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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACEÚTICA
Actividad antibacteriana in vitro de nanopartículas propóleo de abejas de la especie Apis
mellifera frente a cepa ATCC de Streptococcus mutans.
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de:
Química Farmacéutica
Autora: Andrea Belen Pillajo Balladares
Tutor: PhD. Pablo Mauricio Bonilla Valladares
QUITO
2019
II
III
IV
V
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Investigación de Nanoestructuras,
Laboratorio de Biotecnología y Laboratorio de Química Sostenible de la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
VI
DEDICATORIA
“El verdadero signo de la inteligencia no es el conocimiento, sino la imaginación”
-Albert Einstein-
Dedico este trabajo a Dios, a mis Padres Vicenta y Francisco por traerme al mundo,
educarme con amor, esfuerzo y sacrificio, a mis hermanas Verónica, Gloria y Diana que
Dios bendiga a sus hijos y familias las quiero mucho, a mis amigos Cecilia Chulde y David
Nacimba gracias por las risas y los años de amistad.
VII
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Central del Ecuador a la facultad de Ciencias Químicas
Gracias por permitir formarme en esta ilustre Alma máter
A mi Tutor PhD. Pablo Bonilla
Gracias por el apoyo, ayuda, asesoría, confianza, paciencia y ánimos brindado durante la
elaboración de este trabajo y por transmitirme sus conocimientos.
A MSc. Milene Díaz
Mis más sinceros agradecimientos por la motivación, confianza, paciencia, generosidad y
toda la ayuda proporcionada
A MSc. Rommy Terán
Gracias por la colaboración en el desarrollo, revisión de este trabajo y por brindarme sus
conocimientos.
A los Docentes de la Facultad de Ciencias Químicas
Gracias por transmitirme el amor hacia esta profesión y por todos los conocimientos
brindados.
A mis amigas Dayana Villareal, Jhosselyn Guachalá, Diana Iza, Diana Carrasco, Evelyn
Guerrón, Karolina Álvarez y Patricio Rocha.
Gracias por la confianza, risas, llantos y momentos compartidos.
A mi familia de la U, Patricia Panchi, Sofy Ortega, Paul Chávez y Estalyn Caizapanta
Gracias por su amistad y momentos compartidos.
A Rosa Linda Sharian, Edwin Guamán, Soraya Martínez
Gracias por tantos años de amistad.
A Lolo Torres y Catalina Montesdeoca
Gracias por orar por mí y la confianza brindada Dios bendiga sus hogares.
VIII
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ....................................................................................................................... XVI
SUMMARY .................................................................................................................... XVII
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... XVIII
CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 1
1. El Problema ................................................................................................................ 1
1.1 Planteamiento del problema ................................................................................ 1
1.2 Formulación del problema .................................................................................. 2
1.3 Preguntas Directrices .......................................................................................... 2
1.4 Objetivo de la Investigación................................................................................ 2
1.4.1 Objetivo General ............................................................................................. 2
1.4.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 2
1.5 Justificación e Importancia ................................................................................. 3
CAPÍTULO II ........................................................................................................................ 4
2. Marco teórico.............................................................................................................. 4
2.1 Antecedentes ....................................................................................................... 4
2.2 Fundamentación teórica ...................................................................................... 5
2.2.1 Biofilm o placa bacteriana. .......................................................................... 5
2.2.2 Streptococcus mutans. ................................................................................. 6
2.2.3 Caries Dental................................................................................................ 7
2.2.4 Clorhexidina................................................................................................. 8
2.2.5 Propóleo. ...................................................................................................... 8
2.2.6 Soluciones coloidales. ................................................................................ 13
2.2.7 Nanopartículas ........................................................................................... 14
2.2.8 Síntesis de nanopartículas. ......................................................................... 15
2.2.9 Recolección del propóleo........................................................................... 16
2.2.10 Limpieza y Molienda. ................................................................................ 17
2.2.11 Estandarización del propóleo. .................................................................... 17
2.2.12 Método de Folin-Ciocalteu para compuestos fenólicos totales. ................ 20
2.2.13 Determinación de flavonoides totales. ....................................................... 21
2.2.14 Caracterización de nanomateriales. ........................................................... 22
IX
2.2.15 Métodos para determinar la actividad antibacteriana. ............................... 23
2.3 Fundamentación legal ....................................................................................... 24
2.4 Hipótesis ............................................................................................................ 25
2.4.1 Hipótesis alternativa (Hi). .......................................................................... 25
2.4.2 Hipótesis nula (Ho). ................................................................................... 25
2.5 Sistema de variables .......................................................................................... 25
2.5.1 Variables Independientes. .......................................................................... 25
2.5.2 Variable dependiente. ................................................................................ 25
Capítulo III .......................................................................................................................... 26
3. Marco Metodológico ................................................................................................ 26
3.1 Diseño de la Investigación ................................................................................ 26
3.2 Población y muestra .......................................................................................... 26
3.3 Materiales, Reactivos y Equipos ....................................................................... 27
3.4 Metodología ...................................................................................................... 29
3.4.1 Recolección del propóleo........................................................................... 29
3.4.2 Limpieza y molienda. ................................................................................ 29
3.4.3 Pérdida por calentamiento. ........................................................................ 29
3.4.4 Cenizas. ...................................................................................................... 29
3.4.5 Impurezas mecánicas. ................................................................................ 30
3.4.6 Índice de oxidación. ................................................................................... 30
3.4.7 Preparación de los extractos hidroalcóholicos. .......................................... 30
3.4.8 Preparación de nanopartículas de propóleo. .............................................. 30
3.4.9 Caracterización de las nanopartículas. ....................................................... 31
3.4.10 Determinación de flavonoides totales. ....................................................... 31
3.4.11 Determinación de compuestos fenólicos totales. ....................................... 32
3.4.12 Evaluación de la actividad antibacteriana. ................................................. 32
3.5 Diseño experimental.......................................................................................... 35
3.5.1 Fase I: Obtención de extractos. .................................................................. 35
3.5.2 Fase II: Obtención de soluciones coloidales. ............................................. 36
3.6 Matriz de Operacionalización de Variables ...................................................... 37
3.7 Técnicas de procesamiento y análisis de datos ................................................. 37
Capítulo IV .......................................................................................................................... 40
X
4. Análisis y discusión de resultados ............................................................................ 40
4.1 Estandarización del propóleo. ........................................................................... 40
4.2 Porcentaje de Rendimiento. .............................................................................. 41
4.3 Cuantificación de fenoles totales ...................................................................... 43
4.4 Cuantificación de flavonoides totales ............................................................... 45
4.5 Tamaño de partícula .......................................................................................... 49
4.6 Polidispersión del tamaño ................................................................................. 51
4.7 Actividad antibacteriana.................................................................................... 53
4.7.1 Actividad antibacteriana por el método pozos en agar. ............................. 53
4.7.2 Actividad antibacteriana por el Método Microdilución en placa. ............. 55
5. CAPITULO V .......................................................................................................... 60
5.1 Conclusiones ..................................................................................................... 60
5.2 Recomendaciones .............................................................................................. 61
Referencias .......................................................................................................................... 62
ANEXOS ............................................................................................................................. 69
XI
Índice de Tablas
Tabla 1. Métodos de Extracción ......................................................................................... 20
Tabla 2. Materiales, Equipos y Reactivos .......................................................................... 27
Tabla 3. Diseño completamente al azar .............................................................................. 35
Tabla 4. Diseño Factorial axb ............................................................................................. 36
Tabla 5. Variables, dimensiones e indicadores................................................................... 37
Tabla 6. ANOVA con un factor.......................................................................................... 37
Tabla 7. ANOVA con dos factores ..................................................................................... 38
Tabla 8. Características Físicas y Químicas del propóleo .................................................. 40
Tabla 9. Porcentaje de Rendimiento ................................................................................... 41
Tabla 10. ANOVA para el rendimiento.............................................................................. 41
Tabla 11. Pruebas de LSD para el porcentaje de propóleo disuelto ................................... 42
Tabla 12. Concentración de fenoles totales ........................................................................ 44
Tabla 13. ANOVA para concentración de fenoles totales.................................................. 44
Tabla 14. Pruebas LSD para concentración de fenoles totales ........................................... 45
Tabla 15. Concentración de flavonoides totales ................................................................. 46
Tabla 16. ANOVA para concentración de flavonoides totales .......................................... 46
Tabla 17. Pruebas LSD para concentración de flavonoides totales .................................... 47
Tabla 18. Tamaño de partícula ........................................................................................... 49
Tabla 19. ANOVA para tamaño de partícula ..................................................................... 49
Tabla 20. Pruebas LSD para tamaño de partícula .............................................................. 50
Tabla 21. Polidispersión ..................................................................................................... 52
Tabla 22. ANOVA para Polidispersión .............................................................................. 52
Tabla 23. Halos de inhibición ............................................................................................. 53
Tabla 24. ANOVA para halos de inhibición ...................................................................... 54
Tabla 25. Pruebas LSD para halo de inhibición ................................................................. 54
Tabla 26. Porcentaje de Inhibición ..................................................................................... 56
Tabla 27. ANOVA para porcentaje de inhibición .............................................................. 56
Tabla 28. Pruebas LSD para Porcentaje de inhibición ....................................................... 57
Tabla 29. Pérdida por calentamiento .................................................................................. 72
Tabla 30. Cenizas ............................................................................................................... 72
Tabla 31. Impureza mecánicas ........................................................................................... 72
Tabla 32. Índice de oxidación............................................................................................. 72
XII
Índice de Figuras
Figura 1: Núcleo estructural de los principales grupos de polifenoles ................................ 10
Figura 2: Núcleo estructural de los principales grupos de flavonoides ............................... 11
Figura 3: Principales compuestos fenólicos y flavonoides encontrados en el propóleo ..... 12
Figura 4: Rangos de tamaños de partículas de una solución verdadera, solución coloidal y
suspensión............................................................................................................................ 13
Figura 5: Ejemplos y tamaños de nanopartículas y soluciones coloidales .......................... 14
Figura 6: Mecanismo de acción del reactivo de Folin-Ciocalteu ........................................ 20
Figura 7: Complejo flavonoide-Al ...................................................................................... 22
Figura 8: Esquema de Microdilución en placa (placas 1 y 2) ............................................. 34
XIII
Índice de Gráficos
Gráfico 1: Porcentaje de propóleo disuelto según el grado alcohólico en el extracto ......... 43
Gráfico 2: Concentración de fenoles según el grado alcohólico y la concentración de tween
80 ......................................................................................................................................... 45
Gráfico 3: Concentración de flavonoides según el grado alcohólico y la concentración de
tween 80............................................................................................................................... 47
Gráfico 4: Concentración de fenoles y flavonoides según el grado alcohólico de la solución
coloidal ................................................................................................................................ 48
Gráfico 5: Tamaño de partícula según el grado alcohólico y la cantidad de tween ............ 51
Gráfico 6: Polidispersión según el grado alcohólico y la concentración de tween ............. 53
Gráfico 7: Halos de inhibición según el tamaño de partícula de cada solución coloidal .... 55
Gráfico 8: Porcentaje de inhibición según el tamaño de partícula de cada solución coloidal
............................................................................................................................................. 59
Gráfico 9: Curva de calibración de Fenoles Totales ........................................................... 73
Gráfico 10: Curva de calibración de Flavonoides Totales .................................................. 73
XIV
Índice de Ecuaciones
Ecuación 1: Porcentaje de humedad .................................................................................... 18
Ecuación 2: Porcentaje de cenizas ....................................................................................... 18
Ecuación 3: Porcentaje de impurezas mecánicas ................................................................ 19
Ecuación 4: Curva de calibración ........................................................................................ 21
Ecuación 5: Concentración de fenoles totales ..................................................................... 21
Ecuación 6: Concentración de flavonoides totales .............................................................. 22
Ecuación 7: Ley de Stokes Einstein .................................................................................... 23
Ecuación 8: Porcentaje de inhibición .................................................................................. 24
Ecuación 9: Diferencia mínima significativa (LSD) con un factor ..................................... 38
XV
Índice de Anexos
Anexo 1. Árbol de problemas. ........................................................................................... 69
Anexo 2. Diagrama de flujo de la Fase I ............................................................................ 70
Anexo 3. Diagrama de flujo Fase II ................................................................................... 71
Anexo 4. Datos de estandarización del propóleo. .............................................................. 72
Anexo 5. Curvas de calibración ......................................................................................... 73
Anexo 6. Recolección del propóleo ................................................................................... 74
Anexo 7. Preparación de los extractos a diferentes concentraciones. ............................... 74
Anexo 8. Preparación de soluciones coloidales ................................................................. 75
Anexo 9. Determinación de fenoles y flavonoides ............................................................ 76
Anexo 10. Determinación de la actividad antibacteriana ................................................... 77
Anexo 11. Halos de inhibición ........................................................................................... 78
Anexo 12. Técnica Microdilución en placa ....................................................................... 78
Anexo 13. Técnica de Pozos en Agar. ............................................................................... 79
Anexo 14. Certificado de análisis del estándar de Quercetina ........................................... 81
XVI
“Actividad antibacteriana in vitro de nanopartículas propóleo de abejas de la especie Apis
mellifera frente a cepas ATCC de Streptococcus mutans.”
Autora: Andrea Belen Pillajo Balladares
Tutor: PhD. Pablo Mauricio Bonilla Valladares
RESUMEN
En el presente trabajo se evaluó la actividad antibacteriana de varias soluciones coloidales
elaboradas por el método intercambio de solvente frente a cepas ATCC 25175 de
Streptococcus mutans. Para ello se elaboraron varios extractos de propóleo en donde se
evaluó la concentración de alcohol del 5-70% como agente estabilizante se utilizó tween 80
al 0,5% seguidamente se sometió a agitación y filtración para la reducción del tamaño de
partícula. Se evaluó la influencia de la concentración de alcohol en el porcentaje de propóleo
disuelto en cada extracto; se cuantificó la concentración de Fenoles totales y Flavonoides
totales en cada solución coloidal con y sin tween 80 a diferentes concentraciones de alcohol
de las soluciones coloidales por el método espectrofotométrico obteniendo concentraciones
de 1,66-122,1 mg EAG/g para Fenoles totales y 0,10-48,53mg EQ/g para Flavonoides
totales. En la determinación del tamaño de partícula y la polidispersión de las soluciones se
utilizó la técnica de dispersión de la luz (DLS) obteniendo tamaños de partícula de 200-
1000nm. Para la evaluación de la actividad antibacteriana se utilizó las técnicas de pozos en
agar y Microdilución en placa comparando cada solución con Clorhexidina al 0,12%. La
solución de referencia presenta halos de inhibición de 15mm y un porcentaje de inhibición
del 99,83%, ninguna de las soluciones coloidales superó a la Clorhexidina, pero las
soluciones coloidales S70 y S60 presentan una actividad antibacteriana comparable con la
solución de referencia con tamaños de partículas entre 900-1000nm. Para las soluciones S50-
S5 por el método intercambio de solvente hay un aumento del 0,4% al 49% en la actividad
antibacteriana. Determinando que el efecto antibacteriano de las nanopartículas de propóleo
frente a S. mutans, no solo está dado por su disminución en el tamaño de partícula sino por
la concentración de metabolitos secundarios presentes en la solución.
PALABRAS CLAVE: NANOPARTÍCULAS DE PROPÓLEO, ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA, Streptococcus mutans, SOLUCIÓN COLOIDAL, FENOLES
TOTALES, FLAVONOIDES TOTALES, CLORHEXIDINA.
XVII
"In vitro antibacterial activity of propolis nanoparticles of bees of the species Apis mellifera
against ATCC strains of Streptococcus mutans."
Author: Andrea Belen Pillajo Balladares
Tutor: PhD Pablo Mauricio Bonilla Valladares
SUMMARY
In the present work the antibacterial activity of several solutions elaborated by the method
of solvent exchange against ATCC strains of Streptococcus mutans was evaluated. For this,
several chemical extracts were elaborated in which the alcohol concentration was reduced
from 5-70%, as stabilizing agent was reduced between 80% and 0.5%, then the particle size
was reduced. The influence of alcohol concentration on the yield percentage in each extract
was evaluated. The concentration of Total Phenols and Total Flavonoids in each colloidal
solution with and without tween 80 was quantified. Different alcohol levels of the colloidal
solutions by the spectrophotometric method obtained the concentration of 1.66-122.1
mgGAE/g for Phenols and 0.10-48.53 mgQE/g for flavonoids. In the determination of the
size of the particle and the polidispersión of the solutions was used Dynamic light scattering
(DLS) obtaining the sizes of the particle between 200nm -1000nm. For the evaluation of the
antibacterial activity, the techniques of wells in agar and microdilution in plate are used,
comparing each solution with 0.12% Chlorhexidine. The reference solution has inhibition
zones of 15 mm and a percentage inhibition of 99.83%, none of the colloidal solutions
exceeded Chlorhexidine, nor colloidal solutions S70 and S60 have an antibacterial activity
comparable to the reference solution with particles between 900-1000nm. For the S50-S5
solutions by the solvent exchange method there is an increase of 0.4% to 49% in the
antibacterial activity. Determining that the antibacterial effect of propolis nanoparticles
against S. mutans, is not only due to its decrease in particle size but also due to the
concentration of secondary metabolites present in the solution.
KEYWORDS: PROPOLIS NANOPARTICLES, ANTIBACTERIAL ACTIVITY,
Streptococcus mutans, COLOIDAL SOLUTION, TOTAL PHENOLS, TOTAL
FLAVONOIDS, CHLORHEXIDINE.
XVIII
INTRODUCCIÓN
El efecto antibacteriano del propóleo en tinturas y extractos, la síntesis de nanopartículas
de propóleo se encuentra en estudios por el alto potencial de sus propiedades antibacterianas,
antiinflamatorias e incluso inmunológicas. En el presente estudio, a partir del extracto de
propóleo recogido en una Zona al norte de Quito específicamente en Calderón, se utilizó
para la síntesis de nanopartículas propóleo y evaluación de su potencial antibacteriano contra
cepas ATCC de Streptococcus mutans.
En el capítulo I describe el problema al cual se trata de dar una alternativa frente a los
antibióticos convencionales utilizados frente al Streptococcus mutans basándose en estudios
realizados que se relacionen con nuestro objeto de estudio, de la misma forma se encuentra
el objetivo general como los objetivos específicos con una posterior justificación del presente
proyecto.
En el capítulo II detalla el marco teórico de la investigación, también se establece
brevemente los antecedentes de dicho estudio, que servirán como base para comparaciones
posteriores es esta investigación. Se plantea las hipótesis que se desea comprobar de igual
manera las variables de estudio que abarca toda esta investigación.
En el capítulo III consta la metodología de Investigación a ser utilizada, la misma que
describe el enfoque los niveles y el tipo de investigación que se va a realizar, se especifica
los materiales, tipo de método experimental a operar. Se explica la matriz de
operacionalización de las variables, las técnicas de recolección de datos y el proceso para
analizar los datos que se obtengan.
En el capítulo IV expone el análisis y discusión de resultados obtenidos, además de la
interpretación de gráficas y tablas de datos.
En el capítulo V establece las conclusiones y recomendaciones del trabajo en
concordancia a los objetivos planteados.
1
CAPÍTULO I
1. El Problema
1.1 Planteamiento del problema
El Streptococcus mutans forma parte de la flora normal bacteriana en la boca, es una
bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa, además fermenta azúcares produciendo ácido
láctico que es el responsable de la formación de biofilm dental, que se asocian con los
problemas de salud bucal. (Ojeda, Oviedo, & Salas, 2013)
Los colutorios o enjuagues bucales, pastas dentales actúan a nivel superficial en la cavidad
bucal, tienen acción antibacteriana e inhibitoria frente a las alteraciones en la cavidad bucal
previniendo el crecimiento excesivo de la flora bacteriana, que a su vez causa
complicaciones como las caries dentales, acumulación de placa bacteriana, pérdida de piezas
dentales, mal aliento, gingivitis, pulpitis e incluso necrosis pulpar. (Guadrón, 2007)
El agente antiplaca más utilizado para aliviar problemas relacionados a la acumulación
de placa bacteriana y caries es la clorhexidina al 0,12% que se utiliza como antibacteriano
en la formulación de colutorios y pastas dentales, el principal inconveniente de los agentes
antiplaca es el aparecimiento de manchas marrones en los dientes. (Platt & Tosta, 2010)
La disminución en la actividad de los agentes antiplaca tiene muchas causas como la
resistencia bacteriana del Streptococcus mutans frente al principio activo, la vía de
administración de la forma farmacéutica como los colutorios o pastas dentales que, al ser
administrados por vía tópica, presentan inconvenientes en su absorción, concentración de
principio activo.
Por tales motivos se pretende la utilización de nanopartículas de propóleo de abeja, como
una alternativa antimicrobiana, para su utilización frente a cepas de Streptococcus mutans;
además establecer condiciones óptimas para su elaboración por el método intercambio de
solvente, que se utilicen para combatir la caries dental y otros problemas de salud bucal
relacionados. Para su posterior utilización en la elaboración de colutorios, pastas dentales y
limpieza de prótesis dental.
2
1.2 Formulación del problema
Establecer las condiciones óptimas para la elaboración de nanopartículas de propóleo de
abejas Apis mellifera por el método intercambio de solvente, que presente actividad
antibacteriana in vitro frente a cepas de Streptococcus mutans.
1.3 Preguntas Directrices
¿Qué factores afectan en la obtención de nanopartículas de propóleo por el
método intercambio de solvente?
¿Qué concentración de propóleo es optima para la elaboración de nanopartículas
de propóleo?
¿Qué tamaño de nanoparticula es adecuada para la inhibición del Streptococcus
mutans?
1.4 Objetivo de la Investigación
1.4.1 Objetivo General
Evaluar la actividad antibacteriana de nanopartículas de propóleo de abejas de la
especie Apis mellifera, frente a una cepa ATCC de Streptococcus mutans.
1.4.2 Objetivos específicos
Cuantificar las concentraciones de fenoles totales y flavonoides totales de las
soluciones coloidales de nanopartículas de propóleo obtenidas a diferentes
concentraciones de etanol.
Caracterizar por el método Dispersión de Luz Dinámica (DLS), la presencia de
nanopartículas de propóleo en los extractos obtenidos a diferentes
concentraciones.
Determinar la actividad antibacteriana de las soluciones coloidales de la especie
Apis mellifera frente al Streptococcus mutans.
3
1.5 Justificación e Importancia
Las enfermedades bucales, como la caries dental, cuentan con alta prevalencia en el
mundo entero (afectan del 95% al 99% de la población), lo que las sitúa como la principal
causa de pérdida de dientes, ya que de cada 10 personas nueve presentan la enfermedad o
las secuelas de esta, con manifestaciones visibles desde el principio de la vida y progresando
con la edad. Según la OMS (Organización Mundial de la Salud, 2015), se estima que
aproximadamente del 60% a 90% de los escolares tienen caries dental. Los índices de CPOD
(promedio de piezas definitivas cariadas, perdidas u obturadas) en Ecuador Caries a la edad
de entre 6 y 7 años muestran un CPOD de 0,22, y pasa a 2,95 a la edad de 12 años y a 4,64
(CPOD) a la edad de 15 años. Esto define un nivel severo de acuerdo con lo establecido por
la OPS/OMS. (Ministerio de Salud Pública del Ecuador, 2015)
El agente causante de la caries dental es la formación de una película de biofilm por la
acumulación de Streptococcus mutans. Los agentes antibacterianos más utilizados para la
inhibición del crecimiento bacteriano a menudo causan problemas secundarios como
pigmentación en las piezas dentarias, resistencia bacteriana y toxicidad; motivo por lo cual
se busca agentes antiplaca de origen natural, en donde no se reporten estos efectos, que
además aportan al desarrollo de una química verde.
La actividad antibacteriana del propóleo se debe a la presencia de flavonoides que tienen
la capacidad de destruir las células bacterianas y micóticas, además contrarrestan el efecto
de la propagación de las toxinas bacterianas, por medio de la inhibición de la enzima Na+/K+
ATPasa. (Mirzoeva, Gishanin, & Calder, 2000)
Esta investigación es de gran importancia científica por el amplio uso del propóleo como
agente antibacteriano para la posterior elaboración de formas farmacéuticas tópicas como
colutorios y pastas dentales.
4
CAPÍTULO II
2. Marco teórico
2.1 Antecedentes
La actividad antibacteriana de las nanopartículas de propóleo, han sido estudiadas frente
a diferentes cepas de microrganismos como: Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,
Streptococcus epidermidis y Candida albicans, para las síntesis de nanopartículas de
propóleo se han estudiado varios métodos y agentes reductores naturales, a continuación,
algunos artículos científicos en donde se evidencia esta información.
En (Seven, Seven, Baykalir, Mutlu, & Abdelfattah, 2018) “Nanotechnology and
nanopropolis in animal production and health: an overview”, se centra en algunos trabajos
recientes sobre los usos de la nanotecnología en la salud animal o la salud humana utilizando
modelos animales, y la efectividad de la nanotecnología en suplementos naturales como el
propóleo utilizado en la nutrición animal y salud animal. Se concluye que Nanopropolis es
más eficaz que el propóleo en términos de actividad antibacteriana y antifúngica.
En (Afrouzan, y otros, 2012)“Evaluation of antimicrobial activity of propolis and
nanopropolis against Staphylococcus aureus and Candida albicans” se evaluó la actividad
antibacteriana y antifúngica del propóleo y nanopropolis, contra Staphylocuccus aureus y
Candida albicans recogidos de Ferula ovina. Los nanopropoils se prepararon por el método
de medios de molienda, el tamaño de las nanopropolis estaba por debajo de los 100
nanómetros, los hallazgos de este estudio indicaron que las nanopartículas naturales tienen
el potencial para ser utilizadas de manera eficiente en el control de enfermedades bacterianas
y fúngicas.
En (Rangasamy, Chandrasekaran, Kumar, & K S, 2012)“In Vitro Anti-Cancerous and
Anti-Microbial Activity of Propolis Nanoparticles” En este estudio, se encontró que el
tamaño de partícula estaba en el rango de 80-150 nm. La actividad antibacteriana de las
nanopartículas de propóleo se probó contra E. coli y S. aureus. Además, el efecto citotóxico
de las nanopartículas de propóleos contra líneas celulares cancerosas se probó contra MCF-
7, PC3, A375 y PANC-1. Para una concentración de 10g/ml de nanosuspensión de propóleo
y mostraron que pueden usarse como un posible fármaco anticancerígeno y antimicrobiano.
5
En (Brojonegoro, 2013)“Encapsulation of Indonesian Propolis by casein micelle” Este
estudio se realizó para mejorar las propiedades de manejo, el propóleo fue encapsulados por
caseína micela con un homogeneizador seguido de una sonicación, y separados por un
sistema de micro y ultrafiltración, crearon micro y nanopartículas. Estas micro y
nanopartículas exhibieron altos flavonoides y polifenoles moderados capacidades (eficacia
de las encapsulaciones, 94% y 67% para los flovonoides y polifenoles, respectivamente) El
tamaño de las partículas se analizó mediante un analizador de tamaño de partícula (PSA) que
demostró que el tamaño promedio de las partículas es de 1,3 micrómetros y 300 nanómetros.
El resultado muestra que los propóleos indonesios encapsulados tienen actividad
antibacteriana.
En (Ong, y otros, 2017) “Chitosan-propolis nanoparticle formulation demonstrates anti-
bacterial activity against Enterococcus faecalis biofilms” Los resultados de este estudio
revelaron que la nanoformulación de quitosano-propóleos puede considerarse un potencial
agente anti-biopelícula para resistir infecciones que involucran la formación de biopelículas,
como heridas crónicas e infecciones del sitio quirúrgico.
Luego de haber revisado estos artículos acerca de los diferentes estudios de las
nanopartículas de propóleo se identifica que se requieren ampliar los estudios de las
condiciones óptimas para la síntesis de propóleo como antibacteriano, por lo que se tomaran
como antecedentes estos estudios previos para comparaciones.
2.2 Fundamentación teórica
2.2.1 Biofilm o placa bacteriana.
El biofilm es una población de células que crecen unidas a la superficie envueltas en una
matriz de exopolisacáridos que las protege del ataque de los antibióticos. El aumento de la
resistencia de los biofilms involucra varios mecanismos: inactivación de los antibióticos por
polímeros extracelulares o modificación enzimática, disminución de la tasa de crecimiento
por limitación de nutrientes, cambios fenotípicos en las células bacterianas como resultado
de la adquisición de genes de resistencia dentro del biofilm. (Herrera Mendoza, 2004)
6
Las bacterias que se acumulan en la cavidad bucal se encuentran libremente suspendidas
en forma planctónica o adheridas en la superficie dental como biofilm, la acumulación de
placa bacteriana desencadena una serie de problemas odontológicos como la caries y
enfermedades periodontales.
La placa bacteriana está formada a partir de una célula plactónica o de otro biofilm,
compuesto por bacterias, que representan un 20% del volumen, y una matriz o glicocálix,
que representa el 80%. Esta matriz está compuesta por una mezcla de exopolisacáridos,
proteínas, sales minerales y material celular. Los exopolisacáridos (EPS) son el componente
fundamental de la matriz y son producidos por las propias bacterias del biofilm. (Serrano &
Herrera, 2015)
En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos
y diversos productos de la lisis bacteriana, además de materiales como cristales de sales
minerales, partículas de corrosión o componentes sanguíneos, todo esto según sea el medio
ambiente en el cual se estén desarrollando. (Instituto de Agrobiotecnología y Recursos
Naturales Universidad de Navarra, 2013)
2.2.2 Streptococcus mutans.
Streptococcus mutans (S. mutans) es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo, su
capacidad de virulencia está asociado a la metabolización de la sacarosa de los alimentos
para formar polímeros de glucosa insoluble (glucanos).
Para la formación del biofilm se producen glucosiltransferasas, estas enzimas tienen un
rol principal en la adherencia y expresión de virulencia de estos microorganismos debido a
que catalizan la síntesis de polisacáridos extracelulares (glucanos solubles e insolubles en
agua). Ayudan a la colonización permanente de superficies duras y al desarrollo de la matriz
de sustancia polimérica extracelular in situ, lo que lleva a la formación de biopelículas muy
adhesivas y cohesivas, si las bacterias no se eliminan de la superficie dental se forma una
placa cariógena. (Lamont, Hajishengallis, & Jenkinson, 2015)
El S. mutans. es fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina con
la producción de ácido láctico, tiene la capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en
7
aproximadamente 24 horas, éste acidifica con rapidez la biopelícula, con la consecuente
desmineralización del esmalte. (Lamont, Hajishengallis, & Jenkinson, 2015)
Usualmente no producen ni hemólisis ni decoloración en agar sangre, es principalmente
alfa o gamma hemolítico en agar sangre de cordero, aunque se han reportado unas pocas
cepas hemolíticas. Streptococcus mutans se ha sub-clasificado en varios tipos con base en
las propiedades inmunológicas, biológicas y genéticas: los serotipos son c, e, f y k. El hábitat
natural de S. mutans es la cavidad oral.
2.2.3 Caries Dental.
Constituye una enfermedad bucodental crónica, causa dolor, perdida de la pieza dental,
otras enfermedades como gingivitis, además de molestias al comer y hablar. Se estima que,
en todo el mundo, unos 2400 millones de personas padecen caries en dientes permanentes,
y 486 millones de niños sufren de caries en los dientes de leche. (FDI Word Dental
Federation, 2015)
Un desequilibrio en la flora normal bacteriana produce la formación de biopelículas en la
superficie de los dientes, en este proceso intervienen varias bacterias; (estreptococos del
grupo mutans, Lactobacillus spp y Actinomyces spp), siendo el S. mutans el predominante,
que metaboliza azúcares como glucosa, sacarosa y fructosa provenientes de los alimentos
azucarados, con la posterior producción de ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético y
ácido fórmico, disolviendo el esmalte y la dentina generando calcio y fosfato proceso
conocido como desmineralización.
La ingesta abundante de azúcares libres, exposición insuficiente al flúor y la falta de
remoción periódica de la placa bacteriana por falta de higiene, son factores que influyen en
la formación de caries dental. Esta enfermedad es prevenible y tratable en sus etapas
iniciales, en una etapa avanzada se realiza la remoción del tejido cariado con una obturación
o corona, cuya complicación conlleva a una extensa destrucción del diente con la formación
de abscesos e incluso septicemia cuyo tratamiento incluye una endodoncia o extracción de
la pieza. (FDI Word Dental Federation, 2015)
8
2.2.4 Clorhexidina.
Es un álcali fuerte prácticamente insoluble en agua, con acción antiséptica para vía tópica;
es soluble en agua en forma de sales como acetato, hidrocloruro y digluconato de
clorhexidina. El digluconato de clorhexidina C34H54Cl2N10O14, es una solución acuosa
incolora con aplicaciones en odontología para la prevención de la caries, actúa contra
diferentes especies de Streptococcus, incluyendo el Streptococcus mutans agente etiológico
de la caries, se lo puede encontrar en colutorios, aerosoles, pastas dentales y geles, su
concentración varía entre 0,2% y 0,12%.
La clorhexidina en bajas concentraciones (0.02% -0.06%) tiene actividad bacteriostática,
mientras que en concentraciones más altas (> 0.12%) actúa como bactericida; es una
molécula catiónica y se une inespecíficamente a los fosfolípidos de la membrana cargados
negativamente de las bacterias; a bajas concentraciones, afecta el equilibrio osmótico de la
célula bacteriana liberando potasio, fósforo y otras moléculas de bajo peso, y en altas
concentraciones, causa la muerte celular por liberación de los principales componentes
intracelulares. Debido a que las bacterias gram positivas tienen una carga más negativa, por
lo tanto, son más sensibles a este agente. (Karpinski & Szkaradkiewicz, 2015)
El uso prolongado de clorhexidina (más de dos semanas) en el tratamiento dental causa
decoloración de los dientes además de irritación de la lengua y alteración del gusto. En
pacientes internados en cuidados intensivos tratados con colutorios de clorhexidina para la
limpieza oral después de la aplicación de dispositivos para la respiración artificial, se
encontraron lesiones debajo de la lengua y en las bolsas bucales en lugares donde hubo un
estancamiento del enjuague bucal. (Plantinga, y otros, 2016)
2.2.5 Propóleo.
Las abejas melíferas recolectan la resina y la goma de diferentes partes de las plantas,
posteriormente las mezclan con polen y enzimas excretadas por las abejas en el proceso de
recolección formando así una sustancia resinosa llamada propóleo, sus propiedades varían
dependiendo de la flora local y especímenes de diferentes zonas geográficas y climáticas. Su
coloración va desde marrón, verde, amarillo verdoso y marrón oscuro, tiene un sabor amargo
y un aroma resinoso, sus usos en la colmena son:
9
Como material de construcción para regular el tamaño de las entradas de los nidos y
para hacer la superficie más lisa, facilitando su tránsito.
Barnizar el interior de los alvéolos antes de que la reina ponga los huevos,
garantizando una ubicación higiénica, fuerte e impermeable para el desarrollo de la
larva.
Embalsamar los cuerpos de ratones y otros depredadores demasiado grandes, que las
abejas no pueden alejar de sus nidos y que al descomponerse son una fuente de
infecciones. (La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura FAO, 2017)
2.2.5.1 Composición y propiedades.
Es heterogénea, entre los estudios realizados a ésta han sido identificados 150 a 180
sustancias distintas, esto ha sido atribuido a que su constitución depende de la flora, ciclo
evolutivo de la planta proveedora de la resina, microorganismos presentes en el entorno y
factores climatológicos, por esta razón cada colmena produce propóleos diferentes,
básicamente se compone de:
50-55% de resinas y bálsamos.
30-40% de cera de abeja.
5-10% de aceites esenciales o volátiles.
5% de polen.
5% de materiales diversos (orgánicos y minerales) (Bankava & otros, 2016)
Su composición cualitativa principal es:
Aminoácidos, niveles bajos en torno de 0,40%, aportados por las abejas a través del
polen.
Ácidos aromáticos y ésteres: ácido benzoico, caféico, ferúlico, cinámico.
Flavonoides, elevada actividad biológica, sobresalen: Quercetina, Kaempferol,
Naringenina, Acacetina, Apigenina, Pinocembrina y Galangina.
Terpenoides, aromáticos, responsables del aroma y se destacan limoneno, cimeno y
estireno. (Bankava & otros, 2016)
Su actividad biológica es gracias a la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides,
que son altamente utilizados para prevenir y tratar resfriados, heridas, úlceras, enfermedades
del corazón y caries dental.
10
2.2.5.2 Compuestos Fenólicos y flavonoides.
Son compuestos formados por un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilos
unidos en él. El fenol es la estructura más representativa de este grupo, dependiendo de los
sustituyentes se forman ácidos fenólicos como: el ácido benzoico, caféico, ferúlico, cumárico
entre otros. Por su anillo aromático presentan propiedades antioxidantes, fungicidas,
bactericidas, antivirales, e incluso propiedades antitumorales, intervienen en sus funciones
metabólicas como en el crecimiento, reproducción, protección contra patógenos externos
como el estrés, y la radiación UV, además son responsables del color y las características
sensoriales.
Se describen algunas clasificaciones en función del número de anillos fenólicos y de los
elementos estructurales que poseen. Los principales grupos son: ácidos fenólicos (derivados
del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico), estilbenos, lignanos, alcoholes
fenólicos y flavonoides como se describe en la figura 1. (Quiñones & Aleixandre, 2012)
Figura 1: Núcleo estructural de los principales grupos de polifenoles
Tomado de Quiñones & Aleixandre (2012)
Los Flavonoides son metabolitos secundarios presentes en las plantas con una estructura
polifenólica de bajo peso molecular, formado por: un anillo central de tres átomos de carbono
heterociclo (ᴕPirano) y dos anillos bencénicos en los extremos, la secuencia C6-C3-C6, es
la estructura básica y denominada núcleo flavano como se describe en la figura 2.
11
Dependiendo de los grupos sustituyentes unidos a su anillo central, el grado de
instauración y oxidación se los puede clasificar en: flavonoles, flavonas, flavanonas,
isoflavonas, antocianidinas y flavanoles. A estos compuestos se les atribuyen propiedades
antioxidantes, antibacterianas, antiinflamatorias, antimutagénicas y anticancerígenas.
(Martinez Flores, Gonzalez Gallego, Culebras, & Tuñon, 2002)
Figura 2: Núcleo estructural de los principales grupos de flavonoides
Tomado de Quiñones & Aleixandre (2012)
Hasta el año 2000, se han identificado más de 300 componentes químicos pertenecientes
a los compuestos fenólicos, flavonoides y terpenos, estos varían dependiendo de la ubicación
geográfica, el origen botánico y las especies de abejas. Los constituyentes característicos en
los propóleos de la región templada son los flavonoides sin sustituyentes en el anillo B, tales
como: artepilina C, crisina, galanginina quercetina, apigenina, kaempferol, pinobanksina,
pinocembrina, además de compuestos fenólicos como fenilpropanoides que incluyen ácido
cinámico, ácido p-cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico, éster fenetílico del ácido caféico
(CAPE) y sus derivados los ácidos cinámicos prenilados que le confieren la actividad
antimicrobiana al propóleo como se describen en la figura 3. (Huang, Zhang, Wang, Li, &
Liang Hu, 2014)
12
Figura 3: Principales compuestos fenólicos y flavonoides encontrados en el propóleo
Tomado de Huang et al, (2014)
2.2.5.3 Mecanismo de acción antibacteriano del propóleo.
El propóleo, a través de los flavonoides, tiene actividad contra: Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Streptomyces sobrinus, Streptococcus mutans, Streptococcus
cricetus, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Bacteroides
nodosos, Klebsiella pneumoniae, y Streptococcus pyogenes. Los flavonoides del propóleo,
además de destruir las células bacterianas y micóticas, contrarrestan el efecto de la
propagación de las toxinas bacterianas. (Bankava & otros, 2016)
El mecanismo de acción del propóleo como agente antibacteriano es realizado por los
flavonoides y los compuestos cinámicos.
El propóleo actúa como agente anticaries frente al S. mutans, por medio de dos procesos:
1. Inhibe la actividad de la proteína Na+/K+ ATPasa y la translocación de protones; lo
cual modifica el mantenimiento de un gradiente de pH a través de la membrana
celular de las bacterias; interviene en la glucólisis y en la expresión de la virulencia
del microorganismo, además afecta la capacidad del microorganismo para producir
y tolerar ácidos. (Koo, y otros, 2005)
13
2. Inhibe la actividad de la enzima glucosiltransferasa (tipos C, B y D), que cataliza la
formación de glucanos solubles e insolubles de la sacarosa que promueven la
adherencia y formación de biopelículas dentales cariogénicas en la cavidad oral.
(Koo, Rosales, Cury, Park, & Bowen, 2002)
2.2.6 Soluciones coloidales.
Un coloide se define como una partícula cuyo tamaño oscila entre 1nm-1000nm, una
dispersión de tales partículas se llama solución coloidal, dispersión coloidal o simplemente
coloide y representan un tipo de mezcla intermedia entre una solución verdadera y una
suspensión como se observa en la figura 4, pueden ser amorfas o cristalinas y estar
compuestas de materiales inorgánicos, orgánicos o biológicos, cuando el medio de
dispersión es alcohol o benceno, los soles se denominan alcosoles y bencosoles
respectivamente. (Ghosh, 2018)
Figura 4: Rangos de tamaños de partículas de una solución verdadera, solución coloidal y suspensión Tomado de Suez University, Faculty of Petroleum and Mining Engineering (2015)
Es un sistema heterogéneo de dos fases que consiste en la fase dispersa (fase interna o
discontinua) y el medio de dispersión (fase externa o continua). La fase dispersa en un
sistema coloidal se distribuye uniformemente como partículas muy finas el medio de
dispersión. Las partículas coloidales son más grandes que las moléculas simples pero lo
suficientemente pequeñas para permanecer suspendidas, de modo que simple vista parece
un sistema homogéneo e incluso a un microscopio común. Las partículas coloidales tienen
un área de superficie muy grande por unidad de masa, como resultado de su pequeño tamaño
de partícula, así pues, a menor tamaño de partícula aumenta la superficie especifica. (Ghosh,
2018)
Entre las propiedades de los coloides se encuentran: el movimiento browniano debido a
las colisiones con las moléculas del medio huésped, también pueden dispersar la luz (efecto
Tyndall) cuando se suspenden en medios transparentes a la luz y forman dispersiones
14
estables a causa de las fuertes fuerzas de solvatación del medio dispersante, superando así
las fuerzas gravitacionales e impidiendo que se asienten.
2.2.7 Nanopartículas
Las nanopartículas son partículas con al menos una dimensión más pequeña que 1 micra,
potencialmente tan pequeñas como las escalas de longitud atómica y molecular 1nm como
se describen en la figura 5, presentan forma amorfa o cristalina y pueden actuar como
portadores de gotitas liquidas o gases, por su tamaño submicroscópico, tienen características
únicas con amplias aplicaciones, tienen una mayor área de superficie por peso que las
partículas grandes, por lo tanto, son más reactivas que algunas otras moléculas, y se las
considera un estado distinto de la materia, además de los estados sólido, líquido, gaseoso y
plasmático. (King, Jarvie, & Dobson, 2018)
Figura 5: Ejemplos y tamaños de nanopartículas y soluciones coloidales
Tomado de Lower (2019)
La comunidad europea ofrece un enfoque más complejo sobre el tamaño de partículas de
las soluciones coloidales y las subdivide en tres categorías:
- Categoría 1: tamaño mayor a 500 nm.
Es considerado un nanomaterial. Las propiedades especificas del nanomaterial pueden o
no evaluarse dependiendo sus características; la evaluación de riesgos clásica debe realizarse
teniendo en cuenta la naturaleza particulada del material. (Jung, Chaudhry, Proykova, &
Gaffet, 2010)
15
- Categoría 2: 500 nm > tamaño> 100 nm.
Es considerado una nanomaterial ya que existe la probabilidad de encontrarse partículas
menores a 100nm y es necesaria una caracterización más detallada y una evaluación de
riesgos nanoespecífica. Se debe realizar una evaluación de riesgo nano-específica si la
caracterización demuestra que hay más del 0.15% de partículas de 100nm. (Jung, Chaudhry,
Proykova, & Gaffet, 2010)
- Categoría 3: 100 nm> tamaño> 1 nm.
El material se considera un nanomaterial y se debe realizar una evaluación de riesgos
nanoespecífica. (Jung, Chaudhry, Proykova, & Gaffet, 2010)
Las nanopartículas pueden diseñarse para que posean una composición y funcionalidades
únicas, pueden proporcionar herramientas y técnicas para el desarrollo de investigación
científica, además de una alta biodisponibilidad y propiedades de biodegradabilidad. Las
propiedades del nanopropóleo mejoran con respecto al propóleo común, por su reducido
tamaño; tienen la capacidad de superar las barreras anatómicas y fisiológicas; son más fáciles
de absorber, de igual forma aumentan la actividad antibacteriana, antifúngica y mejoran el
sabor del propóleo. (Talti Seven , Seven, Gul Bayklir, Multu Iflazoglu, & Abdelfattah, 2018)
2.2.8 Síntesis de nanopartículas.
Existen diferentes formas de obtener nanopartículas, las cuales se clasifican en dos
grandes grupos, el método top-down, que es el continuo rompimiento de un material y las
de bottom-up que consiste en la construcción de nanomateriales a partir de sus
constituyentes. Por otro lado, la obtención de nanopartículas se puede clasificar en métodos
de síntesis físicas, químicas o biológicas.
Métodos físicos. condensación con un gas inerte, descarga al arco eléctrico, corte por
láser, pirólisis y pirólisis por aerosol.
Métodos químicos. reducción del metal, síntesis solvotermal, síntesis fotoquímica,
síntesis electroquímica, rutas termolíticas, rutas sonoquímicas, micelas y micro
emulsiones, interfaces líquido-líquido.
Métodos biológicos. microorganismos son los reactores y realizan la síntesis de las
nanopartículas.
Métodos híbridos. es una mezcla de los métodos anteriores; como la síntesis láser, el
procesamiento selectivo de tamaño post sintético y la dispersión atómica de metal
solvatados (DAMS).
16
En la gran mayoría de los métodos y rutas sintéticas, la formación de las nanopartículas
depende de la nucleación que se efectúa al momento de la síntesis de éstas y la estabilidad
que se le otorgue a la partícula nanométrica cuando se forma. (Zanella, 2012)
2.2.8.1 Método de elaboración de nano partículas por intercambio de solvente.
Es un método que consiste en reacciones químicas o cambio de solvente, donde los
átomos o moléculas de la fase dispersa aparecen primero, se unen o se agregan para formar
partículas coloidales. Las condiciones (temperatura, concentración, pH, tiempo de
agitación), utilizadas son tales que permiten la formación de partículas coloidales; pero
evitan que las partículas se vuelvan demasiado grandes y formen un precipitado.
Un ejemplo de este método se da cuando se agrega una solución de azufre o resina en
etanol a un exceso de agua, el sol de azufre o resina se forma debido a la disminución de la
solubilidad. La sustancia está presente en estado molecular en etanol, pero en la transferencia
al agua, las moléculas precipitan para formar partículas coloidales de tamaño reducido.
2.2.9 Recolección del propóleo.
2.2.9.1 Recolección artesanal.
Raspado. Se usan espátulas de plástico o acero inoxidable para retirar el propóleo de los
marcos, cubre panales, entretapas o cualquier sitio de la piquera, se debe recoger de la forma
más higiénica para evitar contaminaciones. El raspado se almacena en bolsas o recipientes
herméticos a bajas temperaturas. (Ministerio de Ganaderia, Agricultura y Pesca de la
República Oriental del Uruguay, 2019)
2.2.9.2 Recolección técnica.
Trampas o mallas. Son elaboradas de polietileno de alta densidad o hilos de nylon, su
tamaño varía dependiendo de las dimensiones de la colmena, aproximadamente miden (55
x 43cm y 0,4 cm de espesor). Se colocan sobre la última alza encima de los cuadros, están
diseñados con pequeños orificios no mayores de 2mm, simulan las grietas en las paredes de
17
la colmena y las abejas por instinto al detectar aberturas, van poco a poco cubriendo los
agujeros con propóleo para proteger la colmena. Las mallas se retiran cuando tengan al
menos 40% de la superficie cubierta (aprox. 2 meses), posteriormente se pesa y almacena a
-18ºC por 24 horas, al término de este tiempo se extrae el propóleo por fricción entre la
malla, la producción promedio esperada es de 50 -100g por malla. (Alejandro Cuenca &
Jumbo Jimbo, 2015)
2.2.10 Limpieza y Molienda.
Posterior a la recolección se almacena el propóleo en recipientes a bajas temperaturas
donde adquiere una consistencia compacta y de forma manual se eliminan los contaminantes
como cera, trozos de madera y restos de abejas (alas, patas y tórax); por lo general el uso de
trampas permite recolectar propóleos más limpios en comparación al método de raspado; de
esta manera se reduce los contaminantes no deseados que afectan la calidad del propóleo.
La molienda se realiza en frío -18ºC, aplicando fuerza mecánica en molinos
convencionales hasta obtener un polvo fino uniforme que cumpla con las características
establecidas en la normativa y de esta manera aumenta la superficie de contacto de la muestra
para la obtención de extractos. (Api-portal, 2011)
2.2.11 Estandarización del propóleo.
2.2.11.1 Determinación de perdida por calentamiento.
En los tejidos vegetales y animales el contenido de agua se encuentra como: agua libre
que está localizada superficialmente en forma predominante, mientras el agua ligada se halla
dentro de las moléculas combinada o absorbida. La determinación de la humedad representa
un parámetro de calidad y estabilidad de la muestra. La pérdida de humedad de la muestra
se manifiesta en forma lineal con respecto a la humedad relativa ambiental.
Método de Secado al Horno. La muestra se calienta a 100 ºC y la pérdida de peso de la
muestra se utiliza para calcular el contenido de humedad de la misma. ( Departamento de
Alimentos y Biotecnología, 2008)
18
Para el cálculo se utiliza la siguiente fórmula:
Ecuación 1: Porcentaje de humedad
Donde:
H: pérdida por calentamiento, en fracción de masa expresada en porcentaje
ms: masa de la cápsula con la muestra seca, en gramos
m: masa de la cápsula con la muestra, en gramos
2.2.11.2 Determinación de cenizas totales.
Es el análisis de residuos inorgánicos que quedan después de la ignición u oxidación
completa de la materia orgánica de una muestra. La técnica consiste en quemar la muestra
al aire y posteriormente en una mufla para eliminar todo el material orgánico y la ceniza
remanente es el residuo inorgánico.
Para el cálculo se utiliza la siguiente fórmula:
𝐶 = [(𝑚𝑐 − 𝑚550)
(𝑚 − 𝑚550)] × 100
Ecuación 2: Porcentaje de cenizas
Donde:
C: contenido de cenizas, en fracción de masa expresada en porcentaje.
mc: masa del crisol con la muestra incinerada, en gramos.
m: masa del crisol con la muestra, en gramos.
m550: masa del crisol, en gramos.
Se expresa el resultado como la media aritmética de las dos determinaciones, con una
cifra decimal.
2.2.11.3 Impurezas mecánicas.
Es un parámetro de calidad, cuya medición permite determinar la cantidad de elementos
ajenos al propóleo, que han sido incorporados durante el proceso de recolección y
manipulación. Se calcula mediante un análisis gravimétrico de la fracción remanente que
queda después del proceso de extracción del propóleo.
19
Para el cálculo se utiliza la siguiente fórmula:
𝐼𝑀 = [(𝑃1 − 𝑃)
𝑚] × 100
Ecuación 3: Porcentaje de impurezas mecánicas
Donde:
IM: contenido de impurezas mecánicas, en fracción de masa expresada en porcentaje
P1: masa del cartucho (o el papel) seco, en gramos
P: masa del cartucho (o el papel) vacío seco, en gramos
m: masa de la muestra, en gramos
Se expresa el resultado como la media aritmética de las dos determinaciones y cuando los
resultados individuales no difieran entre sí en más de 5% del valor obtenido.
2.2.11.4 Índice de oxidación.
Es una prueba cualitativa para compuestos fenólicos; se basa en la capacidad antioxidante
de los fenoles en medio acido con el permanganato de potasio que es un oxidante fuerte. Se
mide el tiempo en segundos, que la solución acidulada de propóleo tarda en decolorarse, si
el tiempo de la reacción es más rápido indica una mayor concentración de fenoles totales.
(Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion. Estados
Unidos Mexicano, 2016)
2.2.11.5 Obtención de extractos de propóleo.
Para la preparación de extractos líquidos de propóleo se emplean varios solventes que
permitan la obtención de metabolitos secundarios. El propóleo crudo generalmente se trata
con un solvente, se usa el extracto resultante que se puede preparar con una amplia variedad
de solventes orgánicos como el etanol absoluto, glicerol, agua, propilenglicol e incluso
DMSO; el solvente más usado es el etanol. (Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentaciñon y la Agricultura FAO, 2017)
Métodos de extracción.
En la tabla 1, se muestra un resumen de los métodos de extracción más comunes
empleados en productos naturales.
20
Tabla 1. Métodos de Extracción
Método Solvente Polaridad del extracto de los
productos natural
Maceración Agua, solventes acuosos,
no acuosos y orgánicos
Depende del tipo de solvente
utilizado en la extracción
Decocción Agua
Compuestos polares
Extracción por reflujo Solventes acuosos, no
acuosos y orgánicos
Depende del tipo de solvente
utilizado en la extracción
Extracción soxhelet Solventes orgánicos
Depende del tipo de solvente
utilizado en la extracción
Tomada de Zang et al, (2018)
2.2.12 Método de Folin-Ciocalteu para compuestos fenólicos totales.
Es un método colorimétrico que permite la cuantificación del contenido de compuestos
fenólicos totales. Se fundamenta en la capacidad de los compuestos fenólicos para reaccionar
con agentes oxidantes a pH básico, adquiriendo una coloración azul que es determinada en
base a una recta patrón de ácido gálico por espectrofotometría UV-VIS a una longitud de
onda de 765nm. (García Martinez, Fernandez Segovia , & Fuentes López, 2015)
El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene molibdato y tungstato sódico que en presencia de
fenoles forman un complejo fosfomolíbdico-fosfotúngstico; que a pH básico reduce el
complejo en óxidos cromógenos (tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23)), cuya
coloración es azul intenso, siendo proporcional este color al número de grupos hidroxilo de
la molécula como se observa en la figura 7. (Gutiérrez Avella, García Ortiz, & Mendoza
Cisneros, 2008)
Figura 6: Mecanismo de acción del reactivo de Folin-Ciocalteu
Tomado de García et al, (2015)
21
Para el cálculo de la curva de calibración del ácido gálico, utiliza la siguiente fórmula:
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 Ecuación 4: Curva de calibración
Donde:
y: Absorbancia
m: pendiente
x: Concentración del analito
b: ordenada en el origen
Para el cálculo de la concentración de fenoles totales, utiliza la siguiente fórmula:
𝐹𝑒 =𝐶 × 𝑉1 × 𝑉𝑆 × 𝑉𝑐
𝑉𝑇1 × 𝑉𝑡 × 𝑀
Ecuación 5: Concentración de fenoles totales
Donde:
Fe: concentración de fenoles totales de propóleos, en mg equivalentes de ácido gálico por
gramos de extracto
C: concentración del analito, en mg por mililitro
VS: volumen total de la muestra, en mililitros.
Vt: volumen de la alícuota de la muestra, en mililitros.
V1: volumen del primer aforo, en mililitros.
VT1: volumen de la segunda alícuota, en mililitros.
VC: volumen del segundo aforo, en mililitros.
M: masa de propóleo
2.2.13 Determinación de flavonoides totales.
Es un método colorimétrico que permite la cuantificación de flavonoides totales. Se basa
en la formación de un complejo amarillo estable en presencia de metanol; que forma el catión
de aluminio del tricloruro de aluminio con los grupos hidroxilos y cetona presentes en los
flavonoides de la muestra y se determina en base a una recta patrón de Quercetina, utilizando
la espectrofotometría UV-VIS a una longitud de onda de 425nm. (Amaya Rodriguez &
Portillo Membreño, 2013)
22
Figura 7: Complejo flavonoide-Al
Tomado de Amaya Rodriguez & Portillo Membreño (2013)
Para el cálculo de la curva de calibración de la Quercetina, se utiliza la Ecuación 4.
Para el cálculo de la concentración de fenoles totales, utiliza la siguiente fórmula:
𝐹𝑙 =𝐶 × 𝑉𝑆 × 𝑉𝑐
𝑉𝑡 × 𝑀 × 100
Ecuación 6: Concentración de flavonoides totales
Donde
Fl: concentración de flavonoides totales de propóleos, en mg equivalentes de Quercetina
por gramo de extracto.
C: concentración del analito, en mg por mililitro
VS: volumen total de la muestra, en mililitros.
Vt: volumen de la alícuota de la muestra, en mililitros.
VC: volumen del aforo, en mililitros.
M: gramos de propóleo.
2.2.14 Caracterización de nanomateriales.
2.2.14.1 Dispersión de luz dinámica DLS.
El tamaño de partícula se puede determinar midiendo los cambios aleatorios en la
intensidad de la luz dispersada desde una suspensión o solución. Esta técnica se conoce como
dispersión dinámica de la luz (DLS); sus aplicaciones son la caracterización de partículas,
emulsiones o moléculas que se han dispersado o disuelto en un líquido.
El movimiento Browniano de las partículas o moléculas en suspensión hace que la luz
láser se disperse en diferentes intensidades. Del análisis de estas fluctuaciones de intensidad
se obtiene la velocidad del movimiento browniano y por lo tanto el tamaño de partícula
utilizando la relación de Stokes-Einstein. (Santafe conicet, 2018)
23
Ley de Stokes Einstein: Relacionar el tamaño de partícula con el movimiento de partícula. Las
pequeñas partículas en suspensión experimentan un movimiento térmico aleatorio conocido
como movimiento browniano. Este movimiento aleatorio está modelado por la ecuación de
Stokes-Einstein, que se presenta en la forma más utilizada para el análisis del tamaño de
partículas:
Ecuación 7: Ley de Stokes Einstein
Dónde
Dh: diámetro hidrodinámico
Dt: coeficiente de difusión
kB: constante de Boltzmann
T: temperatura termodinámica
η: viscosidad dinámica
La relación de Stokes-Einstein conecta el coeficiente de difusión medido por la
dispersión dinámica de la luz al tamaño de partícula. (Florence & Attwood, 2006)
2.2.15 Métodos para determinar la actividad antibacteriana.
Los métodos se basan en la comparación de una solución de estudio de concentración
conocida, que se cree que posee actividad antibacteriana y frente a un antibiótico cuyo
mecanismo ya está definido en un microorganismo especifico; estos métodos permiten
determinar la sensibilidad del microorganismo frente a varias muestras de estudio.
2.2.15.1 Método de difusión en disco (Kirby-Bauer).
En este método se impregna 10-25ul del antibiótico a estudiar se en discos de papel filtro
de 6mm de diámetro; que inmediatamente se colocan en la superficie de una placa de agar
previamente inoculado con el microorganismo de prueba. El filtro absorbe agua y el
antibiótico difunde por el agar, se incuban con la caja invertida de 18 a 24 horas a una
temperatura de 37°C. La difusión origina zonas de inhibición del microorganismo cuyo
diámetro está en relación con la concentración del antibiótico. (Vignoli, Taraco, & Seija,
2008)
24
2.2.15.2 Método modificado de pozos en agar.
Es una modificación del método de Kirby-Bauer; consiste en hacer agujeros de 6mm de
diámetro con el apoyo de un sacabocados, en la superficie de una placa de agar previamente
inoculado con el microorganismo de prueba. En cada pozo se colocan entre 25-75 μl de la
muestra; se deja reposar 5-30min (para evaporar el líquido), se incuban con la caja invertida
de 18 a 24 horas a una temperatura de 37°C, y se miden los halos de inhibición. En el anexo
11, se describe el procedimiento. (Sánchez García, Castillo Hernández, & García Palencia,
2016)
2.2.15.3 Método de Microdilución.
Es un método que se basa en la inhibición del crecimiento en forma proporcional a la
concentración adicionada del antibiótico. Utiliza un medio líquido en donde se inocula la
cepa de estudio, el activo a estudiar es mezclado con una cantidad de medio de cultivo, se
expone la cepa a estudiar a diferentes concentraciones del antimicrobiano. Se mide
espectrofotométricamente el crecimiento del microorganismo de prueba, a una longitud de
onda de 600nm. Este método permite inocular simultáneamente un gran número de
microorganismos, utiliza micropipetas y placas de microtitulación. Los activos que no son
solubles pueden interferir en la lectura, por consiguiente, se utilizan un control de
crecimiento del microorganismo tanto positivo como negativo y un blanco que tiene el medio
de cultivo y el activo sin inoculo. (Sánchez García, Castillo Hernández, & García Palencia,
2016)
Para el cálculo del porcentaje de inhibición se utiliza la siguiente fórmula:
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑥100
Ecuación 8: Porcentaje de inhibición
2.3 Fundamentación legal
La ley Orgánica de Salud del Ecuador señala: De la investigación científica en salud Art.
207.- La investigación científica en salud, así como el uso y desarrollo de la biotecnología,
se realizará orientada a las prioridades y necesidades nacionales, con sujeción a principios
bioéticos, con enfoques pluricultural, de derechos y de género, incorporando las medicinas
25
tradicionales y alternativas. Art. 208.- La investigación científica tecnológica en salud será
regulada y controlada por la autoridad sanitaria nacional, en coordinación con los
organismos competentes, con sujeción a principios bioéticos y de derechos, previo
consentimiento informado y por escrito, respetando la confidencialidad. (Ministerio de Salud
Pública del Ecuador, 2012)
La Constitución de la República del Ecuador en el Artículo 365 señala: Garantizar la
disponibilidad y acceso a medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su
comercialización y promover la producción nacional y la utilización de medicamentos
genéricos que respondan a las necesidades epidemiológicas de la población. En el acceso a
medicamentos, los intereses de la salud pública prevalecerán sobre los económicos y
comerciales. (Asamblea Nacional del Ecuador, 2008)
2.4 Hipótesis
2.4.1 Hipótesis alternativa (Hi).
Una solución coloidal de Nanopartículas de propóleo elaborada por el método de
Intercambio de solvente, inhibe el crecimiento de la cepa de Streptococcus mutans.
2.4.2 Hipótesis nula (Ho).
Una solución coloidal de Nanopartículas de propóleo elaborada por el método de
Intercambio de solvente, no inhibe el crecimiento de la cepa de Streptococcus mutans.
2.5 Sistema de variables
2.5.1 Variables Independientes.
Concentración de etanol en el extracto de propóleo
Concentración de tween 80: Tamaño de partícula
2.5.2 Variable dependiente.
Actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans.
26
CAPÍTULO III
3. Marco Metodológico
3.1 Diseño de la Investigación
La investigación es de paradigma de cuantitativo, dado que se evalúa la evolución de las
variables y relación entre ellas, mediante la recolección de datos para su posterior análisis
estadístico, tomándose en cuenta para este estudio como variables Independientes
(Concentración de etanol en el extracto de propóleo y tamaño de partícula), sobre la variable
dependiente (Actividad antibacteriana frente a Streptococcus mutans).
Es de tipo experimental ya que el investigador controla las variables que pueden influir
durante la experimentación.
Con respecto a los niveles es correlacional y explicativa puesto que permite determinar
relaciones entre factores o variables y permite establecer relaciones entre causa y efecto.
3.2 Población y muestra
La muestra analizada corresponde a 8 soluciones coloidales de propóleo de abejas de la
especie Apis mellifera, obtenidas a diferentes concentraciones de etanol y tween 80, con sus
3 respectivas replicas. El propóleo se obtuvo de una zona de la sierra de la comunidad de
Calderón ubicada en la provincia de Pichincha-Ecuador. Se recolectaron 25 gramos de
propóleo por cada colmena de abejas en total 5 colmenas.
27
3.3 Materiales, Reactivos y Equipos
Tabla 2. Materiales, Equipos y Reactivos
Proceso Materiales Equipos Reactivos
Recolección,
limpieza y
molienda
-Fundas plásticas
-Espátula
-Envases plásticos
-Brochas
-Ahumador
-Seguridad del
personal: Guantes,
Overol, Botas,
Sombrero
-Refrigeradora
Caracterización
del propóleo
-Crisoles
-Desecador
-Gradilla con tubos de
ensayo
-Pipetas de 10mL y
5mL
-Papel filtro
-Matraz erlenmeyer
125mL
-Embudo
-Mufla
-Balanza analítica
±0,01g, Marca:
Mettler Toledo,
Modelo: ML204
-Etanol al 96% v/v
-Solución de ácido
sulfúrico 20% v/v
-Solución de
permanganato de potasio
0,1 N.
Obtención de
extractos
-Frascos Ámbar de
100mL
-Embudo simple
-Espátula
-Papel filtro
-Gradilla con tubos de
ensayo
-Termómetro
-Balanza analítica
±0,01g, Marca:
Mettler Toledo,
Modelo: ML204
-Agua tipo II
-Etanol a diferentes
concentraciones (70, 60,
50, 40, 30, 20, 10, 5) %
v/v
Elaboración de
nanopartículas
-Gradilla con tubos de
ensayo
-Jeringas de 10mL
-Filtros de jeringa de
2µm
-Termómetro
-Baño Ultrasónico
-Balanza analítica
±0,0001g, Marca:
Mettler Toledo,
Modelo: AB204-S
-Analizador de
nanopartículas (DLS),
Marca Horiba, Modelo
SZ-100
-Cubetas de cuarzo
-tween 80
28
Determinación de
fenoles totales y
flavonoides
-Gradilla con tubos de
ensayo
-Micropipetas de 10-
100ul
-Pipetas aforadas de
5mL y 10mL
-Matraces aforados de
25mL, 50mL y 100Ml
-Baño María
-Balanza analítica
±0,0001g, Marca:
Mettler Toledo,
Modelo: AB204-S
-Espectrofotómetro
UV-visible, Marca:
Bio Varian, Modelo:
Cary 50 Bio
-Cubetas de cuarzo
-Metanol
-Etanol al 10%v/v
-Agua tipo 1 y II
-Solución madre de
Quercetina de 1mg/mL
-Triculoruro de aluminio
al 20% p/v
-Solución de referencia
de ácido gálico de 0,5
mg/mL
-Solución de carbonato
de sodio anhidro al 10%
p/v
Evaluación de la
actividad
antibacteriana
-Cajas Petri
-Pipetas estériles
-Asas y agujas de
inoculación
-Micropipetas 100µl y
1000 µl
-Matraces Erlenmeyer
-Espátula
-Gradilla con tubos de
ensayo
-Probeta de 100mL
-Microplacas de 96
pocillos
-Asa de Digralski
-Sacabocados de 6mm
-Balanza analítica
±0,0001g, Marca:
Mettler Toledo,
Modelo: AB204-S
-Espectrofotómetro
UV-visible, Marca:
Bio Varian, Modelo:
Cary 50 Bio
-Lector de microplacas
multimodo híbrido
(Programa Gen 5TM)
-Mechero
-Autoclave
-Incubadora
Bacteriológica, Marca:
Edmund Buhler,
Modelo: Md; BSU 100
Cabina de
Bioseguridad BQ,
Marca: Hawai Force.
Jarra de Anaerobiosis
Gas Pak BD
-Cepa Streptococcus
mutans ATCC 25175
-Solución clorhexidina al
0,12%
-Agua destilada
Medios de cultivo:
-Agua Peptonada,
Neogen Company
-Agar mitis salivarius,
Becton, Dickinson and
Company
-Infusión de cerebro y
corazón BHI, Becton,
Dickinson and Company
Escala McFarland 0.5
-Agar nutriente Becton,
Dickinson and Company
-Agar Dextrosa
Sabouraud, Pronadisa.
Laboratorios Conda S.A.
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
29
3.4 Metodología
3.4.1 Recolección del propóleo.
El propóleo se recolectó de forma manual tras rasparlo con ayuda de una espátula de acero
inoxidable de los marcos y cubre panales de cada colmena y se seleccionó para su
determinación de sus características organolépticas.
3.4.2 Limpieza y molienda.
La muestra recolectada, se colocó en refrigeración, se retiró las impurezas como alas,
patas, astillas y cuerpos de abejas muertas, posteriormente se almacenó la muestra en
congelación (-4ºC) y se trituró en un molino de café.
3.4.3 Pérdida por calentamiento.
Se pesó un crisol limpio, previamente seco en la estufa a 100±2 °C (m100). Se pesó
aproximadamente 4g de la muestra de la muestra fresca en el crisol, se registró la masa del
crisol con la muestra (m), se colocó el crisol con la muestra en la estufa regulada a 100±2 °C
durante 2h. Luego se colocó en un desecador hasta que llegue a temperatura ambiente, y se
pesó (ms), finalmente se calculó la humedad con la ecuación 1.
3.4.4 Cenizas.
Se taró el crisol, previamente secado en la mufla a 550±25 °C (m550), se pesó en el crisol
aproximadamente 4 g de la muestra, se registró la masa del crisol con la muestra (m). Se
quemó la muestra en un mechero, se colocó en la mufla durante 4h, se retiró cuidadosamente
la muestra de la mufla, se dejó enfriar en un desecador y se pesó la muestra incinerada,
finalmente se calculó el porcentaje de cenizas con la ecuación 2.
30
3.4.5 Impurezas mecánicas.
Se pesó 2g de muestra en un papel filtro, se colocó en el cuerpo de un extractor de Soxhlet
utilizando etanol al 96% como solvente, se secó en la estufa a 80°C el remanente de la
extracción, se retiró de la estufa la muestra, se colocó en un desecador hasta temperatura
ambiente y se pesó. Se repitió el último procedimiento hasta lograr constancia de masa, lo
cual se verificó cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg, finalmente
se calculó el porcentaje de cenizas con la ecuación 3.
3.4.6 Índice de oxidación.
Se pesó 0,2g de la muestra, se añadió 5mL de etanol al 96%, se dejó en reposo durante
1h, se agregó 100mL de agua tipo I y se filtró. Se colocó 2mL del filtrado en un tubo de
ensayo, se añadió 1mL de solución de ácido sulfúrico y se agitó durante 1min, finalmente,
se agregó en el tubo 0,05mL (1 gota) de la solución de permanganato de potasio 0,1N y con
el cronómetro se determinó el tiempo en segundos, desde que la gota se pone en contacto
con la solución acidulada de propóleo, agitando constantemente hasta que la solución se
decolore.
3.4.7 Preparación de los extractos hidroalcóholicos.
Se pesó 15g propóleo triturado y se colocó en 100mL de etanol al (70%, 60%, 50%, 40%,
30%, 20%, 10% y 5%) en un frasco ámbar de vidrio de boca ancha, se dejó reposar durante
8 días, posteriormente se filtró y se almacenó el filtrado.
3.4.8 Preparación de nanopartículas de propóleo.
Se añadió 0% y 0,5% de tween 80 a los extractos filtrados (70%, 60%, 50%, 40%, 30%,
20%, 10% y 5%), se colocó los extractos en un baño ultrasónico a una temperatura de 25ºC,
en un tiempo de 30min y posteriormente se filtró en una membrana de poro de 0,2µm.
31
3.4.9 Caracterización de las nanopartículas.
3.4.9.1 Dispersión de la Luz (DLS).
Se determinó el índice de refracción de cada solución coloidal, se ajustó el equipo DLS
de acuerdo a las condiciones de las soluciones coloidales y se colocó en la celda. Se
determinó el tamaño medio de partícula y el índice de polidispersión.
3.4.10 Determinación de flavonoides totales.
3.4.10.1 Preparación de la curva de calibración.
Se preparó soluciones de 1,5mg/L; 3,0mg/L; 4,5mg/L, 6,0mg/L; 7,5mg/L; 9,0mg/L y
10,5mg/L, de Quercetina, respectivamente. En matraces aforados de 25,0mL se pipeteó
0,5mL; 1,0mL; 1,5mL; 2,0mL; 2,5mL; 3,0mL y 3,5mL de la solución patrón de Quercetina
y se dejó uno como blanco. Se agregó 0,5mL de la solución de tricloruro de aluminio a cada
una de ellas y al blanco. Se enrasó a 25mL con metanol. Se dejó 30min en la oscuridad, y
midió las absorbancias a 425nm.
3.4.10.2 Determinación de flavonoides totales en las muestras.
Se parte de los extractos alcohólicos obtenidos y se pipeteó 0,1mL de cada uno de ellos
en matraces de 25mL, se agregó 0,5mL de solución de tricloruro de aluminio y se aforó con
metanol. Se preparó un blanco con 0,1mL de alcohol etílico y 0,5mL de solución de
tricloruro de aluminio y se aforó con metanol.
Se dejó 30 min en la oscuridad, se colocó en una cubeta de vidrio y se midió la absorbancia
a 425nm. Para calcular la concentración de flavonoides totales expresados en Quercetina se
aplicó la Ecuación 6.
32
3.4.11 Determinación de compuestos fenólicos totales.
3.4.11.1 Preparación de la curva de calibración.
Se preparó una solución madre de ácido gálico de 0,5mg/mL, se tomó alícuotas de 5mL,
10mL, 15mL, 20mL y 25mL de la solución de madre, se colocó en matraces aforados de
25mL y se dejó un matraz vacío como blanco. Se aforó con etanol al 10% v/v. Las diluciones
al final tienen una concentración de: 0mg/mL; 0,1mg/mL; 0,2mg/mL; 0,3mg/mL y
0,4mg/mL, respectivamente de ácido gálico.
Se tomó una alícuota de 1mL de cada una de las soluciones de referencia diluidas, se
agregó 10mL de agua para análisis y 1mL del reactivo de Folin-Ciocalteu, se agitó
suavemente y se dejó en reposo durante 2min. Se añadió 4mL de la solución de carbonato
de sodio y se completó el volumen con agua para análisis. Se calentó la mezcla un baño
maría a 50 °C por 5 min y se midió la absorbancia a 765nm.
3.4.11.2 Determinación de fenoles totales en las muestras.
Se tomó una alícuota de 5mL de cada muestra, se aforó con agua hasta 25mL. Se tomó
1mL de la solución anterior y se colocó en un matraz aforado de 25mL, se agregó 10mL de
agua, 1mL del reactivo de Folin-Ciocalteu, se dejó en reposo durante 2min a temperatura
ambiente. Se añadió 4mL de la solución de carbonato de sodio y se aforó con agua y se
calentó en un baño maría 50°C durante 5min. Se midió la absorbancia a 765nm y para
calcular la concentración de fenoles totales se aplicó la Ecuación 5.
3.4.12 Evaluación de la actividad antibacteriana.
3.4.12.1 Control microbiológico de las soluciones coloidales.
Como proceso de control de calidad de las soluciones coloidales, se evalúa la presencia o
ausencia de contaminación antibacteriana y fúngica, para cumplir con este proceso.
Utilizando la técnica de extensión en placa con la ayuda del asa de Digralski se sembró una
alícuota de 100ul de cada solución coloidal en cajas petri con agar Nutriente y agar
Sabouraud, se incubó a 37ºC durante 48h para bacterias y a temperatura ambiente durante 5-
7 días para hongos. Finalmente se observó la presencia o ausencia de colonias en cada agar
33
y en caso de encontrar colonias se reportaron como unidades formadoras de colinas sobre
mililitro (ufc/mL).
3.4.12.2 Activación de la cepa.
Para activación de la cepa se añadió 10mL de solución salina para rehidratar la cepa
liofilizada, se sembró por estriación en cajas petri con agar sangre y se incubó a 37ºC durante
48h.
3.4.12.3 Preparación del inóculo.
Se llevó la cepa activada a un tubo con agua estéril. El inoculo se ajustó a una turbidez
0,5 McFarland que equivale a 1.5 x 108 ufc/mL. Se confirmó el valor de la escala McFarland,
leyendo en un espectrofotómetro la absorbancia a 625nm y el valor debe estar entre 0,08-
0.1.
3.4.12.4 Solución estándar (Clorhexidina al 0,12%)
Se utilizó como una solución estándar Clorhexidina al 0,12% obtenida comercialmente.
3.4.12.5 Método pozos en agar.
Se sembró por estriación con un hisopo estéril el inóculo sobre cajas Petri con medio de
cultivo Mitis salivarius, se dejó secar entre 3-5 minutos después se perforó la superficie del
agar inoculado con un sacabocado estéril de 6mm de diámetro, se colocó 75µL una de las
muestras, solución estándar y blancos (agua, alcohol y tween 80) en cada uno de los pozos
por triplicado, se dejó reposar por 30min. Se incubó en Jarra de Anaerobiosis Gas Pak, con
la caja invertida a 37°C por 24h. Se midió los halos de inhibición incluyendo el diámetro del
pozo y se comparó con el diámetro de inhibición de la solución de referencia.
3.4.12.6 Método de Microdilución.
Preparación del inoculo. Se tomó 1mL del inoculo preparado a una turbidez 0,5
McFarland (1.5 x 108 ufc/mL) y se colocó en 1mL de Caldo Brain Heart Infusión (BHI)
ajustando el inóculo a una concentración de 1x105 ufc/mL.
34
Microdilución en las placas. Se utilizó placas para Microdilución de 96 pocillos y con la
ayuda de micropipetas, la distribución en cada pocillo se realizó de la siguiente manera:
Placa 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
B B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
C B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
D B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
E B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
F B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
G B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
H B C+ BCHX CCHX BEtOH CEtOH BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6
Placa 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
B BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
C BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
D BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
E BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
F BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
G BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
H BT7 BT8 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Figura 8: Esquema de Microdilución en placa (placas 1 y 2)
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Blanco, B: (110µl BHI)
Control positivo, C+: (100µl BHI+ 10µl inóculo)
Blanco clorhexidina, BCHX: (100µl BHI + 10µl clorhexidina)
Control clorhexidina, CCHX: (90µl BHI + 10µl inóculo + 10µl clorhexidina)
Blanco alcohol, BEtOH: (100µl BHI + 10µl alcohol 70%)
Control alcohol, CEtOH: (90µl BHI + 10µl inóculo + 10µl alcohol 70%)
Para todos los tratamientos se siguió la misma distribución por triplicado en cabina de
flujo laminar:
Blanco tratamiento 1, BT1: (100µl BHI + 10µl sol 70%)
Tratamiento 1, T1: (90µl BHI + 10µl inóculo + 10µl sol 70%)
35
Por último, se incubó cada placa a 37°C por 24h. Se midió la absorbancia en el equipo
lector de microplacas multimodo híbrido y se calculó el porcentaje de inhibición de cada
fracción mediante la ecuación 8.
3.5 Diseño experimental
El análisis estadístico de los datos se realizó en el programa STATGRAPHICS Centurion
versión XVI.I.
3.5.1 Fase I: Obtención de extractos.
3.5.1.1 Diseño Experimental.
Se aplicó un diseño experimental completamente al azar (DCA), para los tratamientos se
utilizó la prueba de LSD ya que requiere investigar simultáneamente la relación entre
variables al 95% de confianza.
Variable independiente. Concentración de etanol en el extracto de propóleo
Variable dependiente. Porcentaje rendimiento
Tabla 3. Diseño completamente al azar
Porcentaje de rendimiento
Concentración
de etanol %p/v
Repeticiones Media
R1 R2 R3 RM
C70 C70R1 C70R2 C70R3 C70RM
C60 C60R1 C60R2 C60R3 C60RM
C50 C50R1 C50R2 C50R3 C50RM
C40 C40R1 C40R2 C40R3 C40RM
C30 C30R1 C30R2 C30R3 C30RM
C20 C20R1 C20R2 C20R3 C20RM
C10 C10R1 C10R2 C10R3 C10RM
C5 C5R1 C5R2 C5R3 C5RM
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
36
3.5.2 Fase II: Obtención de soluciones coloidales.
3.5.2.1 Diseño Experimental.
Se aplicó un diseño experimental factorial axb, con un 95% de confianza, se aplica la
prueba de LSD para determinar la diferencia significativa entre las medias de los
tratamientos.
Factores.
Concentración de etanol en la suspensión coloidal (Factor A)
Concentración de tween 80 (Factor B)
Variables Dependientes.
Tamaño de partícula de la solución coloidal,
Concentración de fenoles totales.
Concentración de flavonoides totales.
Actividad antibacteriana
Tabla 4. Diseño Factorial axb
Factor B
Factor A Tamaño de partícula
B1 B2
1 2 3 1 2 3
A1 A1B1 A1B1 A1B1 A1B2 A1B2 A1B2
A2 A2B1 A2B1 A2B1 A2B2 A2B2 A2B2
A3 A3B1 A3B1 A3B1 A3B2 A3B2 A3B2
A4 A4B1 A4B1 A4B1 A4B2 A4B2 A4B2
A5 A5B1 A5B1 A5B1 A5B2 A5B2 A5B2
A6 A6B1 A6B1 A6B1 A6B2 A6B2 A6B2
A7 A7B1 A7B1 A7B1 A7B2 A7B2 A7B2
A8 A8B1 A8B1 A8B1 A8B2 A8B2 A8B2
Nota: Para la concentración de fenoles totales, flavonoides totales y actividad antibacteriana se realizó el
mismo procedimiento, con las mismas tablas.
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
37
3.6 Matriz de Operacionalización de Variables
Tabla 5. Variables, dimensiones e indicadores
Variables Dimensiones Indicadores
Rendimiento Concentración de propóleo
disuelto
Porcentaje
Etanol en la solución
coloidal
Concentración de etanol Porcentaje
volumen/volumen de etanol
Tween en la solución
coloidal
Porcentaje de Tween Porcentaje peso/volumen
Fenoles totales Concentración de ácido
gálico
mg equivalentes de ácido
gálico por mL de solución.
Flavonoides totales Concentración de
quercetina
mg equivalentes de
quercetina por mL de
solución.
Tamaño de partícula Dimensión de las partículas Nanómetros
Actividad antibacteriana Antibiograma
Microdilución en placa
Halo de inhibición
Porcentaje de Inhibición
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
3.7 Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Para la evaluación de la fase I, se aplicó un análisis de varianza ANOVA con un factor,
a un nivel de confianza del 95%.
Tabla 6. ANOVA con un factor
Fuente de
variación
Suma de cuadrados Grados
de
libertad
Cuadrados Medios Razón F
Tratamientos 𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇 = ∑
𝑌𝑖.2
𝑛𝑖
𝑘
𝑖=1−
𝑌..2
𝑁
𝑘 − 1 𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇 =
𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇
𝑘 − 1
𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇
𝐶𝑀𝐸
Error 𝑆𝐶𝐸 = 𝑆𝐶𝑇 − 𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇 𝑁 − 𝑘 𝐶𝑀𝐸 =
𝑆𝐶𝐸
𝑁 − 𝑘
Total 𝑆𝐶𝑇 = ∑ ∑ 𝑌𝑖𝑗
2 −𝑌..
2
𝑁
𝑛𝑖
𝑗=1
𝑘
𝑖=1
𝑁 − 1
Tomada de Gutiérrez & Salazar (2008)
38
Para probar la igualdad de las medias de los tratamientos se plantea las hipótesis de pares
de medias y se aplicó la prueba LSD.
𝐻𝑜: 𝜇𝑖 = 𝜇𝑗
𝐻𝐴: 𝜇𝑖 ≠ 𝜇𝑗
𝐿𝑆𝐷 = 𝑡∝/2, 𝑁−𝐾 √2𝐶𝑀𝐸/𝑛
Ecuación 9: Diferencia mínima significativa (LSD) con un factor
Para la evaluación de la fase II, se utilizó un análisis de varianza ANOVA con dos
factores, a un nivel de confianza del 95% y la prueba de LSD para diferenciar las medias
de los tratamientos.
Tabla 7. ANOVA con dos factores
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
Medios
Razón F Valor-p
Efecto A 𝑆𝐶𝐴 𝑎 − 1 𝐶𝑀𝐴 𝐶𝑀𝐴
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐴)
Efecto B 𝑆𝐶𝐵 𝑏 − 1 𝐶𝑀𝐵 𝐶𝑀𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐵)
Efecto
AB
𝑆𝐶𝐴𝐵 (𝑎 − 1)(𝑏 − 1) 𝐶𝑀𝐴𝐵 𝐶𝑀𝐴𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐴𝐵)
Error 𝑆𝐶𝐸 𝑁 − 𝑘 𝐶𝑀𝐸
Total 𝑆𝐶𝑇 𝑁 − 1
Tomada de Gutiérrez & Salazar (2008)
Para probar la igualdad de las medias de los tratamientos se plantea las hipótesis de pares
de medias para cada factor y se aplicó la prueba LSD.
39
𝐻𝑜: 𝜇𝐴1 = 𝜇𝐴2
𝐻𝐴: 𝜇𝐴1 ≠ 𝜇𝐴2
𝐻𝑜: 𝜇𝐵1 = 𝜇𝐵2
𝐻𝐴: 𝜇𝐵1 ≠ 𝜇𝐵2
𝐿𝑆𝐷𝐵2(𝐴) = 𝑡∝/2, 𝑎𝑏(𝑛−1) √𝐶𝑀𝐸 (1
𝑛+
1
𝑛)
Ecuación 10: Diferencia mínima significativa (LSD) para dos factores
40
CAPÍTULO IV
4. Análisis y discusión de resultados
4.1 Estandarización del propóleo.
En la tabla 8 se presentan los resultados físicos y químicos del propóleo en base a los
requerimientos de la norma INEN 2794 y norma oficial Mexicana NOM-003-SAG/GAN-
2017.
Tabla 8. Características Físicas y Químicas del propóleo
Tipo de ensayo Especificación Resultados Referencia
Color Rojo, amarillo-rojizo, amarillo-
obscuro, verde castaño, pardo o
negro, variando conforme a su
origen botánico
Verde obscuro Norma oficial
Mexicana NOM-
003-SAG/GAN-
2017
Aroma Resinoso (olor a madera) o
balsámico (olor a cera), o
balsámico, dependiendo de su
origen botánico
Resinoso olor a
madera
Sabor Variable, de suave balsámico, a
fuerte y picante, dependiendo de
su origen botánico.
Fuerte picante
Consistencia A temperatura ambiente
maleable o rígido, dependiendo
de su origen botánico.
A temperatura
ambiente maleable
Pérdida por
calentamiento
Máx. 10,0% 6,09%±0,07 Norma INEN
2794
Cenizas Máx. 5,0% 2,63%±0,13
Impurezas
mecánicas
Máx. 25,0% 24,49%±0,52
Índice de
oxidación
Máx. 22s 19s±1,94
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En el anexo 4 se detallan los datos utilizados para la caracterización físico-química del
propóleo.
41
El propóleo recolectado y utilizado para esta experimentación cumple con los requisitos
establecidos en la normativa Ecuatoriana INEN 2794, para cenizas 2,63%±0,13; impurezas
mecánicas 24,49%±0,52 e índice de oxidación 19s±1,94; requisitos que comprueban la
buena calidad del propóleo.
4.2 Porcentaje de Rendimiento.
En la tabla 9 se muestran los resultados del porcentaje de rendimiento, el cálculo se realizó
en base a la cantidad remanente de propóleo tras el proceso de maceración y filtración de 8
extractos con concentraciones descendentes de Etanol por 8 días.
Tabla 9. Porcentaje de Rendimiento
%
Alcohol
% Rendimiento
Repeticiones Media Desviación
R1 R2 R3
70 48,05 48,15 48,27 48,16 0,11
60 39,05 38,96 39,20 39,07 0,12
50 28,28 28,12 28,08 28,16 0,11
40 15,69 15,66 15,97 15,77 0,17
30 8,82 8,32 8,71 8,62 0,26
20 6,13 6,20 6,05 6,13 0,08
10 2,64 2,75 2,80 2,73 0,08
5 1,98 1,84 1,88 1,90 0,07 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Con la finalidad de determinar la relación que existe entre el porcentaje de rendimiento y
el grado de alcohol utilizado para la extracción, en la tabla 10 se presentan los resultados del
análisis de varianza ANOVA para el porcentaje de propóleo disuelto. Se muestra que el
valor-p de la prueba-F es menor que 0,05, de modo que existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias con un nivel del 95,0% de confianza. Los
resultados señalan que el rendimiento depende del grado alcohólico utilizado para su
extracción.
Tabla 10. ANOVA para el rendimiento
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
medio
Razón-F Valor-p
Tratamientos 6532,87 7 993,267 48533,94 <0,0000
Error 0,31 16 0,02
Total 6533,18 23 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
42
En la tabla 11 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares
de medias que muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0%
de confianza.
Tabla 11. Pruebas de LSD para el porcentaje de propóleo disuelto
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límite
μ5 - μ10 *0,83 μ20 – μ40 *19,65 0,24
μ5 – μ20 *4,23 μ20 – μ50 *32,03 0,24
μ5 – μ30 *12,72 μ20 – μ60 *52,94 0,24
μ5 – μ40 *23,87 μ20 – μ70 *62,03 0,24
μ5 – μ50 *36,26 μ30 – μ40 *11,16 0,24
μ5 – μ60 *57,17 μ30 – μ50 *23,54 0,24
μ5 – μ70 *66,26 μ30 – μ60 *44,45 0,24
μ10 – μ20 *3,40 μ30 – μ70 *53,54 0,24
μ10 – μ30 *11,89 μ40 – μ50 *12,39 0,24
μ10 – μ40 *23,04 μ40 – μ60 *33,30 0,24
μ10 – μ50 *35,43 μ40 – μ70 *42,38 0,24
μ10 – μ60 *56,34 μ50 – μ60 *20,91 0,24
μ10 – μ70 *65,43 μ50 – μ70 *29,99 0,24
μ20 – μ30 *8,49 μ60 – μ70 *9,08 0,24
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En el Gráfico 1, se señalan los valores promedio del rendimiento en los extractos con
diferentes concentraciones de etanol, se observa que el rendimiento aumenta a medida que
aumenta el grado alcohólico. Los resultados indican que al utilizar etanol al 70% para la
extracción existe mayor rendimiento con una media de 48,16 ±1,73%, es así que con etanol
al 70% existe un incremento del 80-96% del rendimiento en comparación con los alcoholes
del 5 al 30%, además existe un incremento gradual del rendimiento del 5-10% al aumentar
el grado alcohólico.
En Talero et al, (2014) evaluaron extractos con etanol al 70% donde mostraron valores
promedio menores que los extractos obtenidos con etanol al 96%, explicando que este
comportamiento se debe a la menor solubilidad de resinas y ceras en agua. En Toledo et al,
(2011), realizaron pruebas de solubilidad con muestras de propóleo, donde se evidenció que
contienen una variedad de compuestos que van desde no polar a polar. Además, se probó
que el propóleo es altamente soluble en diclorometano, moderadamente soluble en etanol,
alcohol isopropílico, hexano, acetato de etilo, metanol y agua destilada.
43
Los resultados concuerdan con el estudio de Soon Ok et al, (2015) en donde se evaluaron
las propiedades de los extractos de propóleo con diferentes concentraciones de etanol,
determinándose que el porcentaje de rendimiento de extracción del propóleo aumenta: 10%
con alcohol al 40%, más del 30% con alcohol al 60%, entre 44-46% con alcohol sobre el
70% y las curvas de rendimiento mostraron un aumento gradual del 10-20% cuando se utiliza
etanol con altos grados alcohólicos.
Gráfico 1: Porcentaje de propóleo disuelto según el grado alcohólico en el extracto
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Los rendimientos de los EEP elaborados a partir de alcoholes al 70-30%, tienen
rendimientos aceptables al compararlos con las normativas para propóleos de Brasil (11%),
Argentina (10%) y Japón (8%), mientras que EEP elaborados con alcoholes al 20-5%,
presentan rendimientos muy bajos, cuyos rangos no son aceptables de acuerdo a las
normativas internacionales.
4.3 Cuantificación de fenoles totales
En la tabla 12 se muestran los resultados de la cuantificación de fenoles totales para cada
solución coloidal sin tween y con tween al 0,5%; que ha sido colocada en el ultrasonido a
25ºC por 30min, filtrada en una membrana de poro de 0,2µm.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
70 60 50 40 30 20 10 5
48,16
39,07
28,16
15,77
8,626,13
2,73 1,90
% R
end
imie
nto
% Alcohol en el extracto
% Rendimiento
44
Tabla 12. Concentración de fenoles totales
%
Alcohol
Concentración de Fenoles (mg EAG/g)
Sin tween Con tween
Repeticiones Media
Repeticiones Media
R1 R2 R3 R1 R2 R3
S70 122,00 122,30 122,00 122,10 122,92 122,00 122,00 121,64
S60 90,20 89,95 90,20 90,12 89,90 89,95 89,95 89,93
S50 73,12 73,09 73,09 73,10 73,06 73,06 73,06 73,06
S40 58,73 58,60 58,00 58,44 58,50 58,50 58,50 58,50
S30 30,57 30,25 30,57 30,46 30,30 30,30 30,25 30,28
S20 14,68 14,48 14,68 14,61 14,56 14,56 14,68 14,60
S10 2,69 2,69 2,56 2,65 2,63 2,63 2,63 2,63
S5 1,64 1,64 1,70 1,66 1,70 1,70 1,70 1,70
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Para establecer si influyen el porcentaje de alcohol en las soluciones coloidales y el
porcentaje de tween en la concentración de Fenoles totales, se realizó un análisis de varianza
ANOVA como se describe en la tabla 13. El Factor A, el valor-p de la prueba-F es menor
que 0,05, de modo que existe una diferencia estadísticamente significativa sobre la
concentración de fenoles con un 95,0% de nivel de confianza. Para el Factor B e Interacción
AB; los valores-p de la prueba-F es mayor que 0,05, de modo que no hay diferencia
estadísticamente significativa entre las medias. Los resultados indican que el grado
alcohólico influye en la concentración de fenoles totales mientras que el porcentaje de tween
utilizado no influyen en la concentración de fenoles.
Tabla 13. ANOVA para concentración de fenoles totales
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-p
A:%Alcohol 81486,10 7 11640,90 285519,61 >0,0000
B:tween 80 0,12 1 0,12 2,92 <0,0972
Interacción AB 0,31 7 0,04 1,08 <0,3998
Error 1,30 32 0,04
Total 81487,8 47 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En la tabla 14 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares
de medias que muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0%
de confianza.
45
Tabla 14. Pruebas LSD para concentración de fenoles totales
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límites
μ5 - μ10 *0,96 μ20 – μ40 *43,86 0,24
μ5 – μ20 *12,93 μ20 – μ50 *58,47 0,24
μ5 – μ30 *28,69 μ20 – μ60 *75,41 0,24
μ5 – μ40 *56,79 μ20 – μ70 *107,26 0,24
μ5 – μ50 *71,40 μ30 – μ40 *28,09 0,24
μ5 – μ60 *88,34 μ30 – μ50 *42,70 0,24
μ5 – μ70 *120,19 μ30 – μ60 *59,65 0,24
μ10 – μ20 *11,97 μ30 – μ70 *91,49 0,24
μ10 – μ30 *27,74 μ40 – μ50 *14,60 0,24
μ10 – μ40 *55,83 μ40 – μ60 *31,55 0,24
μ10 – μ50 *70,44 μ40 – μ70 *63,39 0,24
μ10 – μ60 *87,39 μ50 – μ60 *16,94 0,24
μ10 – μ70 *119,23 μ50 – μ70 *48,79 0,24
μ20 – μ30 *15,77 μ60 – μ70 *31,84 0,24
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Gráfico 2: Concentración de fenoles según el grado alcohólico y la concentración de tween 80
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
4.4 Cuantificación de flavonoides totales
En la tabla 15 se muestran los resultados de la cuantificación de flavonoides totales para
cada solución coloidal sin tween y con tween al 0,5%; que ha sido colocada en el ultrasonido
a 25ºC por 30min, filtrada en una membrana de poro de 0,2µm.
0
20
40
60
80
100
120
140
70 60 50 40 30 20 10 5
122,1
90,12
73,1
58,44
30,46
14,61
2,65 1,66
121,64
89,93
73,06
58,5
30,28
14,6
2,63 1,7
Co
nce
ntr
ació
n d
e F
en
ole
s (m
g G
AE/
g)
% Alcohol solución coloidal
0% Tween 0,5% Tween
46
Tabla 15. Concentración de flavonoides totales
%
Alcohol
Concentración de Flavonoides (mg EQ/g)
Sin tween Con tween
Repeticiones Media
Repeticiones Media
R1 R2 R3 R1 R2 R3
S70 48,40 48,80 48,40 48,53 48,60 48,40 48,60 48,53
S60 33,60 33,40 33,60 33,53 33,20 33,45 33,45 33,36
S50 21,20 21,40 21,40 21,33 21,25 21,30 21,30 21,28
S40 7,60 7,40 7,60 7,53 7,55 7,55 7,30 7,47
S30 5,65 5,60 5,65 5,63 5,63 5,63 5,60 5,62
S20 2,73 2,70 2,73 2,72 2,70 2,70 2,73 2,71
S10 0,42 0,40 0,40 0,41 0,41 0,41 0,40 0,41
S5 0,10 0,10 0,11 0,10 0,11 0,10 0,11 0,11
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Para establecer si influyen el porcentaje de alcohol en las soluciones coloidales y el
porcentaje de tween en la concentración de Flavonoides totales, se realizó un análisis de
varianza ANOVA como se describe en la tabla 16. El Factor A, el valor-p de la prueba-F es
menor que 0,05, de modo que existe una diferencia estadísticamente significativa sobre la
concentración de flavonoides con un 95,0% de nivel de confianza. Para el Factor B e
Interacción AB; los valores-p de la prueba-F es mayor que 0,05, de modo que no hay
diferencia estadísticamente significativa. Los resultados indican que el grado alcohólico
influye en la concentración de flavonoides totales mientras que el porcentaje de tween
utilizado no influyen en la concentración de flavonoides.
Tabla 16. ANOVA para concentración de flavonoides totales
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-p
A:%Alcohol 13407,10 7 1915,31 202767,25 >0,0000
B: tween 80 0,02 1 0,02 1,83 <0,1860
Interacción AB 0,04 7 0,01 0,53 <0,8027
Error 0,30 32 0,01
Total 13407,50 47
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En la tabla 17 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares
de medias que muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0%
de confianza.
47
Tabla 17. Pruebas LSD para concentración de flavonoides totales
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límites
μ5 - μ10 *0,30 μ20 – μ40 *4,78 0,24
μ5 – μ20 *2,61 μ20 – μ50 *18,59 0,24
μ5 – μ30 *5,52 μ20 – μ60 *30,73 0,24
μ5 – μ40 *7,39 μ20 – μ70 *45,81 0,24
μ5 – μ50 *21,20 μ30 – μ40 *1,87 0,24
μ5 – μ60 *33,34 μ30 – μ50 *15,68 0,24
μ5 – μ70 *48,42 μ30 – μ60 *27,82 0,24
μ10 – μ20 *2,30 μ30 – μ70 *42,90 0,24
μ10 – μ30 *5,22 μ40 – μ50 *13,80 0,24
μ10 – μ40 *7,09 μ40 – μ60 *25,95 0,24
μ10 – μ50 *20,90 μ40 – μ70 *41,03 0,24
μ10 – μ60 *33,04 μ50 – μ60 *12,14 0,24
μ10 – μ70 *48,12 μ50 – μ70 *27,22 0,24
μ20 – μ30 *2,91 μ60 – μ70 *15,08 0,24
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Gráfico 3: Concentración de flavonoides según el grado alcohólico y la concentración de tween 80
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En los Gráficos 2, 3 y 4 se puede observar que la concentración de tween 80 en las
soluciones coloidales no influyen en las concentraciones de fenoles y flavonoides totales ya
que el tween 80 se coloca para brindarle mayor estabilidad a las partículas y no modifica la
concentración de los compuestos activos. La concentración de metabolitos secundarios
tiende a aumentar con el porcentaje de alcohol de la solución coloidal.
0
10
20
30
40
50
70 60 50 40 30 20 10 5
48,53
33,53
21,33
7,535,63
2,720,41 0,1
48,53
33,36
21,28
7,475,62
2,710,41 0,11
Flav
on
oid
es
(mg
QE/
g)
% Alcohol solución coloidal
0% Tween 0,5% Tween
48
La solución coloidal con alcohol al 70% es la que tiene mayor concentración de
metabolitos secundarios, este comportamiento se debe a que los compuestos activos del
propóleo se encuentran en su mayoría en las resinas, cuyas propiedades van desde apolar a
polar, por lo cual al disminuir la concentración de etanol aumenta la polaridad del solvente
disminuyendo la solubilidad y a su vez la concentración de metabolitos secundarios. En Sun
et al, (2015), menciona que los extractos acuosos de propóleo disminuyen hasta cinco veces
la concentración de metabolitos secundarios en comparación con extractos alcohólicos.
Las normas internacionales de Ecuador, Argentina, México y el Salvador sugieren una
concentración mínima para Fenoles Totales de 50mg/g de extracto de propóleo y para
Flavonoides Totales de 5mg/g de extracto de propóleo, las soluciones coloidales con alcohol
del 40-70% están dentro de los rangos que establece la normativa, mientras que las
soluciones del 5-30% están fuera de este rango.
En Kubiliene et al, (2018) y Monhdaly et al, (2015), se realizaron estudios por HPLC
encontrándose que hay mayor cantidad de compuestos fenólicos y flavonoides en extractos
etanólicos en comparación con extractos acuosos y con propilenglicol. Los principales
compuestos encontrados fueron quercetina, kaempherol, pinocembrina, naringenina, rutina,
ácido fenólico, ácido p-cumárico y, en niveles más bajos, ácido sinínico, ácido gálico, ácido
vanílico, catequina y apigenina; a estos compuestos se les atribuye sus propiedades
antibcaterianas.
Gráfico 4: Concentración de fenoles y flavonoides según el grado alcohólico de la solución coloidal
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
-10
10
30
50
70
90
110
130
70 60 50 40 30 20 10 5
121,64
89,93
73,06
58,5
30,28
14,6
2,63 1,7
48,53
33,36
21,28
7,47 5,62 2,71 0,41 0,11
% Alcohol Solución Coloidal
Fenoles Totales Flavonoides Totales
49
4.5 Tamaño de partícula
En la tabla 18 se muestran los resultados del tamaño de partícula para cada solución
coloidal sin tween y con tween al 0,5%; que ha sido colocada en el ultrasonido a 25ºC por
30min, filtrada en una membrana de poro de 0,2µm.
Tabla 18. Tamaño de partícula
%
Alcohol
Tamaño de partícula (nm)
Sin tween Con tween
Repeticiones Media
Repeticiones Media
R1 R2 R3 R1 R2 R3
S70 5024,4 5002,4 5079,9 5035,6 1072,4 1075,2 1011,5 1053,0
S60 2413,4 2413,1 2386,4 2404,3 992,4 997,1 985,2 991,6
S50 1026,5 1060,1 1042,6 1043,1 778,7 710,8 715,0 734,8
S40 917,0 929,7 920,4 922,4 624,9 679,3 678,6 660,9
S30 849,0 834,2 876,9 853,4 583,5 567,5 594,1 581,7
S20 550,0 556,2 581,5 562,6 420,4 424,1 421,2 421,9
S10 404,4 420,4 392,6 405,8 313,4 310,6 316,6 313,5
S5 268,8 264,8 261,0 264,9 193,8 179,8 186.6 186,7
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Para comprobar si influyen el porcentaje de alcohol y el tensoactivo en el tamaño de
partícula, se realizó un análisis de varianza ANOVA como se describe en la tabla 19. Para
los Factores: A, B e Interacción AB, los valores-p de la prueba-F son menores que 0,05,
estos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre el tamaño de partícula
con un 95,0% de nivel de confianza. Los resultados indican que el grado alcohólico y el
tween influye en el tamaño de partícula de la solución coloidal.
Tabla 19. ANOVA para tamaño de partícula
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-p
A:%Alcohol 3,66E7 7 5,23E6 13315,16 >0,0000
B:tween 80 7,88E6 1 7,88E6 20041,74 >0,0000
Interacción AB 1,89E7 7 2,70E6 6865,53 >0,0000
Error 12587,7 32 393,36
Total 6,35E7 47 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
50
En la tabla 20 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares
de medias que muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0%
de confianza.
Tabla 20. Pruebas LSD para tamaño de partícula
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límites
μ5 - μ10 *148,87 μ20 – μ40 *299,42 23,32
μ5 – μ20 *266,43 μ20 – μ50 *396,72 23,32
μ5 – μ30 *491,73 μ20 – μ60 *1205,70 23,32
μ5 – μ40 *565,85 μ20 – μ70 *2568,73 23,32
μ5 – μ50 *663,15 μ30 – μ40 *74,12 23,32
μ5 – μ60 *1472,13 μ30 – μ50 *171,42 23,32
μ5 – μ70 *2835,17 μ30 – μ60 *980,40 23,32
μ10 – μ20 *117,57 μ30 – μ70 *2343,43 23,32
μ10 – μ30 *342,87 μ40 – μ50 *97,30 23,32
μ10 – μ40 *416,98 μ40 – μ60 *906,28 23,32
μ10 – μ50 *514,28 μ40 – μ70 *2269,32 23,32
μ10 – μ60 *1323,27 μ50 – μ60 *808,98 23,32
μ10 – μ70 *2686,30 μ50 – μ70 *2172,02 23,32
μ20 – μ30 *225,30 μ60 – μ70 *1363,03 23,32
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En el gráfico 5 se puede observar que las soluciones con mayor grado alcohólico tienen
un tamaño de partícula más grande, ya que la concentración de metabolitos secundarios es
mayor. Con la presencia de tensoactivo las soluciones S70 y S60 tienen una disminución del
70-50% del tamaño, las soluciones S50 a S5 disminuyen del 30-20% gradualmente. Esta
diferencia se puede explicar debido a que las soluciones sin tensoactivo son menos estables
y pueden sufrir fenómenos de agregación a causa de la alteración de las fuerzas de repulsión
incrementando el tamaño de partícula.
Las soluciones con grado alcohólico S70 y S60 que tienen mayores tamaños de partícula
y menores fuerzas de repulsión entre ellas, al agregar tween 80 al 0,5% aumenta la fuerza de
repulsión evitando la floculación. En las soluciones S70 y S60 es evidente este fenómeno
con una disminución de tamaño del 70%- 50%, las soluciones S50-S5 tienen mayores fuerzas
de repulsión por este motivo el porcentaje de disminución es menor.
Las soluciones con tensoactivo son más estables puesto que el tween 80 se asocia con la
superficie de las partículas y evita la aglomeración o floculación. En Gutiérrez et al, (2013),
se estudió el efecto de la relación entre los tensoactivos y la formación de nanopartículas
lipídicas sólidas determinando que los tensoactivos como tween y Cremophor en
51
combinación con co-tensoactivos promueven la formación de nanopartículas con tamaño
más homogéneo y estabilidad adecuada que las obtenidas con Labrasol.
Los parámetros que influyen en la elaboración de nanopartículas de propóleo por este
método son la utilización de un agente estabilizante como un tensoactivo, el porcentaje de
alcohol de las soluciones y la concentración de metabolitos secundarios.
Gráfico 5: Tamaño de partícula según el grado alcohólico y la cantidad de tween
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
4.6 Polidispersión del tamaño
En la tabla 21 se muestran los resultados del tamaño de partícula para cada solución
coloidal sin tween y con tween al 0,5%; que ha sido colocada en el ultrasonido a 25ºC por
30min, filtrada en una membrana de poro de 0,2µm.
-500
500
1500
2500
3500
4500
5500
70 60 50 40 30 20 10 5
5035,6
2404,3
1043,1922,4 853,4 562,6 405,8
264,9
1053 991,6734,8 660,9 581,7 421,9 313,5 186,7
Tam
año
nm
% Alcohol solución coloidal
0% Tween 0,5% Tween
52
Tabla 21. Polidispersión
%
Alcohol
Polidispersión
Sin tween Con tween
Repeticiones Media
Repeticiones Media
R1 R2 R3 R1 R2 R3
S70 1,329 34,866 5,550 13,915 0,801 0,691 0,711 0,734
S60 4,031 5,703 19,913 9,882 0,557 0,369 0,455 0,460
S50 4,105 6,852 6,378 5,778 0,315 0,366 0,980 0,554
S40 0,309 0,500 0,469 0,426 0,502 0,110 0,388 0,333
S30 0,299 0,469 0,468 0,412 0,311 0,341 0,376 0,343
S20 0,426 0,468 0,433 0,442 0,329 0,461 0,388 0,393
S10 0,321 0,426 0,385 0,377 0,340 0,393 0,369 0,367
S5 0,369 0,340 0,404 0,371 0,308 0,338 0,436 0,361
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En la tabla 22 se presentan los resultados del análisis de varianza ANOVA para la
polidispersión. El Factor B, el valor-p de la prueba-F es menor que 0,05, de modo que existe
una diferencia estadísticamente significativa sobre la polidispersión con un 95,0% de nivel
de confianza. Para el Factor A e Interacción AB; los valores-p de la prueba-F es mayor que
0,05, de modo que no hay diferencia estadísticamente significativa. Los resultados indican
que agregar tween influye en la polidispersión mientras que el grado alcohólico no influye
en la polidispersión.
Tabla 22. ANOVA para Polidispersión
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
A:%Alcohol 314,29 7 44,89 1,74 <0,00
B:tween 80 146,92 1 146,92 5,70 >0,02
Interacción: AB 282,39 7 40,34 1,57 <0,00
Error 824,13 32 25,75
Total 1567,75 47 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En el Gráfico 6 se observa que el índice de polidispersión de las muestras con tensoactivo
tienen valores menores a 0,4 dado que poseen una moderada distribución de tamaños de
partículas tratándose de muestras moderadamente dispersas.
53
Gráfico 6: Polidispersión según el grado alcohólico y la concentración de tween
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
4.7 Actividad antibacteriana
4.7.1 Actividad antibacteriana por el método pozos en agar.
En la tabla 23 se muestran los resultados de los halos de inhibición de cada una de las
soluciones coloidales con diferentes tamaños de partícula frente al Streptococcus mutans y
utilizando como solución de referencia Clorhexidina 0,12%.
Tabla 23. Halos de inhibición % Alcohol Halo de Inhibición mm
Sin tween Con tween
Repeticiones Media Repeticiones Media
R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4
S70 15 14 14 15 15 15 15 15 14 15
S60 13 14 12 13 13 14 14 13 14 14
S50 11 12 12 11 12 13 13 12 13 13
S40 10 10 9 10 10 11 12 10 12 11
S30 8 8 9 8 8 10 9 9 10 10
S20 7 8 8 8 8 9 9 9 9 9
S10 7 7 6 7 7 8 8 8 8 8
S5 7 6 7 7 7 7 8 8 8 8
Clorhexidina 0,12% 15 15 15 15 15
Alcohol 70% No inhibe No inhibe No inhibe No inhibe No inhibe
Nota: (Sin tween): equivale a las soluciones cuyas medias del tamaño de partícula varían entre: 200-5000nm.
(Con tween): equivale a las soluciones cuyas medias del tamaño de partícula varían entre: 100-1000nm.
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Se realizó un análisis de varianza ANOVA como se describe en la tabla 24, en donde se
considera a los factores A y B. El Factor A corresponde al porcentaje de alcohol de la
0
2
4
6
8
10
12
14
70 60 50 40 30 20 10 5
sin tween 13,915 9,882 5,778 0,426 0,412 0,442 0,377 0,371
con tween 0,734 0,46 0,554 0,333 0,343 0,393 0,367 0,361
Po
lidis
per
sió
n
% Alcohol
sin tween con tween
54
solución coloidal, mientras que en el Factor B se colocó a la concentración de tween 80;
aunque se conoce que no afecta la actividad como menciona en Umesaki et al, (1977) y
Jacques et al, (1985), esto con la finalidad de relacionar el tamaño de partícula con la
actividad, ya que los datos de los tamaños de partícula no son homogéneos entre sí como se
muestra en la tabla 18, por lo cual no se corrió un diseño experimental en función del tamaño
de partícula, sino que se consideró que las soluciones sin tween tiene tamaño de partículas
más grandes en relación a las soluciones con tween.
Los valores-p de la prueba F son menores que 0,05 para los Factores A y B con un 95,0%
de nivel de confianza, estos factores tienen un efecto significativo sobre los halos de
inhibición. La interacción AB no presenta diferencia significativa.
Tabla 24. ANOVA para halos de inhibición
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
A:%Alcohol 338,31 7 48,33 136,46 <0,00
B:% Tween 13,02 1 13,02 36,76 <0,00
Interacción: AB 0,81 7 0,11 0,33 >0,94
Error 11,33 32 0,35
Total 363,47 47 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En la tabla 25 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares.
Se muestran que los pares S5-S10 y S20-S30 no presentan diferencia significativa por lo que
sus halos de inhibición no difieren entre sí. Los pares de medias restantes muestran
diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0% de confianza
Tabla 25. Pruebas LSD para halo de inhibición
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límites
μ5 - μ10 0,12 μ20 – μ40 *2,12 0,55
μ5 – μ20 *1,12 μ20 – μ50 *3,75 0,55
μ5 – μ30 *1,62 μ20 – μ60 *5,00 0,55
μ5 – μ40 *3,25 μ20 – μ70 *6,25 0,55
μ5 – μ50 *4,87 μ30 – μ40 *1,62 0,55
μ5 – μ60 *6,12 μ30 – μ50 *3,25 0,55
μ5 – μ70 *7,37 μ30 – μ60 *4,50 0,55
μ10 – μ20 *1,00 μ30 – μ70 *5,75 0,55
μ10 – μ30 *1,5 μ40 – μ50 *1,62 0,55
μ10 – μ40 *3,12 μ40 – μ60 *2,87 0,55
μ10 – μ50 *4,75 μ40 – μ70 *4,12 0,55
μ10 – μ60 *6,00 μ50 – μ60 *1,25 0,55
μ10 – μ70 *7,25 μ50 – μ70 *2,50 0,55
μ20 – μ30 0,50 μ60 – μ70 *1,25 0,55
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Se utilizó como solución estándar Clorhexidina al 0,12%, debido a que el Gluconato de clorhexidina se utiliza como activo en la elaboración de los enjuagues bucales contra el S.
55
mutans y como control alcohol al 70% donde no se observó sensibilidad descartando la
influencia de este en la actividad antibacteriana.
En el Gráfico 7 se evidencia que existe un aumento de 1,00mm en el halo de inhibición a
medida que disminuye el tamaño de partícula estabilizado con tween, al comparar estos
valores con la solución estándar, el S. mutans presenta sensibilidad a la solución S70 en
comparación con las soluciones S60-S30 que tiene un efecto menor y las soluciones S20-S5
no muestran una actividad considerable. Estos resultados se comparan con los estudios
realizados por Rueda et al, (2015), en donde se realizó un estudio comparativo de los
extractos de propóleo ecuatoriano vs el gluconato de clorhexidina contra el S. mutans y se
determinó que extractos acuosos al 50% y 30% presentan halos de inhibición de 8,53 y
11,0mm respectivamente.
% Alcohol solución coloidal
70 60 50 40 30 20 10 5 Clorxh.
Gráfico 7: Halos de inhibición según el tamaño de partícula de cada solución coloidal
Nota: el 0,12% corresponde a la concentración de clorhexidina.
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
4.7.2 Actividad antibacteriana por el Método Microdilución en placa.
Previamente a la evaluación de la actividad antibacteriana se realizó una prueba para
determinar la presencia de Mohos y Levaduras en los extractos etanólicos, tras la incubación
por 5 días no se observó crecimiento.
0
2
4
6
8
10
12
14
16 15 15
1314
1213
1011
810
89
78
78
15
Hal
o d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Tamaño de partícula nm
56
En la tabla 26 se muestran los resultados del porcentaje de inhibición obtenido mediante
la técnica de Microdilución en placa para el S. mutans.
Tabla 26. Porcentaje de Inhibición
% Alcohol Porcentaje de Inhibición
Sin tween Con tween
Repeticiones Media Repeticiones Media
R1 R2 R3 R1 R2 R3
S70 99,40 99,45 99,34 99,39 99,83 99,67 99,84 99,78
S60 98,01 98,12 98,04 98,06 99,50 99,39 99,42 99,44
S50 96,35 96,21 96,78 96,45 98,84 98,76 98,71 98,77
S40 78,97 78,45 78,74 78,72 85,87 85,80 85,75 85,81
S30 66,51 66,47 66,50 66,49 78,19 78,22 78,16 78,19
S20 49,05 49,01 49,08 49,05 61,89 61,80 61,76 61,82
S10 35,80 35,85 35,14 35,60 49,10 49,05 49,20 49,12
S5 20,38 20,24 20,15 20,26 37,50 37,70 37,85 37,68
Clorhexidina 0,12 99,84 99,81 99,84 99,83
Alcohol 70% No inhibe No inhibe No inhibe No inhibe
Nota: (Sin tween): equivale a las soluciones cuyas medias del tamaño de partícula varían entre 200-5000nm.
(Con tween): equivale a las soluciones cuyas medias del tamaño de partícula varían entre 100-1000nm.
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En la tabla 27 se muestra los resultados del análisis de varianza ANOVA que se realizó
con las mismas consideraciones del literal 4.7.1. Para los Factores: A, B e Interacción AB,
los valores-p de la prueba-F son menores que 0,05, estos factores tienen un efecto
estadísticamente significativo sobre el porcentaje de inhibición con un 95,0% de nivel de
confianza.
Tabla 27. ANOVA para porcentaje de inhibición
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
A:%Alcohol 31454,10 7 4493,44 181187,01 <0,00
B:% Tween 831,33 1 831,33 33521,55 <0,00
Interacción: AB 434,71 7 62,10 2504,13 <0,00
Error 0,79 32 0,02
Total 32720,90 47 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
57
En la tabla 28 se presenta el análisis de las medias mediante la prueba LSD de 28 pares
de medias que muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0%
de confianza.
Tabla 28. Pruebas LSD para Porcentaje de inhibición
Contraste Diferencia Contraste Diferencia Límites
μ5 - μ10 *13,39 μ20 – μ40 *26,83 0,18
μ5 – μ20 *26,46 μ20 – μ50 *42,17 0,18
μ5 – μ30 *43,37 μ20 – μ60 *43,31 0,18
μ5 – μ40 *53,29 μ20 – μ70 *44,15 0,18
μ5 – μ50 *68,63 μ30 – μ40 *9,92 0,18
μ5 – μ60 *69,77 μ30 – μ50 *25,26 0,18
μ5 – μ70 *70,61 μ30 – μ60 *26,40 0,18
μ10 – μ20 *13,07 μ30 – μ70 *27,24 0,18
μ10 – μ30 *29,98 μ40 – μ50 *15,34 0,18
μ10 – μ40 *39,90 μ40 – μ60 *16,48 0,18
μ10 – μ50 *55,25 μ40 – μ70 *17,32 0,18
μ10 – μ60 *56,39 μ50 – μ60 *1,13 0,18
μ10 – μ70 *57,23 μ50 – μ70 *1,98 0,18
μ20 – μ30 *16,91 μ60 – μ70 *0,84 0,18
Nota: (*) significativa
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
En el Gráfico 8 se evidencia un aumento en el porcentaje de inhibición del 0,4% al 46%,
tras la disminución del tamaño de partícula sin embargo estos valores no superan el valor del
estándar que es del 99,78%, debido a la influencia de otros factores como la concentración
de metabolitos secundarios (fenoles y flavonoides) compuestos que son responsables de la
actividad antibacteriana. Jayakumar et al. (2012) realizaron un estudio antibacteriano de
varias concentraciones de nanopartículas de propóleo a partir de 5g/ml a 100g/ml frente a E.
coli y S. aureus, demostrando que a medida que aumenta la concentración de las
nanopartículas, disminuye la supervivencia de ambas bacterias a las nanopartículas de
propóleo. Estos a su vez dependen de la polaridad de solvente, del método utilizado para su
extracción, del tipo de propóleo recolectado, de la vegetación disponible en el área donde se
encuentran ubicadas las colmenas.
En Tatli et al., (2018) se establece que el nanopropóleo puede entrar más fácilmente a
través de la membrana externa de las bacterias para que los compuestos antibacterianos
activos puedan dañar las paredes celulares de las bacterias, lo que facilita la difusión de los
58
fenoles y flavonoides a través de la pared celular y a su vez la acidificación intracelular, que
causa alteraciones irreversibles en la bomba de sodio-potasio ATPasa y la muerte celular.
Esto podría explicar aumento en la actividad de las soluciones S40, S30, S20, S10 y S5, que
tienen un aumento de la actividad del 8% al 46% y cuyos tamaños oscilan entre 581nm-
186,7nm respectivamente.
Por otro lado, para las soluciones S70, S60 y S50 que tienen un aumento de la actividad
mínimo del 0,4% al 2% y cuyos tamaños de partículas oscilan entre 1000nm-700nm
respectivamente, el aumento de la actividad puede ser atribuido a los errores propios de la
metodología aplicada para determinar la actividad antibacteriana, al contrario de las
soluciones S40-S5 que tienen un aumento mayor. A pesar que las soluciones S30-S5
presentan un aumento en la actividad antibacteriana del 8% al 46% al disminuir el tamaño
de partícula este aumento no logra superar el efecto de la solución de referencia por la baja
concentración de metabolitos secundarios presentes.
En Carelli et al., (2011) se menciona que se puede considerar a al método de pozos en
agar como un ensayo cualitativo debido a su limitación para compuestos con baja
difusibilidad en el medio de cultivo, como es el caso de soluciones o extractos de origen
vegetal ya que son una mezcla tanto de sustancias apolares como polares, por lo cual se
puede explicar las pequeñas diferencias entre ambos métodos.
Las soluciones con mayor actividad son S70-S60 con tamaños de partícula entre 1000nm-
900nm al contrario de las soluciones S50-S5 con tamaños que varían entre 700nm-200nm
cuya actividad es inferior comparada con el estándar. Asimismo, tienen altas
concentraciones de Fenoles totales entre 90,12-122,10 mgEAG/g de solución y Flavonoides
totales entre 33,53-48,53-mgEQ/g de solución.
59
% Alcohol solución coloidal
70 60 50 40 30 20 10 5 Clorxh.
Gráfico 8: Porcentaje de inhibición según el tamaño de partícula de cada solución coloidal
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0,12
186,7
264,9
313,5
405,8
421,9
562,6
581,7
853,4
660,9
922,4
734,8
1043,1
991,6
2404,3
1053
5035,6
99,83
37,68
20,26
49,12
35,6
61,82
49,05
78,19
66,49
85,81
78,72
98,77
96,45
99,44
98,06
99,78
99,39
% de Inhibición
Tam
año
nm
60
5. CAPITULO V
5.1 Conclusiones
Se determino que la concentración de Fenoles para las soluciones S5-S70 varía entre
1,70-121,64 mg EAG/g, y de Flavonoides varía entre 0,11-48,53mg EQ/g. Al
aumentar la polaridad de los solventes utilizados para la extracción del propóleo
disminuye la solubilidad y el porcentaje de rendimiento de la extracción. Es así que
los extractos con alcohol del 40-70% tienen un mayor porcentaje de rendimiento del
15,77-48,16% y una concentración de Fenoles entre 58,5-121,64 EAG/g y
Flavonoides entre 7,47-48,53 mg EQ/g. Las soluciones elaboradas con menor grado
alcohólico del 5-30% tienen un porcentaje de rendimiento del 1,90-8,63% con una
concentración de Fenoles entre 1,70-30,28 EAG/g y flavonoides entre 0,11-5,62 mg
EQ/g. El porcentaje de rendimiento de los extractos con alcohol del 70 al 30% están
dentro de las normas internacionales establecidas por Japón, Argentina y Brasil cuyas
normativas son la base para la Norma Ecuatoriana.
Al caracterizar las soluciones coloidales de propóleo por el DLS, se determinó que
las soluciones S5-S70 tienen un tamaño de partícula entre 265-5000nm. Al ser
tratadas con tween 80 el tamaño de partícula varía entre 185nm-1000nm y son
muestras moderadamente dispersas. El tween 80 actúa como agente estabilizante en
la elaboración de soluciones coloidales para evitar la floculación y fenómenos de
agregación de las partículas. El tween 80 no tiene efecto alguno sobre la actividad
antibacteriana ni en la concentración de metabolitos secundarios.
Al evaluar la actividad antibacteriana de las soluciones coloidales frente al S. mutans,
se determinó que el estándar de clorhexidina al 0,12% tienen un halo de inhibición
de 15mm y un porcentaje de inhibición del 99,83%. Las soluciones S60-S70 tienen
halos entre 14-15mm y porcentajes de inhibición entre 99,44-99,78% valores que son
comparables con el estándar por lo tanto se puede sugerir a estas soluciones como
una alternativa natural al uso de clorhexidina, mientras que las soluciones S5-S30
tienen halos entre 8-10mm y porcentajes de inhibición del 37,68-85,81% valores
inferiores a la solución de referencia.
61
Se determinó que la actividad antibacteriana frente al S. mutans dependen de la
cantidad de compuestos orgánicos presentes en el propóleo como fenoles, ésteres,
flavonoides y alcoholes aromáticos presentes en las resinas que se extraen en su
mayoría con solventes apolares. Por consiguiente, porcentaje de alcohol de las
soluciones coloidales interviene en la extracción de metabolitos secundarios y no en
la actividad de antibacteriana. No hay reportes de que el Etanol al 70% ejerza algún
tipo de actividad antibacteriana frente al S. mutans.
Ninguna de las soluciones elaboradas supera el efecto antibacteriano de la solución
de referencia, por lo cual se acepta la hipótesis nula. Como resultado el efecto
antibacteriano no solo está dado por su disminución en el tamaño de partícula sino
por la concentración de metabolitos secundarios presentes en la solución y el uso de
esta metodología para la elaboración de nanopartículas de propóleo no es
aconsejable.
5.2 Recomendaciones
Estudiar las propiedades fisicoquímicas de los propóleos recolectados en diferentes
áreas y regiones del Ecuador y determinar los compuestos que se encuentran en
mayor proporción.
Disminuir el tamaño de partícula de forma paulatina de las soluciones cuyos
metabolitos secundarios se encuentran en mayor concentración y evaluar la actividad
antibacteriana con varios tipos de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Analizar la formación de nanopropóleo utilizando varios agentes estabilizantes
cambiando el tipo de agitación y temperatura durante el proceso.
Evaluar el efecto de los tensoactivos y co-tensoactivos en el tamaño de partícula a
diferentes concentraciones.
Proponer nuevos métodos para la elaboración de nanopartículas de propóleo, en
donde permita disminuir el tamaño de partícula de forma homogénea y cuyo tamaño
sea menor o igual a 100nm.
62
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ANEXOS
Anexo 1. Árbol de problemas.
70
Anexo 2. Diagrama de flujo de la Fase I
INICIO
RECOLECCIÓN
ACONDICIONAMIENTO
MOLIENDA
CARACTERIZACIÓN
PESAR
MACERAR
FIN
Manual por raspado
Limpieza de partículas
extrañas
Molino de café Pérdida por
calentamiento
Cenizas
Impurezas
mecánicas
Índice de
oxidación
15g propóleo
molido
FILTRAR
Etanol del 70% al 5%
por 8 días
Porcentaje de
rendimiento
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
71
Anexo 3. Diagrama de flujo Fase II
INICIO
PREPARAR
SONICAR
FILTRAR
ANÁLISIS QUÍMICO
CARACTERIZACIÓN
ACTIVIDAD
ANTOBACTERIANA
FIN
Extractos
hidroalcóholicos
Extractos con/sin
Tween 80
Temperatura: 25ªC
Tiempo: 30min
Filtro: Membrana 0,2 µm Soluciones coloidales
EspectrofotometríaFenoles Totales
Flavonoides Totales
DLSTamaño de partícula
Polidispersión
Pozos en agar
Microdilución en
placa
Halos de inhibición
Porcentaje de
inhibición
Cepa S. mutans ATCC
25175
Estándar Clorexidina
0,12%
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
72
Anexo 4. Datos de estandarización del propóleo.
Tabla 29. Pérdida por calentamiento
No. Peso crisol
vacío (g)
Peso crisol +
muestra (g)
Peso crisol +
muestra seca (g)
% Pérdida por
calentamiento
1 18,2154 20,5674 20,4232 6,13
2 18,8765 19,9358 19,8717 6,05
3 15,9876 17,7657 17,6572 6,10
Media 6,09
Desviación 0,04 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Tabla 30. Cenizas
No. Peso crisol
vacío (g)
Peso crisol +
muestra (g)
Peso crisol + muestra
incinerada (g)
% Cenizas
1 15,9373 16,0111 16,0091 2,64
2 16,8252 17,3544 17,3408 2,56
3 15,0981 16,5002 16,4633 2,71
Media 2,63
Desviación 0,08 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Tabla 31. Impureza mecánicas
No. Peso muestra
(g)
Peso papel
filtro (g)
Peso papel filtro +
muestra seca (g)
% Impurezas
mecánicas
1 1,5677 0,8766 1,2619 24,58
2 1,5383 0,7861 1,1575 24,15
3 1,5439 0,7689 1,1508 24,74
Media 24,49
Desviación 0,31 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Tabla 32. Índice de oxidación
No. Tiempo (s)
1 20
2 18
3 18
Media 19
Desviación 1,15 Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
73
Anexo 5. Curvas de calibración
Gráfico 9: Curva de calibración de Fenoles Totales
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Gráfico 10: Curva de calibración de Flavonoides Totales
Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
y = 0,0778x + 0,0449R² = 0,9917
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14
Ab
sorb
an
cia
Concentración mg/L
Curva de calibración Fenoles totales
y = 0,0748x - 0,0208R² = 0,9978
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10 12
Ab
sorb
an
cia
Concentración mg/mL
Curva de calibración flavonoides totales
74
Anexo 6. Recolección del propóleo
Recolección del propóleo por raspado
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Anexo 7. Preparación de los extractos a diferentes concentraciones.
Muestra de propóleo Pesado del propóleo Maceración del propóleo
Filtración de los extractos Extractos hidroalcóholicos obtenidos
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
75
Anexo 8. Preparación de soluciones coloidales
Soluciones con y sin Tween 80 Sonicación por 30min a 25 ºC
Soluciones coloidales con Tween 80 Soluciones coloidales sin Tween 80
Caracterización de las soluciones coloidales en DLS
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
76
Anexo 9. Determinación de fenoles y flavonoides
Soluciones coloidales analizadas Curva de calibración fenoles totales
Soluciones coloidales analizadas Curva de calibración flavonoides
Lectura de absorbancias de la curva de calibración y muestras
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
77
Anexo 10. Determinación de la actividad antibacteriana
Determinación de Mohos y levaduras en las
soluciones coloidales
Cepa ATCC 25175
Cepa ATCC 25175 activada y preparación de
la escala MacFarland
Elaboración de pozos en agar y siembra
de las muestras
Incubación de las Cajas Petri a 37ºC
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
78
Anexo 11. Halos de inhibición
EtOH Soluciones coloidales sin tween
70% S70 S60 S50 S40 S30 S20 S10 S5
Clorhx Soluciones coloidales con tween
0,12% S70 S60 S50 S40 S30 S20 S10 S5
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
Anexo 12. Técnica Microdilución en placa
Preparación del inóculo a 0,5 McFarland
Siembra de las muestras
Incubación de las placas a 37ºC Lectura de las placas
Nota: Elaborado por Andrea Pillajo (2019)
79
Anexo 13. Técnica de Pozos en Agar.
80
81
Anexo 14. Certificado de análisis del estándar de Quercetina