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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

DESARROLLO DE CUATRO PROTOTIPOS DE BIOFORMULACIONES EN

BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum

Trabajo de titulación previo a la obtención del Título de Ingeniera Agrónoma

AUTORA: Perdomo Quishpe Cynthia Estefania

TUTOR: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David, M.Sc.

QUITO, octubre 2018

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, CYNTHIA ESTEFANIA PERDOMO QUISHPE, en calidad de autora y titular de los

derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: DESARROLLO DE CUATRO

PROTOTIPOS DE BIOFORMULACIONES EN BASE A CONIDIAS DE

Trichoderma asperellum modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del

CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,

CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador

una licencia gratuita, intransferible y exclusiva para el uso, no comercial de la obra, con fines

estrictamente académicos. Los derechos de autor me corresponden y seguirán a mi favor,

con excepción de la presente autorización de conformidad con lo establecido en los artículos

5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la LEY DE PROPIEDAD INTELECTUAL y su

reglamento.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización

y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo

dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad

de toda responsabilidad.

Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

C.C.: 1719685776

[email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por CYNTHIA ESTEFANIA

PERDOMO QUISHPE, para optar por el Grado de Ingeniera Agrónoma; cuyo título es:


BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum, considero que dicho trabajo reúne los

requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por

parte del tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de junio de 2018

____________________________________

Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.

CC. 1719050682

DOCENTE-TUTOR

iv


BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum

APROBADO POR:

Ing. Agr. Jorge Caicedo, M. Sc. __________________________

TUTOR

Lic. Diego Salazar, Mag. __________________________

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL

Ing. Agr. Clara Iza, M. Sc. __________________________

PRIMER VOCAL

Ing. Agr. Christian Tamayo, M. Sc. __________________________

SEGUNDO VOCAL

2018

v

DEDICATORIA

Este trabajo de titulación lo dedico a Dios y a mis padres Rosa y

Luis, por su amor, ejemplo, esfuerzo e incondicional apoyo

durante mi formación personal y profesional. A mis hermanos,

Alex y Mishel por brindarme constante ánimo y permanecer

siempre a mi lado.

A mis sobrinas Katherine y Danna quienes son la fuerza adicional

que me impulsa a ser mejor día a día y al amor, por motivarme a

cumplir todos mis anhelos con paciencia y dedicación

recordándome en cada paso que ¡La vida es bella!

Cynthia

J.L.L.A

vi

AGRADECIMIENTO

A la Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Ciencias

Agrícolas, por mi desarrollo profesional.

Agresearch-Nueva Zelanda, en la persona de Trevor Jackson, al

Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias -

Estación Experimental Santa Catalina; en la persona de Cristina Tello;

por el financiamiento y apoyo otorgado al proyecto en el cual estuvo

inmersa esta investigación.

A Jorge Caicedo M. Sc, en calidad de tutor académico, por dirigir mi

trabajo de titulación con excelente disposición, preocupación y

constante orientación.

A Francisco Báez Ing. Agr. Técnico del Laboratorio de Control

Biológico, por brindarme su amistad, ánimo, asesoría y la oportunidad

de adquirir nuevos conocimientos.

A la Doctora Laura Villamizar de AgResearch–Nueva Zelanda, por su

asistencia técnica y consejos para el desarrollo de bioformulaciones, a

la Ing. Nicolalde y la Sra. Marcia Verdezoto por su amabilidad y

colaboración.

A mi familia en especial a mis padres y mi tía Geovanna, por su

incondicional apoyo y compañía desde mi niñez, por ser ejemplo de

que si deseamos algo y batallamos por ello se alcanza, no importa

cuántos obstáculos debamos vencer.

A mi abuelito Luis, por sus regaños y consejos; a mi abuelita Mercedes

que me da su bendición desde el cielo, por haberme motivado a luchar

por mis sueños.

A mis amigos y amigas en especial a Hugo, Cynthia, Diana y Pamela,

por su valiosa amistad, anécdotas y travesías compartidas durante la

carrera.

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CAPÍTULOS PÁGINAS

I. INTRODUCCIÓN ___________________________________________________ 1

II. REVISIÓN DE LITERATURA ________________________________________ 2

2.1. Control biológico ____________________________________________________ 2

2.2. Trichoderma sp. _____________________________________________________ 2

2.3. Mecanismos de acción de Trichoderma ___________________________________ 3

2.3.1. Competencia ________________________________________________________ 3

2.3.2. Antibiosis __________________________________________________________ 3

2.3.3. Micoparasitismo _____________________________________________________ 4

2.3.4. Inducción de resistencia _______________________________________________ 4

2.3.5. Trichoderma asperellum ______________________________________________ 5

2.4. Bioformulaciones generalidades _________________________________________ 5

2.5. Tipos de formulaciones ________________________________________________ 6

2.6. Formulaciones sólidas _________________________________________________ 6

2.6.1. Polvos _____________________________________________________________ 6

2.6.2. Polvos mojables _____________________________________________________ 6

2.6.3. Granulados _________________________________________________________ 6

2.6.3.1. Gránulos cubiertos __________________________________________________ 7

2.6.3.2. Gránulos dispersables _______________________________________________ 7

2.7. Formulación líquida __________________________________________________ 7

2.7.1. Concentrados emulsionables ___________________________________________ 7

2.8. Estabilidad de bioformulaciones en almacenamiento _________________________ 8

2.9. Control de calidad de bioformulados _____________________________________ 8

2.10. Características microbiológicas de las formulaciones ________________________ 9

2.10.1.Concentración de colonias en Unidades formadoras de colonia (UFC/g o ml) ____ 9

2.10.2. Porcentaje de germinación de conidias (%) _______________________________ 9

2.10.3. Prueba de pureza ____________________________________________________ 9

2.11. Características fisicoquímicas de las formulaciones _________________________ 9

2.11.1. pH _______________________________________________________________ 9

2.11.2. Porcentaje de humedad (%) __________________________________________ 10

2.11.3. Humectabilidad (min) _______________________________________________ 10

2.11.4. Suspendibilidad (%) ________________________________________________ 10

viii

CAPÍTULOS PÁGINAS

2.11.5. Tamaño de la partícula (%) __________________________________________ 11

2.11.6. Actividad de agua (aw) ______________________________________________ 11

2.11.7. Densidad apisonada (g/ml) ___________________________________________ 11

2.11.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml) ___________________________ 12

III. MATERIALES Y MÉTODOS ________________________________________ 13

3.1. Ubicación ___________________________________________________________ 13

3.2. Ubicación política ____________________________________________________ 13

3.3. Ubicación geográfica __________________________________________________ 13

3.3.1. Características del laboratorio __________________________________________ 13

3.4. Materiales __________________________________________________________ 13

3.5. Material biológico ____________________________________________________ 13

3.6. Material de Laboratorio ________________________________________________ 13

3.7. Reactivos ___________________________________________________________ 14

3.8. Equipos ____________________________________________________________ 14

3.9. Métodos ____________________________________________________________ 15

3.9.1. Microorganismo experimental Trichoderma asperellum _____________________ 15

3.9.2. Producción masiva de Trichoderma asperellum. ___________________________ 15

3.9.3. Extracción de conidias de Trichoderma asperellum ________________________ 17

3.10. Formulación de Trichoderma asperellum ________________________________ 17

3.10.1. Formulación del prototipo polvo mojable (WP) __________________________ 17

3.10.2. Formulación del prototipo concentrado emulsionable (EC)__________________ 19

3.10.3. Formulación del prototipo gránulo cubierto (CG) _________________________ 21

3.10.4. Formulación del prototipo gránulo dispersable (WG) ______________________ 23

3.11. Análisis de calidad microbiológica de bioformulaciones a base de Trichoderma

asperellum _____________________________________________________________ 25

3.11.1. Porcentaje de germinación de conidias (%) ______________________________ 25

3.11.2. Determinación de la concentración de colonias en UFC/g o ml ______________ 26

3.11.3. Determinación de la pureza __________________________________________ 26

3.11.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) _______________________ 27

3.12. Caracterización fisicoquímica de los prototipos de bioformulaciones. _________ 27

3.12.1. Humedad (%) _____________________________________________________ 27

3.12.2. Actividad de agua (aw) ______________________________________________ 27

ix

CAPÍTULOS PÁGINAS

3.12.3. Densidad apisonada (g/ml) ___________________________________________ 28

3.12.4. Determinación de pH _______________________________________________ 28

3.12.5. Humectabilidad (minutos) ___________________________________________ 28

3.12.6. Suspendibilidad (%) ________________________________________________ 28

3.12.7. Tamaño de partícula (%) ____________________________________________ 28

3.12.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml) ___________________________ 29

IV. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ___________________________________________ 30

4.1. Factores en estudio __________________________________________________ 30

4.1.1. Prototipos de bioformulaciones (P) _____________________________________ 30

4.1.2. Temperaturas de almacenamiento (T) ___________________________________ 30

4.1.3. Tratamientos _______________________________________________________ 30

4.2. Esquema del experimento ____________________________________________ 31

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN _______________________________________ 32

5.1. Caracterización microbiológica de los prototipos ___________________________ 32

5.1.1. Porcentaje de germinación ____________________________________________ 32

5.1.2. Concentración de colonias en UFC _____________________________________ 36

5.1.3. Pureza ____________________________________________________________ 39

5.1.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación ____________________________ 41

5.2. Caracterización fisicoquímica de los prototipos ____________________________ 42

5.2.1. Densidad apisonada _________________________________________________ 42

5.2.2. Humectabilidad _____________________________________________________ 44

5.2.3. Humedad __________________________________________________________ 45

5.2.4. pH _______________________________________________________________ 47

5.2.5. Estabilidad del concentrado emulsionable ________________________________ 48

5.2.6. Suspendibilidad ____________________________________________________ 50

5.2.7. Tamaño de la partícula _______________________________________________ 51

5.2.8. Actividad de agua __________________________________________________ 55

5.3. Resumen de las características microbiológicas y fisicoquímicas _____________ 58

VI. CONCLUSIONES __________________________________________________ 60

VII. RECOMENDACIONES _____________________________________________ 61

VIII. RESUMEN ________________________________________________________ 62

IX. REFERENCIAS ____________________________________________________ 66

x

CAPÍTULOS PÁGINAS

X. ANEXOS __________________________________________________________ 70

xi

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICOS PÁG

1. Porcentaje de contaminación de los bioformulados, antes y después de seis meses

de almacenamiento. ................................................................................................. 40

2. Porcentaje de pureza de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento. ...................................................................................................... 40

3. Suspendabilidad en porcentaje del WP y WG, después de manufacturación y

almacenamiento por seis meses a dos temperaturas. ............................................... 51

4. Distribución del material retenido (%) de WG, a partir de su elaboración (inicial) y

almacenamiento por seis meses. .............................................................................. 53

5. Distribución del material retenido (%) de CG, a partir de su elaboración (inicial) y


6. Distribución del material retenido (%) de WP, a partir de su elaboración (inicial) y


xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURAS PÁG

1. Colonias del hongo Trichoderma asperellum. ........................................................ 15

2. Producción masiva de Trichoderma asperellum a) multiplicación in vitro b)

multiplicación en sustrato arroz. .............................................................................. 16

3. Método de extracción y conservación de conidias secas de Trichoderma asperellum.

................................................................................................................................. 17

4. Mezcla de excipientes con el ingrediente activo (conidias puras y secas). ............. 18

5. Prototipo de polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum. ......... 18

6. Empaque y etiquetado del producto polvo mojable (WP) a dos condiciones de

almacenamiento. ...................................................................................................... 19

7. Formulación del producto concentrado emulsionable (EC) a base de conidias de

Trichoderma asperellum. ........................................................................................ 20

8. Empaque y etiquetado de porciones del producto concentrado emulsionable (EC).

................................................................................................................................. 20

9. Elaboración del Gránulo Dispersable (WG). ........................................................... 24

10. Secado del Gránulo Dispersable (WG). .................................................................. 24

11. Empaque y división de gránulos dispersables (WG) para almacenamiento a dos

temperaturas............................................................................................................. 25

12. Elaboración del Biomatrix para la formulación de gránulo cubierto (CG). ........... 22

13. Elaboración y secado del prototipo gránulo cubierto (CG). ................................... 22

14. Empaque y etiquetado del gránulo cubierto (CG) para almacenamiento a dos

temperaturas............................................................................................................. 23

15. Esquema de la disposición de las unidades experimentales. ................................... 31

xiii

FIGURAS PÁG

16. Disposición de las unidades experimentales según cada tratamiento a diferentes

temperaturas de almacenamiento............................................................................. 31

17. Humectabilidad de WP. ........................................................................................... 44

18. Humectabilidad de WG. .......................................................................................... 45

19. Estabilidad del concentrado emulsionable cremado a) 1 hora b) 24 horas. ............ 49

xiv

LISTA DE CUADROS

CUADROS PÁG

1. Medio de cultivo para la multiplicación de Trichoderma asperellum. ................... 16

2. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del polvo

mojable (WP). .......................................................................................................... 18

3. Datos informativos correspondientes al etiquetado del polvo mojable. .................. 19

4. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del

concentrado emulsionable (EC). ............................................................................. 19

5. Datos informativos correspondientes al etiquetado del concentrado emulsionable. 21

6. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

cubierto (CG). .......................................................................................................... 21

7. Porcentajes de ingredientes que forman el Biomatrix para gránulo cubierto .......... 21

8. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo cubierto................ 23

9. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

dispersable (WG). .................................................................................................... 23

10. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo dispersable. .......... 25

11. Medio de cultivo utilizado en el porcentaje de germinación de conidias. ............... 25

12. Medio de cultivo para cuantificación de colonias de Trichoderma asperellum ...... 26

13. Tratamientos correspondientes a los 4 prototipos de bioformulaciones desarrolladas

a base de conidias Trichoderma asperellum............................................................ 31

14. Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de germinación antes y durante los

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................................ 32

15. ANOVA del porcentaje de germinación después de formulados los prototipos y

durante dos meses de almacenamiento a 4 y 30°C. ................................................. 33

xv

CUADROS PÁG

16. ANOVA del porcentaje de germinación del 3er al 4to mes de almacenamiento, a dos

temperaturas............................................................................................................. 33

17. Medias del porcentaje de germinación después de la elaboración de los prototipos y

durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................... 34

18. Porcentaje de germinación de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................................... 35

19. Normalidad y varianzas constantes de la concentración en Log UFC/g de lo

bioformulados, antes y durante los seis meses de almacenamiento, a dos

temperaturas............................................................................................................. 36

20. ANOVA del porcentaje de la concentración de colonias (Log UFC/g) después de

formulados los prototipos y durante dos meses de almacenamiento, a dos

temperaturas............................................................................................................. 37

21. ANOVA de la concentración de colonias (Log UFC/g) a partir 3er al 6to mes de


22. Medias de la concentración (Log UFC/g) después de formulados los prototipos y

durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas. .................................. 38

23. Concentración de colonias (UFC/g) de los bioformulados, antes y después de seis

meses de almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................... 39

24. Medias del nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) después de

manufacturación en los cuatro bioformulados a base de Trichoderma asperellum. 41

25. Análisis de la densidad apisonada según Kruskall Wallis antes y durante seis meses

de almacenamiento, a dos temperaturas. ................................................................. 43

26. Medias y rangos de significación para densidad apisonada (g/ml), evaluados en

prototipos sólidos WP, WG, CG a partir del mes de formulación y durante seis meses


xvi

CUADROS PÁG

27. Análisis del porcentaje de humedad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses

de almacenamiento, a dos temperaturas. ................................................................. 46

28. Medias y rangos de significación para porcentaje de humedad (%), evaluados en



29. Análisis del pH según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento,

a dos temperaturas. .................................................................................................. 47

30. Medias y rangos de significación para el valor de pH, evaluados en los cuatro

prototipos WP, WG, CG y EC, a partir del mes de formulación y durante seis meses


31. Análisis de la suspendibilidad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de


32. Medias y rangos de significación para suspendibilidad (%), evaluados en prototipos

sólidos WP y WG a partir del mes de formulación y durante seis meses de

almacenamiento. ...................................................................................................... 50

33. Análisis del tamaño de partícula según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de


34. Medias y rangos de significación correspondiente a tamaño de la partícula (%), en



35. Normalidad y varianzas constantes de la aw de los bioformulados, antes y durante los

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................................ 55

36. ANOVA correspondiente a la aw después de formulados los prototipos y durante tres

meses de almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................... 56

37. ANOVA correspondiente a la aw del 4to al 6to mes de los bioformulados

almacenados, a dos temperaturas............................................................................. 56

xvii

CUADROS PÁG

38. Medias correspondientes a la aw después de formulados los prototipos y durante seis

meses de almacenamiento a dos temperaturas. ....................................................... 57

39. Características microbiológicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C y 30°C. ......................... 58

40. Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C. ..................................... 59

41. Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 30°C. ................................... 59

xviii

LISTA DE ANEXOS

ANEXO PÁG

1. Identificación del aislamiento de Trichoderma asperellum realizado por INIAP-

Estación Experimental Litoral Sur. ......................................................................... 70

2. Parámetros de calidad para formulaciones biológicas, establecidos por el Laboratorio

de Control Biológico de INIAP-EESC. ................................................................... 71

3. Determinación de la concentración de colonias (UFC/g) en diluciones serias de 104

a 106. ........................................................................................................................ 72

4. Determinación del porcentaje de germinación (%) de Trichoderma asperellum. ... 72

5. Conteo de conidias de Trichoderma asperellum germinadas y sin germinar (40x).73

6. Área de secado de sustrato arroz con deshumificador. ............................................ 73

7. Producción masiva de Trichoderma asperellum en sustrato arroz. ........................ 74

8. Procedimiento para medición de la densidad apisonada en productos sólidos. ...... 74

9. Determinación de la actividad de agua .................................................................... 75

10. Determinación del porcentaje de humedad de los productos biológicos................. 75

11. Determinación del valor de pH ............................................................................... 76

12. Anexo 12: Determinación de la suspendibilidad ..................................................... 76

xix

TÍTULO: DESARROLLO DE CUATRO PROTOTIPOS DE

BIOFORMULACIONES EN BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum

Autora: Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez

RESUMEN

Se desarrollaron cuatro prototipos de bioformulaciones, tales como polvo mojable, concentrado

emulsionable, granulado cubierto y dispersable, basado en conidias de Trichoderma asperellum

provenientes del INIAP- Estación Litoral Sur. El objetivo de esta investigación fue determinar los

parámetros fisicoquímicos y microbiológicos de los prototipos en dos temperaturas, además de

establecer el mejor prototipo en función de su viabilidad, estabilidad y conservación después del

tiempo de almacenamiento. Estos productos almacenados en refrigeración a 4°C mostraron una

mayor viabilidad y estabilidad después de seis meses de tiempo de almacenamiento, en comparación

con 30°C, donde el efecto de la temperatura redujo la germinación de los conidios al 100%. Según

los parámetros antes mencionados, el mejor prototipo fue el polvo mojable almacenado a 4°C, que

presentó una viabilidad mayor al 85% de conidios germinados, y una concentración de colonias de

1x108 unidades formadoras de colonias (UFC)/g, manteniendo una buena estabilidad y conservación

del microorganismo después de seis meses del período de evaluación.

PALABRAS CLAVE: FORMULACIÓN BIOLÓGICA / POLVO MOJABLE /

CONCENTRADO EMULSIONABLE / GRANULADOS / AGENTE

BIOCONTROLADOR

xx

SUBJECT: DEVELOPMENT OF FOUR BIOFORMULATION PROTOTYPES

BASED ON CONIDIAS OF Trichoderma asperellum

Author: Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez

ABSTRACT

Four prototypes of bioformulations were developed, such as wettable powder, emulsifiable

concentrate and covered and dispersable granulated, based on conidia of Trichoderma

asperellum coming from the INIAP- Station Litoral Sur. The aim of this research was to

determine the physicochemical and microbiological parameters of the prototypes under two

temperatures, in addition to establish the best prototype based on its viability, stability and

preservation after storage time. These products stored in refrigeration at 4 °C, showed greater

viability and stability after six months of storage time, compared with 30 °C, where the effect

of temperature reduced the conidia germination to 100 %. According to parameters above

mentioned, the best prototype was wettable powder stored at 4 °C, which presented a high

viability than 85 % of conidia germination, and a concentration of colonies of 1 x 108 colony

forming unit (CFU)/g, maintaining a good stability and preservation of the microorganism

after six month of evaluation period.

KEYWORDS: ORGANIC FORMULATION / WETTABLE POWDER /

EMULSIFIABLE CONCENTRATE / GRANULATES/ BIOCONTROLLER AGENT.

xxi

CERTIFICACIÓN

En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es “Desarrollo de cuatro prototipos

de bioformulaciones en base a conidias de Trichoderma asperellum”, presentado por la

señorita Cynthia Estefania Perdomo Quishpe, previo a la obtención del Título de Ingeniera

Agrónoma, certifico haber recibido y corregido el ABSTRACT para el trabajo de grado,

aprobado el mismo, después de realizadas las observaciones por los miembros del tribunal,

por lo que apruebo, para el empastado final.

____________________________________

Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.

CC. 1719050682

DOCENTE-TUTOR

1

I. INTRODUCCIÓN

Ecuador posee sistemas de producción diferenciados por el tamaño de la Unidad Productiva

Agropecuaria (UPA) con factores edafoclimáticos muy diferenciados que contribuyen al desarrollo

de plagas humana (Bettiol et al., 2014). Las pérdidas por patógenos pueden superar el 20% de los

costos de producción, razón por la cual se ha impulsado la búsqueda de estrategias de control

alternativas al control químico, eficientes, con bajos impactos ambientales y sin afectar la salud

(Vallejo, 2014).

Entre las alternativas de control en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP), se considera

el control biológico que es la utilización de un organismo antagonista frente a otro denominado

patógeno (Bettiol et al.,2014). En el suelo existe una gran cantidad de microorganismos benéficos

entre los que destacan los hongos pertenecientes al género Trichoderma, por su versatilidad,

adaptabilidad y fácil manipulación, los cuales son capaces de controlar una amplia gama de

microorganismos patógenos (Falconí, 2010). Trichoderma asperellum presenta diferentes

mecanismos de acción como la inducción eficiente de resistencia sistémica en plantas (RSI por sus

siglas en inglés) y se observa su acción sobre patógenos foliares como Pseudomonas syringae pv.

lachrymans en pepino; y de suelo tales como Fusarium oxysporum f. sp. cubense en banano (Yedidia

et al., 2003., Thangavelu y Gopi, 2015., Bissett al., 2015).

De acuerdo con Fernández (2001) y Vallejo (2014), es importante destacar que se pueden realizar

diferentes formulaciones con el hongo Trichoderma spp, sin embargo, estos formulados no poseen

el mismo efecto en todas las zonas agroecológicas debido a las diversas condiciones ambientales

consiguiendo elevar o disminuir su efectividad, por lo tanto, es pertinente realizar investigaciones

especificas en cada región agrícola (Falconí, 2010).

García, Durán y Riera (2006), mencionan que el material seco es el preferido para la elaboración de

formulaciones, debido a que, en la posterior comercialización del producto, son el peso y la

manipulación aspectos muy importantes del formulado. También se considera que las hifas son

poco resistentes al secado, por lo que se trabaja con las formas reproductoras (conidias y

clamidosporas). De esta forma, el tipo de formulación dependerá de la metodología de aplicación,

sitio de acción, condiciones ambientales, entre otros factores (Pavone, 2012).

Con la finalidad de promover estrategias biológicas para el control de plagas, el presente trabajo

tuvo como objetivo el desarrollo de cuatro prototipos de bioformulaciones a base de conidias de

Trichoderma asperellum mezcladas con varios ingredientes inertes que mejoren sus niveles de

sobrevivencia y almacenamiento; este microorganismo fue escogido por sus cualidades de

antagonismo y mecanismo de acción frente a nematodos fitopatógenos, según investigaciones

previas realizadas en el cultivo de banano en el INIAP-Estación Experimental Litoral Sur en el año

2010.

2

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Control biológico

El control biológico (CB), es un medio ecológicamente efectivo y específico que permite mitigar

poblaciones de plagas con el uso de uno o más organismos benéficos (enemigos naturales),

reduciendo el nivel de daño económico. Entre los agentes biocontroladores o enemigos naturales

de patógenos están las bacterias, hongos, parasitoides y depredadores entre otros (Nicholls, 2008).

Existen diversas formas para la implementación del CB, entre las que se destacan la importación o

introducción de agentes foráneos conocido como control clásico; la conservación o aumento de

enemigos naturales, preservando el agente benéfico nativo y las condiciones para que este

aumente su población y actué contra la plaga; otra forma es la aplicación de plaguicidas

microbianos (incluidos virus, bacterias, hongos, protozoos, nematodos o sus bioproductos),

alternativa más promisoria debido a su baja toxicidad y su potencial de permanecer en el

ecosistema aplicado (Quiroga, 2009).

Entre las ventajas de utilizar organismos biocontroladores está la seguridad durante su aplicación,

al no ser nocivo para humanos, cultivos y el ambiente; considerando que no afecta a otros

organismos benéficos y fauna útil, siendo totalmente compatible con los conceptos de manejo

integrado de plagas y agricultura sostenible (Rubio y Fereres, 2005).

Entre los géneros de hongos mayormente utilizados como agentes de control biológico se

encuentra Trichoderma que puede ejercer una actividad antagonista mediante diferentes

mecanismos de acción frente a distintos organismos patogénicos (Pavone, 2012).

2.2. Trichoderma sp.

Person describió el género Trichoderma en 1794, basándose en el material recogido en Alemania;

posteriormente, Rifai en 1969 hizo el primer agrupamiento de especies que se utiliza hasta el

presente (Martínez, Danay y Reyes, 2013). Este género reúne una gran cantidad de especies

ampliamente distribuidas en casi todos los tipos de suelos y ambientes, en especial con materia

orgánica en descomposición como madera y hojarasca; poseen importancia económica por su

diversa capacidad metabólica y agresiva competencia natural (Pavone, 2012).

Trichoderma es un género anamórfico cuya forma sexual es Hypocrea, considerado como un

excelente agente de control biológico por su alto nivel de diversidad genética y su eficiencia. Se

encuentra en una amplia gama de productos comerciales para el control de ciertos patógenos como

Rhizoctonia y Sclerotinia efecto que lo identificó por primera vez Weindling en 1930 (Martínez et

al., 2013., Sosa, Pérez, Molina y Rumbos, 2011). Especies como T. harzianum, T. atroviride,

T. asperellum entre otras, son capaces de controlar diferentes patógenos de plantas por

mecanismos de acción específicos (Casimiro, 2001).

Características macroscópicas de las colonias de Trichoderma definen en su inicio una coloración

blanquesina, que se torna a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es ralo

en su mayoría, y visto al microscopio es fino. Sus conidióforos son ramificados y terminan en fiálides

donde se forman las esporas asexuales o conidias, de gran importancia para la identificación

3

taxonómica a nivel de especies. Las conidias aseguran las generaciones del hongo durante gran

parte del período vegetativo de las plantas (Infante et al., 2009).

2.3. Mecanismos de acción de Trichoderma

La habilidad de Trichoderma spp. para reducir daños causados por hongos fitopatógenos está

relacionada a su fuerte capacidad competitiva y persistencia en el ambiente. Los principales

mecanismos de acción que el hongo emplea son competencia, antibiosis, micoparasitismo e

inclusive inducción de resistencia (Casimiro, 2001), estos mecanismos pueden ser afectados por el

tipo de suelo, humedad de la planta y el ambiente, temperatura, pH y otros miembros de la

microflora (Chávez, 2011).

2.3.1. Competencia

La competencia es el comportamiento distinto entre dos o más organismos ante un mismo

requerimiento, reduciendo la cantidad necesaria para los demás por aprovechamiento del

microorganismo benéfico (Martínez et al., 2013). Se puede originar competencia por los sitios de

infección, donde la ocupación por un microorganismo impide la colonización por otro o bien por

determinados nutrientes. En la competencia por nutrientes o bien cierto microorganismo posee

un mejor mecanismo de absorción o enzimas extracelulares más activas en comparación a otro,

de forma que obtiene más nutrientes y mayor crecimiento (Rubio y Fereres, 2005). La competencia

por nutrientes de Trichoderma, es principalmente por carbono, nitrato y hierro (Martínez et al.,

2013).

El hongo Trichoderma es considerado un excelente competidor por espacio y recursos nutricionales

debido a su alta plasticidad ecológica, velocidad de crecimiento y desarrollo (Martínez et al., 2013).

Este antagonista está adaptado para una colonización agresiva de los sustratos y en condiciones

adversas forma clamidosporas; factores como crecimiento, abundante esporulación y la amplia

gama de sustratos sobre los que puede crecer, cantidad enzimas, lo convierte en un hongo saprofito

muy eficiente excelente agente de control biológico (Infante et al., 2009). Los nutrientes de mayor

demanda para Trichoderma son carbono, nitrato y hierro (Martínez et al., 2013).

2.3.2. Antibiosis

La antibiosis es la acción directa de antibióticos o metabolitos tóxicos producidos por un

microorganismo sobre otro sensible a estos (Infante et al., 2009). Trichoderma produce

principalmente tres tipos de compuestos: peptaibols, poliketidos y terpenos, los cuales pueden ser

volátiles o solubles, tales como: ácido harziánico, alameticina, tricolina, peptaiboles, antibióticos,

6-pentil-α-pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisopreninas, ácido heptelidico, entre otros

(Pavone, 2012), algunos inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen

contacto físico (Infante et al., 2009).

Algunas especies de Trichoderma producen compuestos antifúngicos que actúan sobre

Rhizotocnia solani y S. rolfsii ocasionando la degradación de sus hifas, otras especies producen la

inhibición in vitro de la germinación de conidias de Botrytis cinerea Pers. Con relación al efecto de

Trichoderma sobre nemátodos se ha encontrado que las quitinasas y proteasas de Trichoderma

4

spp. son muy similares a las de los hongos nematófagos, lo cual les da el potencial para atacar a

estos invertebrados. El proceso parasítico y el efecto de las enzimas y metabolitos de Trichoderma

sobre nematodos pueden ocurrir en el suelo, en el interior de las raíces o sobre la superficie de

estas (Martínez et al., 2013).

Sin embargo se debe considerar que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de acción de

un antagonista, ya que existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno resistentes al antibiótico

(Infante et al., 2009).

2.3.3. Micoparasitismo

Según el modo de micoparasitismo los hongos se dividen en dos grupos biotróficos o necrotróficos

(Casimiro, 2001). Los biotróficos tienen un rango de hospedantes restringido y producen

estructuras especializadas para absorber los nutrientes de sus células, se han encontrado pocos

casos de agentes de biocontrol de este tipo, entre ellos esta Sporidesmiun sclerotivorum Uecker y

Ampelomyces quisqualis (Memenza, 2009). Los necotróficos matan a la célula antes o después de

la invasión absorbiendo los nutrientes, no son especializados y tiene un amplio rango de

hospederos su actividad antagónica se da por la producción de antibióticos, toxinas y enzimas

hidrolíticas que matan y destruyen al patógeno, los géneros más comunes en este grupo son

Trichoderma, Pythium, Talaromyces, Coniothyrium y Gliocladium (Casimiro, 2001).

Trichoderma produce exoenzimas hidrolíticas que facilitan la degradación de la pared celular del

hospedero (Memenza, 2009), permitiendo su ingreso y uso del contenido celular para su

alimentación, ejerciendo de esta manera el control. Entre las enzimas que actúan en este

mecanismo se encuentran las quitinolíticas, las β-glucanasas o celulasas, las liasas, las proteasas y

lipasas, siendo las dos primeras las más importantes en el proceso de control, pudiendo incluso

actuar de forma sinérgica (Pavone, 2012).

Se ha evidenciado que Trichoderma posee diferentes tipos de interacción hifal para realizar

parasitismo, considerando esta acción como una potencialidad para su uso como biorregulador de

hongos del suelo. En pruebas realizadas sobre F. oxysporum f. sp. cubense, Pythium sp. y

Rhizoctonia solani se ha encontrado enrollamiento y penetración de hifas de Trichoderma las cuales

reducen la población del patógeno y evidencian su capacidad de micoparasitismo (Infante et al.,

2009).

2.3.4. Inducción de resistencia

Consiste en la inducción del sistema de defensa que da resistencia al hospedero frente a patógenos

por la interacción con un microorganismo no patógeno. Cuando se induce la resistencia la planta

expresa una serie de genes que confieren resistencia como 1,3-b-glucanasas, fitoalexinas, genes

relacionados con el refuerzo de la pared celular como peroxidasas y la deposición de lignina, callosa

y glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y proteínas relacionadas con patogénesis, proteínas (PR)

(Rubio y Fereres, 2005).

Estudios recientes a niveles celular y molecular explican la diversidad de vías y mecanismos de

acción de Trichoderma, se ha descubierto que algunas cepas de este hongo pueden activar un

5

mecanismo nativo de defensa en las plantas, conocido como Inducción de Resistencia Sistémica

(por sus siglas en inglés IRS). Esto supone que puedan controlar a patógenos distantes del lugar

donde se encuentra físicamente el antagonista. Prueba de ello, fue la colonización de las raíces de

pepino con T. asperellum, la cual indujo resistencia a Pseudomonas syringae pv. lachrymans.

También existen evidencias de este modo de acción frente a nematodos (Martínez et al., 2013).

2.3.5. Trichoderma asperellum

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE Trichoderma asperellum

Reino: Fungi

División: Ascomycota

Subdivisión: Pezizomycotina

Clase: Sordariomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocreaceae

Género: Tel= Hypocrea; An= Trichoderma

Especie: asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg

(Flores, 2013)

2.4. Bioformulaciones generalidades

Las formulaciones biológicas consisten en la mezcla física de uno o más principios biológicamente

activos (mohos, levaduras, bacterias, virus o nemátodos) de acción biocontroladora, con

ingredientes inertes para mejorar la eficiencia, estabilidad y manejo del producto (Agamez et al.,

2009).

El desarrollo de un bioformulado implica el seguimiento de diferentes etapas que aseguren la

obtención de un producto seguro, eficaz y confiable. El ingrediente activo (microorganismo) debe

ser aislado y seleccionado de acuerdo con su actividad biológica, pero antes de que este

microorganismo sea utilizado, debe ser caracterizado para garantizar que su utilización no

represente un riesgo para la salud humana, animal o para la sanidad vegetal. Además, el

microorganismo debe ser conservado bajo condiciones que mantengan sus características

genéticas y fisiológicas (Contreras, 2003).

Las funciones básicas del bioformulado son mantener estable el microorganismo durante la

producción, distribución y almacenamiento; facilitar la manipulación y aplicación del producto de

manera que sea fácilmente suministrado al patógeno y de la forma más apropiada, proteger el

agente biocontrolador su patogenicidad en el sitio de acción mediante aumento de su actividad,

reproducción, contacto y la interacción con el patógeno especifico (Burges, 1998).

Por todo esto, las etapas de preformulación y formulación son etapas críticas en el desarrollo de un

bioformulado. La etapa de preformulación es aquella encaminada a determinar las características

del microorganismo utilizado como principio activo y los cambios físicos, químicos y microbiológicos

que éste pueda sufrir al ser combinado con los auxiliares de formulación (Contreras, 2003).

6

2.5. Tipos de formulaciones

La formulación de microrganismos puede dividirse en dos grupos sólidos secos o líquidos.

Actualmente las formulaciones sólidas más ampliamente usadas son los polvos, gránulos, cápsulas,

cebos, briquetas y dentro de las líquidas se encuentran suspensiones concentradas, aerosoles y

concentrados emulsionables (Quiroga, 2009).

2.6. Formulaciones sólidas

2.6.1. Polvos

Los polvos son compuestos producidos por la mezcla del ingrediente activo con un material inerte

que actúa como diluyente o transportador (Carrier) el cual normalmente posee una capacidad

absorbente. Los diluyentes comúnmente empleados en este tipo de formulación son talcos de

silicatos, minerales de sílice en proporciones variadas según la densidad deseada (Quiroga, 2009).

Se caracterizan por tener un tamaño ideal de partícula que oscila desde 5 y 20 µm considerando

que las partículas menores a 10 µm son abrasivos e insecticidas y pueden provocar peligro de

inhalación para quien lo manipula. Este formulado contiene generalmente menor al 10% de

ingrediente activo (Burges, 1998).

Los tipos más comunes de polvos son, polvos para espolvoreo, los cuales pueden ser aplicados

directamente sobre las plantas o el suelo y polvos para reconstituir o mojables, los cuales

predominan entre los primeros productos comerciales y comprenden polvos técnicos mezclados

con aditivos (excipientes) para hacerlos estables durante el almacenamiento en la estantería y

fácilmente miscibles con agua para su aplicación por aspersión (Burges, 1998., Padin et al.,

2013.,Quiroga, 2009).

2.6.2. Polvos mojables

Un polvo mojable debe formar una adecuada suspensión en agua, por lo cual necesita de

considerable agitación para evitar la sedimentación. Entre las propiedades importantes de los

polvos mojables deben citarse la fluidez, la humectabilidad, la baja producción de espuma, la

estabilidad física y química, la suspendibilidad y el tamaño de partícula. La suspendibilidad es la

capacidad de un sólido de mantenerse en suspensión en un medio líquido por el mayor tiempo

posible sin depositarse en el fondo del recipiente o depositándose en la mínima cantidad posible

(Ramírez, 1982).

2.6.3. Granulados

Las formulaciones granulares contienen el principio activo en un medio sólido adecuado para llevar

a cabo la aplicación directa. Un producto granular debe ser seco, fluir libremente, sin tendencia a

aglomerarse, con índice de polvos bajo, tamaño uniforme de las partículas y presentar estabilidad

del principio activo (Contreras, 2003).

Los materiales inertes que sirven como soporte en este tipo de formaciones pueden ser zeolita,

vermiculita, caolinita, entre otros; capaces de absorber o de recubrirse con el resto de los

excipientes y el ingrediente activo. Típicamente la concentración del ingrediente activo va desde 5

7

a 20 % (Burges, 1998., Quiroga, 2009). Se caracterizan por tener un rango de tamaño mayor que

polvos los cuales oscilan entre 100 y 6 000 micrones (Padin et al., 2013).

Los excipientes utilizados para un granulado comprende agentes estabilizantes que se añaden para

evitar pérdidas del ingrediente activo durante el almacenamiento, agentes humectantes para

mejorar la eficacia, la lixiviación y percolación en el suelo, agente anti aglomerante para conservar

la fluidez del material y un vehículo diluyente inerte que puede ser mineral (zeolita, vermiculita,

diatomitas, Caolinitas, carbonatos), materiales extruidos (arcillas extruidas) y materiales orgánicos

(cáscaras de arroz o de maíz, etc.)(Ramírez, 1982).

En la formación de granulados los componentes más importantes son el principio, los diluyentes,

adherentes y el solvente. Las propiedades físicas del formulado como densidad, tamaño de

partícula, solubilidad y humectabilidad son críticas en la calidad y características finales de un buen

gránulo (Agamez et al., 2009).

Los diluentes más comunes son azúcares como la lactosa y la sacarosa y varias sales inorgánicas

como fosfato de calcio y sulfato de calcio y polímeros naturales como la celulosa y el almidón. Un

adherente es un material añadido a la formulación para causar que las partículas individuales se

adhieran durante la granulación para así aumentar el tamaño de partícula y generar un material de

libre flujo, el almidón, la gelatina y la sacarosa actúan como adherentes, hoy en día. El solvente de

mayor importancia y más utilizado es el agua, aunque no es parte del granulado final ya que es

removido en el secado, dependiendo de los ingredientes de la formulación se puede utilizar otros

solventes como el etanol (Contreras, 2003).

Entre los tipos de granulados, se encuentran los granulados encapsulados (cubiertos), solubles,

dispersables, macro y micro granulados (Agamez et al., 2009).

2.6.3.1. Gránulos cubiertos

Es un proceso de granulación en el cual las partículas de polvo y el ingrediente activo son agregados

sobre un soporte los cuales son agrupados mediante la utilización de un agente adherente. Este

tipo de granulación consume menos tiempo y por lo tanto es más económica que la granulación en

húmedo (Contreras, 2003).

2.6.3.2. Gránulos dispersables

Los gránulos dispersables están formados de sustancias finamente fragmentadas que se

comprimen en gránulos durante el proceso de composición y elaboración. Al ser colocados en agua

tienden a dilatarse y a separarse en las partículas originales finamente fragmentadas. Los requisitos

de una formulación de gránulos dispersables incluyen buena dispersabilidad, fragmentación en

partículas que pasen a través de mallas y toberas durante la operación de rociado y la estabilidad

de las propiedades físicas (Agamez et al., 2009).

2.7. Formulación líquida

2.7.1. Concentrados emulsionables

Estos constan del ingrediente activo suspendido en un vehículo oleoso acompañado de los

coadyuvantes necesarios, de manera que al mezclarse con agua se forme una emulsión estable.

8

Toda emulsión forma un sistema constituido por dos fases, el agua o fase continua y el líquido

emulsionable o la fase dispersa (Quiroga, 2009).

Cuando en el concentrado emulsionable se agrega agua, se forma una emulsión estable constituida

por pequeñas gotas del vehículo oleoso que contienen el principio activo y que están dispersas en

el agua. El emulsificante actúa para mantener las gotas de aceite bien dispersas y evitar la

coalescencia de las mismas (Contreras, 2003).

Con el fin de producir emulsiones estables, deben aplicarse surfactantes adecuados, los cuales

pueden presentar en su estructura cadenas polares hidrofílicas (solubles en agua) o no polares

lipofílicas (solubles en aceite) (Burges, 1998).

2.8. Estabilidad de bioformulaciones en almacenamiento

Durante el almacenamiento, los microorganismos presentes en un bioformulado pueden sufrir

alteraciones debido a factores del proceso de manufactura del producto, como el medio de cultivo

utilizado para la producción masiva del microorganismo, el proceso de congelamiento, secado y la

utilización de agentes protectores de secado. Además, el microorganismo también puede ser

afectado por la interacción de éste con los auxiliares de formulación y por las condiciones de

almacenamiento que incluyen la temperatura, la exposición a la luz, la atmósfera, la humedad

relativa e incluso el material y el tipo de envase que sea utilizado (Abadías et al., 2001).

La posibilidad de llevar a cabo la utilización de agentes biocontroladores a nivel comercial está

determinada en gran medida por la estabilidad de las formulaciones, debido a que la utilización y

aplicación de los microorganismos se hace más segura y fácil si se encuentran formulados, también

las formulaciones optimizan la vida útil de un producto, así como la eficacia del mismo (Contreras,

2003).

El almacenamiento a bajas temperaturas y en un ambiente libre de humedad son condiciones que

disminuyen la actividad metabólica de los microorganismos, para así prevenir la acumulación de

metabolitos tóxicos y la utilización de nutrientes para lograr mantener la estabilidad de las

características microbiológica durante el almacenamiento (Sabaratnam y Traquair, 2002).

2.9. Control de calidad de bioformulados

Una característica esencial en la producción de cualquier agente de control biológico es la

implementación de un sistema de control de calidad para las características fisicoquímicas y

microbiológicas que presenta el formulado. Las especificaciones del producto, acompañadas del

control de calidad, ayudan a maximizar los rendimientos, estandarizar costos de producción,

brindar confianza a los usuarios y mantener los estándares de calidad óptimos (Quiroga, 2009.,

Vélez et al., 1997).

Para plaguicidas en general, existen protocolos aprobados internacionalmente por la Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la

Salud (OMS) elaborados por entidades como el Consejo Internacional para la Colaboración en los

Análisis de Plaguicidas (CIPAC) y la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) (FAO y OMS,

2004).

9

2.10. Características microbiológicas de las formulaciones

2.10.1. Concentración de colonias en Unidades formadoras de colonia (UFC/g o

ml)

La cuantificación de conidias permite determinar el número de unidades infectivas por unidad de

peso o volumen existentes en una formulación y sirve de base para establecer la dosificación del

producto (Vélez et al., 1997).

2.10.2. Porcentaje de germinación de conidias (%)

Esta prueba establece la viabilidad del ingrediente activo de la formulación, en un tiempo

determinado y nos permite conocer la cantidad de conidias viables por unidad de peso o volumen.

Una formulación comercial debe tener una germinación superior al 85% en un tiempo de

incubación de 24 horas. Lo anterior, debido a que al asperjar el formulado en campo el ingrediente

activo debe tener una rápida ambientación y efecto sobre el patógeno (Vélez et al., 1997).

El porcentaje de germinación se obtiene con la siguiente fórmula:

a/(a+b) x 100

Donde:

a = conidios germinados

b = conidios no germinados

(Berlanga y Hernández, 2006)

2.10.3. Prueba de pureza

La prueba de pureza tiene como finalidad establecer la proporción del agente biológico y los

microorganismos contaminantes en la formulación (Vélez et al., 1997). Los niveles de

contaminación aceptables en productos comerciales de bioformulaciones deben ser < 0,1%, con un

límite mínimo de 99% de pureza (Berlanga y Hernández, 2006).

2.11. Características fisicoquímicas de las formulaciones

“La doctora Villamizar expuso que las características fisicoquímicas deben ser evaluadas según el

tipo de formulación, durante el proceso de manufactura y el periodo de almacenamiento en las

temperaturas establecidas, con el fin de garantizar y comprobar la calidad del producto”.

(Villamizar, comunicación personal 18 de enero de 2018)

2.11.1. pH

El pH es la medida de la acidez o alcalinidad determinada en términos de la cantidad de iones

hidrógeno que posee la formulación (Quiroga, 2009). El valor de pH influye en la germinación del

ingrediente activo, retardándolo en valores extremos. Se consideran intervalos óptimos de pH los

valores entre 5,5 y 7,0% (Vélez et al., 1997)

10

2.11.2. Porcentaje de humedad (%)

La humedad es una variable física definida formalmente como la cantidad de agua que contiene un

material, es un parámetro determinante en la estabilidad de productos cuyo principio activo es un

microorganismo (Contreras, 2003., Quiroga, 2009).

En formulaciones biológicas con excipientes como talco, bentonita, leche y tierra de diatomeas, se

presentan porcentajes de humedad que oscilan entre 3 y 5 %, valores que retardan ligeramente el

proceso de germinación, mantienen en latencia al agente biocontrolador, permiten un mejor

almacenamiento y prolongan la viabilidad de las conidias por más tiempo (Quiroga, 2009., Vélez et

al., 1997).

Humedades mayores del 80% proporcionan condiciones favorables para el desarrollo de

microorganismos tales como bacterias y levaduras que entran a competir con el agente biológico y

reducen su viabilidad (Vélez et al., 1997).

En formulaciones granuladas y polvos la humedad elevada puede influir en sus características y

conservación debido a que su exceso puede dar lugar a adhesión entre granos y partículas,

facilitando el crecimiento de microorganismos contaminantes por la aparición de grumos o

aglomerados (Quiroga, 2009).

2.11.3. Humectabilidad (min)

Capacidad que tiene un sólido para humedecerse completamente. Esta prueba se realiza solo a

productos formulados en polvos, talcos, bentonitas, tierra de diatomáceas y leche entre otros

(Vélez et al., 1997). El tiempo que tarda el formulado en tener una humectabilidad completa

permite al productor dar una recomendación antes de aplicación como es la agitación vigorosa del

producto por un tiempo determinado (Santos et al., 2012).

2.11.4. Suspendibilidad (%)

La suspendibilidad es definida como la cantidad de principio activo en suspensión después de un

tiempo establecido de reposo (Vélez et al., 1997). Esta prueba tiene como propósito asegurar que

una cantidad suficiente de ingrediente activo esta homogéneamente dispersa en la suspensión a

fin de mantener una mezcla satisfactoria y eficaz durante la aplicación y evitar el taponamiento de

boquillas (FAO y OMS, 2004).

Se consideran valores óptimos de suspendibilidad los que presentan más del 50 % de ingrediente

activo en suspensión para formulaciones de polvos mojables y gránulos dispersables y 60% para

concentrados emulsionables, todos los productos son evaluados después de 30 minutos de iniciada

la suspensión (Figueres, 1998). En polvos mojables reducir el tamaño de la partícula hasta que estás

queden excepcionalmente finas aumenta la capacidad de suspensión en agua (Agamez et al.,

2009).

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2.11.5. Tamaño de la partícula (%)

Algunas propiedades físicas y químicas de las diferentes formulaciones, incluidas la uniformidad de

contenido, textura, color y estabilidad se ven afectadas por la distribución de tamaño de la partícula

(Quiroga, 2009).

Para determinar el tamaño y distribución de frecuencia de las partículas se dispone de métodos

como gravimetría que consiste en pasar una muestra de producto por una serie de tamices de

apertura conocida y pesar la porción de partículas que conserva cada tamiz. Los resultados se

expresan en porcentaje correspondiente al tamaño de poro en el que queda retenida la mayor

cantidad de producto. Una buena formulación presenta tamaños homogéneos y no dispersos, es

decir, que la dispersión sea lo más pequeña posible y la mayoría de las partículas se encuentre en

un mismo rango nominal (Contreras, 2003., Quiroga, 2009).

Para polvos mojables se considera adecuado un tamaño de partícula menor 50 µm limite que evita

el taponamiento de boquillas al momento de aplicación (FAO y OMS, 2004).

2.11.6. Actividad de agua (aw)

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.

Cuando un microorganismo se encuentra en un sustrato con una actividad de agua menor que la

que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no está relacionada a la

muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de latencia durante un

tiempo. En el caso de las esporas, la fase de latencia puede ser considerada prácticamente ilimitada

(Equinlab, 2009).

Los valores mínimos de actividad para el crecimiento óptimo de diferentes tipos de

microorganismos son, los siguientes: bacterias aw > 0.90, levaduras, aw > 0.85 y hongos filamentosos

aw > 0.80, estos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (más

secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras (Heer, 2007).

2.11.7. Densidad apisonada (g/ml)

La densidad de una formulación sólida se define como la relación que existe entre la masa y el

volumen ocupado por esta. Se pueden medir diferentes tipos de densidades que pueden ser

densidad volumétrica (sin comprimir) más conocida como densidad aparente y densidad

volumétrica comprimida o densidad apisonada, la cual se refiere al vehículo o formulación luego de

su compactación por distintas técnicas, de modo que sus partículas se orienten conforme a su mejor

acomodamiento, eliminando el aire entre ellas. Indica el máximo peso de una sustancia que puede

ser envasada en un recipiente de un volumen dado, y es de utilidad para predecir el

comportamiento de las formulaciones sólidas durante el manipuleo, transporte y almacenamiento.

La densidad aparente se expresa en g/ ml (Padin, et al., 2013., Quiroga, 2009).

Los límites de densidad apisonada son establecidos por el productor, según sus protocolos de

elaboración de formulaciones sólidas (FAO y OMS, 2004). Para obtener una manufactura eficaz de

formulaciones en polvos se requiere una densidad apisonada de hasta 1 g/ml (Torres, 2009).

12

2.11.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml)

La definición de estabilidad es mejor entendida si se habla en términos de inestabilidad, en una

emulsión inestable ocurrirán una serie de cambios que pueden ser observados y cuantificados. Por

ejemplo, la separación de fases de diferente color y de diferente densidad y el incremento del

tamaño de partícula visible bajo microscopía. Estos cambios pueden considerarse poco importantes

para la utilización de la estabilidad, por lo cual son inestabilidades menores. Las estabilidades

menores como el cremado, el ligero cambio de color o la formación de una delgada capa en la

superficie, son reversibles, es decir que el estado de una perfecta emulsión puede ser restaurado

fácilmente. Del otro lado, se pueden presentar inestabilidades mayores que alteran las

propiedades para el uso de la emulsión. Estos cambios, como el rompimiento de la emulsión y la

reversión de fases, son irreversibles, ni la agitación, ni los tratamientos prolongados en maquinaria

emulsificante lograrán reestablecer satisfactoriamente el producto (Contreras, 2003).

La calidad de una emulsión se evalúa determinando la separación espontánea de fases, en un

tiempo específico mediante evaluación óptica. Se considera estable la emulsión cuando cumple con

los siguientes requisitos referentes al cremado en reposo:

- A los 0 minutos presenta una emulsificación completa y espontánea

- A los 30 minutos se puede observar 2.0 ml de cremado máximo

- A la 1 hora presenta 3.0 ml de cremado máximo

- A las 24 horas es capaz de reemulsificarse completamente

Durante el proceso de análisis (24 horas), no debe de presentarse en ningún momento separación

de agua, si en cualquiera de los tiempos establecidos el cremado o el aceite sobrepasan los límites

señalados, se considera que la emulsión no es estable y que por ello no cumple con la norma de

calidad (Figueres, 1998., Quiroga, 2009).

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Ubicación

La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Control Biológico del Instituto Nacional

de Investigaciones Agropecuarias, INIAP-ECUADOR, Estación Experimental Santa Catalina.

3.2. Ubicación política

País: Ecuador

Provincia: Pichincha

Cantón: Mejía

Parroquia: Cutuglagua

Lugar: INIAP-Estación experimental Santa Catalina

3.3. Ubicación geográfica

Latitud: 00°22’ 57.33’’ S

Longitud: 78°33’18.46’’ O

Fuente: Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (INAMHI), 2018

3.3.1. Características del laboratorio

Temperatura Máxima: 22°C

Temperatura Mínima: 12°C

Temperatura Promedio: 17°C

Humedad relativa Promedio: 65%

Fuente: Dattaloger, laboratorio de control biológico, 2018

3.4. Materiales

3.5. Material biológico

- Trichoderma asperellum proveniente de INIAP-ECUADOR, Estación Experimental–

Litoral Sur.

3.6. Material de Laboratorio

- Algodón

- Bandejas plásticas

- Bisturí (mangos y hojas respectivas)

- Cajas Petri de vidrio de 10 ml

- Cedazo

- Cronómetro

- Desecador

- Embudo

- Envases de vidrio color ámbar (capacidad 500ml)

- Estanterías metálicas

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- Frascos autoclavables de 500ml, 1000 ml y 2000ml (BOECO)

- Fundas metalizadas stand ups con zipper, 16 x 24 cm (capacidad 500g)

- Fundas de papel 8 x12 cm

- Gradillas

- Jeringuillas (10 ml y 60 ml)

- Libro de campo

- Material de protección (mandil, guantes, mascarillas, cofia, gafas)

- Micropipetas de 100 µl y 1000 µl (THERMO SCIENTIFIC)

- Mechero de vidrio de alcohol

- Papel parafilm

- Papel aluminio

- Pipetas de 10 ml

- Pinzas

- Porta y cubre objetos

- Probetas (50 ml, 100 ml, 250 ml y 1000 ml)

- Puntas para micropipetas (1000 µl y 100 µl)

- Regla metálica 30 cm

- Soporte metálico

- Tabla de 20 x 25,5 cm con 3 cm grosor

- Tubos de ensayo (capacidad 15ml)

- Vasos de precipitación (250 ml, 400 ml, 600 ml)

3.7. Reactivos

- Agua destilada

- Agua desionizada

- Alcohol 70%

- Alcohol 90%

- Aceite de parafina

- Ácido láctico

- Almidón de yuca

- Arroz pilado

- Goma Gellan 1%

- Goma Xanthan

- Papa Dextrosa Agar (Difco)

- Silica Gel

- Sacarosa (azúcar)

- Talco sin olor

- Tritón x-100 (LOBAL chemie)

- Zeolita

- Bentonita sódica

3.8. Equipos

- Agitador magnético (THERMO SCIENTIFIC)

- Autoclave

- Balanza analítica (OHAUS)

15

- Cámara de flujo laminar (THERMO SCIENTIFIC)

- Cámara de Neubauer (Marienfeod)

- Cámara de microscopio (MEM1300)

- Deshumificador (M&Z corporación)

- Estufa (memmert SN 30)

- Incubadora (THERMO SCIENTIFIC)

- Medidor de actividad de agua (AQUA-LAB 4TE)

- Medidor de porcentaje de humedad (BOECO BMA I50)

- Microscopio óptico (Olympus) Bx41

- pH-metro digital de mesa (HACH Sension 3)

- Refrigeradora

- Vórtex (Mixer VM- 300)

3.9. Métodos

La investigación se realizó durante 6 meses, evaluando mensualmente características fisicoquímicas

y microbiológicas de los prototipos de bioformulaciones, bajo condiciones de almacenamiento a

4°C y 30°C tomando como fundamento lo expuesto por Santos et al. (2012), quien considera un

lapso de seis meses como periodo de tiempo apropiado para realizar evaluaciones confiables en

bioformulaciones con microorganismos.

3.9.1. Microorganismo experimental Trichoderma asperellum

En el presente trabajo se utilizaron conidias liofilizadas de Trichoderma asperellum obtenido e

identificado en el INIAP- Estación Experimental Litoral Sur (Anexo 1), mismo que es utilizado por

presentar características de inducción de resistencia sistémica en las plantas y evitar proliferación

de plagas (Martínez et al., 2013).

Las conidias liofilizadas se conservaron en desecadores conteniendo perlas de silica gel hasta el

momento de su reactivación y multiplicación en sustrato sólido.

Figura 1: Colonias del hongo Trichoderma asperellum. Fuente: La autora.

3.9.2. Producción masiva de Trichoderma asperellum.

El hongo requerido fue multiplicado en cajas Petri y posteriormente sobre sustrato sólido (arroz

pilado), según metodología utilizada en el Laboratorio de Control Biológico del INIAP – EESC.

16

En 4 tubos Eppendorf con 1000 µl de agua destilada estéril y tritón al 0,1% se preparó una

suspensión de las conidias liofilizadas, utilizando una alícuota del hongo Trichoderma asperellum

para cada tubo, posteriormente se agitó vigorosamente en vórtex homogenizando la suspensión y

se sembraron 100 µl en cada caja Petri conteniendo medio de cultivo según especificaciones de la

tabla 3; se sembraron 10 cajas Petri por tubo Eppendorf.

Cuadro 1: Medio de cultivo para la multiplicación de Trichoderma asperellum.

Componente Concentración

PDA (Papa Dextrosa Agar). 39 g/l

Ácido Láctico. Marca Panreac® 320 µl/l

Las cajas Petri sembradas se incubaron por el lapso de 7 días a una temperatura de 25°C. Para

promover la esporulación, se trasladaron las cajas Petri con Trichoderma asperellum a un área con

luz indirecta y fotoperiodo de 12:12 durante 7 días.

Para la multiplicación en sustrato sólido estéril (arroz pilado), se pesaron 2 000 g de arroz crudo por

lote, se sumergieron en agua caliente a 70 °C durante 20 minutos; se filtró el agua del arroz con un

colador y se colocó en una tela absorbente sobre una mesa durante 20 minutos a temperatura

ambiente de laboratorio. Se pesaron 100 g de arroz y se colocó en fundas plásticas de 8cm x 12cm,

se sellaron con grapas dejando un poco de aire dentro de la funda y se esterilizo en autoclave con

una presión de 15 libras y temperatura de 121°C.

Se preparó inoculo de Trichoderma asperellum en un frasco autocavable de 1000 ml con 200 ml de

agua destilada estéril, 200 µl de Tritón al 0.1% y 20 g de azúcar correspondiente al 10% del volumen

total. A la solución se añadió un raspado de micelio y conidias de 2 cajas Petri de 14 días de edad y

se procedió a inocular 100 g de arroz estéril con 10 ml de la solución preparada; el sustrato sólido

inoculado se incubó a 25°C por un lapso de 7 a 8 días hasta observar total crecimiento del hongo y

cobertura total del sustrato (se realizó remociones constantes del sustrato, para evitar

aglomeración y mantener aireación del hongo); el sustrato esporulado se trasvasó a fundas de

papel de 8cm x 12cm y se colocó en el área de secado (esta área contiene un deshumificador que

mantiene la temperatura a 18 °C y una humedad relativa entre 58 y 60 %), por el lapso de 7 días

(Anexo 7).

Figura 2: Producción masiva de Trichoderma asperellum a) multiplicación in vitro b) multiplicación

en sustrato arroz. Fuente: La autora.

17

3.9.3. Extracción de conidias de Trichoderma asperellum

La extracción de conidias se realizó a partir de sustratos sólidos de 7 días de secado, se empleó un

juego de tamices de 500 µm y 250 µm colocados en forma de columna, respectivamente; en el

primer tamiz se colocó el sustrato seco mientras que en el segundo tamiz por la parte inferior se

colocó una funda plástica para recolección de las conidias secas; se tapó la parte superior del primer

tamiz y se procedió a la extracción. Las conidias extraídas se almacenaron en un desecador con

silicagel y el material restante (granos de arroz y residuos) se colocó en fundas plásticas para su

desecho. Por cada 100 g de sustrato arroz seco se obtuvieron 3.5 g de conidias puras.

El proceso se repitió varias veces hasta obtener la cantidad de conidias necesarias para la

elaboración de los 4 prototipos de bioformulaciones.

Figura 3: Método de extracción y conservación de conidias secas de Trichoderma asperellum. Fuente: La autora.

3.10. Formulación de Trichoderma asperellum

3.10.1. Formulación del prototipo polvo mojable (WP)

Para el desarrollo del polvo mojable se utilizaron las conidias puras y secas de Trichoderma

asperellum, las cuales se mezclaron con excipientes inertes previamente seleccionados como

arcilla, minerales y almidón (Cuadro 2) a determinados porcentajes; los ingredientes a excepción

del almidón de yuca fueron secados y esterilizados durante 24 horas antes de la formulación, en

estufa Memmert SN 30 a 100 °C.

18

Figura 4: Mezcla de excipientes con el ingrediente activo (conidias puras y secas). Fuente: La autora.

Cuadro 2: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del polvo mojable

(WP).

Ingredientes Porcentajes (%)

Bentonita: talco (1:1) 86.91

Almidón de yuca 7.10

Conidias secas 5.99

Total 100.00

Fuente: Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC

El prototipo se realizó, utilizando el protocolo adaptado por el Laboratorio de Control Biológico del

INIAP- EESC, se formuló un lote de 3000 g (Figura 5).

En la formulación se pesaron 2607.36 g de bentonita y talco en proporción 1:1, mezclando

vigorosamente hasta homogenizar los excipientes, se adicionaron 213 g de almidón de yuca

evitando la formación de aglomeraciones, finalmente se incorporaron las conidias de Trichoderma

asperellum y se homogenizaron hasta obtener una sola tonalidad de la mezcla (Figura 4).

Figura 5: Prototipo de polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum. Fuente: La autora.

El lote de polvo mojable se dividió en 10 porciones (observaciones) de 300 g de peso, mismos que

se envasaron en fundas metalizada stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad 500 g. Las

porciones fueron almacenadas a dos condiciones de temperaturas, una mitad a refrigeración a 4°C

y otra a 30°C.

19

Figura 6: Empaque y etiquetado del producto polvo mojable (WP) a dos condiciones de

almacenamiento. Fuente: La autora.

Cuadro 3: Datos informativos correspondientes al etiquetado del polvo mojable.

Concentración teórica 3x108

Concentración real 6x108

Fecha de formulación 2017-08-02

3.10.2. Formulación del prototipo concentrado emulsionable (EC)

El concentrado emulsionable se elaboró mezclando las conidias puras y secas de Trichoderma

asperellum con excipientes inertes como aceite mineral y dispersante previamente seleccionados,

los porcentajes de cada ingrediente se muestran en el Cuadro 4.

Cuadro 4: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del concentrado

emulsionable (EC).


Conidias puras 8.33

Aceite de parafina 86.67

Tritón x-100 5.00

Total 100.00

Fuente: Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC

El prototipo se elaboró, utilizando el protocolo adaptado por el Laboratorio de Control Biológico

del INIAP- EESC, para lo cual se realizó un lote de producto de 3000 ml.

En la formulación de concentrado emulsionable, se midió un volumen de 2600.1 ml de aceite de

parafina al cual se adicionó un volumen de 150 ml de Tritón x-100, la solución se homogenizo

utilizando el Polytron PT 2100 a 15 000 rpm durante aproximadamente 5 minutos hasta observar

una mezcla homogénea con el dispersante, a esta mezcla se adicionaron 249.9 g de conidias puras

20

de Trichoderma asperellum y se homogenizó en el Polytron PT 2100 a 15 000 rpm durante

aproximadamente 3 minutos hasta obtener una mezcla homogénea.

Figura 7: Formulación del producto concentrado emulsionable (EC) a base de conidias de

Trichoderma asperellum. Fuente: La autora.

El lote de concentrado emulsionable se dividió en 10 porciones y se envasaron en frascos de vidrio

color ámbar con capacidad de 500 ml, en cada frasco se colocaron 300 ml del prototipo. Las

porciones fueron almacenadas a dos condiciones de temperaturas, una mitad a refrigeración a 4°C

y la otra a 30°C.

Figura 8: Empaque y etiquetado de porciones del producto concentrado emulsionable (EC). Fuente: La autora.

21

Cuadro 5:Datos informativos correspondientes al etiquetado del concentrado emulsionable.




3.10.3. Formulación del prototipo gránulo cubierto (CG)

Para el gránulo cubierto se utilizaron conidias puras y secas de Trichoderma asperellum, las cuales

se mezclaron con ingredientes inertes previamente seleccionados como goma, aceite vegetal,

arcilla y minerales (Cuadro 8 y Cuadro 9); los excipientes a excepción del almidón de yuca fueron

secados y esterilizados durante 24 horas antes de la formulación, en estufa Memmert SN 30 a

100°C.

Cuadro 6: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

cubierto (CG).


Zeolita 77.81


Talco 1.04

Biomatrix 16.98

Total 100.00

Fuente: Adaptado de AgResearch Nueva Zelanda

Cuadro 7: Porcentajes de ingredientes que forman el Biomatrix para gránulo cubierto


Agua con Tritón x-100 11.44

Aceite de Canola 0.52

Goma Xanthan 0.52

Conidias Puras 4.49

Total 16.97

Se elaboró el prototipo, utilizando el protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda, para lo

cual se realizó un lote de 3000 g.

En el gránulo cubierto se obtuvo el Biomatrix que contiene el principio activo para lo cual se

mezclaron 15.6 g de aceite de canola con 15.6 g Goma Gellan, se mezcló hasta formar una masa

homogénea y se añadieron 134,.7 g de conidias de Trichoderma asperellum y 343.40 ml de agua

con Triton x-100 al 0.1%. Se mezclaron hasta obtener una masa semi líquida que corresponde al

Biomatrix. Se tomaron 3 muestras de Biomatrix para obtener la concentración en UFC/g.

22

Figura 9: Elaboración del Biomatrix para la formulación de gránulo cubierto (CG). Fuente: La autora.

Al Biomatrix se incorporaron 2 334.3 g de Zeolita y se mezclaron hasta que todo el mineral se cubra;

posteriormente se agregaron 125 g de bentonita y talco en proporción 1:1 y se mezclaron hasta

recubrir el gránulo formado anteriormente, finalmente se adicionaron 31.2 g de talco. Los gránulos

cubiertos se colocaron en bandejas plásticas y se llevaron al área de secado a una temperatura de

18 °C y humedad relativa de 60 %, por un lapso de 24 horas.

Figura 10: Elaboración y secado del prototipo gránulo cubierto (CG). Fuente: La autora.

Después del secado el gránulo cubierto se dividió en 10 porciones (observaciones) las cuales se

envasaron en fundas metalizadas stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad de 500 g, en

cada funda se colocaron 300 g del prototipo. Las porciones se dividieron considerando las dos

temperaturas de almacenamiento 4°C y 30°C.

Las pruebas microbiológicas de este prototipo para el mes cero (formulación) se realizaron el día

de envasado del CG.

23

Figura 11: Empaque y etiquetado del gránulo cubierto (CG) para almacenamiento a dos

temperaturas. Fuente: La autora.

Cuadro 8: Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo cubierto.




Fecha de empaque 2017-11-15

Tiempo de secado (horas) 22

3.10.4. Formulación del prototipo gránulo dispersable (WG)

Para el desarrollo del gránulo dispersable se utilizaron las conidias puras y secas de Trichoderma

asperellum, las cuales se mezclaron con excipientes inertes previamente seleccionados como goma,

arcilla, minerales y almidón; los ingredientes y sus porcentajes se presentan en el cuadro 6; los

excipientes a excepción del almidón de yuca fueron secados y esterilizados durante 24 horas antes

de la formulación, en estufa Memmert SN 30 a 100 °C.

Cuadro 9: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

dispersable (WG).

Ingredientes Porcentaje (%)

Goma Gellan 0.83


Almidón de yuca 3.30

Conidias puras 7.10

Agua con Tritón x-100 al 0,1% 35.80

Total 100.00

Fuente: Protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda

24

El prototipo se elaboró, utilizando el protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda, para lo

cual se realizó un lote de 3000 g.

En la formulación de gránulo dispersable se pesaron 213 g de conidias puras, se adicionaron 24.9 g

de Goma Gellan y agua con Tritón x-100 al 0.1 %, se mezclaron hasta obtener una pasta homogénea

sin grumos. A la mezcla se adicionaron 1588.8 g de bentonita y talco en proporción 1:1 y 99.0 g de

almidón de yuca, se obtuvieron pellets o gránulos pequeños pasando la mezcla por un cedazo

plástico. Los gránulos se colocaron en el área de secado a una temperatura de 18 °C y una humedad

relativa de 60%, por un lapso de 22 horas.

Figura 12: Elaboración del Gránulo Dispersable (WG). Fuente: La autora.

Los gránulos dispersables se dividieron en 10 porciones (observaciones), envasadas en fundas

metalizadas stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad de 500 g, en cada funda se

colocaron 300 g del prototipo. Las porciones se almacenaron a dos temperaturas correspondientes

a refrigeración a 4°C y a 30°C.

Figura 13: Secado del Gránulo Dispersable (WG). Fuente: La autora.

Las pruebas microbiológicas para este prototipo en el mes cero (formulación) se realizaron el día

de envasado del producto.

25

Figura 14: Empaque y división de gránulos dispersables (WG) para almacenamiento a dos

temperaturas. Fuente: La autora.

Cuadro 10: Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo dispersable.




Fecha de empaque 2017-11-29

Tiempo de secado (horas) 24

3.11. Análisis de calidad microbiológica de bioformulaciones a base de

Trichoderma asperellum

El análisis de los prototipos se realizó mensualmente considerado el porcentaje de germinación y

la concentración de unidades formadoras de colonias (UFC). Las evaluaciones se realizaron a partir

del mes de formulación y durante seis meses bajo condiciones de almacenamiento a dos

temperaturas.

3.11.1. Porcentaje de germinación de conidias (%)

La determinación del porcentaje de germinación se realizó en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar

(PDA) (Cuadro 11), para lo cual se tomaron muestras de 1g o 1ml de cada prototipo almacenados a

las diferentes temperaturas.

Cuadro 11: Medio de cultivo utilizado en el porcentaje de germinación de conidias.


PDA (Papa Dextrosa Agar) 39 g/l

Las muestras se reconstituyeron en tubos con 9ml de agua destilada con dispersante (Tritón x-100

al 0.1%), se homogenizaron en vórtex por aproximadamente un minuto y se extrajeron alícuotas de

1ml de la suspensión inicial, a partir de esta, se realizaron diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-3

sembrándose en cajas Petri que contenían el medio de cultivo únicamente las diluciones 10-2 y 103.

Las muestras sembradas se incubaron durante 24 horas a temperatura de 25 °C, transcurrido este

26

tiempo se realizó el contaje de 100 conidias entre germinadas y no germinadas utilizando un

microscopio óptico con lente 40X, finalmente se registró el porcentaje de conidias germinadas en

relación con los datos registrados.

3.11.2. Determinación de la concentración de colonias en UFC/g o ml

La concentración de colonias se determinó utilizando la técnica de recuento en caja Petri en medio

de cultivo (Cuadro 12).

Cuadro 12: Medio de cultivo para cuantificación de colonias de Trichoderma asperellum


PDA (Papa Dextrosa Agar). 39 g/L

Ácido Láctico. 320 µl/ L

Tritón X – 100 0.1%

Mensualmente se tomaron muestras de 1g o 1ml de cada prototipo almacenado a las diferentes

temperaturas, las cuales fueron reconstituidas en tubos con 9ml de agua destilada con Tritón x-100

al 0,1%. La solución se homogenizó en vórtex por aproximadamente un minuto y se extrajo 1ml de

la suspensión a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas en agua con dispersante desde 101

hasta 10-6, las muestras se sembraron por duplicado en las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en cajas Petri

conteniendo el medio de cultivo. Las muestras sembradas se incubaron durante 7 días a 25°C, los

recuentos se realizaron en cajas Petri que contenían entre 10 y 99 colonias considerando una misma

dilución.

El calculó de la concentración de colonias se realizó aplicando la siguiente fórmula:

N° de UFC = (X) x (FD) x (FA)

Donde:

X = Promedio de 2 lecturas en cajas Petri de una misma dilución

FD = Factor de dilución

FA = Factor de ajuste

3.11.3. Determinación de la pureza

El contenido de contaminantes se evaluó reconstituyendo 1 g o 1 ml de las muestras de cada

prototipo en 9 ml de agua con Tritón x-100 al 0,1%. Se extrajo 1 ml de la suspensión y se realizaron

diluciones seriadas desde 10-1 a 10-4. Se sembraron las muestras por duplicado considerando la

dilución 10-4, se incubaron durante 7 días a una temperatura constante de 25°C. Se realizaron

contajes de colonias pertenecientes a Trichoderma asperellum, así como de los contaminantes. El

contenido de contaminantes se obtuvo aplicando la fórmula 1 y posteriormente se calculó el

porcentaje de pureza de las formulaciones, con la fórmula 2 (Berlanga y Hernández, 2006).

Fórmula 1:

𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐚 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐚𝐦𝐢𝐧𝐚𝐧𝐭𝐞 (𝐔𝐅𝐂)

𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐚 𝐝𝐞𝐥 𝐡𝐨𝐧𝐠𝐨 (𝐔𝐅𝐂) 𝐱 𝟏𝟎𝟎 = % 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐚𝐦𝐢𝐧𝐚𝐜𝐢ó𝐧


27

Fórmula 2:

% Pureza= 100% - %de contaminación


3.11.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación (%)

La eficiencia del proceso de formulación se determinó el día de elaboración de cada prototipo

tomando 10 muestras de 1 g o 1 ml de cada producto. Para obtener el porcentaje de eficiencia del

proceso de formulación, se consideraron los parámetros de contenido de colonias puras, para el

caso de gránulos se tomaron muestras del biomatrix, mientras que para polvo mojable y

concentrado emulsionable se tomaron muestras de la concentración de colonias obtenidas a partir

de las conidias secas en las formulaciones finales expresadas en UFC.

El nivel de eficiencia de los prototipos de bioformulaciones se obtuvo utilizando la siguiente fórmula

adaptada por el laboratorio de control biológico de la EESC:

E = ((A x B) / (C x D)) x 100

Donde:

A = Cuantificación de colonias del hongo en conidias secas (UFC/g).

B = Cantidad de conidias secas utilizadas en la formulación (g).

C = Volumen o peso de otros ingredientes en la formulación (ml o g).

D = Cuantificación de colonias del hongo en formulación (UFC/ml o g).

3.12. Caracterización fisicoquímica de los prototipos de bioformulaciones.

La caracterización fisicoquímica de los cuatro prototipos de bioformulaciones se realizó

inmediatamente después de la elaboración de cada producto y mensualmente durante seis meses

de almacenamiento a dos temperaturas (4 °C, ambiente de refrigeración y 30 °C, temperatura

ambiente promedio de la Región Costa del Ecuador).

3.12.1. Humedad (%)

El porcentaje de humedad se determinó siguiendo las recomendaciones establecidas por el

Laboratorio de Control Biológico, INIAP-EESC. En un medidor de humedad Boeco Modelo BMA 150,

se pesaron 2.0 g del producto en un plato de aluminio específico para el equipo y se inició el secado

de la muestra a 100 °C. Después de un tiempo que osciló entre 5 a 25 minutos según el tipo de

formulado, se registró el porcentaje de humedad en la pantalla del equipo.

3.12.2. Actividad de agua (aw)

La actividad de agua se determinó según las recomendaciones del Laboratorio de Control Biológico.

En un medidor de aw Aqua Lab modelo 4TE, se ubicó un recipiente plástico con una muestra de 2.0g

de formulado en el cual se consideró que la base se encuentre completamente cubierta por el

producto y se inició la medición. Se registró el valor de actividad de agua del bioformulado y

temperatura de medición en la pantalla del equipo. La actividad de agua se realizó en todos los

prototipos realizados.

28

3.12.3. Densidad apisonada (g/ml)

La prueba de densidad apisonada se realizó basándose en la norma MT 33 del CIPAC. Se pesaron

5.0 g del producto y se colocaron en una probeta de 50 ml de base plástica ubicada dentro de un

soporte de madera. La probeta se levantó a 5 cm de la madera y se dejó caer sobre la base del

soporte. Este proceso se repitió mecánicamente por 50 veces. Al finalizar, se registró el volumen

(V) de la muestra apisonada y se determinó la densidad apisonada (D) aplicando la fórmula

(Quiroga, 2009), en prototipos sólidos, polvo mojable y granulaciones.

D = 5 g/ V

3.12.4. Determinación de pH

Se preparó la muestra para análisis con 5,0 g del formulado reconstituido en 50 ml de agua destilada

desionizada, la solución se homogenizó con agitador magnético a 150 rpm durante dos minutos y

se determinó el valor de pH mediante lectura con un pH metro Hach modelo Sension 3 previamente

calibrado. La determinación de pH se realizó en todos los prototipos realizados.

3.12.5. Humectabilidad (minutos)

Esta prueba se determinó según la norma CIPAC MT 53.3. Se adicionaron 5.0 g del producto desde

una altura de 25 cm en un vaso de precipitación de 250 ml con 100 ml de agua destilada sin ningún

tipo de agitación. Se registró el tiempo en segundos que tardó el producto en humedecerse

completamente. La humectabilidad se determinó en prototipos sólidos, polvo mojable y gránulos.

3.12.6. Suspendibilidad (%)

La suspendibilidad del bioformulado se determinó basándose en la norma CIPAC MT 168. Se

reconstituyó el prototipo, adicionando 2,5 g del producto en un vaso de precipitación de 250 ml

con 50 ml de agua destilada previamente calentada a 30 °C. La solución se mezcló durante dos

minutos a 120 rpm con un agitador magnético y posteriormente se colocó la suspensión preparada

en una probeta de 250ml con el mismo volumen de agua destilada, se selló la probeta con una

funda plástica sujetada por una liga y a continuación, se invirtió la probeta 30 veces a 180° durante

1 minuto y se ubicó en incubación a 30 ± 1 °C por 30 minutos. Posteriormente con una pipeta de

10ml, se extrajeron 225ml de la suspensión a 600 rpm considerando una misma altura de

extracción, el sedimento se transfirió con agua destilada a una caja Petri de peso conocido y se llevó

en estufa a 90°C durante 24 horas, se registró el peso final de los sólidos de la muestra y se calculó

el porcentaje de suspendibilidad aplicando la fórmula (Quiroga, 2009) en prototipos sólidos, polvo

mojable y gránulos.

111 (1-a/w)

Donde:

a =Peso de la masa seca en los 25 ml de residuo w=Peso de la muestra inicial (2.5 g)

3.12.7. Tamaño de partícula (%)

El tamaño de la partícula se determinó con 10 g del prototipo. El producto se pesó y colocó en una

columna de tamices de poro conocido ordenados de mayor a menor correspondientes a 2mm,

1,7mm, 250µm, 150µm y 53µm para formulaciones granuladas y 500µm, 250µm, 150µm, 106µm,

29

y 53µm para polvo mojable ambas columnas seguidas de un colector en la base. La columna de

tamices se ubicó en un agitador vibratorio marca KARL KOLB por 5 minutos, transcurrido este

tiempo, se pesó el material retenido en cada tamiz. El rango de tamaño de partícula se analizó

mediante una distribución de frecuencias. El porcentaje de tamaño de partícula se determinó en

prototipos sólidos, polvo mojable y gránulos.

3.12.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml)

La estabilidad del concentrado emulsionable se determinó según en la norma CIPAC MT 20, la cual

consistió en reconstituir la emulsión en agua destilada y observar si esta es estable por la formación

de crema y en caso de separación de fases ver si es reversible a formas emulsión. La reconstitución

del concentrado emulsionable se realizó en un vaso de precipitación de 100 ml con 28 ml de agua

destilada al cual se le adicionó gota a gota 2 ml del producto oleoso, mezclando el sistema con una

barra de cristal dirigiendo el flujo hacia el centro del vaso de precipitación. El líquido reconstituido

se transfirió a una probeta de 100 ml la cual se llenó hasta el mismo volumen con agua destilada y

se dejó en reposo durante una hora. Transcurrido este tiempo, se observaron y registraron los

cambios en la emulsión.

30

IV. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El diseño experimental para la determinación de las características fisicoquímicas y microbiológicas

fue arreglo factorial 2X4 en Diseño Completamente al Azar (DCA). Cada prototipo consistió en 10

observaciones, que partieron de un mismo lote de formulación con un total de 40 unidades

experimentales (UE), divididas entre las dos temperaturas de almacenamiento (4°C y 30 °C), con 20

UE/cada una.

Los resultados fueron evaluados con el fin de establecer el efecto del tiempo y la temperatura de

almacenamiento sobre la viabilidad de Trichoderma asperellum en los bioformulados y para

determinar en cuál de estos presenta mayor estabilidad.

La normalidad y varianzas constantes de los resultados fueron determinadas mediante las pruebas

de Shapiro Wilks y Levene, respectivamente. Una vez demostrados estos principios, se procedió a

un análisis de varianza ANOVA y a pruebas de comparación de medias DMS (Least significant

difference) y Tukey (alfa 0.05%). Las variables que presentaron resultados no paramétricos se

evaluaron mediante la prueba Kraskall Wallis y Dunnett para comparación de medias. Se utilizó el

programa estadístico Infostat versión estudiantil 2017.

4.1. Factores en estudio

4.1.1. Prototipos de bioformulaciones (P)

Se realizaron cuatro diferentes prototipos de bioformulaciones con Trichoderma asperellum.

P1: Prototipo en gránulo dispersable

P2: Prototipo en gránulo cubierto

P3: Prototipo en polvo mojable

P4: Prototipo en concentrado emulsionable

4.1.2. Temperaturas de almacenamiento (T)

Los prototipos de bioformulaciones se almacenaron a dos temperaturas diferentes, considerando

el lugar de prospección del microorganismo y temperaturas promedio en cultivos de banano del

Ecuador, factor importante para su posterior uso:

T1: Temperatura a 4°C

T2: Temperatura a 30°C

4.1.3. Tratamientos

Los tratamientos resultaron de la interacción de los factores en estudio: Prototipos (4) x

Temperaturas (2), en total 8 tratamientos (Cuadro 13).

31

Cuadro 13: Tratamientos correspondientes a los 4 prototipos de bioformulaciones desarrolladas a

base de conidias Trichoderma asperellum.

Tratamiento Código Descripción

T1 P1T1 Prototipo en gránulo dispersable a 4 °C

T2 P1T2 Prototipo en gránulo dispersable a 30 °C

T3 P2T1 Prototipo en gránulo cubierto a 4 °C

T4 P2T2 Prototipo en gránulo cubierto a 30 °C

T5 P3T1 Prototipo en polvo mojable a 4 °C

T6 P3T2 Prototipo en polvo mojable a 30 °C

T7 P4T1 Prototipo en concentrado emulsionable a 4 °C

T8 P4T2 Prototipo en concentrado emulsionable a 30 °C

Fuente: La autora

4.2. Esquema del experimento

Figura 15: Esquema de la disposición de las unidades experimentales. Fuente: La autora

Figura 16: Disposición de las unidades experimentales según cada tratamiento a diferentes

temperaturas de almacenamiento. Fuente: La autora

Ob1 Ob2 Ob3 Ob4 Ob5

P1T1 P2T1 P3T1 P4T1 P2T1




Ob1 Ob2 Ob3 Ob4 Ob5





4 ºC 30 ºC

32

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Caracterización microbiológica de los prototipos

El análisis de calidad efectuado a los bioformulados antes y durante el almacenamiento a dos

temperaturas, consideró como parámetros importantes el porcentaje de germinación,

concentración de colonias del hongo en unidades formadoras de colonia (UFC), la pureza y el nivel

de eficiencia del proceso de formulación.

5.1.1. Porcentaje de germinación

Expresa el total de conidias que se encuentran viables, es decir que tienen la capacidad de germinar.

Un producto se considera de alta calidad cuando alcanza niveles cercanos al 100% de germinación,

considerando que a medida que esta se reduce pierde su capacidad de establecerse en campo y su

efectividad sobre la plaga (Granada, 2000).

Las evaluaciones del porcentaje de germinación en los bioformulados sólidos y el líquido

desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum se realizaron antes y durante los seis

meses de almacenamiento a dos temperaturas. Los prototipos polvo mojable y concentrado

emulsionable se evaluaron inmediatamente después de su elaboración, mientras que para los

prototipos granulados se evaluaron el día de envasado. El análisis estadístico del porcentaje de

germinación se realizó por transformación de datos con arcoseno.

El análisis de los supuestos del ANOVA determinó normalidad según Shapiro Wilks y

homocedasticidad mediante la prueba de Levene, antes y durante seis meses de almacenamiento

a dos temperaturas (Cuadro 14). Con base en lo anterior, se analizó los resultados paramétricos

mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5% para prototipos (P),

temperaturas (T) y al presentarse interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0.05%. Las medias

para los meses con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette.

Cuadro 14: Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de germinación antes y durante los seis

meses de almacenamiento a dos temperaturas.

Porcentaje de germinación de conidias (%) Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.388 0.9123

1er mes 0.4945 0.9674

2do mes 0.4956 0.5422

3er mes 0.166

Na 4to mes 0.6038

5to mes Na

6to mes

* Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 15), determinó que los prototipos inicialmente presentaron

diferencias significativas entre sí, por lo contrario, las temperaturas de almacenamiento y la

interacción de estos dos factores no presentaron diferencias significativas. A partir del segundo

mes de almacenamiento los factores prototipos, temperaturas y la interacción presentaron

diferencias significativas sobre la germinación del hongo.

33

La viabilidad microbiológica de las conidias de Trichoderma asperellum, se evaluó mensualmente

presentando diferencias altamente significativas a partir del 2do hasta el 4to mes de

almacenamiento, encontrándose mayor porcentaje de germinación de conidias a 4 °C, y menor

porcentaje a 30 °C (Cuadros 16). Por lo tanto, se consideró que las temperaturas influyeron sobre

el porcentaje de germinación de las conidias en almacenamiento.

Cuadro 15: ANOVA del porcentaje de germinación después de formulados los prototipos y durante

dos meses de almacenamiento a 4 y 30°C.

Fuentes de variación Gl Cuadrados medios1 y p – valor2

Inicial 1er mes 2do mes

Total 39

Prototipos (P) 3 0.031 0.0005**2 0.04 <0.0001*** 0.38 <0.0001***

Temperatura (T) 1 0.001 0.5778 0.0002 0.7962 1.11 <0.0001***

P x T 3 8E-04 0.8818 0.0009 0.8429 0.18 <0.0001***

Error 32 0.004

0.0032

0.003

Promedio 0.01 0.01 0.42

Coeficiente de variación (%) 4.50 4.50 4.94

* Presenta diferencias significativas; ** Diferencias altamente significativas; *** Diferencias altamente

significativas.

Cuadro 16: ANOVA del porcentaje de germinación del 3er al 4to mes de almacenamiento, a dos

temperaturas.

Fuentes de variación Gl Cuadrados medios y p – valor

3er mes 4to mes

Total 39

Prototipos (P) 3 0.89 <0.0001*** 0.75 <0.0001***

Temperatura (T) 1 3.17 <0.0001*** 4.01 <0.0001***

P x T 3 0.55 <0.0001*** 0.45 <0.0001***

Error 32 0.01

0.003

Promedio 1.16 1.30

Coeficiente de variación (%) 8.77 6.42


significativas.

La prueba DMS al 5% para prototipos (Cuadro 17), inicialmente presentó tres rangos de

significación, encontrándose en el primer rango la formulación de gránulo dispersable (WG), con

mejor respuesta a la variable y 96.17 % de germinación, seguido de WP con 93.91 % de germinación

y en el último rango EC con menor efecto sobre la germinación de conidias (%). Por el contrario,

para el factor temperatura de almacenamiento y la interacción no presentaron diferencias

significativas entre las medias.

Después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, para la interacción P x T, se realizó

la prueba de Dunnett al 5%, determinado que el mejor bioformulado fue WP almacenado a 4 °C;

34

mientras que WG, CG y EC a 30 °C, presentaron menor respuesta al porcentaje de germinación, al

cabo de 24 horas.

Cuadro 17: Medias del porcentaje de germinación después de la elaboración de los prototipos y

durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.

Prototipos (P) Medias1 y Rangos de Significación2

Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

Granulo

dispersable

(P1)

1.371 A2 1.3 A 1.12 B 1.04 B 0.93 B 0.61 B 0.56 B

Gránulo

cubierto (P2) 1.28 BC 1.26 A 0.91 C 0.57 D 0.57 D 0.56 A 0.54 B

Polvo mojable

(P3) 1.33 AB 1.32 A 1.28 A 1.24 A 1.20 A 1.18 B 1.17 A

Concentrado

emulsionable

(P4)

1.26 C 1.18 B 0.86 D 0.76 C 0.73 C 0.60 B 0.53 B

Temperaturas

(T) Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

4°C (T1) 1.31 A 1.27 A 1.21 A 1.18 A 1.17 A 1.16 A 1.12 A

30°C (T2) 1.32 A 1.26 A 0.87 B 0.62 B 0.54 B 0.32 B 0.28 B

Prototipos x

Temperaturas Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

P1T1 1.37 A 1.30 AB 1.27 A 1.27 A 1.24 AB 1.22 A 1.11 B

P1T2 1.38 A 1.30 AB 0.98 C 0.81 C 0.61 D 0.00 D 0.00 C

P2T1 1.28 B 1.26 ABC 1.21 A 1.14 AB 1.13 BC 1.12 AB 1.09 B

P2T2 1.29 AB 1.26 ABC 0.61 D 0.00 E 0.00 F 0.00 D 0.00 C

P3T1 1.33 AB 1.31 AB 1.27 A 1.24 AB 1.25 A 1.22 A 1.21 A

P3T2 1.33 AB 1.32 A 1.29 A 1.24 AB 1.16

ABC 1.15 AB 1.12 B

P4T1 1.28 AB 1.20 BC 1.09 B 1.08 B 1.06 C 1.07 B 1.06 B

P4T2 1.24 B 1.16 C 0.63 D 0.43 D 0.39 E 0.13 C 0.00 C

* Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Tukey: (p > 0,05);

Dunnette: alfa 0,05 (meses sin homocedasticidad).

Los prototipos granulados WG y CG presentaron un porcentaje de germinación inicial de 96.17% y

91.98%, respectivamente. Después de seis meses de almacenamiento WG tuvo una reducción del

16.45% a 4 °C y 100 % a 30°C. El CG presentó similares reducciones con un 14.89% a 4°C y 100% a

35

30°C (Cuadro 18). La disminución de la viabilidad en los prototipos granulados almacenados a altas

temperaturas provocó el daño en las conidias del hongo retardando su crecimiento o provocando

su muerte. Por otra parte, el almacenamiento a 4°C permitió el mantenimiento de una germinación

superior al 50%.

El porcentaje de germinación inicial del prototipo polvo mojable fue de 93.6% y después de seis

meses de almacenamiento presentó una disminución de la viabilidad de 6.71% y 13.96% a 4 y 30°C,

respectivamente (Cuadro 14), encontrándose dentro de los parámetros de aceptación para

porcentaje de germinación de conidias después de 24 horas. Por otro lado, concentrado

emulsionable presentó una germinación inicial de 90.36 % y después de seis meses obtuvo una

reducción de 15.89% y 100% a 4 y 30°C, respectivamente.

Cuadro 18: Porcentaje de germinación de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento, a dos temperaturas.

Prototipos Porcentaje de germinación (%)

Inicial 6to mes

Gránulo Dispersable (WG) 96.17 4°C 80.35

30°C 0.00

Gránulo Cubierto

(CG) 91.98

4°C 78.28

30°C 0.00

Polvo Mojable

(WP) 93.91

4°C 87.60

30°C 80.80

Concentrado Emulsionable

(EC) 90.36

4°C 76.00

30°C 0.00

Granada (2000), señaló que la capacidad de sobrevivencia de las conidias en una formulación

depende de factores como contenido de humedad y temperaturas de almacenamiento. Así mismo,

expresa que la refrigeración (4 - 5 °C) puede mantener la viabilidad hasta por un año.

De acuerdo con Marín y Bustillo (2016), una formulación comercial debe tener una germinación

superior al 85% después de un tiempo de incubación de 24 horas, tomando en cuenta que el hongo

al ser aplicado en campo debe poseer un rápido efecto sobre la población plaga, atacando en un

corto periodo de exposición a condiciones ambientales adversas.

González, Valbuena, Rivera, Bustillo y Chaves, (1996), mencionaron que la germinación del hongo

entomopatógeno Metarhizium anisopliae a las 24 horas fue de 70%, debido a daños de la conidias

o al desarrollo de un mecanismo protector llamado choque proteico ocasionados por efecto de la

temperatura elevada de almacenamiento.

Troytiño, Fernandez, & Lara, (2007), determinaron que formulaciones a base de B. bassiana

almacenadas a 26°C tienden a bajar la viabilidad de manera casi lineal a lo largo del tiempo,

mientras que si se almacena a 4°C se puede conservar hasta por un año con mayor estabilidad.

En un estudio similar en polvo mojable a base de Trichoderma koningiopsis Th003 Corpoica (2010),

recomendó que la conservación del prototipo en polvo deba realizarse a temperaturas de entre 4°C

y 18°C para asegurar su calidad y efectividad durante su vida útil.

36

Por lo tanto, el mejor prototipo basado en el porcentaje de germinación de las conidias fue polvo

mojable que presentó una reducción mínima al cabo de seis meses de almacenamiento a 4°C

conservando un 87.6% de germinación. Los porcentajes de germinación de WP a menor

temperatura se encontraron dentro de los parámetros de calidad propuestos por el Laboratorio de

Control Biológico, INIAP-EESC, es decir la viabilidad fue superior al 85%. También se debe tomar en

cuenta que polvo mojable a 30 °C mantuvo una germinación del 80.8%, lo cual es importante debido

a que las formulaciones realizadas tienen como finalidad su aplicación en cultivos de banano de la

Región Litoral del Ecuador.

5.1.2. Concentración de colonias en UFC

La evaluación de la estabilidad microbiológica de los prototipos en estudió se determinó mediante

la evaluación de la concentración por la técnica de recuento en caja Petri antes y durante seis meses

de almacenamiento a 4°C y 30°C. El análisis de los resultados se realizó después de transformar la

concentración en UFC/g a Log UFC/g.

El análisis de los supuestos del ANOVA (Cuadro 19) determinó normalidad según Shapiro Wilks y

homocedasticidad mediante la prueba de Levene, antes y durante seis meses de almacenamiento

a dos temperaturas. Con base en lo anterior, se analizó los resultados paramétricos mediante

ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5% para prototipos (P), temperaturas

(T) y al presentarse interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0,05%. Las medias para los meses

con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette.

Cuadro 19: Normalidad y varianzas constantes de la concentración en Log UFC/g de lo

bioformulados, antes y durante los seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Concentración en LOG UFC/g Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.6804 0.807

1er mes 0.4365 0.5435

2do mes 0.3439 0.2378

3er mes 0.1211 0.2885

4to mes 0.1105 0.2313

5to mes Na Na

6to mes 0.1267


El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 20) determinó que los prototipos inicialmente presentaron

diferencias significativas entre sí, por lo contrario, las temperaturas de almacenamiento y la

interacción de estos dos factores no presentaron efectos significativos a partir del segundo mes de

almacenamiento los factores prototipos, temperaturas y la interacción presentaron diferencias

significativas sobre la viabilidad de Trichoderma asperellum.

La estabilidad microbiológica de Trichoderma asperellum se evaluó durante seis meses en cuatro

bioformulados observándose que las temperaturas de almacenamiento tuvieron un efecto

altamente significativo encontrándose mayor concentración de colonias en UFC a 4°C y menor

concentración a 30°C (Cuadro 21).

37

Cuadro 20: ANOVA del porcentaje de la concentración de colonias (Log UFC/g) después de

formulados los prototipos y durante dos meses de almacenamiento, a dos temperaturas.


Inicial 1er mes 2do mes

Total 39

Prototipos (P) 3 0.191 0.0013(2) ** 0.54 <0.0001*** 1.08 <0.0001***

Temperatura (T) 1 0.01 0.6671 0.34 0.0001** 7.02 <0.0001***

P x T 3 0.02 0.5184 0.0024 0.9307 2.02 0.0001**

Error 32 0.03

0.02

2.12

Promedio 0.0625 0.2256 3.06



significativas.

Cuadro 21: ANOVA de la concentración de colonias (Log UFC/g) a partir 3er al 6to mes de



3er mes 4to mes 6to mes

Total 39

Prototipos (P) 3 2.591 <0.0001***(2) 6.73 <0.0001*** 28.32 <0.0001***

Temperatura (T) 1 18.39 <0.0001*** 42.15 <0.0001*** 147.42 <0.0001***

P x T 3 1.44 <0.0001*** 6.96 <0.0001*** 28.46 <0.0001***

Error 32 0.03

0.03

0.01

Promedio 5.61 13.97 51.05



significativas.

El análisis estadístico de comparación de medias DMS al 5% (Cuadro 22), determinó inicialmente

dos rangos de significación para los prototipos, encontrándose en el primer rango WP, EC y WG con

mejor respuesta a la variable, mientras que CG en el segundo rango con 3.92 x108 UFC/g y menor

efecto sobre la concentración de colonias en UFC. Los bioformulados polvo mojable, gránulo

dispersable y concentrado emulsionable, sobrepasaron la concentración teórica deseada 5x108

UFC/g después de su elaboración. Por el contrario, gránulo cubierto con 3x108 UFC/g no alcanzó la

concentración inicial propuesta por el Laboratorio de Control Biológico del Departamento de

Protección Vegetal INIAP-EESC (Anexo 2).

Después de seis meses de almacenamiento de los prototipos la comparación de medias DMS al 5%,

presentó cuatro rangos de significación, dejando en el primer rango a WP con 108UFC/g con mejor

respuesta a la variable, por lo tanto, mayor estabilidad en el tiempo; seguido de CG con 107UFC/g,

EC con 106UFC/g y finalmente WG con 104UFC/g con menor respuesta a la variable. La temperatura

a la cual se presentó mayor estabilidad microbiológica de Trichoderma asperellum fue 4°C, en todos

38

los casos y en todos los meses de evaluación, al contrario del almacenamiento a 30°C donde hubo

una reducción hasta del 100% en la concentración de colonias en UFC/g. Los factores en estudio a

partir del segundo mes y hasta el sexto mes de evaluación evidenciaron la misma tendencia en el

comportamiento de la viabilidad a las diferentes temperaturas de almacenamiento, permitiendo

recomendar que el almacenamiento de productos bioformulados se realice a temperaturas de

refrigeración la cual garantiza su estabilidad y prolonga la vida útil del producto.

La interacción P x T al sexto mes de almacenamiento, determinó que los mejores prototipos fueron

Polvo mojable y Concentrado emulsionable almacenados a 4°C, debido a su alta estabilidad con

valores superiores a 1x108UFC/g límite de aceptación propuesto por el Laboratorio de Control

Biológico.

Cuadro 22: Medias de la concentración (Log UFC/g) después de formulados los prototipos y durante

seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Prototipos (P) Medias y Rangos de Significación


Granulo

dispersable (P1) 8.75 A 8.71 A 8.04 B 7.54 B 6.47 C 5.93 D 4.23 D

Gránulo cubierto

(P2) 8.51 B 8.26 B 7.83 BC 7.44 B 7.38 B 7.41 B 7.34 B

Polvo mojable

(P3) 8.78 A 8.72 A 8.44 A 8.52 A 8.48 A 8.19 A 8.13 A

Concentrado

emulsionable (P4) 8.81 A 8.40 B 7.68 C 7.56 B 7.5 B 7.06 C 6.40 C

Temperaturas (T) Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

4°C (T1) 8.72 A 8.61 A 8.42 A 8.44 A 8.48 A 8.46 A 8.44 A

30°C (T2) 8.70 A 8.43 B 7.58 B 7.09 B 6.43 B 5.83 B 4.60 B

Prototipos x


P1T1 8.83 A 8.79 A 8.48 A 8.45 AB 8.59 A 8.54 A 8.46 AB

P1T2 8.68 AB 8.63 AB 7.60 B 6.62 C 4.35 C 3.33 E 0.00 F

P2T1 8.46 B 8.35 CD 8.19 A 8.28 B 8.31 A 8.28 A 8.26 B

P2T2 8.55 AB 8.16 D 7.47 B 6.60 C 6.45 B 6.54 C 6.42 D

P3T1 8.79 AB 8.8 A 8.56 A 8.63 A 8.56 A 8.55 A 8.57 A

P3T2 8.77 AB 8.63 AB 8.32 A 8.41 AB 8.39 A 7.83 B 7.68 C

P4T1 8.81 AB 8.51 BC 8.43 A 8.52 A 8.48 A 8.47 A 8.47 A

P4T2 8.80 AB 8.28 CD 6.93 C 6.71 C 6.52 B 5.64 D 4.32 E

* Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Tukey: (p > 0,05);

Dunnette: alfa 0,05 (en meses sin varianzas constantes).

Los bioformulados WG, CG, WP y EC presentaron concentración de colonias iniciales de 5.88x108,

3.92x108, 6,16x108 y 6.48x108UFC/g, respectivamente. Después de seis meses de almacenamiento

a 4°C y 30°C se obtuvo una reducción de concentración de colonias de 50.51%, 100.0%, 99.52%,

39

99.30%, 38.96%, 91.99% y 53.39% y 99.99%, respectivamente para cada prototipo y temperaturas

de almacenamiento (Cuadro 23).

Los prototipos granulados almacenados a 4°C mantuvieron una estabilidad del microorganismo

conservando una concentración de colonias superior a 1x108 en el gránulo dispersable y 1x105 en

la formulación de gránulo cubierto, la reducción de la estabilidad del principio activo en estos

formulados especialmente en gránulo cubierto se originó por efecto del elevado porcentaje de

humedad con que fue almacenado el producto, recomendándose la extensión del tiempo de secado

antes de empaque para asegurar la cobertura del bioformulado.

Cuadro 23: Concentración de colonias (UFC/g) de los bioformulados, antes y después de seis meses

de almacenamiento, a dos temperaturas.

Prototipos Concentración de colonias en UFC/g

Inicial 6to mes

Gránulo Dispersable (WG) 5.88x108 4°C 2.91x108

30°C 0.00

Gránulo Cubierto

(CG) 3.92x108

4°C 1.85x106

30°C 2.71x106

Polvo Mojable

(WP) 6.16x108

4°C 3.76x108

30°C 4.93x107

Concentrado Emulsionable

(EC) 6.48x108

4°C 3.02x108

30°C 2.18x104

Corpoica (2010), mencionó que Trichoderma konongiopsis Th003, en formulaciones de polvo

mojable mostró mayor estabilidad y vida útil cuando fue almacenado a una temperatura de 4°C,

presentándose una disminución de los valores a medida que aumentó a 28°C.

En estudios similares Zhang et al., (2006), observaron una viabilidad del principio activo entre 7.8 y

8 Log UFC/g cuando el producto fue almacenado a 4°C, mientras que a 25°C hubo una reducción

hasta valores inferiores a 5 Log UFC/g, luego de 14 semanas.

Por consiguiente, solo prototipos almacenados en refrigeración presentaron una vida útil y

estabilidad por seis meses, asegurando la estabilidad de las conidias de Trichoderma asperellum. El

almacenamiento a temperaturas elevadas reduce la estabilidad del microrganismo corroborando

la reducción de su viabilidad después de 24 horas.

5.1.3. Pureza

El contenido de contaminantes en una formulación puede acarrear una pérdida en la eficacia del

ingrediente activo por un efecto de competencia con los microorganismos contaminantes, los

cuales pueden ocasionar un efecto inhibitorio, debido a la producción de metabolitos secundarios

(Torres, 2009).

40

Según el Senasa (1999), el nivel de contaminantes no debe ser mayor al 0.1% y bajo ninguna

circunstancia se deben encontrar patógenos de plantas o animales en las formulaciones biológicas.

Los niveles de contaminantes encontrados en las bioformulaciones desarrolladas a base de conidias

de Trichoderma asperellum fueron menores a 0.1% en todos los meses de almacenamiento,

considerando que en el mes de manufacturación (inicial) se determinó mayor presencia de

contaminantes (Gráfico 1).

Gráfico 1: Porcentaje de contaminación de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento.

Gráfico 2: Porcentaje de pureza de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento.

Los prototipos WG, WP y EC presentaron mayor porcentaje de impurezas después de su

elaboración, esto se pudo deber a que en el área de formulación se trabajó al mismo instante con

otro microorganismo como Purpureocillium lilacinum, el cual puede permanecer en mínimas

cantidades en el ambiente del Laboratorio de Control Biológico. Por otro lado, CG no presentó

0,00

0,01

0,02

Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mesPo

rcen

taje

de

con

tam

iaci

ón

(%)

Gránulo Dispersable Gránulo Cubierto

Polvo Mojable Concentrado Emulsionable

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00


Pu

reza

de

los

bio

form

ula

do

s (%

)

Gránulo Dispersable Gránulo Cubierto Polvo Mojable Concentrado Emulsionable

41

contaminación alguna en ningún mes, durante el almacenamiento se evidenció que a partir del 3er

mes hasta el 6to mes el nivel de contaminación se redujo al 0% para todos los prototipos y

registrando una pureza del 100%, esto nos indicó que los contaminantes se redujeron con el

tiempo, es decir pierden viabilidad. El porcentaje de pureza en todos los prototipos fue superior al

90 %, antes y después de seis meses de almacenamiento (Gráfico 2).

Figura 16: Presencia de Purpureocillium lilacinum en las formulaciones a base de Trichoderma

asperellum y aislamiento del contaminante. Fuente: La autora

El nivel de pureza presente en las cuatro bioformulaciones cumplió con el estándar de calidad

establecido, sugiriendo que la estabilidad y viabilidad del microorganismo no se vio afectado por

otros microorganismos durante la etapa de almacenamiento a dos temperaturas.

5.1.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación

La eficiencia del proceso de formulación se evaluó después de la formulación de los prototipos,

para lo cual se registró la cantidad del microorganismo con su respectiva concentración de colonias

en UFC/g, la cantidad de excipientes y la concentración real de colonias en la formulación medida

en UFC/g. El nivel de eficiencia evaluado al mes de manufacturación no presentó normalidad, ni

varianzas constantes, realizando su análisis mediante pruebas no paramétricas según Kruskal Wallis

al 5% (Cuadro 24). La misma prueba indicó que existió diferencias significativas entre los

tratamientos. Con un p-valor de 0.0209.

Cuadro 24: Medias del nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) después de

manufacturación en los cuatro bioformulados a base de Trichoderma asperellum.

TRATAMIENTOS Medias y rangos de significación

Inicial/ tratamiento Inicial/ prototipo

Tratamiento T1: P1T1 99.83 AB 97.08

Tratamiento T2: P1T2 94.33 AB


Tratamiento T4: P2T2 100.00 A

Tratamiento T5: P3T1 100.00 A 100.00

Tratamiento T6: P3T2 100.00 A


Tratamiento T8: P4T2 91.28 B

P1T1: gránulo dispersable a 4°C, P1T2: gránulo dispersable a 30°C, P2T1: gránulo cubierto a 4°C, P2T2: gránulo

cubierto a 30°C, P3T1: polvo mojable a 4°C, P3T2: polvo mojable a 30°C, P4T1: concentrado emulsionable a

4°C, P4T2: concentrado emulsionable a 30°C.

42

Los cuatro prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron un

porcentaje de nivel de eficiencia superior al 90%, siendo mejor el bioformulado polvo mojable con

100% de eficiencia, seguido por los granulados WG y CG, con 97.08% y 97.40% respectivamente y

con menor porcentaje de eficiencia el concentrado emulsionable con 93.98%.

Según los parámetros establecidos por el Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC, una

buena formulación debe presentar un porcentaje de eficiencia en el proceso de formulación

superior al 60%, por lo anterior, los productos a base de Trichoderma asperellum en sus

presentaciones sólidas y líquida se encuentran sobre el límite de aceptación.

Se debe considerar que los productos biológicos que no alcanzaron el 100% de eficiencia en

manufacturación pudieron presentar daño del ingrediente activo y consecuente reducción de

viabilidad por incorrecta manipulación, incompatibilidad con los excipientes o estrés durante el

proceso de formulación, así como daño por el tiempo de secado.

5.2. Caracterización fisicoquímica de los prototipos

Las características fisicoquímicas como densidad apisonada, porcentaje de humedad, valor de pH,

suspendibilidad y tamaño de la partícula no presentaron normalidad y homogeneidad de la

varianza, por lo que se realizó su análisis mediante prueba no paramétrica según Kruskall Wallis al

5%.

5.2.1. Densidad apisonada

La densidad apisonada es una característica que permite calcular el tamaño del empaque y la

capacidad de almacenamiento en bodegas o vehículos de transporte (Silva, 2001). Esta variable se

evaluó el mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento para los prototipos sólidos.

El prototipo correspondiente a gránulo dispersable presentó una densidad apisonada inicial

promedio correspondiente a 0.64 g/ml y después de almacenamiento a dos temperaturas, se

evidenció una variación mínima, obteniendo al 6to mes una densidad apisonada promedio de

0.63g/ml (Cuadro 26). El gránulo cubierto inicialmente obtuvo una densidad apisonada promedio

de 1g/ml, misma que permaneció constante durante los seis meses de almacenamiento a dos

temperaturas, según Padin, et al (2013), esto se produce porque el material base de prototipos

granulares tiene partículas homogéneas que no presentan espacios de aire libres entre ellas,

manteniendo constante su rango de compactación. El prototipo de polvo mojable presentó una

densidad apisonada inicial promedio de 0.73 g/ml y después de seis meses de almacenamiento a

4°C y 30°C, obtuvo una densidad apisonada promedio de 0.71 g/ml y 0.72 g/ml, respectivamente

(Cuadro 26).

Por lo tanto, los valores de densidad apisonada (g/ml) en los meses de almacenamiento para los

prototipos formulados presentaron diferencias estadísticas entre sí, según la prueba de Kruskall

Wallis (Cuadro 25). Sin embargo, según la comparación de medias el prototipo con mejor respuesta

a la variable después de seis meses de almacenamiento fue gránulo cubierto almacenado a 4°C y

30°C, por mantener valores de densidad apisonada constante.

43

Cuadro 25: Análisis de la densidad apisonada según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Variable p-valor1


Densidad

apisonada

(g/ml)

0.00011 0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001

Cuadro 26: Medias y rangos de significación para densidad apisonada (g/ml), evaluados en

prototipos sólidos WP, WG, CG a partir del mes de formulación y durante seis meses de

almacenamiento.

TRATAMIENTOS Medias1 y rangos de significación2


Tratamiento T1:

P1T1

0.641 C2 0.68 C 0.63 BC 0.63 B 0.63 B 0.63 B 0.63 C

Tratamiento T2:

P1T2

0.64 BC 0.70 AB 0.62 C 0.63 B 0.63 B 0.63 B 0.63 C

Tratamiento T3:

P2T1

1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A

Tratamiento T4:

P2T2

1.00 A 1.00 A 1.00 A

1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A

Tratamiento T5:

P3T1

0.73 AB 0.72 AB 0.79 AB 0.75 AB 0.72 AB 0.71 AB 0.71 AB

Tratamiento T6:

P3T2

0.72 BC 0.78 BC 0.76 ABC 0.74 AB 0.73 AB 0.72 AB 0.75 BC

P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial: mes de

formulación. * Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas.

En un estudio similar realizado por Quiroga (2009), al desarrollar una formulación granular en base

a Granulovirus encontró que la densidad presentó un promedio de 628.33g/L, valor que

consideraron adecuado para un gránulo dispersable en agua.

Según Padin, et al., (2013) la densidad apisonada óptima para granulados a base de un vehículo

compacto se encuentra dentro de un rango de 1000 g/L y para polvos mojables los limites oscilan

entre 220 y 250 g/L. Valores apropiados para obtener un buen manipuleo, transporte y

almacenamiento.

Por consiguiente, se determinó que los prototipos sólidos a base de Trichoderma asperellum

evaluados al mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento presentaron una

densidad apisonada promedio que oscila entre 630 g/L y 700 g/L para gránulos dispersables en

agua, permaneciendo dentro de los parámetros de calidad establecidos. El gránulo cubierto

presentó un valor constante de 1000g/L, adecuado para este tipo de granulados. El prototipo de

polvo mojable presentó una densidad apisonada de 710g/L a 780g/L, valores que se encuentran

sobre los limites recomendables. Sin embargo, el producto mostró un adecuado comportamiento

44

al ser reconstituido. En consecuencia, los rangos obtenidos para cada prototipo sólido no

presentaran problemas en operaciones de formulación a gran escala.

5.2.2. Humectabilidad

Se refiere a la capacidad que tiene un sólido para humedecerse completamente al hacer contacto

con el agua (Vélez et al., 1997). La humectabilidad condiciona la eficacia de los prototipos

reconstituidos en agua, debido a que determina la rapidez con la cual se libera el principio activo.

Se considera adecuado un tiempo de humectabilidad inferior a 1 minuto (Salazar, 2003).

La humectabilidad se analizó cualitativamente observando el tiempo que tardaron los prototipos

de polvo mojable y gránulo dispersable en humectarse completamente, el tiempo registrado fue

mayor a 1 min durante los seis meses de almacenamiento a las dos temperaturas evaluadas. Este

resultado indica que no existió efecto en la humectabilidad entre los prototipos formulados y entre

las temperaturas de almacenamiento.

Durante la evaluación de humectabilidad en el WP se observó que el producto se mantuvo sobre el

agua sin romper la tensión superficial, por un periodo superior a un minuto, como se observa en la

figura 17.

Figura 17: Humectabilidad de WP. Fuente: La autora.

Durante la evaluación de humectabilidad en el prototipo de gránulo dispersable se observaron que

los gránulos al hacer contacto con el agua no se humedecían homogéneamente y precipitaban hacia

el fondo del vaso a diferentes tiempos, sobrepasando el minuto al caer el último gránulo. Este

fenómeno se debe a las diferencias en la porosidad y tamaño de cada gránulo, precipitándose

inmediatamente los gránulos con mayor densidad y retardando la humectación en los gránulos con

menor densidad (Helman, 1982).

45

Figura 18: Humectabilidad de WG. Fuente: La autora.

La humectabilidad que presentó el WG a base de Trichoderma asperellum fue mayor a 1 minuto a

comparación de resultados obtenidos por Quiroga (2009) en la cual las granulaciones tuvieron un

tiempo de humectación que osciló entre 52 y 62 segundos durante los seis meses de

almacenamiento.

Por lo descrito anteriormente, los prototipos sólidos (WP y WG) a base de Trichoderma asperellum,

no se encuentran dentro del tiempo de humectación adecuado para bioformulaciones y de acuerdo

Abraham y Casillas, (2014). Se deberá mejorar esta propiedad con adición de humectantes o

disminuyendo la cantidad de aglutinantes y aumentando la humedad del gránulo.

5.2.3. Humedad

El contenido de humedad en una formulación genera efectos importantes sobre las características

y conservación del ingrediente activo durante el periodo de almacenamiento (Quiroga, 2009). El

porcentaje de humedad en los prototipos sólidos al inicio de las evaluaciones presentó diferentes

valores debido al tipo de formulación, componentes inertes y cantidad del ingrediente activo.

La humedad inicial promedio determinada para el prototipo gránulo dispersable fue de 5.59% y

después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, los porcentajes de humedad fueron

del 5.22% y 4.95% para 4°C y 30°C, respectivamente (Cuadro 28). El prototipo de gránulo cubierto

presentó un valor promedio inicial de 6.14% y después de seis meses de almacenamiento los

porcentajes de humedad a 4°C y 30°C fueron de 5.94% y 5.73%, respectivamente. El polvo mojable

presentó una humedad promedio inicial de 2.21% y después de seis meses de almacenamiento a

dos temperaturas, los porcentajes de humedad fueron 2.79% y 2.82%, respectivamente (Cuadro

28).

Por lo tanto, durante los meses de almacenamiento y evaluación presentaron diferencias

estadísticas entre sí según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 27). Según la comparación de

medias utilizando Dunnette, el prototipo que presentó mínima variación de humedad después de

seis meses de almacenamiento fue, el polvo mojable almacenado a 4°C.

46

Cuadro 27: Análisis del porcentaje de humedad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de


Variable p-valor1


Porcentaje de

humedad (%) 0.00031 0.0006 0.0002 0.0001 0.0004 0.0001 0.0001

Cuadro 28: Medias y rangos de significación para porcentaje de humedad (%), evaluados en


almacenamiento.

TRATAMIENTOS

Medias1 y rangos de significación2

Inicial 1er

mes

2do

mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

Tratamiento T1:

P1T1 5.461 BC2 6.19 A 5.64 BC 5.64 CD 6.11 A 5.70 BC 5.22 BCD

Tratamiento T2:

P1T2 5.71 A 5.72 A 6.33 A 5.19 BC 4.98 BC 4.79 AB 4.95 ABC

Tratamiento T3:

P2T1 6.15 A 5.71 A 6.08 A 6.17 A 5.81 A 6.08 A 5.94 A

Tratamiento T4:

P2T2 6.14 A 5.88 A 5.75 BC 5.79 CD 5.76 A 6.05 BC 5.73 CD

Tratamiento T5:

P3T1 2.19 C 2.05 C 2.20 B 2.21 D 2.20 C 2.25 C 2.79 D

Tratamiento T6:

P3T2 2,.2 AB 2.14 C 2.61 B 2.60 AB 2.71 AB 2.64 c 2.82 AB



Contreras (2003), determinó que la humedad del granulado a base de microorganismos

biocontroladores después de manufactura fue de 5.67%, siendo este valor próximo a los obtenidos

en los prototipos granulados a base de Trichoderma asperellum, con 5.59% para WG y 6,14% para

CG, valores que se acercan al rango de aceptación de 3 a 5% propuesto por Vélez et al., (1997).

De acuerdo con Marín y Bustillo (2016), productos liofilizados o formulados a base de hongos

entomopatógenos como B. bassiana y M. anisopliae con adhesión de materiales inertes como

talco, bentonita, leche y tierra de diatomáceas deben presentar porcentajes de humedad entre 3,0

y 15 %.

Otros autores como Corpoica (2010), después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base

de Trichoderma koningiopsis Th003 obtuvieron valores de humedad que oscilaron entre 4 y 7%, los

cuales consideraron aceptables para bioplaguicidas.

En esta investigación, el polvo mojable a base de Trichoderma asperellum alcanzó una humedad de

2.21% al mes de formulación y 2.79% después de seis meses de almacenamiento a 4°C

encontrándose dentro del límite establecido por Gato (2010), el mencionado autor considera que

47

la temperatura y humedad relativa son los parámetros más importantes durante el

almacenamiento los cuales garantizan un formulado viable de tres a seis meses, recomendando

una temperatura de refrigeración a 5°C y humedad hasta de 1%.

Por lo expuesto, se concluye que la humedad de los prototipos sólidos fue adecuada y estable

durante el almacenamiento y se espera no exista efectos sobre la viabilidad de Trichoderma

asperellum, compactación o aglomeración de las partículas en las formulaciones dentro de las

fundas metalizadas.

5.2.4. pH

El valor de pH en una formulación debe ser ligeramente ácido para facilitar el crecimiento de hongos

benéficos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos (Góngora, Marín, &

Benavides, 2009). Los valores promedio de pH después de la manufacturación en los cuatro

prototipos a base de Trichoderma asperellum presentaron un rango de pH de 5.0 a 7.0 evidenciando

ligera acidez en las formulaciones.

El pH promedio inicial registrado en el prototipo WG fue de 6.57 y después de seis meses de

almacenamiento a dos temperaturas, los valores de pH fueron de 6.99 y 6.96 para 4°C y 30°C,

respectivamente (Cuadro 30). El gránulo cubierto presentó un valor de pH promedio inicial de 6.51

y después de seis meses de almacenamiento los valores a 4°C y 30°C fueron 6.84 y 6.77,

respectivamente. El polvo mojable presentó un valor de pH promedio inicial de 5,79 y después de

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, los valores fueron 6.22 y 6.13,

respectivamente. Para el concentrado emulsionable los valores de pH registraron un promedio

inicial de 5.43 y después de seis meses de almacenamiento los valores a 4°C y 30°C fueron 5.58 y

5.57, respectivamente (Cuadro 30).

El valor de pH durante los seis meses de almacenamiento presentó diferencias estadísticas entre sí,

condición similar se observó en el valor inicial en cada uno de los prototipos tanto sólidos como el

líquido, según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 29). Sin embargo, según la comparación de

medias realizada mediante Dunnette al 5%, el prototipo con mejor respuesta a la variable de pH

después de seis meses de almacenamiento fue gránulo dispersable a almacenado a 4°C y 30°C.

Cuadro 29: Análisis del pH según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Variable p-valor1


Valor de pH <0.00011 <0.0001 <0.0001 0.0003 0.0006 <0.0001 <0.0001

48

Cuadro 30: Medias y rangos de significación para el valor de pH, evaluados en los cuatro prototipos

WP, WG, CG y EC, a partir del mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento.

TRATAMIENTOS Medias1 y rangos de significación2


Tratamiento T1:

P1T1 6.711 A2 6.66 A 6.58 DE 5.84 BC 6.11 BC 6.47 DE 6.99 A

Tratamiento T2:

P1T2 6.43 CDE 6.85 A 6.85 A 5.93 A 6.26 A 6.82 A 6.96 A

Tratamiento T3:

P2T1 6.55 DE 6.45 A 6.26 CDE

5.70

ABC 5.59 C

5.99

CDE 6.84 BC

Tratamiento T4:

P2T2 6.47 DE 6.29 BC 6.14 CD 5.59 C 5.65 C

5.79

ABC 6.77 BC

Tratamiento T5:

P3T1 6.12 BCD 5.62 AB 6.14 BCD 5.93 A 5.68 AB

5.88

BCD 6.22 AB

Tratamiento T6:

P3T2 5.46 AB 5.67 C 5.75 E 5.63 AB 5.66 C 5.83 BC 6.13 AB

Tratamiento T7:

P4T1 5.45 ABC 5.58 AB 5.83 AB 5.57 C 5.59 C 5.55 E 5.58 C

Tratamiento T8:

P4T2 5.40 E 5.61 AB 5.87 ABC 5.60 C 5.56 C 5.65 AB 5.57 C

P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; P4: Concentrado Emulsionable; T1: 4°C;

T2: 30°C; inicial: mes de formulación. * Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias

significativas.

Cenicafé (2012) recomienda que el pH para productos biológicos se encuentre en un rango entre

5.5 a 7.5 con un óptimo de 6,6 debido a que este límite ayuda a mantener la integridad de las

células. Otros autores como Góngora, Marín, & Benavides, (2009) determinaron que el rango de

pH adecuado para formulaciones con hongos entomopatógenos es de 5.5 a 7.0.

Otros autores como Corpoica (2010), después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base

de Trichoderma koningiopsis Th003 obtuvieron valores de pH que oscilaron entre 5.0 -7.0 los cuales

se consideraron aceptables para bioplaguicidas, sugiriendo que aquellos cuyo valor era mayor a 7

no debían ser utilizados o se debería utilizar un auxiliar de formulación como regulador de pH.

Según Marín y Bustillo ( 2016), los valores extremos de pH influyen en la germinación del hongo,

retardándola.

Por consiguiente, los valores de pH determinados en los cuatro prototipos tanto sólidos como el

líquido a base de Trichoderma asperellum se encuentran dentro de los rangos de aceptación,

manteniendo estables las formulaciones y sin efectos negativos en la germinación del hongo.

5.2.5. Estabilidad del concentrado emulsionable

El prototipo de concentrado emulsionable se analizó cualitativamente a partir del mes de

formulación y durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas de evaluación. El

concentrado no presentó separación de fases entre aceite y agua, al realizar su reconstitución en

medio acuoso. El sistema inicialmente presentó una coloración verde oscura y en la primera hora

de evaluación se observaron valores iniciales de cremado (aproximadamente de 2 ml) que se

49

presentaron en la parte superior de la emulsión; 24 horas después se observó la formación de

cremado (aproximadamente de 3 ml) y se observó una coloración verde pálida ocasionado por la

sedimentación de material en la base de la probeta. El cremado es un fenómeno fácilmente

reversible que se presentó de manera constante tanto a 4°C y 30°C por el periodo de seis meses de

almacenamiento (Figura 18).

Figura 19: Estabilidad del concentrado emulsionable cremado a) 1 hora b) 24 horas. Fuente: La autora.

Según Quiroga (2009), el cremado es un fenómeno común que se observa en emulsiones aceite en

agua, debido a que las gotas de aceite son menos densas que la fase acuosa, por lo que se trasladan

a la superficie del sistema y forman una capa denominada crema.

El IICA (1998), dispone que la estabilidad de la emulsión a la media hora no deberá tener más de 2

ml de cremado y a las dos horas 4 ml. Después de 24 horas un concentrado emulsionable estable

debe ser capaz de reemulsificarse fácilmente.

Otros autores como Leiva (2013) mencionan que una buena estabilidad del formulado permite

mantener una homogeneidad de la suspensión una vez disuelta en agua (agitación por retorno) y

asegura la cobertura al hacer contacto con el área de aplicación. Tomando en cuenta que la primera

reacción del sistema una vez en contacto con el agua es tornase de color lechoso, lo cual demuestra

que la emulsión se forma con éxito.

Los resultados obtenidos en estabilidad del concentrado emulsionable muestran que la cantidad

de cremado obtenido en la primera hora y 24 horas después de reconstituido el sistema en agua se

encuentra dentro de los rangos permitidos para formulaciones en aceite, sin encontrarse

diferencias por efecto de la temperatura o el periodo de almacenamiento. Sin embargo, no existe

reacción de cambio de color de la formulación al hacer contacto con el agua, lo que puede sugerir

que la emulsión no es completamente efectiva y se debe mejorar mediante adición de agentes

emulsificantes.

50

5.2.6. Suspendibilidad

La suspendabilidad es una característica fisicoquímica que presentan las formulaciones para

asegurar que una cantidad suficiente del ingrediente activo este homogéneamente disperso en

todo el volumen del medio acuoso, a fin de mantener una mezcla satisfactoria y eficaz durante su

aplicación, evitando además el taponamiento de boquillas (Hidalgo, 2014).

La suspendibilidad se evaluó en los prototipos sólidos con capacidad de disolverse en agua WP y

WG a partir del mes de manufacturación y durante seis meses de almacenamiento a dos

temperaturas.

La suspendabilidad inicial promedio para gránulo dispersable presentó un valor de 97.51% y

después de seis meses de almacenamiento obtuvo una suspensión de 98.23% y 98.50% a 4 °C y

30°C, respectivamente (Cuadro 32). El polvo mojable registró un valor de suspendibilidad inicial

promedio de 97.18% y después de seis meses de almacenamiento presentó una suspensión de

97.90% a 4 °C y 97.26% a 30 °C. La suspensión de los prototipos almacenados durante seis meses a

dos temperaturas presentó valores que oscilan entre 94% y 98.80%.

La suspendibilidad en los prototipos WP y WG según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 31) no

presentó diferencias estadísticas en relación con el valor inicial y los seis meses de almacenamiento

a dos temperaturas.

Cuadro 31: Análisis de la suspendibilidad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Variable p-valor1


Suspendibilidad 0.16661 0.4135 0.5897 0.8308 0.9128 0.8098 0.8728

Cuadro 32: Medias y rangos de significación para suspendibilidad (%), evaluados en prototipos

sólidos WP y WG a partir del mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento.

TRATAMIENTOS Medias


Tratamiento T1: P1T1 97.08 94.75 98.66 97.79 98.32 98.57 98.23

Tratamiento T2: P1T2 97.95 94.57 97.97 97.24 98.41 98.14 98.50

Tratamiento T5: P3T1 94.95 97.17 99.16 97.47 97.34 97.90 97.90

Tratamiento T6: P3T2 99.41 97.70 97.63 97.35 97.28 97.52 97.26

P1: Gránulo Dispersable; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial: mes de formulación.

51

Gráfico 3: Suspendibilidad en porcentaje del WP y WG, después de manufacturación y

almacenamiento por seis meses a dos temperaturas.

Quiroga (2009), obtuvo valores de suspendibilidad para gránulo dispersable entre 67.80% y 78.88%,

considerados bajos del límite de aceptación utilizado por el Laboratorio de Control Biológico de

Corpoica que exige una estabilidad mínima del 80%.

Hidalgo (2014), considera que formulaciones de tipo polvo mojable y gránulo dispersable deben

presentar suspensiones de no menos del 60% para asegurar homogeneidad en la aplicación.

Cermeli y Díaz (2016), mencionan que los materiales con mayor tendencia a la suspendibilidad en

agua son el caolín, talco, carbonato cálcico y bentonita la cual presenta la más alta suspendibilidad,

sin embargo, por su acción de recubrir el principio activo puede tender a disminuir la eficiencia de

la formulación.

Por consiguiente, los prototipos WP y WG a base de Trichoderma asperellum, presentan un

porcentaje de suspendibilidad adecuado para formulaciones de reconstitución en agua y aplicación

con equipos de aspersión. La suspendibilidad se mantuvo superior al 90% a partir de la elaboración

de los formulados y durante los seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, presentando

valores de suspensión que oscilan entre 94% y 99%, superiores al 60% y 80% límites establecidos

en investigaciones similares. Por lo tanto, se sugiere que los porcentajes obtenidos en la

suspendibilidad de los prototipos se debe al material base de las formulaciones.

5.2.7. Tamaño de la partícula

El tamaño que presenta una partícula en su formulación sólida es una característica de importancia

debido a que puede inferir en otras propiedades del formulado tales como uniformidad del

contenido, textura, color y estabilidad en almacenamiento (Quiroga, 2009). La característica

fisicoquímica tamaño de partícula para prototipos sólidos WP, WD y CG se determinó mediante

granulometría a partir de su elaboración y durante seis meses de almacenamiento a dos

temperaturas.

0

20

40

60

80

100


Susp

end

ibili

dad

(%

)

Tratamiento T1: P1T1 Tratamiento T2: P1T2

Tratamiento T5: P3T1 Tratamiento T6: P3T2

52

El gránulo dispersable presentó un porcentaje de retención de partículas inicial de 95.64% y

después de seis meses de almacenamiento a 4°C y 30°C mostró una retención de material de

89.98% y 96.0%, respectivamente (Cuadro 34). La mayor cantidad de producto se encontró en el

tamiz con tamaño de poro correspondiente a 250 µm, determinando que el tamaño de partícula

osciló entre 1.70 mm y 250 µm. Por lo tanto, los gránulos fueron homogéneos en las dos

temperaturas, reduciendo la tendencia a la aglomeración o segregación del producto durante el

almacenamiento (Gráfico 3).

El tamaño de la partícula determinado por el porcentaje de material retenido en diferentes tamices

para prototipos sólidos WG, CG y WP, según la prueba de Kruskall Wallis al 5% (Cuadro 33)

presentaron diferencias estadísticas en relación con el valor inicial y los seis meses de

almacenamiento a dos temperaturas.

Cuadro 33: Análisis del tamaño de partícula según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Variable p-valor1


Tamaño de

partícula 0.00011 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 <0.0001

Cuadro 34: Medias y rangos de significación correspondiente a tamaño de la partícula (%), en


almacenamiento.

Tratamientos

Medias1 y rangos de significación2

Inicial 1er mes 2do

mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

Tratamiento

T1: P1T1

94.751

CD2 94.34CD 94.59BC 95.13 CD 94.33 CD 94.71 A 89.98BC

Tratamiento

T2: P1T2 96.54 A 97.16 A 97.56 A 95.71 A 96.57 A 96.14 A 96.00 A

Tratamiento

T3: P2T1 66.32 D 66.74AB 66.39 C 65.60AB 64.00 AB 60.20 C 63.20 C

Tratamiento

T4: P2T2 67.16AB 66.49AB 66.54 C 64.91 D 58.06 D 59.26C 62.80 C

Tratamiento

T5: P3T1 76.69BC 76.52BCD 76.11AB 76.16BCD 76.15BCD 76.30BC 76.66BC

Tratamiento

T6: P3T2 75.84ABC 74.19ABC 74.03AB 74.07ABC 74.61ABC 74.01AB 74.11AB



53

Gráfico 4: Distribución del material retenido (%) de WG, a partir de su elaboración (inicial) y

almacenamiento por seis meses.

El prototipo gránulo cubierto presentó una retención inicial promedio de 66.74%, mientras que a

los seis meses de almacenamiento a dos temperaturas obtuvo valores de 62.80% y 63.20% a 4°C y

30°C, respectivamente. De acuerdo con el tamiz de 250 µm en el cual se concentró la mayor

cantidad de gránulos se determinó que las partículas del formulado tuvieron un tamaño que osciló

entre 1.70 mm y 250 µm, similar al tamaño de gránulo dispersable, sin embargo, existió una menor

homogeneidad debido a que presentó elevados porcentajes de material retenido en otros tamices.

Se observó desprendimiento o excesos de la cobertura del gránulo al encontrar más de 40% de

material retenido entre 150 µm y 53 µm (Gráfico 4).

Gráfico 5: Distribución del material retenido (%) de CG, a partir de su elaboración (inicial) y


0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00


Mat

eria

l ret

enid

o (

%)

mm um

2 2,00 - 1,70 1,70 - 250 250 - 150 150 - 53 < 53

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00


Mat

eria

l ret

enid

o (

%)

mm um

2 2,00 - 1,70 1,70 - 250 250 - 150 150 - 53 < 53

54

Polvo mojable, presentó una retención de material inicial promedio de 76.40% en la base de la

columna de tamices, determinando que el tamaño de partícula del formulado es inferior a 53 µm.

Después de seis meses de almacenamiento los valores de material retenido fueron 76.66% y 74.11%

a 4°C y 30°C, respectivamente, indicando que la formulación se mantuvo estable a dos

temperaturas y seis meses de almacenamiento (Gráfico 5).

Gráfico 6: Distribución del material retenido (%) de WP, a partir de su elaboración (inicial) y


Morales (1996) y Díaz (2011), propusieron que las formulaciones granuladas en un soporte

preformado, como vermiculita, caolinita, zeolita, etc. deberían presentar tamaños de partícula que

oscilen entre 0.2 mm y 1.5 mm, para aprovechar la capacidad de absorción y recubrimiento de este

tipo de minerales.

Estudios realizados por diversos autores como Corpoica, (2010) y Grijalba, Gómez, y Zuluaga, (2014)

después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base de microorganismos como Trichoderma

koningiopsis Th003 y Isaria fumosorosea coincidieron que el tamaño de partícula para este tipo de

bioplaguicidas fue inferior a 100 µm.

Prototipos sólidos como polvos y granulados de aplicación directa, restringen el contenido de

partículas de tamaños no deseables, sin embargo, no presentan límites generales. En cuanto a

gránulos dispersables estos deben asegurar una proporción homogénea de la formulación, a fin de

minimizar la segregación o separación de las partículas durante el transporte, manipulación y

aplicación, por lo tanto, no menos del 85% de la formulación debe estar dentro del rango nominal

(Hidalgo, 2014).

Por lo expuesto anteriormente, el tamaño de la partícula para formulaciones sólidas como polvo

mojable y gránulo cubierto no presentan límites definidos de aceptación y se tomó como válidos

los rangos obtenidos para los prototipos desarrollados: Polvo mojable en base a Trichoderma

asperellum presentó uniformidad del tamaño de partícula siendo inferior a 53µm, tamaño que

permite un adecuado envase y almacenamiento. El gránulo cubierto presentó una homogeneidad

de tamaño que osciló entre 1.70 mm y 250 µm, con un porcentaje de material uniforme retenido

superior al 50%, sin embargo, existieron residuos de polvo en tamices inferiores, que sugieren se

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00


Mat

eria

l ret

enid

o (

%)

um500 500-250 250-150 150-106 106-53 < 53

55

debe mejorar la cobertura del gránulo. El tamaño de partícula que presentó el gránulo dispersable

osciló entre 1.70mm y 250µm con más del 90% de homogeneidad del material uniforme retenido,

encontrándose dentro de los rangos establecidos y asegurando que no existe problemas de

segregación o aglomeración de partículas. Las dos temperaturas y período de almacenamiento no

influyeron en el tamaño de la partícula de los prototipos.

5.2.8. Actividad de agua

La actividad de agua (aw), es una característica fisicoquímica que determina, la germinación,

crecimiento y esporulación de microorganismos. La disminución de aw puede reducir drásticamente

la germinación de conidios dejándolos en latencia por periodos extensos de tiempo, sin embargo,

un descenso extremo en la aw podría ocasionar efectos adversos (Aguirre, Villamizar, Espinel, &

Cotes, 2009).

La evaluación de la actividad de agua en los bioformulados sólidos y el líquido desarrollados a base

de conidias de Trichoderma asperellum se realizó inmediatamente después de la formulación y

durante seis meses de almacenamiento. Los prototipos polvo mojable y concentrado emulsionable,

se analizaron inmediatamente después de su elaboración, mientras que los granulados se

analizaron el día de envasado, debido a que estos pasan por un tiempo previo de secado.

La aw presentó normalidad antes y durante cinco meses de almacenamiento a dos temperaturas,

sin embargo, no hubo varianzas constantes en todos los meses de almacenamiento (Cuadro 35).

Por lo anterior, se analizaron los resultados paramétricos mediante ANOVA y pruebas de

comparación de medias según DMS para prototipos (P), temperaturas (T) y al presentarse

interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0.05%. Las medias para los meses con resultados no

paramétricos se determinaron mediante Dunnette al 5%.

Cuadro 35: Normalidad y varianzas constantes de la aw de los bioformulados, antes y durante los

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.

Actividad de agua (aw) Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.3748 0.3281

1er mes 0.3181 Na

2do mes Na

3er mes 0.7109 0.4824

4to mes 0.4410 0.3746

5to mes 0.6107 0.0748

6to mes 0.194 0.1762


La aw inicial presentó diferencias altamente significativas entre los prototipos, sin encontrar

diferencias estadísticas entre temperaturas o la interacción P x T (Cuadro 36 y Cuadro 37), esto se

debe a que la temperatura inicial es la misma, considerando que la muestra para evaluación se

tomó antes de que los formulados ingresen a almacenamiento a 4° y 30°C.

Se evaluó mensualmente la variable aw después de almacenar los prototipos a dos temperaturas y

por el periodo de seis meses encontrándose que a partir del primer mes de almacenamiento

existieron diferencias estadísticas tanto en los prototipos, las temperaturas y la interacción.

56

Cuadro 36: ANOVA correspondiente a la aw después de formulados los prototipos y durante tres

meses de almacenamiento, a dos temperaturas.


Inicial 1er mes 3er mes Total 39

Prototipos (P) 3 0.281 <0.0001***2 0.2 <0.0001*** 0.15 <0.0001***

Temperatura (T) 1 9E4 0.8091 0.01 0.0446* 0.0042 0.1401

P x T 3 0.0014 0.4273 0.01 0.0003*** 0.01 0.0012**

Error 32 0.0015 0.0017 0.0018 Promedio 0.09 0.06 0.04



significativas.

Cuadro 37: ANOVA correspondiente a la aw del 4to al 6to mes de los bioformulados almacenados,

a dos temperaturas.


4to mes 5to mes 6to mes Total

3

9

Prototipos (P) 3 0.131 <0.0001***2 0. 12 <0.0001*** 0.06 <0.0001***

Temperatura (T) 1 0.01 0.0001*** 0.0001 0.6328 0.01 0.0071**

P x T 3 0.04 <0.0001*** 0.03 <0.0001*** 0.0048 0.0014**

Error 3

2 7.4E4

0.0005

7E4

Promedio 0.05 0.04 0.02

Coeficiente de variación

(%) 5.60 4.95 6.17

Al 6to mes de almacenamiento se encontró que los prototipos presentaron diferencias altamente

estadísticas y tanto las temperaturas como la interacción tuvieron diferencias estadísticas (Cuadro

38). Por lo tanto, se comprobó que las temperaturas generan un efecto sobre la aw durante el

periodo de almacenamiento.

57

Cuadro 38: Medias correspondientes a la aw después de formulados los prototipos y durante seis

meses de almacenamiento a dos temperaturas.

Prototipos (P) Medias y Rangos de Significación


Granulo

dispersable (P1) 0.59 A 0.58 A 0.58 A 0.58 A 0.56 A 0.55 A 0.50 A

Gránulo cubierto

(P2) 0.61 A 0.59 A 0.54 A 0.56 A 0.55 A 0.55 A 0.47 B

Polvo mojable

(P3) 0.25 C 0.29 C 0.29 C 0.31 C 0.32 C 0.32 C 0.33 C

Concentrado

emulsionable (P4) 0.41 B 0.44 B 0.44 B 0.44 B 0.50 B 0.44 B 0.45 B

Temperaturas (T) Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes

4°C (T1) 0.46 A 0.49 A 0.47 A 0.48 A 0.50 A 0.47 A 0.42 A

30°C (T2) 0.46 A 0.46 B 0.45 B 0.46 B 0.47 B 0.46 B 0.45 B

Prototipos x


P1T1 0.61 A 0.61 A 0.57 A 0.63 A 0.66 A 0.62 A 0.50 A

P1T2 0.57 A 0.55 A 0.52 AB 0.53 BC 0.46 D 0.47 C 0.50 A

P2T1 0.61 A 0.58 A 0.60 A 0.57 AB 0.57 B 0.55 B 0.47 A

P2T2 0.60 A 0.60 A 0.56 A 0.54 ABC 0,54 BC 0.55 B 0.47 A

P3T1 0.25 C 0.23 D 0.23 E 0.28 F 0.27 F 0.25 E 0.28 C

P3T2 0.26 C 0.36 C 0.35 D 0.35 EF 0.37 E 0.38 D 0.37 B

P4T1 0.39 B 0.43 B 0.42 CD 0.46 CD 0.52 BCD 0.43 C 0.45 A

P4T2 0.42 B 0.45 B 0.46 BC 0.42 DE 0.49 D 0.44 C 0.45 A


significativas. P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial:

mes de formulación. Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0.02);

Tukey: (p > 0.05); Dunnette: alfa 0.05 (en meses sin varianzas constantes).

La prueba de comparación de medias DMS al 5%, para prototipos inicialmente presentó tres rangos

de significación, encontrándose en el primer rango los prototipos granulados WG, CG con medias

de 0.59 y 0.61, respectivamente; seguido de EC con una media de 0.41 y con menor respuesta a la

variable WP. Tanto temperaturas de almacenamiento como la interacción P x T no presentaron

diferencias entre las medias.

Después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, la prueba de comparación de

medias DMS para prototipos determinó que no existen diferencias estadísticas en comparación al

mes inicial, conservando los tres rangos de significación y los prototipos con mejor respuesta a la

variable son los granulados. La prueba DMS para las dos temperaturas al sexto mes de evaluación

determinaron dos rangos de significación, presentando mejor respuesta a la variable la

temperatura a 4°C con una media de 0.42. La interacción P x T según la prueba de Tukey (0.05%)

presentó al sexto mes de almacenamiento tres rangos de significancia, determinando que los

prototipos granulados y concentrado emulsionable a las dos temperaturas de almacenamiento

58

presentan mejor respuesta a la variable, seguido de polvo mojable a 30°C y con menor respuesta a

la variable polvo mojable almacenado a 4°C.

Autores como Swaminathan, Koten, Henderson, Jackson y Wilson (2016) consideran rangos

adecuados de actividad de agua entre 0.560 y 0.765 para recubrir semillas a base de Trichoderma

spp. Estudios similares de formulaciones en polvo a base de Beauveria y formulaciones líquidas a

base de Trichoderma presentaron valores de actividad de agua entre 0.542-0.596 y 0.425- 0.622,

respectivamente durante tres meses de almacenamiento (Swaminathan & Jackson, 2011).

Por consiguiente, según los análisis estadísticos, los mejores prototipos son los granulados por

presentar mejor respuesta a la variable en la interacción P x T. Sin embargo, al tomar en cuenta los

resultados obtenidos en el análisis de las variables microbiológicas concentración en UFC y

porcentaje de germinación el mejor prototipo es Polvo Mojable (WP) almacenado a 4°C. La

actividad de agua de 0.28 que presentó el WP, mantuvo en mejores condiciones las características

del ingrediente activo, dejando al microorganismo en latencia por mayor tiempo en comparación

con el resto de los prototipos a pesar de ser la aw más baja en comparación con estudios similares.

5.3. Resumen de las características microbiológicas y fisicoquímicas

Los resultados obtenidos en las bioformulaciones y sus respectivas características microbiológicas

y fisicoquímicas después de seis meses de almacenamiento determinaron que 4°C es la mejor

temperatura de conservación para el ingrediente activo en sus respectivas formulaciones,

evidenciando que el polvo mojable generó mejor respuesta a las variables según los parámetros de

calidad establecidos por el Laboratorio de Control biológico INIAP-EESC.

El resumen de la evaluación de las características microbiológicas y fisicoquímicas se muestran en

los Cuadros 39, 40 y 41, respectivamente, apreciando la diferente estabilidad en las cuatro

bioformulaciones generada después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.

Cuadro 39: Características microbiológicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C y 30°C.

Características

Microbiológicas

Polvo mojable

(WP)

Concentrado

emulsionable (EC)

Gránulo cubierto

(CG)

Gránulo

dispersable

(WG)

4°C 30°C 4°C 30°C 4°C 30°C 4°C 30°C

Porcentaje de

germinación

(%)

87.60 80.80 76.00 0.00 78.28 0.00 80.35 0.00

Concentración

de colonias

(UFC)

3.76x108 4.93x107 3.02x108 2.18x104 1.85x106 2.71x108 2.91x108 0.00

Pureza (%) < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1

Nivel de

eficiencia del

proceso de

formulación (%)

100.00 100.00 96.68 91.28 100.00 94.80 99.83 94.33

59

Cuadro 40: Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C.

Características

fisicoquímicas

Polvo mojable

(WP)

Concentrado

emulsionable

(EC)

Gránulo

cubierto (CG)

Gránulo

dispersable

(WG)

Densidad apisonada

(g/ml) 0.72 - 1.00 0.63

Humectabilidad

(min) > 1 > 1 > 1 > 1

Humedad (%) 2.79 - 5.94 5.22

Valor de pH 6.22 5.58 6.84 6.99

Estabilidad del

concentrado

emulsionable (ml)

- 3 - -

Suspendibilidad (%) 97.90 - - 98.23

Tamaño de la

partícula (%) 76.66 - 63.20 89.98

Actividad de agua

(aw) 0.28 0.45 0.47 0.50

Cuadro 41: Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum después de seis meses almacenamiento a 30°C.

Características

fisicoquímicas

Polvo mojable

(WP)

Concentrado

emulsionable

(EC)

Gránulo

cubierto (CG)

Gránulo

dispersable

(WG)

Densidad apisonada

(g/ml) 0.71 - 1.00 0.63

Humectabilidad

(min) > 1 > 1 > 1 > 1

Humedad (%) 2.82 - 5.73 4.95

Valor de pH 6.13 5.57 6.77 6.96

Estabilidad del

concentrado

emulsionable (ml)

- 3 - -

Suspendibilidad (%) 97.26 - - 98.50

Tamaño de la

partícula (%) 74.11 - 63.80 96.00

Actividad de agua

(aw) 0.37 0.45 0.47 0.50

60

VI. CONCLUSIONES

• El formulado biológico con mayor estabilidad y preservación de Trichoderma asperellum,

después de seis meses de almacenamiento fue el polvo mojable almacenado a bajas

temperaturas (4°C), escogido por presentar alta viabilidad tanto en germinación con valor

mayor al 85% y concentración de colonias superior al 1x108 UFC/g; límite mínimo establecido

por el Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC.

• Los prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron

mayor viabilidad por seis meses de almacenamiento cuando fueron almacenados en

refrigeración 4°C.

• La temperatura de 30°C afectó la estabilidad de Trichoderma asperellum en las formulaciones

causando en algunos de ellos la pérdida total de la viabilidad.

• Las características fisicoquímicas, porcentaje de humedad, actividad de agua, densidad

apisonada, suspensibilidad, pH y tamaño de la partícula en los prototipos de bioformulaciones

sólidas; polvo mojable, gránulo cubierto y gránulo dispersable se mantuvieron dentro de los

límites establecidos para asegurar la calidad de los productos con excepción de la

humectabilidad que superó el límite para el tiempo de mojadura.

• El bioformulado líquido concentrado emulsionable presentó estabilidad en las características

fisicoquímicas pH y aw después de su manufactura y durante el almacenamiento. Sin embargo,

no se observó una adecuada formación de emulsión, a pesar de que el parámetro de cremado

estuvo dentro de los límites de aceptación.

• El polvo mojable a 30°C fue el único producto que mantuvo su germinación mayor al 80%,

después de seis meses de almacenamiento. Sin embargo, su concentración estuvo bajo del

límite de aceptación, siendo esta una característica de mejora.

• Valores de actividad de agua de hasta 0,20 en formulaciones de polvo mojable mantienen, las

características microbiológicas de Trichoderma asperellum por periodos prolongados.

61

VII. RECOMENDACIONES

• Mejorar la característica de humectabilidad en los prototipos polvo mojable y gránulo

dispersable para disminuir el tiempo de humectación completa de las partículas y asegurar

la inmediata liberación del ingrediente activo.

• Optimizar la estabilidad del concentrado emulsionable mediante la adición de diferentes

productos estabilizantes que mejoren la emulsificación y su posterior aplicación en el

campo.

• Evaluar varios agentes aglutinantes y humectantes para formulación del gránulo

dispersable para disminuir disgregación del producto durante el almacenamiento.

• Estudiar la compatibilidad de más ingredientes inertes con el hongo Trichoderma

asperellum para mejorar las propiedades microbiológicas y fisicoquímicas de las

formulaciones ensayadas.

• Realizar un análisis socio económico del mejor prototipo a base de conidias de Trichoderma

asperellum.

• Estudiar los efectos de la aw sobre Trichoderma asperellum para determinar los mínimos y

máximos valores en los cuales puede sobrevivir el microorganismo en una formulación.

• Implementar ensayos a nivel de invernadero y campo para evaluar aplicación y eficacia del

prototipo en polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum.

62

VIII. RESUMEN

Ecuador posee un sistema de producción de cultivos diferenciado por el tamaño de la Unidad

Productiva Agropecuaria (UPA) que presenta diversos factores edafoclimáticos en cada Región del

país los cuales contribuyen al desarrollo de plagas (Vallejo, 2014). Las pérdidas generadas por

patógenos pueden superar el 20% de los costos de producción, dependiendo de la severidad de

ataque razón por la cual se ha impulsado la búsqueda de estrategias de control que sean

alternativas al control químico y eficientes. El control biológico es una opción para minorar el uso

de agroquímicos, mediante la utilización de microorganismos antagonistas sobre otros patógenos

(Bettiol et al.,2014).

Los hongos biocontroladores pertenecientes al género Trichoderma, por su versatilidad,

adaptabilidad y fácil manipulación son capaces de controlar una amplia gama de microorganismos

patógenos (Falconí, 2010), siendo los preferidos para el control biológico. Actualmente se ha

incrementado el uso de hongos antagonistas motivo por el que se buscan maneras de conservar al

microorganismo por mayor tiempo asegurando sus características físicas y microbiológicas. El

desarrollo de bioformulaciones es una herramienta esencial que promueve la producción,

manipulación y aplicación eficiente del microorganismo en campo.

El presente trabajo tuvo como finalidad el desarrollo de cuatro prototipos de bioformulaciones a

base de conidias de Trichoderma asperellum, escogido por sus cualidades de antagonismo y su

amplio mecanismo de acción frente a diversos patógenos, observando que los productos

bioformulados se realizaron a partir de una cepa obtenida en el INIAP-Estación Experimental Litoral

Sur y con la mezcla de ingredientes inertes que ayudaron a la sobrevivencia, actividad, preservación

y almacenamiento del agente biocontrolador.

Las características microbiológicas evaluadas determinaron al mejor prototipo con respecto a su

preservación en el tiempo.

El mejor prototipo considerando la viabilidad y concentración de colonias UFC/g fue polvo mojable

que presentó una reducción mínima de la germinación al cabo de seis meses de almacenamiento a

4°C conservando un 87,6% y una concentración promedia de 3,76x108 UFC/g, valores considerados

aceptables dentro de los parámetros de calidad establecidos por el Laboratorio de Control

Biológico. También se debe considerar que el polvo mojable a 30 °C mantuvo una germinación del

80,8%, lo cual es importante debido a que las formulaciones realizadas tienen como finalidad su

aplicación en la Región Litoral del Ecuador.

El nivel de pureza presente en las cuatro bioformulaciones cumplió con el estándar de calidad

establecido, sugiriendo que la estabilidad y viabilidad del microorganismo no se vio afectado por

otros microorganismos durante la etapa de almacenamiento a dos temperaturas. Los cuatro

prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron un porcentaje

de eficiencia superior al 90%, obteniendo mejor porcentaje el bioformulado polvo mojable con 100

% de eficiencia, es decir los procesos de formulación no afectaron al hongo.

Los resultados de la evaluación de las características fisicoquímicas se analizaron antes y durante

seis meses de almacenamiento, determinaron que existió estabilidad en estas propiedades.

La densidad apisonada promedio para gránulo dispersable oscila entre 630g/L y 670 g/L y gránulo

cubierto tuvo un valor constante de 1000g/L, adecuados para este tipo de productos. El prototipo

63

de polvo mojable presentó una densidad apisonada de 710g/L a 780g/L, valores que se encuentran

sobre los limites recomendables, sin embargo, el producto mostró un adecuado comportamiento

microbiológico. En consecuencia, los rangos obtenidos para cada prototipo sólido sugieren que no

existirán problemas en operaciones de formulación a gran escala.

La humectabilidad de los prototipos sólidos (WP y WG) no presentaron un tiempo de humectación

adecuado para bioformulaciones debido a que exceden el minuto para humedecerse

completamente.

El porcentaje de humedad fue evaluada solo en los prototipos sólidos y según el análisis de los

resultados esta se encuentra entre un rango entre 2 a 5%, niveles adecuados y estables que no

permiten proliferación de agentes contaminantes, así como evitar compactación o aglomeración

de las partículas dentro del envase.

El pH determinado en los cuatro prototipos tanto sólidos como el líquido a base de Trichoderma

asperellum se encuentran en un rango de 5 a 7, valores adecuados para formulaciones biológicas.

El pH mantuvo estables las formulaciones y no influyó negativamente en la germinación del hongo.

La estabilidad del concentrado emulsionable mostró que la cantidad de cremado obtenido en la

primera hora y 24 horas después de reconstituido en agua, estuvo dentro de los rangos permitidos

para formulaciones en aceite. Sin embargo, no existe reacción de cambio de color de la formulación

al hacer contacto con el agua, lo que puede sugerir que la emulsión no es completamente efectiva

y se debe mejorar mediante adición de agentes emulsificantes.

Los prototipos WP y WG a base de Trichoderma asperellum, presentan un porcentaje de

suspendibilidad adecuado para formulaciones de reconstitución en agua y aplicación con equipos

de aspersión. La suspendibilidad se mantuvo superior al 90% a partir de su formulación.

El tamaño de la partícula para formulaciones sólidas como polvo mojable y gránulo cubierto no

presentan límites definidos de aceptación y se tomaron como validos los rangos obtenidos para los

prototipos desarrollados: El polvo mojable presentó uniformidad del tamaño de partícula siendo

inferior a 53µm, tamaño que permite un adecuado envase y almacenamiento. El gránulo cubierto

y gránulo dispersable presentaron una homogeneidad de tamaño que osciló entre 1,70 mm y

250µm- Las temperaturas y período de almacenamiento no produjeron cambios en el tamaño de

la partícula de los prototipos.

La actividad de agua de 0,28 que presentó el WP, mantuvo en mejores condiciones las

características del hongo, dejando al microorganismo en latencia por mayor tiempo en

comparación del resto de prototipos.

Por consiguiente, solo prototipos en refrigeración presentaron una vida útil y estabilidad por seis

meses de almacenamiento, asegurando la sobrevivencia de las conidias de Trichoderma

asperellum. El almacenamiento a temperaturas elevadas reduce la estabilidad del microrganismo

corroborando la reducción su viabilidad después de 24 horas.

64

SUMMARY

Ecuador has a system of crop production differentiated by the size of the Agricultural Productive

Unit (UPA) that presents various edaphoclimatic factors in each region of the country which

contribute to the development of pests (Vallejo, 2014). The losses generated by pathogens can

exceed 20% of production costs, depending on the severity of the attack, which is why the search

for control strategies that are alternatives to chemical control and efficient. Biological control is an

option to reduce the use of agrochemicals, through the use of antagonistic microorganisms on

other pathogens (Bettiol et al.,2014).

The biocontroller fungi belonging to the genus Trichoderma, for their versatility, adaptability and

easy handling are able to control a wide range of pathogenic microorganisms (Falconí, 2010), being

preferred for biological control. Currently, the use of antagonist fungi has been increased, which is

why ways are looking for ways of preserving the microorganism for a longer time assuring its

physical and microbiological characteristics. The development of bioformulations is an essential

tool that promotes the production, handling and efficient application of the microorganism in the

field.

The purpose of this work was to developing four prototypes of bioformulations based on

Trichoderma asperellum, chosen for its antagonistic qualities and its broad mechanism of action

against various pathogens, contemplating that the bioformulated products were made from a strain

obtained at the INIAP- Station Experimental Litoral Sur and with the mixture of inert ingredients

that helped the survival, activity, preservation and storage of the biocontrol agent.

The microbiological characteristics evaluated determined the best prototype with respect to its

preservation over time.

The best prototype based on the viability and concentration of conidia CFU / g was wettable powder

that presented a minimum reduction of germination after six months of storage at 4 ° C, conserving

87.6% and 3.76x108 CFU / g, respectively, values within the quality parameters established by the

Biological Control Laboratory. It should also be taken into account that wettable powder at 30 ° C

maintained a germination of 80.8%, which is important because the formulations made are

intended for application in the Littoral Region of Ecuador.

The level of purity present in the four bioformulations met the established quality standard,

suggesting that the stability and viability of the microorganism was not affected by other

microorganisms during the storage stage at two temperatures. The four prototypes developed

based on conidia of Trichoderma asperellum presented a percentage of efficiency level higher than

90%, obtaining a better percentage of the bioformulated wettable powder with 100% efficiency,

that is, the formulation processes did not affect the fungus.

The results of the evaluation of the physicochemical characteristics were analyzed before and

during six months of storage, determined that there was stability in these properties.

65

The average rammed density for dispersible granule ranges from 630g / L to 670 g / L and covered

granule had a constant value of 1000g / L, suitable for this type of products. The prototype of

wettable powder presented a tamped density of 710g / L to 780g / L, values that are above the

recommendable limits, however, the product showed an adequate microbiological behavior.

Consequently, the ranges obtained for each solid prototype suggest that there will be no problems

in large-scale formulation operations.

The wettability of the solid prototypes (WP and WG) did not present an adequate wetting time for

bioformulations because they exceed one minute to completely moisten.

The percentage of humidity was evaluated only in the solid prototypes and according to the analysis

of the results this is within a range between 2 to 5%, suitable and stable levels that do not allow

proliferation of contaminating agents as well as avoiding without compaction or agglomeration of

the particles in the formulations inside the container.

The pH determined in the four solid prototypes and the liquid based on Trichoderma asperellum

are in a range of 5 to 7 values suitable for biological formulations. The pH kept the formulations

stable and did not influence negatively in the germination of the fungus.

The stability of the emulsifiable concentrate showed that the amount of cream obtained in the first

hour and 24 hours after reconstitution in water was within the allowed ranges for oil formulations.

However, there is no color change reaction of the formulation when making contact with water,

which may suggest that the emulsion is not completely effective and must be improved by the

addition of emulsifying agents.

The prototypes WP and WG based on Trichoderma asperellum, present a percentage of suitable

suspensibility for formulations of reconstitution in water and application with spray equipment.

Suspendability remained above 90% from the time of production.

The particle size for solid formulations such as wettable powder and covered granule do not have

defined limits of acceptance and the ranges obtained for the developed prototypes were taken as

valid: Wettable powder showed uniformity of the particle size being less than 53μm, size that allows

a suitable container and storage. Coated granule and dispersible granule presented a homogeneity

of size that ranged between 1.70 mm and 250 μm- Temperatures and storage period did not change

the particle size of the prototypes.

The water activity of 0.28 presented by WP kept the characteristics of fungus in better conditions,

leaving the microorganism in latency for a longer time compared to the rest of the prototypes.

Therefore, only prototypes in refrigeration presented a shelf life and stability for six months of

storage, assuring the survival of the conidia of Trichoderma Asperellum. Storage at elevated

temperatures reduces the stability of the microorganism by corroborating the reduction of its

viability after 24 hours.

66

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70

X. ANEXOS

Anexo 1. Identificación del aislamiento de Trichoderma asperellum realizado por INIAP-Estación Experimental Litoral Sur.

71

Anexo 2. Parámetros de calidad para formulaciones biológicas, establecidos por el Laboratorio de Control Biológico de INIAP-EESC.

Parámetros de calidad

Variables Rango aceptación

Polvo Mojable

Concentrado

Emulsionable

Gránulo Cubierto

Gránulo Dispersabl

e

Concentración de conidias (UFC/g o ml)

1x108 1x108 1x108 1x108 1x108

Pureza (%) < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 %

Porcentaje de germinación (%)

> 85 % > 85 % > 85 % > 85 % > 85 %

Nivel de eficiencia (%) > 60 % > 60 % > 60 % > 60 % > 60 %

Porcentaje de humedad (%)

3 a 7% 3 a 7 % NO APLICA 3 a 5 % 3 a 7 %

Actividad de agua máximo 0,7 máximo 0,7

máximo 0,7 máximo 0,7 máximo 0,7

Densidad apisonada (g/ml)

hasta 1g/ml 1g/ml NO APLICA 1g/ml 1g/ml

72

Valor pH 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0

Tiempo de humectación (s)

< 60seg < 60seg NO APLICA NO APLICA < 60seg

Suspendibilidad (%) > 50 % sólidos y > 60% CE

> 50 % > 60 % NO APLICA > 50 %

Tamaño de la partícula (%)

< 50 µm polvo mojable

< 50 µm NO APLICA NO APLICA NO APLICA

Estabilidad Concentrado Emulsionable (ml)

1hora ---3ml 24horas - 4ml

NO APLICA 3 ml crema NO APLICA NO APLICA

Anexo 3. Determinación de la concentración de colonias (UFC/g) en diluciones serias de 104 a 106.

Anexo 4. Determinación del porcentaje de germinación (%) de Trichoderma asperellum.

73

Anexo 5. Conteo de conidias de Trichoderma asperellum germinadas y sin germinar (40x).

Anexo 6. Área de secado de sustrato arroz con deshumificador.

74

Anexo 7. Producción masiva de Trichoderma asperellum en sustrato arroz.

Anexo 8. Procedimiento para medición de la densidad apisonada en productos sólidos.

75

Anexo 9: Determinación de la actividad de agua

Anexo 10: Determinación del porcentaje de humedad de los productos biológicos

76

Anexo 11: Determinación del valor de pH

Anexo 12: Determinación de la suspendibilidad