentes y su
epidemiología en los sistemas de producción.
51
REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS
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Bacteriologia Servicio de Enterobacterias (Eds.), (pp. 1-72). Buenos Aires, Argentina.
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57
ANEXOS
58
ANEXOS
Anexo 1. Diagrama Aislamiento Salmonella Spp. (Cepas Móviles)
10 PAPELES DE CAJAS DE TRANSPORTE DE POLLOS BEBE
Pesar 25gr de papel impregnado de heces, tomando 2.5 gr por cada papel y homogenizar la muestra
Adicionar 225ml de Agua Peptonada
Sembrar 3 gotas de la muestra incubada en el agar MSRV
POSITIVA (Presencia de halo blanco alrededor
del inóculo)
NEGATIVA
Tomar una azada del extremo del halo y sembrar en XLD
POSITIVA (Presencia de colonias
transparentes con centro negro)
NEGATIVA
Incubar por 24 horas a 42°C
Incubar de 24 - 48h a 37°C
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
TSI Urea Indol Lisina
Incubar a 37°C por 24 horas
NEGATIVA
POSITIVA
Autoclavar
Tomar dos asadas desde TSI y colocarlos en un tubo
epperdorff con 300ul de TSB
Incubar a 37°C por 24 horas
Adicionar 600ul de glicerol y guardar los
tubos a -80°C
TSI K/A+G
Urea Neg
Indol Neg
Lisina Pos
Una vez más
Incubar a 37°C por 24 horas
Fuente: Laboratorio Bacteriología Universidad Central del Ecuador.
59
Anexo 2. Esquema Para El Uso De Salmonella O Poly A-I Y Vi
Anexo 3. Esquema Para L Uso D Salmonella O Poly Grupos A,B,C,D,E,F Y G
60
Anexo 4. Diagrama De Serotipificación Para Salmonella Spp.
Caldo flagelar
Cepas con características bioquímicas de Salmonella
Estría en Medio No
Selectivo Serotipificación somática
(aglutinación en lámina)
Inversión de fase
Aglutinación con solución salina 0.87%
Negativa Positiva
Cepa rugosa Aglut. c/antisueros poliv.
A-I & Vi Somáticos
Positiva Negativa
Aglu. c/antisueros de grupo O específicos
del serotipo buscado
Positiva
Aglut. Antisueros de
fase 1 H /factores H
Positiva
RESULTADO FINAL
Negativo
Aglu. c/antisueros de
fase 2 H/factores H
Positiva
Aglu. c/antisueros poliv.
A ó B de grupo O
Serotipificación flagelar
(aglutinación en tubo)
Elaboración: El Autor.
61
Anexo 5. Diagrama de Serotipificacion Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis.
Serotipificación Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis
Antisuero Poly A-I & Vi
Antisuero Poly A Antisuero Poly B
S. Enteritidis S. Typhimurium S. Infantis
Antisuero O Antisuero H Antisuero O Antisueros H Antisuero O Antisueros H
1, 9, 12 gm 1, 4, 5, 12 Inversión de fase 6, 7, 14 Inversión de fase
i 1, 2 r 1, 5 Elaboración: El Autor.
62
Anexo 6. Resultados muestra 2CTP.021 Positiva al Aislamiento Salmonella (Norma
ISO 6579).
Fuente: El Autor
Anexo 7. Resultados muestra 2CTP.002 Negativa al Aislamiento Salmonella
(Norma ISO 6579).
63
Fuente: El Autor
Anexo 8. Resultados Serotipificación Somática y Flagelar.
Fuente: El Autor