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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DEL TABACO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

POR

M.C. MAGDALENA ESCOBAR SAUCEDO

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN QUÍMICA BIOMÉDICA

SEPTIEMBRE, 2017

III

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA

DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DEL TABACO EN MUESTRAS

BIOLÓGICAS.

Presentado por:

M.C. MAGDALENA ESCOBAR SAUCEDO

Este trabajo se realizó en el Departamento de Química Analítica de la Facultad

de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León, bajo la asesoría de la

Dra. Noemí H. Waksman Minsky y la coasesoría del Dr. Q. Juan Ricardo Lucio

Gutiérrez.

FIRMAS

IV

The important thing is not to stop questioning.

Curiosity has its own reason for existing.

Albert Einstein

V

Dedico este trabajo a mi esposo Joaquín Pérez

Villarreal, por que sin su apoyo, cariño y ánimos

durante todo el trayecto, esto no hubiese sido

posible.

VI

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por permitirme vivir cada uno de los momentos que hasta hoy he

atesorado, por las pruebas que pone en mi camino y porque sé que de su mano

nunca me ha soltado.

A mi esposo, gracias Joaquín por ser un pilar en mi vida, por exhortarme a seguir

adelante, por apoyar mis locuras y aguantar mis malos ratos. La vida me ha dado

a un hombre perfecto, gracias por compartir mi sueño y sobre todo por ser el

combustible en mis días de lucha y ser mi descanso en mis días de dudas. Gracias

por que tanto tu como Aquiles me hacen sentir muy especial y me hacen querer

regresar a casa para cargar pilas para continuar siempre adelante.

A mis padres, porque desde pequeña me enseñaron a luchar por mis sueños, porque

siempre me brindan su apoyo, aunque a veces no entiendan lo que hago. Gracias

papá y mamá por confiar en mí, por creer y sobre todo por todo aquello que

sacrificaron para que ahora sea quien soy.

A mi hermana Brenda, que desde pequeña fuiste mi meta a alcanzar, que cuando

perdía el rumbo volteaba a verte y así orientarme, se que somos diferentes y a la

vez tan iguales, gracias por apoyarme y estar siempre pendiente de tu pequeña

hermana.

A mi hermana Mayela, tu apoyo hasta el día de hoy ha sido muy importante para

mi, se que nos gustan cosas diferentes, que nos comportamos distinto, pero en el

fondo nos parecemos tanto. Gracias por tus palabras de aliento, por ver lo que a

mi se me dificultaba ver de mi, gracias por enseñarme y dejarme enseñarte a ti.

VII

A mi familia adoptiva, Don Arturo García, Doña Juany Mata,

Irene y Diana García Mata, el cuñis Jorge Luna y la pequeña Alejandra Luna

García, por acogerme en su casa como un miembro más de su familia, por gozar

con mis logros y acompañarme en los días malos.

A mi familia política, Don Joaquín, Omar, María, Lola, Claudia, Fermanda,

Gerardo, Alejandra y Daniela, por su apoyo en estos años tanto moral como en el

desarrollo de esta tesis, ya que casi desde que entré a esta familia me han visto

inmersa en este proyecto.

A la Dra. Noemí Waksman por confiar en mi, por alentarme a no rendirme y

sobre todo porque en este viaje descubrí que los límites solo existen mi mente y que

estos se pueden romper si estamos realmente dispuestos a seguir adelante.

A la Dra. Ma. de la Luz Salazar, por su paciencia y por esa forma tan particular

de enseñar, gracias por estar siempre presente y dispuesta a despejar mis dudas y

sobre todo, por que me ha enseñado a ser firme pero amable en el trato con los

alumnos.

Al Dr. Ricardo Lucio, por empezar este proyecto juntos, darme la oportunidad de

crecer en forma profesional, por despejar mis dudas y sobre todo a buscar el lado

bueno de las cosas.

A la Dra. Rocío Castro por su consejo y amistad durante ya más de 14 años, por

todo lo que me ha enseñado, por su ejemplo y por brindarme ese recurso no

renovable llamado tiempo. Muchas gracias por todo.

VIII

Al Dr. Augusto Rojas por confiar en mi, por apoyarme, por su manera tan rápida

de analizar las cosas y siempre alentarme.

A Jonathan P. Meseguer, David Silva, Graciela Granados, Alejandra Fraga,

Samantha Armijo, Cecilia Delgado, Omar Portillo, Juan Tamez, Héctor Salas por

ser mi familia en el día a día, dentro y fuera del departamento, por las risas, los

consejos, los regaños, las lágrimas y las palabras de aliento. Gracias por hacer más

divertido este trayecto.

A todo el departamento de Química Analítica, gracias por esas explicaciones, las

palabras de aliento, el oído presto a escuchar, las palmadas en la espalda, los

abrazos y las nuevas perspectivas que me brindan cada vez que los necesito.

A quienes, sin saberlo ni imaginarlo, aportaron su granito de arena para que esta

meta haya llegado a su término. Gracias a mis alumnos por sus palabras de

aliento, a esos alumnos que después se convirtieron en compañeros del posgrado,

es un honor verlos crecer y ser testigo de todo lo que han logrado.

IX

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL ............................................................................................. IX

ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... XIII

ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................ XVI

LISTA DE ABREVIACIONES ......................................................................... XVIII

RESUMEN ....................................................................................................... XXI

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN. ............................................................................................... 1

1.1. Historia del consumo del tabaco. ............................................. 1

1.2 Tabaquismo. ............................................................................. 3

1.3 Tabaco y su implicación en la salud. ....................................... 4

1.4 Situación en México. ................................................................. 6

1.5 Marcadores biológicos. ............................................................ 7

1.5.2 Características ideales de los marcadores biológicos del tabaco y las variables que influyen en su concentración. . 9

1.5.3 Nitrosaminas específicas del tabaco. ............................. 11

1.6 Determinación del carcinógeno 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1- butanol (NNAL). ...................................................... 13

1.6.1 Técnicas cromatográficas. ............................................. 14

1.6.2 Preparación de muestras. ............................................. 23

1.7 Justificación. ........................................................................... 35

1.8 Objetivo general. ..................................................................... 36

1.9 Objetivos específicos. ............................................................. 36

X

CAPÍTULO 2

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 37

2.1 Material, equipos y reactivos. ................................................. 37

2.1.1 Material. .......................................................................... 38

2.1.2 Equipos. ........................................................................ 40

2.1.3 Reactivos. ...................................................................... 41

2.2 Preparación de soluciones. .................................................... 42

2.2.1. Preparación de soluciones madres. .............................. 42

2.2.2 Preparación de soluciones estándares para optimización del programa de temperaturas del GC-MS. .................... 43

2.2.3 Preparación de soluciones para evaluar la sensibilidad. 44

2.2.4 Preparación de soluciones para la validación del sistema cromatográfico. ............................................................... 45

2.2.5 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción en fase sólida con cartuchos molecularmente impresos. ......................................................................... 45

2.2.6 Preparación de soluciones para la optimización de la microextracción en fase sólida. ....................................... 46

2.2.7 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción en fase sólida con cartuchos tC18. ................ 47

2.2.8 Preparación de soluciones para la comparación de los métodos desarrollados. ................................................... 49

2.2.9 Preparación de soluciones para la validación del método desarrollado. ................................................................... 49

2.3 Cromatografía de Gases-Masas (GC-MS) .............................. 50

2.3.1 Establecimiento de las condiciones de separación cromatográfica y selección de columna. ......................... 50

2.3.2 Confirmación de la identidad de los analitos. ................ 56

2.3.3 Establecimiento de los parámetros de adquisición de datos. .............................................................................. 57

2.3.4 Validación del sistema cromatográfico. ......................... 58

2.4 Métodos de preparación de muestras..................................... 60

2.4.1 Extracción con polímeros molecularmente impresos. .... 60

XI

2.4.2 Microextracción en fase sólida (SPME) .......................... 62

2.4.3 Extracción con cartuchos tC18 ....................................... 69

2.4.5 Selección del método de preparación de muestra. ....... 72

2.4.6 Validación del método de preparación de muestra seleccionado. .................................................................. 73

2.4.7 Aplicación del método .................................................... 74

CAPÍTULO 3

RESULTADOS .................................................................................................. 75

3.1 Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS) .............................................................................................. 75

3.1.2 Optimización de las condiciones de separación cromatográfica y selección de columna. ......................... 79

3.1.3 Establecimiento de los parámetros de adquisición de datos. .............................................................................. 86

3.1.4 Selección de Columna Cromatográfica. ........................ 90

3.1.5 Validación del sistema cromatográfico. ......................... 97

3.2 Preparación de Muestras ...................................................... 101

3.2.1 Extracción con Polímeros Molecularmente Impresos. .. 102

3.2.2 Microextracción en fase sólida (SPME). ....................... 104

3.2.3 Extracción en fase sólida con cartuchos tC18. ............ 112

3.3 Selección del método de extracción para la preparación de Muestras .............................................................................. 118

3.4 Validación del método SPE-MIP para la determinación de NNAL ................................................................................... 119

3.5 Aplicación del método SPE-MIP para la determinación de NNAL en muestras de orina ................................................ 120

CAPÍTULO 4

DISCUSIÓN .................................................................................................... 124

4.1 Cromatografía de Gases-Masas (GC-MS) ........................... 124

4.1.1 Establecimiento de las condiciones de separación cromatográfica. ............................................................. 125

4.1.2 Validación del sistema cromatográfico. ........................ 130

4.2 Métodos de Preparación de Muestra. ................................... 132

XII

4.2.1 SPE-MIP. ...................................................................... 133

4.2.2 SPME ........................................................................... 134

4.2.3 SPE-tC18 ..................................................................... 139

4.3 Selección del método de preparación de muestra. ............... 143

4.4 Validación del método SPE-MIP. .......................................... 144

4.5 Aplicación del método de SPE-MIP. ..................................... 146

CAPÍTULO 5

CONCLUSIONES ........................................................................................... 147

PERSPECTIVAS ............................................................................................ 149

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 150

XIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Distribución de las 8 principales causas de defunción

en el mundo. ........................................................................................ 4

Figura 2 Esquema de la formación de diversas TSNAs ................................... 12

Figura 3 Imagen donde se ejemplifica como calcular la simetría de

un pico cromatográfico. ...................................................................... 55

Figura 4 Montaje del Dispositivo de Extracción por HS-SPME. ....................... 64

Figura 5 Espectro de masas de una solución estándar de NNAL de

25 µg mL-1 obtenido con el programa inicial de temperatura

para la columna HP-5MS. .................................................................. 77

Figura 6 Espectro de masas de una solución estándar de iso-NNAL d3

de 25 µg mL-1 obtenido con el programa inicial de temperatura

para la columna HP-5MS. .................................................................. 78

Figura 7 Desarrollo del programa de temperatura para la columna

HP-5MS. Programa inicial. ................................................................. 80


HP-5MS. Programa final. ................................................................... 81


DB-17. Programa inicial. .................................................................... 82


DB-17. Programa final. ...................................................................... 83

XIV


DB-1701. Programa inicial. ............................................................... 84


DB-1701. Programa final. .................................................................. 85

Figura 13 Cromatograma obtenido con programa final de temperatura

para la columna HP-5MS, adquisición de datos SIM. ...................... 87


para la columna DB-17, adquisición de datos SIM. .......................... 88


para la columna DB-1701, adquisición de datos SIM. ...................... 89

Figura 16 Cromatograma de extracto de orina adicionada a 15 ng mL-1

obtenido con la columna DB-1701 ................................................... 94

Figura 17 Cromatograma de extracto de orina adicionada a 15 ng mL-1

obtenido con la columna DB-17. ...................................................... 95

Figura 18 Curva de calibración de NNAL con regresión lineal. ......................... 97

Figura 19 Curva de calibración con regresión polinomial de

segundo grado. ................................................................................ 98

Figura 20 Gráfica para el análisis de correlación entre las concentraciones

para evaluar exactitud. ................................................................... 100

Figura 21 Cromatograma de una muestra de orina adicionada con

0.1 µg mL-1 del NNAL y del estándar interno obtenido con

el método SPE-MIP descrito en la tabla 21. ................................... 104

Figura 22 Selcción de la fibra de SPME más adecuada. ............................... 105

Figura 23 Gráfica de coeficientes de las variables investigadas en la

optimización de la extración.. ........................................................... 110


4 µg mL-1 del NNAL y 1 µg mL-1 del estándar interno obtenido

con el método HS-SPME descrito en la tabla 24. ............................ 111

Figura 25 Gráfica de coeficientes de las variables investigadas en la

optimización de la extración por SPE tC18. ..................................... 114

XV


0.1 µg mL-1 del NNAL y del estándar interno obtenido con

el método SPE-MIP descrito en la tabla 29. ................................... 118

Figura 27 Cromatograma de mestra de orina de fumador extraída con

el método de SPE-MIP. .................................................................. 121

Figura 28 Cromatograma de muestra de orina de no fumador adicionada

a 2 ng mL-1 extraída con el método de SPE-MIP. .......................... 122

XVI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Compilación de los estudios que analizan NNAL y NNAL-Glu. ............ 17

Tabla 2 Características de las columnas cromatográficas de interés

para este trabajo. ............................................................................... 51

Tabla 3 Condiciones iniciales para la columna HP-5MS ................................... 52

Tabla 4 Condiciones iniciales para la columna DB-17. ..................................... 53

Tabla 5 Condiciones iniciales para la columna DB-1701 .................................. 53

Tabla 6 Condiciones de la SPE-MIP. ................................................................ 61

Tabla 7 Condiciones de análisis por GC-MS. ................................................... 63

Tabla 8 Condiciones de trabajo empleadas para la selección de fibra

de SPME. ........................................................................................... 65

Tabla 9 Experimentos propuestos para la optimización del proceso de

extracción de acuerdo al diseño de Plackett - Burman. ..................... 67

Tabla 10 Experimentos iniciales para la optimización del proceso de

desorción............................................................................................ 68

Tabla 11 Experimentos propuestos para la optimización del proceso de

extracción SPC-tC18 de acuerdo al diseño de Plackett -Burman. ..... 70

Tabla 12 Ventanas de monitoreo para el modo SIM ......................................... 86

Tabla 13 Resoluciones de los picos cromatográficos con las diferentes

columnas. ........................................................................................... 90

XVII

Tabla 14 Factores de asimetría del iso-NNAL-d3 y el NNAL con cada

columna cromatográfica. .................................................................... 91

Tabla 15 Factor de asimetría para cada columna cromatográfica en

cromatogramas obtenidos por SIM. ................................................... 92

Tabla 16 Resultados de sensibilidad obtenidos (n=2). ..................................... 93

Tabla 17 Condiciones cromatográficas para el análisis por GC-MS con la

columna DB 17 y DB-17 MS. ............................................................. 96

Tabla 18 Precisión intradía (n=3). ..................................................................... 99

Tabla 19 Valores de error absoluto y % de error relativo para la evaluación

de la exactitud del método cromatográfico (n=3). ............................ 100

Tabla 20 Áreas obtenidas en el perfil de elución (n=2). .................................. 103

Tabla 21 Condiciones del método de SPE-MIP final. ..................................... 103

Tabla 22 Diseño Simplex Secuencial Básico para la optimización de la

desorción térmica de la fibra DVB-PDMS. ....................................... 107

Tabla 23 Respuesta obtenidas de los experimentos del diseño factorial

fraccionado para la optimización de la extracción de la SPME. ....... 108

Tabla 24 Condiciones óptimas para el método de HS-SPME del NNAL. ....... 111

Tabla 25 Respuesta obtenidas de los experimentos del diseño factorial

fraccionado para la optimización de la extracción de la SPE tC18. . 113

Tabla 26 Condiciones óptimas para el método de SPE tC18 del NNAL. ........ 115

Tabla 27 Comparación de áreas de NNAL con solución de lavado de

diferente composición. ..................................................................... 115

Tabla 28 Áreas obtenidas en el perfil de elución de SPE tC18 (n=2). ............ 117

Tabla 29 Condiciones finales para el método de SPE tC18 del NNAL. .......... 117

Tabla 30 Comparación de los métodos desarrollados (n=3). .......................... 119

Tabla 31 Datos obtenidos de la validación del método SPE-MIP

desarrollado. .................................................................................... 120

Tabla 32 Resultados del análisis de muestras de orina de fumador y

no fumador adicionadas (n=2). ........................................................ 123

XVIII

LISTA DE ABREVIACIONES

OMS Organización Mundial de la Salud

HTA Humo del tabaco ambiental

TSNA Nitrosaminas específicas del tabaco

IARC Agencia Internacional para la Investigación de Cáncer

NNK Nitrosamina cetona derivada de la nicotina

NNA Nitrosamina aldehído derivada de la nicotina

iso-NNAL Iso- nitrosamina alcohol derivada de la nicotina

NNAL Nitrosamina alcohol derivada de la nicotina

NAB Nitrosamina de anabasina

NAT Nitrosamina de anatabina

NNN Nitrosamina de nornicotina

NNAL-Glu Conjugado de nitrosamina alcohol derivada de la nicotina

GC-TEA Cromatografía de gases con analizador de energía térmica

GC-MSD Cromatografía de gases con detector de masas selectivas

XIX

GC-MS/MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem

HPLC-MS/MS Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem

µg Microgramo

ng Nanogramo

pg Picogramo

mL Mililitro

h Hora

LLE Extracción líquido-líquido

KD Constante de partición

µm Micrómetro

SPE Extracción en fase sólida

SPME Microextracción en fase sólida

DLLME Microextracción líquido líquido dispersiva

MIP Polímeros molecularmente impresos

C18 Octadecilsilano

C8 Octilsilano

MCX Intercambiador catiónico fuerte

HS Headspace, espacio de cabeza

GC/LRMS Cromatografía de gases/espectrometría de masas de baja resolución

PDMS Polidimetilsiloxano

DVB Divinilbenceno

PA Poliacrilato

CAR Carboxeno

XX

DER Desviación estándar relativa

R2 Coeficiente de determinación

°C Grados Celsius

rpm Revoluciones por minuto

FDA Food and Drug Administration,Administración de Alimentos y Fármacos

EPA Agencia de Protección Ambiental

iso-NNAL-d3 Isómero de la nitrosamina alcohol derivada de la nicotina deuterada

tR Tiempo de retención

w Ancho de pico

XXI

RESUMEN

M.C. Magdalena Escobar Saucedo. Fecha de graduación: Septiembre, 2017. Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Medicina. Título del estudio: DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DEL TABACO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS. Número de páginas: 162 Candidato para el grado de Doctor en Ciencias

con especialidad en Química Biomédica. Área de estudio: Química Analítica Propósito y Método de Estudio:

Los problemas relacionados al consumo de tabaco tienen un gran impacto en la salud de la población mundial, por lo que la búsqueda de marcadores adecuados para la determinación de factores de riesgos es un tópico de interés actual. El NNAL y sus conjugados han sido utilizados como marcadores del riesgo de sufrir afecciones pulmonares por el consumo del tabaco; sin embargo su determinación puede ser compleja ya que se requiere de métodos laboriosos de preparación de muestra además de equipos con detectores específicos y de alta resolución. El presente trabajo planteó el desarrollo y validación de un método analítico para la determinación del NNAL. Se estudió el comportamiento de técnicas como SPE con distintas fases adsorbentes, así como la SPME en su modalidad de headspace y el uso de cromatografía de gases-espectrometría de masas de baja resolución. Para la optimización de los métodos de extracción se empleó diseños de experimentos, tanto factorial fraccionado para determinar las variables de mayor influencia en el desempeño de cada una de las técnicas de preparación de muestras, así como el diseño simplex para optimizar las variables de mayor influencia. La selección del método se basó en el % de recuperación, la DER y la comparación de costos de los métodos. De los tres métodos de preparación de muestra desarrollados, el método HS-SPME tuvo baja sensibilidad, el método de SPE-tC18 que tuvo una recuperación de 130.3 % y un % DER del 10 % y finalmente el método SPE-MIP presentó una recuperación del 120 % con un 8.3 % de DER. Se seleccionó el método de SPE-MIP para preparación de muestras el cual presentó un comportamineto cuadrático, una precisión entre el 1.3 y el 8 % DER, una exactitud menor al 12 % y límite de detección de 0.7 ng mL-1 y un límite de cuantificación de 2 ng ml-1. No fue posible determinar NNAL en muestras de orina de fumadores. Contribuciones y Conclusiones:

Se desarrollaron y optimizaron tres métodos de preparación de muestra para el análisis de NNAL en muestras de orina. El trabajo desarrollado aplicó por primera vez la SPME en modalidad HS al análisis de NNAL en muestras de orina. No fue posible detectar el NNAL en muestras de orina de fumadores cuando se empleó el SPE-MIP para la preparación de las muestras.

1

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN.

1.1. Historia del consumo del tabaco.

El tabaco es una planta de la familia de las solanáceas, originaria de

América, donde su cultivo y uso se extendió durante siglos. El alcaloide

principal contenido en las hojas del tabaco es la nicotina, cuya proporción en las

hojas es muy variable según las clases de tabaco, por ejemplo el tabaco

empleado para fumar suele contener un 3% de nicotina.

Nicotiana tabacum, la especie utilizada por los nativos en América

Central y Sudamérica, no se encuentra de forma silvestre, sino sólo como

2

planta cultivada;1 se caracteriza por ser una planta perenne, de hojas grandes y

perfectamente aisladas, con abundante vena y semillas extremadamente

pequeñas y numerosas.2 Los análisis genéticos han mostrado que es un híbrido

resultante del cruce de dos especies salvajes, Nicotiana sylvestris y Nicotiana

tomentosiformis. La planta Nicotiana rustica, especie cultivada en Norteamérica,

posee un mayor contenido en nicotina que la N. tabacum.

En América, el tabaco formó parte de las costumbres de la sociedad

prehispánica, ya que el consumo de la hoja, estuvo ligado a prácticas rituales,

sociales, culturales y así como también con fines curativos.2, 3

Después del descubrimiento de América, el tabaco se introdujo en

Europa, donde se difundió rápidamente por este continente y en Rusia, y llegó a

China, Japón y la costa occidental de África en el siglo XVII, debido a que se

creía que el tabaco era útil para curar eccemas, cefaleas, ceguera, dolor de

muelas, tos e incluso asma crónico.3

En el siglo XVIII, el incremento de la demanda del tabaco por

consumidores europeos, asiáticos, africanos y del medio Oriente, convirtió a la

industria tabacalera en una actividad económica muy redituable, convirtiendo al

tabaco en un fenómeno de gran importancia para la economía mundial.2, 3

3

1.2 Tabaquismo.

El tabaquismo se considera un trastorno que implica un consumo

perjudicial de tabaco, lo que conduce a problemas físicos o psicológicos,

síndrome de dependencia y síndrome de abstinencia. La Organización Mundial

de la Salud informó que cualquier cantidad consumida de tabaco puede tener

efectos secundarios peligrosos.4

El tabaco es el único producto de consumo legal que puede dañar a

todos los que se exponen a él y causar la muerte hasta 15 años antes de la

esperanza de vida, en promedio, de alrededor del 50 % de las personas que lo

utilizan voluntariamente. La Organización Mundial de la Salud, reportó en el

2008 que las muertes debidas al tabaco superaron los cinco millones de

personas y de continuar con la misma tendencia, esta cifra aumentaría a más

de ocho millones de defunciones para el año 2030.5 En la figura 1 se muestra la

distribución de defunciones del año 2008, en la cual se puede observar que el

tabaquismo es factor de predisposición a sufrir afecciones cardiacas,

enfermedades cerebro-vasculares, enfermedad pulmonar entre otras.

4

Figura 1 Distribución de las 8 principales causas de defunción en el mundo.5

1.3 Tabaco y su implicación en la salud.

Durante el siglo XVI empezó a considerarse al tabaco como una droga, lo

que llevó a tomar medidas al respecto. En el año 1600 en China, el filósofo

Fang, afirmó que fumar tabaco producía quemaduras en los pulmones. Así

mismo, en el año 1620 el uso del tabaco se prohibió en Japón.3

En 1881 García Ramón, en su libro ―El arte de fumar, tabacología

universal‖ hace mención de que se tenía en cuenta el daño del tabaco, pero

solo en los siguientes casos: ―Ya lo hemos dicho, y volvemos a repetirlo: el

5

tabaco es peligroso cuando se abusa de él ó bien por una predisposición

individual. Existe empero un caso en que su acción nociva es positiva e

incontestable, y es durante la infancia y primera juventud. De los diez a los

quince años, debe el hombre abstenerse del tabaco, pues en este periodo de la

vida ejerce una influencia perjudicial en los órganos cerebrales‖.6

Fue hasta el año de 1929 cuando Fritz Lickint publicó evidencia

estadística que relaciona el cáncer pulmón y el tabaco; y en 1939 se presenta el

primer estudio epidemiológico elaborado a nivel mundial al respecto.3

En 1956, la OMS declaró que el tabaco es la principal causa previsible o

evitable de muerte precoz. Actualmente se relaciona al consumo de tabaco con

más de 25 enfermedades y es el principal factor causante de cáncer de pulmón,

esófago, laringe, boca, garganta, riñón, vejiga, páncreas, estómago y cérvix, así

como de leucemia mieloide aguda.7 Es importante remarcar que las personas

no fumadoras expuestas al humo de cigarro, fumadores pasivos o involuntarios,

presentan efectos adversos en la salud más allá de sólo irritación en la

conjuntiva ocular y tracto respiratorio superior. Se ha reportado que los niños

expuestos al humo de segunda mano tienen un aumento del riesgo de

síndrome de muerte súbita del lactante, infecciones respiratorias agudas y

asma más grave, entre otras enfermedades. En el caso de los adultos no

fumadores pueden desarrollar cáncer de pulmón, así como efectos inmediatos

6

en el sistema cardiovascular, que incluyen: hipertensión, arteriopatía coronaria,

accidente cerebro-vascular e insuficiencia cardiaca congestiva.8

1.4 Situación en México.

En México durante el año 2010, según el reporte de Guerrero-López et

al., fallecieron alrededor de 60 mil personas, es decir 165 muertes por día, a

causas atribuibles al tabaco.9 Según la Encuesta Nacional de Adicciones 2011,

en nuestro país hay 17.3 millones de fumadores, lo que representa un 21.7 %

de prevalencia del consumo activo de tabaco, siendo en promedio de 7

cigarrillos por día. En ese mismo año, se reportó una prevalencia de exposición

al humo de tabaco ambiental (HTA) de 30.2 %, lo que se traduce a 12.5

millones de mexicanos, que nunca han fumado, están expuestos al HTA.10

El 25 % de las muertes debidas al consumo de tabaco se producen en

las edades medias de la vida, lo cual ocasiona pérdidas de productividad laboral

y elevados costos para el sector salud.5, 10

7

1.5 Marcadores biológicos.

La mayor parte de los daños que causa el tabaco en la salud se ponen

de manifiesto hasta varios años después del inicio del consumo; debido a lo

cual, las investigaciones se han centrado en la búsqueda de marcadores

biológicos de exposición al tabaco para poder estudiar y/o predecir efectos a la

salud de los individuos fumadores así como no fumadores expuestos al HTA.

8

1.5.1 Definición e importancia de los marcadores biológicos.

Los marcadores biológicos, también llamados biomarcadores, son

cualquier cambio medible, ya sea químico, fisiológico o morfológico, que refleja

una interacción entre un sistema biológico y un peligro potencial; por ejemplo, el

nivel de colinesterasa en sangre disminuye por la exposición a plaguicidas

organofosforados. La respuesta medida puede ser funcional y fisiológica,

bioquímica, a nivel celular o interacciones moleculares.11 Los marcadores

biológicos pueden clasificarse en tres grupos12:

a) Biomarcadores de exposición: permiten la medición de la dosis interna de

un compuesto tóxico o de sus metabolitos en fluidos del cuerpo o

productos de excreción, mediante un análisis químico.

b) Biomarcadores de susceptibilidad: sirven como indicadores de una

sensibilidad particular de los individuos para el(los) efecto(s) de un

xenobiótico o de un grupo de tales compuestos.

c) Biomarcadores de efecto: también llamados de respuesta, son indicativos

de cambios bioquímicos dentro de un organismo como resultado de la

exposición a xenobióticos.

9

La importancia de la búsqueda de biomarcadores del tabaco se debe a

que permiten conocer la prevalencia del consumo, estudiar el impacto de los

nuevos tratamientos, verificar la exposición al humo de primera o segunda

mano, así como para constatar si un tratamiento se cumple correctamente.13

1.5.2 Características ideales de los marcadores biológicos del tabaco y las

variables que influyen en su concentración.

Dentro de los candidatos a ser biomarcadores del tabaco, se encuentran

el monóxido de carbono en el aire espirado o productos de la combustión del

tabaco, como la nicotina, cotinina, tiocianatos, anabasina, entre otros, cuya

determinación se puede realizar en líquidos biológicos o en aire ambiental.

Las características ideales que debería cumplir un candidato para ser

biomarcador son13:

1. Ser específico, es decir que el humo de tabaco sea su única fuente de

producción.

10

2. Presentar aumento proporcional entre la concentración y el consumodel

tabaco.

3. Ser cuantificable de manera sencilla, económica y sensible, empleando

técnicas habituales.

4. Presentar correlación entre su concentración y la de otros compuestos

del humo del tabaco.

5. Que exista una emisión similar del marcador por las distintas marcas de

tabaco.

Aunque es deseable que los biomarcadores del tabaco presenten todas

las características anteriores, es difícil conseguir una molécula que cumpla con

todas las condiciones, por lo que las investigaciones se han centrado en la

búsqueda y validación del uso de compuestos relacionados con el tabaco que

presentan varias de las características mencionadas anteriormente.

La concentración en que se pueden encontrar los biomarcadores en los

fumadores son influenciadas por factores como: el número de cigarrillos por día,

el número de años de consumo, el nivel de monóxido de carbono en aire

espirado (como medida indirecta de la profundidad de la inhalación de la

calada) y las características idiosincráticas de cada fumador, es decir el número

de bocanadas de aire inspirado por cigarrillo, el tiempo de retención de la

inhalación, entre otras.

11

1.5.3 Nitrosaminas específicas del tabaco.

Las nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA, por sus siglas en inglés)

se generan durante la fermentación, el curado y el añejamiento de la hoja de

tabaco; estas moléculas son buenas candidatas para ser biomarcadores del

consumo de tabaco, ya que sólo se encuentran en los productos derivados de

este.14, 15 Las TSNA son altamente cancerígenas y están clasificadas en los

grupos 1 y 3 de la Agencia Internacional para la investigación de Cáncer

(IARC).16 La formación de estos compuestos se lleva a cabo por la nitrosación

aminas terciarias como la nicotina, previa hidrólisis, o de aminas secundarias

como: nornicotina, anabasina, anatabina, presentes en el tabaco, produciendo

diferentes nitrosaminas, las cuales contienen en su estructura el grupo funcional

nitroso unido al nitrógeno de la amina; en la Figura 2 se muestran las

principales TSNA y su posterior metabolismo.15, 16

12

Figura 2 Esquema de la formación de diversas TSNAs.17

La 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona, llamada también NNK, es

la principal nitrosamina derivada de la nicotina. La NNK es un procarcinógeno

que para ejercer efecto tumorigénico requiere activación metabólica, la cual

puede ser por tres rutas principales: reducción del grupo carbonilo, N-oxidación

y la α-hidroxilación del anillo de piridina.18 El producto de la reducción del grupo

carbonilo es el 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol, también conocido

como nitrosamina alcohol derivada de la nicotina (NNAL). El NNAL presenta

niveles séricos muy bajos, ya que es un sustrato de la enzima

glucuronosiltransferasa que lo transforma en conjugados del ácido glucorónico

(NNAL-Glu), los cuales pueden formarse tanto en el grupo carbinol, para formar

NNAL-O-Glu, como en el nitrógeno del anillo de piridina resultando

NNN NAB NAT

13

NNAL-N-Glu, ver estructuras en la Figura 2, siendo depurados rápidamente por

el organismo mediante excreción por la orina.18-20

1.6 Determinación del carcinógeno 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1- butanol (NNAL).

Para la determinación de NNAL en orina se han reportado diferentes

métodos, los cuales involucran etapas de extracción, limpieza del extracto y

análisis cromatográfico. En general, los métodos involucran el empleo de

instrumental especializado de elevados costos.

14

1.6.1 Técnicas cromatográficas.

La tabla 1 presenta la evolución de los métodos analíticos en la

determinación del NNAL; donde se puede observar que las técnicas

cromatográficas empleadas para su análisis son: cromatografía de gases con

analizador de energía térmica (GC-TEA), cromatografía de gases con detector

de masas selectivas (GC-MSD), cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) y la cromatografía de

líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem

(HPLC-MS/MS).

Cada una de estas técnicas presenta ventajas y limitaciones. La GC-TEA

posee un detector altamente sensible para compuestos que poseen en su

estructura grupos nitro (-NO2) y/o nitroso (-NO).21 Las desventajas que presenta

esta técnica son: la gran cantidad de volumen de muestra requerida y que los

procesos de preparación de muestras son muy laboriosos y costosos;22 la

mayoría de los laboratorios no podría justificar el uso de un detector tan

especializado debido a que no tienen una aplicación regular y frecuente,

además de que el detector no puede distinguir la coelución de compuestos

nitrosos.23 Al utilizar esta técnica cromatográfica con las primeras técnicas de

preparación de muestras, se podía detectar de 0.23–1.00 μg de NNAL y de

15

0.57–6.50 μg de NNAL-Glu por orina de 24 horas24 y en los últimos reportes

utilizando esta técnica se detectaron de 0.018 ng mL-1 de NNAL.25

La GC-MSD se ha utilizado poco para el análisis así como para la

confirmación tanto del NNAL como del NNAL-Glu en muestras de orina.

Carmella et al. en 1993 utilizaron un GC-MS-SIM empleando ionización química

positiva, utilizando metano como reactivo de ionización, para la identificación

del NNAL derivatizado .24 Mientras Bernet et al. reportaron el uso de GC-HRMS

para el análisis de NNAL y el método desarrollado presentó límites de detección

de 0.6 pg mL-1;26 esto debido a que la detección de HRMS agrega especificidad

al análisis requiriendo que la señal registrada tenga la masa exacta, dentro de

un intervalo estrecho, correspondiente al analito y la eliminación del ruido

químico permite límites de detección del rango de picogramos.27 Por otra parte,

la GC-MS/MS es de gran utilidad para la elucidación estructural y el análisis

cuantitativo, donde el primer analizador proporciona una separación de masa

nominal del analito de la matriz y el ion seleccionado experimenta activación

por colisión (CA) para formar fragmentos estructuralmente relevantes.27 Sin

embargo, a pesar de tener límites de detección mejores que GC-TEA, la GC-

MS/MS se ha utilizado principalmente para la confirmación de los picos

cromatográficos ya que los costos de adquisición del equipo son elevados.28

Finalmente, tenemos el desarrollo de la HPLC-MS/MS, la aplicación de esta

técnica ha encontrado una rápida aceptación en el análisis de NNAL en

16

muestras biológicas, debido a la necesidad del análisis de un mayor número de

muestras y un tiempo de análisis menor. La HPLC-MS/MS requiere una

preparación de muestra simple, la separación de los analitos se alcanza en un

menor tiempo y posee buena sensibilidad y selectividad al operar en modo de

monitoreo de reacción múltiple; sin embargo presenta la desventaja de la

posible supresión iónica de las muestras que podría llevar a la mala

cuantificación de las mismas.29 Los límites de detección reportados con el uso

de HPLC-MS/MS es 0.3 - 1.49 pg mL-1 con técnicas de preparación de

muestras menos laboriosas y menor cantidad de muestra utilizada.30–32

17

Tabla 1 Compilación de los estudios que analizan NNAL y NNAL-Glu. TSNA

analizada Tipo de muestra

Método analítico Volumen utilizado

Técnica de preparación de muestra

Comentarios Referencia

NNALa y NNAL-Glu c

Orina de 24 h

GC-TEA y confirmación por

GC-MSD 100 mL

Extracción Líquido-Líquido, posterior limpieza por HPLC y

Derivatización utilizando trimetilclorosilano

Determinaron NNAL-Glu obteniendo la forma libre por hidrólisis con

β-glucoronidasa (5000 unidades e incubación de 16 h). Utilizaron d5-

NNAL y d5-NNAL-Glu como estándar interno.

Carmella et al., 1993.24

NNALa y NNAL-Glu c

Orina de 24 h GC-TEA 100 mL Método desarrollado por

Carmella et al., 1993 Utilizaron iso-NNAL como estándar y

500000 U de β-glucoronidasa. Hecht et al.,

1993.33 NNK d, NNALa,

NNAL-Glu c

Muestra aleatoria GC-TEA 20 mL

Método de Carmella et al., 1993, con pequeñas

modificaciones.

Utilizaron iso-NNAL como estándar y un volumen menor de muestra.

Murphy et al., 1994.34

NNAL a y NNAL-Glu c

Diferentes protocolos GC-TEA 25 mL

Método de Carmella et al., 1993, con pequeñas

modificaciones.

Utilizaron iso-NNAL como estándar interno. Probaron tres tipos de

β-glucoronidasa.(IX-A, H-1 y B-1) observando que el mejor rendimiento

se obtuvo con la enzima IX-A.


NNAL total b y

NNAL-Glu c

Orina de 24 h GC-TEA 25 mL Método desarrollado por

Carmella et al., 1995

El preservador de muestra utilizado fue sulfamato de amonio al 20 % en

ácido sulfúrico 3.6 N.

Kresty et al., 1996.36

NNAL a y NNAL-Glu

Muestra aleatoria GC-TEA 20–25 mL Método desarrollado por

Carmella et al., 1995. Aplicación del método sin

modificaciones. Richie et al.,

1997.37 NNAL a y

NNAL-Glu c Orina de

24 h GC-TEA 20–25 mL

Método desarrollado por Carmella et al., 1995.

Utilizaron ácido ascórbico como preservador de muestras.

Taioli et al., 1997.38

18

Tabla 1 Continuación TSNA





NNAL-Glu c Muestra aleatoria


GC-MS/MS 50 mL

Método de Hecht et al., 1993 con pequeñas modificaciones.

Utilizaron iso-NNAL como estándar interno y 25000 U de β-

glucoronidasa. El análisis cromatográfico se realizó con una columna capilar DB-1701 (30 m x

0.32 mm x 0.25 µm).

Parsons et al., 1998.39

NNAL a y NNAL-Glu c

Orina de 24 h


GC-MS/MS 25 mL

Método de Carmella et al., 1995 con pequeñas

modificaciones.

Aplicaron el uso de columnas capilares como Parsons et al., 1998.

Hecht et al., 1999.40

NNAL a y NNAL-Glu c

Muestra aleatoria

GC-TEA 4 - 9 mL Método de Carmella et al., 1995 y Parsons et al., 1998

con pequeñas modificaciones.

Utilizaron iso-NNAL como estándar interno y 10000 U de β-

glucoronidasa.

Lackmann et al., 1999.41

NNAL a y NNAL-Glu c

Muestra aleatoria

GC-TEA 20 mL no fumadores y 5 mL para fumadores

Método de Carmella et al., 1993, Hecht et al., 1993 y Parsons et al., 1998 con

pequeñas modificaciones.

La purificación de las muestras se realizó con una columna Luna (de 4.6 x 250 mm de 5µm tamaño de

partícula)

Anderson et al., 2001.42

NNAL a y NNAL-Glu c

Muestra aleatoria


GC-MS/MS

20 mL Método de Hecht et al., 1993 y Parsons et al., 1998 con

pequeñas modificaciones.

Para la hidrólisis utilizaron 25000 unidades de

β-glucoronidasa. La limpieza de los extractos se realizó por HPLC fase

normal e inversa.


19

Tabla 1 Continuación TSNA





NNAL-O-Glu,

NNAL a y NNAL-N-Glu

Muestra aleatoria

GC-TEA 10 mL Extracción en fase sólida con cartuchos SepPakVac C18 de

2 g.

En la fracción 1(metanol 10%) se eluyó el NNAL-Glu, que

posteriormente se dividió en dos alícuotas tratadas con: hidróxido de sodio (NNAL-N-Glu) y la otra con β

glucoronidasa (NNAL-N-Glu y NNAL-O-Glu). La fracción 1 contenía NNAL

libre y se eluyó con metanol 50%. Se utilizó iso-NNAL como estándar

interno.


NNAL a y NNAL-Glu c

Orina de 24 h

GC-TEA No especificado

Método de Hecht et al., 1999. La limpieza de los extractos se realizó por HPLC fase normal e

inversa.


NNAL total b Muestra aleatoria

GC-TEA, se realizaron

pruebas con GC-MS/MS

4.5 mL fumadores y 20 mL en no fumadores

Extracción líquido líquido de la muestra acidificada. La limpieza por extracción

líquido-líquido con soporte y se enriqueció por HPLC y se

derivatizó.

Para la extracción líquido-líquido con soporte se utilizaron cartuchos

Chem-Elute. Las condiciones de derivatización fueron: calentamiento a 50 °C por 1 h. Se encontró buena

sensibilidad con GC-MS/MS.

Camella et al., 2003.28

NNAL a y NNAL-Glu c

Orina 24 horas

HPLC-MS/MS

10 mL para NNAL y

5 mL para NNAL total

Extracción en un solo paso por extracción en fase sólida.

De intercambio catiónico.

Utilizaron los cartuchos Oasis MCX de 60 mg. El estándar interno fue d3-NNAL. No se requirió derivatización.

Byrd y Ogden, 2003.22


GC-TEA 4.5 mL Método de Carmella et al., 1995, Hecht et al., 1999.

Se realizó el seguimiento de diversos biomarcadores urinarios.

Murphy et al., 2004.46

20

Tabla 1 Continuación

TSNA analizada

Tipo de muestra




NNAL a y NNAL-Glu c

Muestra aleatoria

GC-MS de alta resolución

5 mL

Extracción líquido-líquido, en dos condiciones, limpieza por extracción en fase sólida, y derivatización con anhídrido del ácido heptafluorobutírico.

Utilizaron como estándar interno 13C6-NNAL. La hidrólisis del NNA-

Glu la realizaron con 10000 unidades de

β-glucoronidasa de H. pomiata y con incubación de 48 h.

Bernet et al., 2005.26


HPLC-MS/MS 5 mL

Extracción en un solo paso por extracción en fase sólida,

utilizando cartuchos con polímeros molecularmente

impresos.

El estándar interno fue 13C6-NNAL. No se requirió derivatización. Para la hidrólisis realizaron estudios con la β

glucoronidasa IX-A de E. coli y la

H-1 de H. pomiata, no encontraron diferencia significativa entre ambas.

Xia et al., 2005.47

NNAL a y NNAL-Glu c

Muestra aleatoria

GC-TEA No

especificado Método de Carmella et al.,

2003.

La limpieza del extracto lo realizaron por extracción en fase sólida de

intercambio iónico y como estándar interno el

5-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-pentanol.


NNAL total b Muestra aleatoria GC-TEA No

especificado Método de Hecht et al., 1999

y Hecht et al., 2001. Utilizaron como estándar interno el

C5-NNAL.

Stepanov et al., 2006.25

NNAL a y NNAL total b

Orina 24 horas HPLC-MS/MS No

especificado

Extracción en fase sólida utilizando cartuchos de intercambio catiónico.

Utilizaron d3-NNAL como estándar interno.

Scherer et al., 2007.49

21

TSNA analizada

Tipo de muestra




NNAL total b Muestra aleatoria HPLC-MS/MS No

especificado

Método basado en Carmella et al., 1995, Carmella et al., 2003 y Carmella et al., 2005.

Realizó estudios utilizando GC-TEA y

HPLC-MS/MS


NNAL total b Muestra aleatoria HPLC-MS/MS 5 mL Extracción Líquido-Líquido

con variaciones de pH. Se realizó derivatización con

anhídrido hexanoico. Jacob III

et al., 2008.51

NNAL total b, NNNg total,

NAB total e y NATf

No especificado HPLC-MS/MS 6 mL

Extracción en fase sólida con polímeros molecularmente impresos y Extracción en fase sólida de intercambio catiónico se realizó con la finalidad de enriquecer el

extracto

Los estándares internos fueron los analitos de interés deuterados. La

extracción en fase sólida.

Kavvadias et al., 2009.52


Muestra aleatoria HPLC-MS/MS 5 mL

Extracción líquido con soporte y posteriormente una extracción líquido-líquido y el paso final extracción en fase

sólida con polímeros molecularmente impresos

Laextracción líquido con soporte se realizó en cartuchos ChemElute.

Método cromatográfico por Xia et al., 2005.

Ashley et al., 2010.53


Muestra aleatoria HPLC-MS/MS 0.25 mL

Extracción líquido-líquido. Derivatización con

acetonitrilo/ yoduro de n-propilo. Posterior purificación por extracción en fase sólida

de intercambio catiónico.

Utilizaron d3-NNAL como estándar interno. Se empleó un método de

dilución isotópica estable en combinación con HPLC-MS/MS y

empleo del monitoreo de reacciones múltiples.

Bhat et al., 2011.54

NNAL a y NNAL-Glu c

Orina de 24 h HPLC-MS/MS 1 mL

Extracción en línea con columnas capilares de

microflujo con polímeros molecularmente impresos.

Para el análisis se ajustó el pH de la orina entre 5 y 7. Se realizó el

análisis del NNAL total hidrolizando la muestra acondicionada con buffer de fosfatos pH 6.4 y 20000 unidades

de β-glucoronidasa H-1 y se incubaron por 48 h.

Shah et al., 2011.55


22

TSNA





NNAL total b Orina de 24 h HPLC-MS/MS 5 mL

Método basado en Shah et al., 2009.

Agregaron 5 mL de buffer de fosfatos 50 mM, ajustaron el pH a 6.3,

adicionaron 2 ng del estándar interno y 10000 unidades de β-

glucoronidasa en buffer de forsfatos pH 7.2.

Hou et al., 2012.56

NNAL a, NNAL-O-Glu

y NNAL-N-Glu

Muestra aleatoria HPLC-MS/MS 10 mL

Extracción líquido-líquido, seguida de una extracción en

fase sólida de intercambio catiónico.

Se analizaron los analitos sin hidrolizar. El estándar interno fue

13C6-NNAL. El método desarrollado se comparó con los métodos

enzimáticos reportados por Shah et al., 2009 y Hou et al., 2012 y se

observó una variación en los resultados de -8.39 % a 13.38 %

para el NNAL y de -3.04 % a 21.54 % para el NNAL total.

Yao et al., 2013.32

NNAL a, NNAL-O-Glu

y NNAL-N-Glu

Muestra aleatoria HPLC-MS/MS 180 µL

Extracción líquida con soporte (SLE) en formato de placa de 96 pozos, seguida por una extracción en fase sólida en formato de placa de 96 pozos. El tratamiento de los analitos se basó en

una adaptación del procedimiento de Carmella et

al., 2002.

La determinación de los analitos se realizó dividiendo el volumen de

muestra en 3 fracciones:80 µL para NNAL libre, 60 µL para NNAL-N-Glu

y 40 µL para NNAL total Para la extracción líquido con

soporte se utilizaron las placas de Isolute SLE+ y la para extracción en fase sólida se emplearon placas de

Oasis MCX. El estándar interno utilizado fue 13C6-NNAL


Nota: aNNAL: NNAL libre,b NNAL Total: NNAL libre + NNAL-Glu,c NNAL-Glu: NNAL-N-Glu + NNAL-O-Glu, d NNK: nitrosonicotina cetona, e NAB:nitrosoanabasina, f NAT: nitrosoanatabina, g NNN: nitrosonornicotina


1.6.2 Preparación de muestras.

La preparación de muestras consiste en convertir una muestra real a un

formato que sea adecuado para el análisis por alguna separación analítica u

otra técnica. Esta etapa del método analítico, consume alrededor del 80 % del

tiempo total del análisis de una muestra,58 siendo sus principales objetivos:

1. Favorecer la selectividad del método, mediante la remoción de

interferencias potenciales presentes en la muestra.

2. Incrementar la concentración del analito y así potenciar la sensibilidad del

ensayo.

3. Convertir el analito a una forma más adecuada para su detección o

separación.

4. Proveer un método robusto y reproducible que sea independiente de las

variaciones en la matriz de la muestra.

Se debe considerar que estas técnicas presenten: una mínima pérdida

de muestra, una buena recuperación del analito de interés, una eficiente

eliminación de compuestos no deseados, un fácil acoplamiento a las técnicas

de análisis, ser de fácil aplicación y presentar el mínimo costo.59

24

En la tabla 1, además de las técnicas cromatográficas empleadas para el

análisis del NNAL, también se pueden observar las técnicas de preparación de

muestras utilizadas para el análisis de NNAL y NNAL-Glu, así como

comentarios de interés para cada uno de los procedimientos, siendo la

extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida y la extracción en fase

sólida utilizando polímeros molecularmente impresos las técnicas más

utilizadas; por lo que vale la pena hacer una breve descripción de las mismas.

1.6.2.1 Extracción líquido-líquido.

La extracción líquido-líquido (LLE) ha sido la técnica de preparación de

muestra predominante en el análisis de NNAL y NNAL-Glu. La LLE se basa en

la transferencia de un analito de una muestra acuosa a un solvente inmiscible

en agua, es decir, se basa en la relación de partición (KD), lo que representa la

razón de la distribución de una sustancia entre dos fases inmisibles, en este

caso una fase acuosa y una orgánica, cuando el sistema está en equilibrio y a

una temperatura constante.60 Es la forma más simple de la extracción y

purificación de analitos a partir de muestras líquidas y ha sido ampliamente

utilizada en el análisis de muestras biológicas. Dentro de las desventajas que

presenta la LLE son la formación de emulsiones, múltiple manipulación de la

muestra, puede consumir mucho tiempo así como el uso de grandes cantidades

de solventes orgánicos potencialmente tóxicos, lo que conlleva a la producción

de grandes volúmenes de residuos tóxicos.61

25

En los primeros reportes para la determinación del NNAL y NNAL-Glu se

utilizó como principal técnica de extracción la LLE, tomando como modelo la

metodología que reportó Carmella et al. en 1993,24 la cual consistió en realizar

una extracción líquido-líquido de la orina a pH neutro con acetato de etilo; esto

con la finalidad de separar la fracción libre (contenida en la fase orgánica) de la

fracción conjugada del NNAL (contenida en la fase acuosa). Posteriormente, la

fase acuosa se sometió a un proceso de concentración seguido de una

hidrólisis enzimática del NNAL-Glu, para lo cual se utilizó la enzima β-

glucuronidasa tipo IX-A para liberar el NNAL del conjugado. Terminada la

hidrólisis, se realizó una limpieza mediante dos procesos de partición. Para el

primero, se acidificó la fase acuosa para provocar la ionización del NNAL y de

esta manera asegurar su permanencia en la fase acuosa; mientras que en el

segundo proceso de partición se neutralizó la fase acuosa, con lo cual el NNAL

se convirtió en su forma no ionizada y se recuperó mediante una extracción con

diclorometano. Tanto la fracción de acetato de etilo como la fracción de

diclorometano fueron llevadas a sequedad, se reconstituyeron en agua y fueron

purificadas mediante HPLC.

Las fracciones purificadas se derivatizaron con trimetilclorosilano, con la

finalidad de producir un derivado de trimetilsileter eter del alcohol secundario

para su análisis por GC-TEA.24

26

Este método de preparación de muestra fue utilizado como base para

posteriores trabajos con la aplicación de pequeñas modificaciones, entre las

que se pueden mencionar: cambio del estándar interno utilizado;33, 35, 38–43, 45,

46, 62 diferente cantidad de enzima requerida en el paso de hidrólisis;33, 62 menor

cantidad de muestra;35, 37–43, 46, 62 diferente conservador de muestra;46, 62 así

como modificaciones al paso de purificación por HPLC.25

Con la finalidad de reducir los costos del tratamiento de muestra por LLE,

esta se puede desarrollar empleando volúmenes pequeños de solventes

orgánicos. En el 2008, Jacob et al. tomaron 5 mL de muestra de orina y

realizaron extracciones empleando menos de 10 mL de los solventes orgánicos,

utilizaron la agitación por vórtex para mejorar la eficiencia de extracción y ciclos

de centrifugación - congelación de la fase acuosa para la eliminación de

emulsiones y la separación de las fases. Este método también incluyó un

proceso de derivatización con anhídrido hexanoico y 4-(dimetilamino) piridina,

con la finalidad de convertir el grupo hidroxilo (moderadamente polar) en un

grupo éster (relativamente no polar) y como consecuencia de esta modificación

química se logró: aumentar la sensibilidad del método de HPLC-MS/MS debido

a la disminución de la supresión iónica, aumentar la retención en la columna

cromatográfica y separar eficientemente el analito y los compuestos

interferentes mediante la extracción y el análisis cromatográfico.51

27

1.6.2.2 Extracción en fase sólida.

La extracción en fase sólida (SPE) es una técnica de partición del analito

entre una fase sólida (en diversas presentaciones) y una fase líquida, que se

puede aplicar para extraer analitos de baja o nula volatilidad, donde los analitos

deben presentar una mayor afinidad por la fase extractante que por la matriz de

la muestra. La retención puede deberse a interacciones no polares, polares o

iónicas, que dependerán de las propiedades físico-químicas del analito y de la

fase extractante.

Existe una amplia variedad de fases extractantes para SPE, entre las que

podemos citar a las unidas químicamente a la sílica: C8, C18, intercambio

iónico; materiales con más de un mecanismo de retención, también llamados de

modo mixto, los inmunoabsorbentes y los polímeros molecularmente

impresos.61 Algunas ventajas de la SPE sobre las extracciones y limpieza

convencionales son: mayor reproducibilidad, empleo de menores volúmenes de

solventes, rapidez, versatilidad, costos menores, posibilidad de automatización

y obtención de extractos libres de interferencias.63

Carmella et al. reportaron por primera vez en 1995 el uso de la SPE para

el análisis del NNAL en orina;35 ellos investigaron la posibilidad de sustituir el

28

paso de limpieza por HPLC por la limpieza por SPE en fase normal o fase

inversa, pero los cromatogramas que obtuvieron no fueron aceptables para la

cuantificación por GC-TEA. Posteriormente en el 2002, emplearon cartuchos

Sep pack Vac C18 para la separación del NNAL libre y NNAL-Glu en muestras

de orina, realizando la elución con metanol al 10 % para el NNAL-Glu y metanol

al 50 % para el NNAL libre , obtuvieron coeficientes de variación menores al

10 % para cada uno de los analitos.44

Byrd y Ogden en el 2003 reportaron un método, validado según los

criterios de la FDA, para la determinación de NNAL y NNAL-Glu mediante SPE

en cartuchos de intercambio catiónico Oasis MCX de 60 mg y el análisis por

HPLC-MS/MS.22 Los volúmenes de muestra que analizaron fueron de 10 y 5 mL

para la determinación del NNAL libre y del NNAL total, respectivamente. La

concentración de NNAL-Glu la calcularon como la diferencia entre el NNAL total

y el NNAL libre. Ellos observaron que al reducir los pasos de la preparación de

las muestras, se logró disminuir el tiempo de análisis de las mismas y

obtuvieron una recuperación del analito superior al 85 %.

En el 2005, Bernet et al.26 cambiaron el proceso de limpieza mediante

HPLC por una limpieza por SPE utilizando cartuchos Oasis HLB y

posteriormente una derivatización con ácido heptafluorobutírico (HFBA) y el

análisis por GC-MSHR; la recuperación promedio del método desarrollado fue

de 97.5 % en un rango de 10 - 800 pg mL-1.26 Hecht et al., en el 2006,48

realizaron modificaciones al método desarrollado por Carmella et al.,28 las

cuales consistieron en la sustitución del paso de limpieza de HPLC por una SPE

29

de intercambio catiónico y posterior análisis por GC-TEA, con lo que

simplificaron el paso de limpieza del extracto y evitaron el uso del HPLC para la

realizar la limpieza. Este trabajo, fue adaptado en el 2007 para el análisis de los

extractos por HPLC-MS/MS por Scherer et al.49 y Hecht et al.50.

1.6.2.3 Polímeros Molecularmente Impresos.

Los polímeros molecularmente impresos (MIP) son materiales

extractantes utilizados en SPE, que no solo concentran a los analitos de interés,

sino que también puede separarlos selectivamente en muestras reales. Los

MIPs son polímeros sintéticos cuya principal ventaja es la posibilidad de

preparar una fase extractante selectiva para un predeterminado analito o un

grupo de analitos.61

En el 2005, Xia et al. reportaron la síntesis de una fase extractante

diferente a las convencionales, que era preparada con una selectividad o

memoria para una sola molécula o clase de moléculas, en este caso para el

NNAL y su aplicación para el análisis de muestras de orina.47 Ellos observaron

que los resultados del método por HPLC-MS/MS aplicando el uso de esta

tecnología fue lo suficientemente sensible para lograr la determinación de NNAL

tanto en fumadores activos como en no fumadores expuestos a HTA.

30

Tomando como antecedente el trabajo de Xia et al., en el 2009, Shah et

al., realizaron pequeñas modificaciones al método, las cuales consistieron en el

uso de la centrífuga durante la elución de los analitos con lo cual se garantizó la

uniformidad de la velocidad de elución y se redujo el 50% del tiempo empleado

en el método original.64 En ese mismo año, 2009, Kavvadias et al. reportaron el

análisis simultáneo de cuatro TSNAs: NNAL, N-nitrosonornicotina (NNN), N-

nitrosoanabasina (NAB) y N-nitrosoanatabina (NAT) por HPLC-MS/MS; la

preparación de las muestras consistió en un proceso de SPE con polímeros

molecularmente impresos, analizando alícuotas de 6 mL de orina y realizando

un enriquecimiento del extracto mediante SPE de intercambio catiónico.52 En el

2014, Xia et al. reportaron la comparación de la eficiencia de extracción de dos

tipos de polímeros molecularmente impresos, uno específico para el NNAL y

otro selectivo para TSNAs (NNN, NNK, NAB, NAT) elaborados por el mismo

fabricante.31 Las recuperaciones obtenidas con los cartuchos NNAL-MIP fueron

de 67.2, 53.0, 64.4, 52.6 y 52.6 % para el NNAL, NNN, NAT, NAB y NNK,

respectivamente; mientras las recuperaciones obtenidas con los cartuchos

TSNA-MIP fueron alrededor de 3 veces menor para el NNAL y 1.5 veces mayor

para las demás nitrosaminas específicas del tabaco. Por lo que a pesar de

utilizar cartuchos específicos, el NNAL presenta competencia por las otras

nitrosaminas con quien comparte similitud en estructura, las cuales podemos

observar en la Figura 2.

31

1.6.3 Nuevas Técnicas de Preparación de Muestra.

Actualmente, la tendencia en los métodos bioanalíticos es la búsqueda y

desarrollo de nuevas tecnologías que permitan aumentar el número de

muestras analizadas, así como disminuir la cantidad de muestra requerida, el

tiempo y el costo por análisis, así como la cantidad de residuos generados. Las

técnicas de preparación de muestras como la microextracción líquido-líquido

dispersiva (DLLME) y la microextracción en fase sólida (SPME) presentan dics

características y se presenta una breve descripción de cada una de ellas.

1.6.3.1 Microextracción Líquido-Líquido Dispersiva.

La microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME), fue desarrollada

en el año del 2006 por Assadi et al. La técnica de microextracción líquido-

líquido está basada en un sistema de tres solventes en el cual el solvente de

extracción y el solvente de dispersión son inyectados rápidamente en la

muestra acuosa con ayuda de una jeringa. La mezcla obtenida es agitada y se

forma una solución turbia (formada por el agua, el solvente de dispersión y el

solvente de extracción). Después de una centrifugación, las partículas finas de

32

solvente de extracción son separadas. Se recupera el volumen de solvente de

extracción con una microjeringa y se inyecta al sistema cromatográfico.65, 66

Las principales ventajas de la DLLME es la simplicidad de su

procedimiento, rapidez, bajo costo, altas recuperaciones, altos factores de

enriquecimiento y es benévolo con el ambiente. Además presenta una amplia

aplicación en el análisis de analitos trazas.61

El mecanismo de extracción se basa en el equilibrio del proceso de

distribución del analito de interés entre la solución de la muestra y el solvente

de extracción. Se aplica a compuestos con propiedades lipofílicas altas o

moderadas. Para los compuestos con propiedades ácido-base, se puede

incrementar el coeficiente de distribución mediante variaciones en el pH de la

muestra, provocando que los analitos existan en su estado no iónico.66

Al inicio, la DLLME sólo se realizaba con solventes más densos que el

agua (en su mayoría solventes clorados), pero recientemente se han

encontrado reportes de la aplicación de la técnica con solventes menos densos

que el agua, ya que existe un gran número de estos solventes y además son

menos tóxicos para el analista y el ambiente.67, 68

33

La microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) se ha aplicado en

la extracción de NNAL en cabello,32 pero no se ha probado en la matriz de

orina.

1.6.3.2 Microextracción en Fase Sólida.

La microextracción en fase sólida (SPME) es una técnica desarrollada

por Pawliszyn y dada a conocer a partir de 1990, que consiste en una pequeña

cantidad de fase extractante dispersa sobre un soporte sólido. Una de las

configuraciones del sistema de SPME consiste en una pequeña fibra de sílice

fundida, normalmente recubierta de una fase polimérica, la cual está instalada

sobre un soporte, obteniéndose un sistema semejante a una jeringa

modificada.69 Es un proceso de extracción no exhaustivo basado en el

establecimiento del equilibrio de partición entre la matriz y la fase extractante; el

proceso de extracción, purificación y concentración se realiza en un solo paso.

La modalidad de extracción puede realizarse por inmersión directa, es

decir, que la fibra esté en contacto directo con la matriz de la muestra, o

mediante el muestreo en el espacio de cabeza o headspace (HS) cuando la

matriz de la muestra es muy compleja y los analitos de interés son volátiles o

34

medianamente volátiles. También las fases extractantes comercialmente

disponibles presentan una amplia gama de polaridades, según las

características del analito de interés. La SPME puede ser una opción para el

análisis de NNAL en muestras de orina ya que este es un compuesto semivolátil

y además existen fibras de una amplia gama de polaridad que pueden favorecer

la extracción del NNAL y el uso de la modalidad de extracción por HS evita las

complicaciones del manejo de la muestra.

35

1.7 Justificación.

El NNAL y sus conjugados han sido utilizados como marcadores del

riesgo de sufrir afecciones pulmonares por el consumo del tabaco; sin embargo,

su determinación puede ser compleja ya que se requiere de métodos laboriosos

de preparación de muestra, además de equipos con detectores específicos y de

alta resolución. Debido a lo anterior, el desarrollo de nuevos procedimientos

para la determinación del NNAL es un tópico de interés actual.

El presente trabajo plantea el desarrollo y validación de un método

analítico para la determinación del NNAL, utilizando diversas técnicas de

preparación de muestra y el uso de cromatografía de gases-espectrometría de

masas de baja resolución; haciendo accesible la determinación en laboratorios

que no cuenten con equipos con detectores específicos y de alta resolución.

Este método permitirá desarrollar, en conjunto con trabajos sobre el

estudio de las variantes genéticas de proteínas involucradas en el metabolismo

y eliminación del NNAL, sistemas de detección y diagnóstico del riesgo a sufrir

de afecciones por el consumo del tabaco mediante el establecimiento de

perfiles toxicológicos y toxicogenéticos.

36

1.8 Objetivo general.

Desarrollar, optimizar y validar un método analítico para la determinación

y cuantificación del NNAL libre y total en orina utilizado diferentes técnicas de

preparación de muestra y cromatografía de gases/espectrometría de masas de

baja resolución (GC/LRMS).

1.9 Objetivos específicos.

1. Desarrollar y validar el método, por cromatografía de gases/

espectrometría de masas de baja resolución (GC/LRMS), para el análisis

del NNAL.

2. Desarrollar y optimizar diferentes procedimientos de preparación de

muestra para la determinación del NNAL en orina.

3. Seleccionar y validar el/los método(s) más adecuado para la

determinación del NNAL libre.

4. Aplicar el método seleccionado al análisis de muestras de orina de

voluntarios jóvenes para la determinación del NNAL libre.

37

CAPÍTULO 2

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Material, equipos y reactivos.

En esta sección se enlistan los materiales, reactivos y equipos que se

utilizaron en la realización de este trabajo.

38

2.1.1 Material.

Barras magnéticas.

Cartuchos para SPE

a) SupelMIPTM NNAL, 25 mg de adsorbente, 10 mL, Supelco.

b) Sep Packt C18, 1 g de adsorbente, 6 mL, 37-55 µm de tamaño de

partícula, Waters.

Columnas cromatográficas:

a) DB-17, 0.25 mm de diámetro interno, 30 m de longitud, 0.25 µm de

espesor de fase, Agilent.

b) DB-17MS, 0.25 mm de diámetro interno, 30 m de longitud, 0.25 µm de


c) DB-1701, 0.25 mm de diámetro interno, 30 m de longitud, 0.25 µm de


d) HP-5MS, 0.25 mm de diámetro interno, 30 m de longitud, 0.25 µm de


Cristalizadores.

Cronómetro.

Espátulas.

39

Fibras para SPME:

a) Carboxen-Polidimetilsiloxano 75 µm, Supelco.

b) Divinilbenceno-Polidimetilsiloxano (DVB-PDMS) de 65 µm, Supelco.

c) Divinilbenceno-Carboxen-Polidimetilsiloxano (DVB-CAR-PDMS)

50-30 µm, Supelco.

d) Poliacrilato 85µm, Supelco.

Filtros Millex LCR con membrana de PTFE modificada, 0.45µm, 13 mm

diámetro, Millipore.

Jeringas de 1 mL sin aguja, desechables.

Jeringas de 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 µL, Agilent.

Matraces volumétricos de 1, 2, 5, 10, 100 y 250 mL.

Pinzas de tres dedos.

Pinzas para soporte.

Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL.

Portafibras, Supelco.

Soporte universal.

Termómetro de -10 a 150°C.

Vasos de precipitados.

40

Viales de vidrio de 2 mL con tapón de rosca y septa de PTFE y silicón, Agilent.

Viales de vidrio de 15 mL con tapón de rosca y septa de PTFE y silicón.

Viales de vidrio ámbar de 40 mL con tapón de rosca y septa de PTFE y silicón.

2.1.2 Equipos.

Agitador tipo vortex, Modelo Maxi Mix II, Thermo Scientific.

Baño con temperatura controlada, Haake C1.

Baño de ultrasonido, Modelo 3510, Branson.

Bomba de vacío, Modelo 1HAB-25B-M100X, GAST Manufacturing.

Congelador -20 °C, Cool-Lab 120 V, Thermo Scientific.

Cromatógrafo de gases, Agilent 6890 N equipado con inyector split/ splitless y

detector selectivo de masas 5973 inert.

Cromatógrafo de gases, Perkin Elmer Autosystem XL con inyector

splits/splitless y detector de ionización de flama.

41

Estación de vacío para SPE con 24 posiciones, Sigma.

Placa de calentamiento y agitación, Corning, Modelo PC-420D.

2.1.3 Reactivos.

4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL), ≥ 92 %, Fluka.

4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol -1,2’,3’,4’,5’,6’-13C6 (NNAL-13C6),

grado estándar, Toronto Research Chemicals Inc.

4-(N-metil- d3)-4-N-nitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL deuterado),

grado estándar, Toronto Research Chemicals Inc.

Ácido fosfórico, ACS, ≥ 85 % p/p en Agua, Sigma Aldrich.

Agua Bidestilada Plus, Laboratorio Monterrey.

Metanol, para análisis de residuos orgánicos, > 99.8 %, UltraResi-

analized®,J.T.Baker

Diclorometano, para análisis de residuos de plaguicidas, Fluka®

42

Hidróxido de amonio, 28-30 % p/p, Halmek.

Tolueno, para análisis de residuos de plaguicidas acorde a la FDA, Fluka®

Fosfato de amonio monobásico, ACS, 98 %p/p, J. T. Baker.

Cloruro de sodio, Cultivo celular, ≥99 % p/p, Sigma.

Acetonitrilo, Grado Pesticida, Fischer Chemicals.

2.2 Preparación de soluciones.

2.2.1. Preparación de soluciones madres.

La solución madre del estándar analítico (NNAL) se preparó mediante la

disolución de 10 mg del compuesto en metanol y posterior aforación a 10 mL,

43

cuya concentración final fue de 1000 µg mL-1. Esta solución se separó en

alícuotas de 1 mL, utilizando viales de vidrio de 2 mL nuevos con tapón de

rosca y septa de PTFE y silicón. Se evaporó el solvente y se guardaron a - 20

°C hasta su uso.

La solución madre del estándar interno (iso-NNAL d3) se preparó

disolviendo y aforando 1 mg del estándar con metanol hasta 1 mL; la

concentración final fue de 1000 µg mL-1. La solución concentrada del NNAL-

13C6 se preparó disolviend oy aforando 0.25 mg del reactivo hasta 1 mL con

metanol; la concentración final fue de 250 µg mL-1.Las soluciones se

almacenaron en viales de vidrio de 2 mL con tapón de rosca y septa de PTFE y

silicón a 4 °C.

2.2.2 Preparación de soluciones estándares para optimización del programa de

temperaturas del GC-MS.

44

A partir de las soluciones madre se prepararon diluciones de los

estándares individuales de cada compuesto, para lo cual se tomaron 25 µL de

la solución stock y se aforó a 1 mL con metanol. También se preparó una

mezcla del estándar analítico y estándar interno, cuya concentración final fue de

25 µg mL-1 para cada compuesto. Estas soluciones se emplearón para el

establecimiento del método de GC-MS para cada columna cromatográfica.

2.2.3 Preparación de soluciones para evaluar la sensibilidad.

La curva de calibración utilizada para la evaluar la sensibilidad del

sistema cromatográfico, estuvo constituida por estándares a 9 niveles de

concentración: 1x10-5, 1x10-4, 1x10-3, 1x10-2, 0.1, 0.5, 1, 5, 25 µg mL-1 con una

adición de 2 µg mL-1del estándar interno en metanol.

45

2.2.4 Preparación de soluciones para la validación del sistema cromatográfico.

Se manejó un intervalo de concentraciones de 0.05 a 5 µg mL-1 para la

evaluación de los parámetros de validación del sistema cromatográfico. La

curva estuvo constituida por estándares a 9 niveles de concentración con una

adición de 0.1 µg mL-1del estándar interno en metanol.

2.2.5 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción en fase

sólida con cartuchos molecularmente impresos.

Para establecer el perfil de elución, seprepararon soluciones de

0.1 µg mL-1 del estándar analítico con una adición de 0.1 µg mL-1 del estándar

interno, en 5 mL de agua bidestilada y 5 mL de una solución amortiguadora de

fosfato de amonio monobásico 50 mM a pH 6.40.

46

2.2.6 Preparación de soluciones para la optimización de la microextracción en

fase sólida.

2.2.6.1 Preparación de soluciones para la selección de fibra y la optimización de la desorción.

Para la selección de la fibra de SPME y para la optimización de la

desorción, se utilizó una solución estándar de 4 µg mL-1 del NNAL y

1 µg mL-1del estándar interno, la cual se preparó por la adición de 40 µL de una

solución estándar de NNAL de 1000 µg mL-1 y 10 µL de una solución estándar

de iso-NNAL-d3 de 1000 µg mL-1 a 10 mL de una solución amortiguadora de

fosfato de amonio diácido 50 mM y pH 6.4.

47

2.2.6.2 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción

Para la optimización de la extracción se utilizó un volumen de 5 mL de

una mezcla de orina de no fumadores adicionada a una concentración de 4 µg

mL-1 de NNAL y 1 µg mL-1 de iso-NNAL-d3 y ajustada a pH 6.4, mediante la

adición de ácido fosfórico o hidróxido de amonio.

2.2.7 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción en fase

sólida con cartuchos tC18.

2.2.7.1 Preparación de soluciones para la optimización de la extracción.

48

Se prepararon soluciones con 5 mL de una mezcla de orina de no

fumadores adicionada a una concentración de 0.1 mg mL-1 de NNAL y

0.1 mg mL-1 de iso-NNAL-d3, la orina se diluyó con 5 mL de una solución

amortiguadora de fosfato de amonio monobásico 50 mM a pH 6.4.

2.2.7.2 Preparación de soluciones para el perfil de elución.

Se prepararon 5 mL de soluciones con una concentración de 0.1 mg mL-1

de NNAL y 0.1 mg mL-1 de iso-NNAL-d3, la cual se obtuvo mediante la adición

de 50 µL de una solución estándar de NNAL de 10 µg mL-1 y 50 µL de una

solución estándar de iso-NNAL-d3 de 10 µg mL-1; previo al proceso de

extracción la orina se diluyó con 5 mL de una solución amortiguadora de fosfato

de amonio monobásico 50 mM a pH 6.4.

49

2.2.8 Preparación de soluciones para la comparación de los métodos

desarrollados.

Las soluciones para la comparación de métodos se prepararon en 5 mL

de una mezcla de orina de no fumadores adicionada a una concentración de

0.1 µg mL-1 de NNAL y 0.1 µg mL-1 de NNAL-13C6. previo al proceso de

extracción la orina se diluyó con 5 mL de una solución amortiguadora de fosfato

de amonio monobásico 50 mM a pH 6.4 y se centrifugó a 3500 rpm por 5 min.

2.2.9 Preparación de soluciones para la validación del método desarrollado.

Para preparar los estándares de las curvas de calibración se utilizaron

alícuotas de 5 mL de una mezcla de orina de no fumadores. Cada curva de

50

calibración se realizó a 6 niveles de concentración en un intervalo de 2 a 25 ng

mL-1. A todas las solución estándar se adicionaron 50 ng de iso-NNAL-d3 como

estándar interno y 5 mL de una solución amortiguadora de fosfato de amonio

monobásico 50 mM a pH 6.4.

2.3 Cromatografía de Gases-Masas (GC-MS)

Se establecieron los programas de temperatura para el análisis por

GC-MS para el NNAL utilizando como estándar interno el iso-NNAL-d3. En esta

sección se probó el comportamiento de 4 columnas cromatográficas

2.3.1 Establecimiento de las condiciones de separación cromatográfica y

selección de columna.

51

Para establecer los programas de temperatura para la separación

cromatográfica de cada columna, se analizaron por inyección directa 1 µL de

una solución estándar de 25 µg mL-1de cada compuesto, así como la mezcla de

los mismos, en el cromatógrafo de gases utilizando las columnas indicadas en

la tabla 2.

Tabla 2 Características de las columnas cromatográficas de interés para este trabajo. Columna Polaridad Características Composición de la fase

HP-5MS (Agilent) No polar 30 m x 0.22 mm y 0.25µm de espesor

5 % fenil – 95 % dimetilpolisiloxano

DB-1701 (J&W Scientific)

Baja a intermedia

30 m x 0.22 mm y 0.25µm de espesor

14 % cianopropilfenil - 84 % dimetilpolisiloxano

DB- 17 (J&W Scientific)

Intermedia 30 m x 0.22 mm y 0.25µm de espesor

50 % difenil- 50 % dimetilpolisiloxano

DB- 17 MS (J&W Scientific)

Intermedia 30 m x 0.22 mm y 0.25µm de espesor

50 % difenil- 50 % dimetilpolisiloxano

2.3.1.1 Establecimiento del programa de temperatura.

Los programas iniciales de temperatura para cada columna se muestran

en las tablas 3 a la 5, los cuales fueron establecidos de acuerdo a las

referencias bibliográficas encontradas. Se determinaron las temperaturas a la

cual eluyeron los analitos mediante cálculos, ya que se conocía el tiempo de

52

retención y el programa de cambio de temperatura. Posteriormente, se

plantearon modificaciones a los programas de temperatura hasta obtener una

separación adecuada entre el analito y el estándar interno, así como la mejor

forma del pico cromatográfico.

Tabla 3 Condiciones iniciales para la columna HP-5MS

Gas acarreador Helio

Flujo 0.8 mL min-1

Temperatura del inyector 230°C

Programa de

temperatura

inicial 80°C mantener 2 min

Rampa 1 10 °C min-1 hasta 160°C mantener 1 min.

Rampa 2 2 °C min-1 hasta 200°C mantener

1 min.

Rampa 3 20 °C min-1 hasta 260°C mantener

5 min.

Temperatura de la interfase 280°C

Temperatura del analizador 150°C

Temperatura de la fuente 230°C

Modo de adquisición de datos Barrido completo de 50-350 m/z

53

Tabla 4 Condiciones iniciales para la columna DB-17.


Flujo 1 mL min-1


Programa de temperatura


Rampa 1

10 °C min-1 hasta 160°C mantener 1 min.

Rampa 2


Rampa 3






Tabla 5 Condiciones iniciales para la columna DB-1701


Flujo 1 mL min-1


Programa de temperatura


Rampa 1


Rampa 2


Rampa 3






54

Para evaluar la resolución cromatográfica (Rs),70 se utilizó la ecuación 1:

Donde:

tR2 = Tiempo de retención del compuesto más retenido.

tR1 = Tiempo de retención del compuesto menos retenido.

Wb1= Ancho del pico cromatográfico del compuesto menos retenido.

Wb2= Ancho del pico cromatográfico del compuesto más retenido.

2.3.1.2 Selección de columna

La selección de la columna se realizó tomando en cuenta tanto la

asimetría de las señales cromatográficas y los límites de detección obtenidos de

cada una de ellas. Esto se realizó con el programa de temperatura que permitió

obtener las mejores condiciones para cada columna y el análisis por duplicado

de una mezcla de los compuestos. Se seleccionó la columna que mostró el

factor de simetría más cercano a la unidad y los menores límites de detección.

21

12

s

2R

bb

RR

w w

tt

Ecuación 1

55

2.3.1.2.1 Cálculo de la asimetría de los picos cromatográficos.

En la figura 3 se muestra una representación de los elementos ha

considerar en el cálculo del factor de asimetría (T).71 Se trazó una línea que

corta el pico por su ápice y se obtuvo la altura del pico (h). Posteriormente, se

determinó el 5 % de la altura y se midió el ancho a ese nivel, tanto de la parte

frontal (a) como posterior (b) del pico cromatográfico.

Figura 3 Imagen donde se ejemplifica como calcular la simetría de un pico

cromatográfico.72

Para este cálculo se empleó la ecuación 2:

Donde:

a= ancho de la parte frontal del pico cromatográfico al 5 % de la altura

b= ancho de la parte posterior del pico cromatográfico al 5 % de la

altura

2a

baT

Ecuación 2

56

El criterio de selección fue un T de 1 o el valor más cercano.

2.3.1.2.2 Límite de detección obtenido con cada columna cromatográfica.

Utilizando el programa de temperatura final para cada columna

cromatográfica, se determinó cual era la concentración mínima detectada. Esta

prueba se realizó mediante la inyección por duplicado de soluciones estándares

de concentración decreciente.

2.3.2 Confirmación de la identidad de los analitos.

Para la asignación de la identidad de los picos cromatográficos en el

análisis de mezclas de NNAL y del iso-NNAL d3, se analizaron soluciones de 25

µg mL-1 de cada compuesto por separado. Los picos cromatográficos se

identificaron por comparación de los tiempos de retención de los estándares y el

análisis de los espectros de masas de cada pico cromatográfico. Se confirmó la

57

identificación mediante la comparación de los espectros de masas reportados

en la literatura.

2.3.3 Establecimiento de los parámetros de adquisición de datos.

Con la finalidad de mejorar la sensibilidad y selectividad del método, una

vez establecido el mejor programa de temperatura y seleccionada la columna

cromatográfica para la separación, se cambió la modalidad de adquisición de

datos de barrido completo (full scan) a monitoreo selectivo de iones (SIM). Para

ello se establecieron, en base a los tiempos de retención, ventanas de

adquisición de datos donde se monitorearon solamente los iones principales de

cada compuesto.

58

2.3.4 Validación del sistema cromatográfico.

Para asegurar el comportamiento adecuado del sistema cromatográfico

desarrollado para el análisis de NNAL, se evaluaron la linealidad, precisión,

exactitud, límite de cuantificación y el límite de detección, empleado como base

lo recomendado por la FDA.73

2.3.4.1 Linealidad.

Se construyó una curva de calibración a 9 niveles de concentración, por

triplicado, en un intervalo de concentración de 0.05 a 5 µg mL-1. Con los datos

obtenidos se realizó un análisis de regresión.

La aceptación de la linealidad se basó en la observación visual de la

curva construida así como en un valor superior a 0.99 del coeficiente de

determinación (r2).

2.3.4.2 Precisión.

La precisión intradía del sistema cromatográfico se evaluó mediante el

cálculo de la desviación estándar relativa (% DER) de la relación de las áreas

de las señales del analito respecto al estándar interno de las soluciones

estándares de nivel bajo, medio y alto analizados por triplicado, utilizando la

ecuación 3. El criterio de aceptación fue una % DER menor al 10 %.

59

Donde:

s= Desviación estándar

� = Media aritmética

2.3.4.3 Exactitud.

Se realizó un análisis de correlación por mínimos cuadrados para los

valores de concentración predichos mediante el uso de la ecuación obtenida de

la curva de calibración y la concentración real de las soluciones. La aceptación

de la exactitud se basó en el valor superior a 0.99 del coeficiente de

determinación (r2). También se evaluó mediante el análisis del error relativo de

la determinación de la concentración aplicando la ecuación obtenida. El error

relativo se calculó aplicando la ecuación 4.

Donde:

valor observado= Concentración obtenida mediante la ecuación de regresión.

valor esperado= Concentración nominal del estándar.

Ecuación 3

Ecuación 4

60

2.3.4.4 Límite de detección

Se realizó experimentalmente, mediante la inyección por duplicado de

soluciones estándares de concentración decreciente. Se tomó como límite de

detección la concentración más baja que nos diera señal analítica.

2.3.4.5 Límite de cuantificación

Se realizó experimentalmente, mediante la inyección por quintuplicado

soluciones estándares de 1.5 µg mL-1 de concentración. EL criterio de

aceptación fue que la señal tuviera un % DER menor al 10 %.

2.4 Métodos de preparación de muestras.

2.4.1 Extracción con polímeros molecularmente impresos.

61

La SPE se realizó con cartuchos con polímeros molecularmente

impresos de 25 mg y 10 mL de capacidad, utilizando una estación de vacío de

24 posiciones. Los cartuchos se acondicionaron utilizando 1 mL de

diclorometano (DCM), 1 mL de metanol y 1 mL de agua bidestilada. Se

utilizaron las condiciones recomendadas por el fabricante, las cuales se

muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Condiciones de la SPE-MIP. Fase Variable Condición

Carga de muestra

Volumen de muestra 5 mL

Velocidad de flujo 0.5 mL min-1

Lavado Agua 2 porciones de 1 mL

Vacío alto 10 min

Tolueno 1 mL

Tolueno:DCM (9:1 v/v) 1 mL

Tolueno: DCM (4:1 v/v) 1 mL

Vacío 2 min

Elución DCM:Metanol (9:1 v/v) 2 porciones de 1 mL, aplicar vacío entre cada porción.

Velocidad de flujo 0.2 mL min-1

62

2.4.1.1 Perfil de elución.

Para determinar el volumen de eluente a ser colectado para recuperar la

máxima cantidad de analito, se estableció el perfil de elución. Para ello con los

cartuchos acondicionados, se extrajeron 5 mL de una solución de 0.1 µg mL-1

de NNAL y del iso-NNAL-d3 a pH 6.4 y realizando la elución con 10 mL de una

mezcla Diclorometano-Metanol (9:1). Se colectaron fracciones de 1 mL, se

evaporaron con nitrógeno y se reconstituyó con 150 µL de metanol. Se

analizaron con las condiciones presentadas en la tabla 17.

2.4.2 Microextracción en fase sólida (SPME)

Con el fin de establecer las mejores condiciones de extracción y

desorción del NNAL, de la matriz de interés a la fibra y de la fibra al sistema

analítico respectivamente, se estudiaron las variables que de acuerdo a la

bibliografía pueden tener influencia sobre el comportamiento del sistema.

63

Durante el desarrollo de estas etapas se utilizó el GC-MS y el programa de

temperatura mostrado en la Tabla 7.

Tabla 7 Condiciones de análisis por GC-MS.

Columna cromatográfica DB-17 MS


Flujo 1 mL min-1

Programa de temperaturas:

Inicial.

80 °C mantener 1 min

Rampa 1. 15 °C/min hasta 190 °C y mantener 25 minutos



La optimización se realizó en tres etapas: la selección de fibra para SPME, la

optimización de la desorción y por último, la optimización de la extracción.

Antes de comenzar con los experimentos de optimización de la SPME,

se acondicionaron las fibras según las recomendaciones del proveedor, las

cuales fueron:

a) 250 °C por 30 minutos para la fibra de DVB-PDMS de 65 µm.

b) 270 °C por 60 minutos para la fibra de DVB-CAR-PDMS 50-30 µm.

c) 280 °C por 60 minutos para la fibra de PA de 85 µm.

64

d) 300 °C por 60 minutos para la fibra de Carboxen-DVB de 85 µm.

Las extracciones se realizaron utilizando las condiciones de extracción

que se muestran en la Tabla 8, en modalidad headspace y con agitación

magnética a 500 revoluciones por minuto (rpm). El dispositivo de extracción se

montó de acuerdo al diagrama que se muestra en la Figura 4, el cual consistió

en un baño de agua colocado sobre una placa de calentamiento y agitación con

temperatura regulada. Se introdujo una barra magnética al vial para mantener la

muestra en agitación constante, posteriormente, éste se sumergió

completamente en posición vertical en el baño de temperatura y transcurrido el

tiempo de equilibrio, se perforó la septa con el portafibras de SPME, se fijó en la

posición adecuada, para finalmente exponer la fibra y proceder a la extracción

por el tiempo establecido. Al término del tiempo de extracción, la fibra se extrajo

y se introdujo en el inyector para el análisis por GC.

Figura 4 Montaje del Dispositivo de Extracción por HS-SPME.

65

Tabla 8 Condiciones de trabajo empleadas para la selección de fibra de SPME.

2.4.2.1 Selección de la fibra para SPME.

Para la selección de la fibra más adecuada, se estudió el

comportamiento de las fibras de, PA de 85 µm, DVB-PDMS de 65 µm,

DVB-CAR-PDMS 50-30 µm y carboxen-PDMS de 85 µm. Se realizaron

extracciones por triplicado, a partir de una solución de estándares a una

concentración de 4 µg mL-1 para el NNAL y de 1 µg mL-1 para el iso NNAL-d3.

Las condiciones de extracción utilizadas fueron las indicadas en la Tabla 8.

EXTRACCIÓN TIEMPO DE EQUILIBRIO 10 MINUTOS

Tiempo de extracción 60 minutos

Temperatura de extracción 70 °C

Adición de NaCl 0%

Adición de ACN 0%

Volumen de headspace 5 mL

Desorción Temperatura del inyector 230 °C

Apertura de la válvula de split

A los 5 minutos

66

Transcurrido el tiempo de extracción, se analizó por GC-MS según el

programa de temperatura que se presenta en la tabla 17. La fibra de SPME se

limpió en el GC-FID mediante su exposición en el inyector a

250 °C por 20 minutos, con lo cual la fibra quedó preparada para la siguiente

extracción.

La selección de la fibra más adecuada se realizó comparando las áreas

obtenidas y el % DER observada para el NNAL. Se seleccionó la fibra que

mostró los valores menores de % DER y que no presentó analitos remanentes

después de la limpieza.

2.4.2.2 Optimización de las condiciones de extracción.

Para el establecimiento de las condiciones óptimas para la extracción de

los analitos de la fibra seleccionada, se realizó un diseño de experimentos de

Plackett- Burman a dos nivelesy completamente aleatorizado. Se empleó el

software Modde v11.0 de Umetrics. En la tabla 9 se muestran los experimentos

planteados.

67

Tabla 9 Experimentos propuestos para la optimización del proceso de extracción de

acuerdo al diseño de Plackett - Burman.

Exp No

Tiempo de

extracción (min)

Tiempo de

equilibrio (min)

Temperatura de

Extracción (°C)

Adición de

NaCl (% p/v)

Adición solvente orgánico

(5 % )

Volumen de

muestra (mL)

Agitación (rpm)

1 60 10 50 5 ACN 5 700 2 60 30 50 0 MeOH 10 700 3 60 30 80 0 ACN 5 400 4 30 30 80 5 ACN 10 700 5 60 10 80 5 MeOH 10 400 6 30 30 50 5 MeOH 5 400 7 30 10 80 0 MeOH 5 700 8 30 10 50 0 ACN 10 400 9 45 20 65 2.5 ACN 8 550

10 45 20 65 2.5 ACN 8 550 11 45 20 65 2.5 ACN 8 550

Con los resultados obtenidos, se seleccionaron las variables que tienen una

mayor influencia en la eficiencia de la extracción del NNAL. Las condiciones

óptimas para dichas variables se establecieron utilizando la proyección de

optimización del mismo programa.

2.4.2.3 Optimización de las condiciones de desorción.

La optimización de la etapa de desorción para la fibra de DVB-PDMS de

65 µm, se realizó mediante un diseño simplex secuencial básico de dos

variables, donde inicialmente se plantearon 3 experimentos, los cuales se

68

presentan en la Tabla 10. En base a los resultados de la suma de áreas tanto

del NNAL como del iso-NNAL-d3, se calcularon los siguientes experimentos en

base a la ecuación 5.

Ecuación 5

Donde:

es el nuevo valor de la variable

es el promedio de los valores de la variable en los experimentos que

produjeron las mejores respuestas.

es el valor de la variable en el experimento que produjo la peor

respuesta.

Se plantearon como condiciones máximas una temperatura de 260 °C y

un tiempo de 5 min.

Tabla 10 Experimentos iniciales para la optimización del proceso de desorción.

Experimento Temperatura

(°C) Tiempo (min)

1 230 3 2 250 3 3 240 5

69

2.4.3 Extracción con cartuchos tC18

La SPE se realizó con cartuchos que contienen silica modificada con

cadenas de hidrofóbicas de 18 carbonos, de 1 g de fase extractante y un

volumen de 6 mL, utilizando una estación de vacío de 24 posiciones. Los

cartuchos se acondicionaron utilizando 10 mL de metanol y 10 mL de agua

bidestilada.

2.4.3.1 Optimización de la extracción.

Se planteó un diseño de experimentos de Plackett-Burman a dos niveles,

completamente aleatorizado. Se empleó el software Modde v8.0 de Umetrics.

En la tabla 11 se muestran los experimentos planteados. Previo a la elución de

los analitos, se realizó un paso de secado del cartucho para eliminar el agua

70

remanente del cartucho, esto se realizó aplicando alto vacío por 2 min. La

elución de los cartuchos se realizó con 5 mL de metanol al 100%. El eluato se

evaporó a sequedad bajo corriente de nitrógeno y se reconstituyó en 150 µL de

Metanol para su análisis por GC-MS.

Tabla 11 Experimentos propuestos para la optimización del proceso de extracción SPC-tC18 de acuerdo al diseño de Plackett -Burman.

Exp. No

Velocidad de carga

(mL/min)

% Metanol en la solución de

lavado

Volumen de solvente de lavado

(mL)

Velocidad de elución (mL/min)

1 0.5 5 2 0.2 2 5 5 2 2 3 0.5 20 2 2 4 5 20 2 0.2 5 0.5 5 6 2 6 5 5 6 0.2 7 0.5 20 6 0.2 8 5 20 6 2 9 2.75 12.5 4 1.1

10 2.75 12.5 4 1.1 11 2.75 12.5 4 1.1

Con los resultados obtenidos, se seleccionaron las variables que tienen una

mayor influencia en la eficiencia de la extracción del NNAL. Las condiciones

óptimas para dichas variables se establecieron utilizando la proyección de

optimización del mismo programa.

71

2.4.3.2 Perfil de Elución.

Para determinar el volumen de eluente a ser colectado para recuperar la

máxima cantidad de analito, se estableció el perfil de elución. Para ello con los

cartuchos acondicionados, se extrajeron 10 mL de una solución de 0.05 µg mL-1

de NNAL y del iso-NNAL-d3 a pH 6.4. La extracción se realizó con las

condiciones óptimas, el paso de elución del cartucho se realizó con 10 mL de

metanol. Se colectaron fracciones de 1 mL, se evaporaron con nitrógeno y se

reconstituyó con 150 µL de metanol. Se analizaron con las condiciones

presentadas en la tabla 17.

72

2.4.5 Selección del método de preparación de muestra.

Para la selección del método para la determinación del NNAL libre y total,

se evaluaron las diferentes metodologías desarrolladas en cuanto la eficiencia

de extracción. También se evaluaron la desviación estándar relativa de los

porcentajes de recuperación, así como el tiempo y el costo por análisis. Se

seleccionó el método que diera los mejores % de recuperación con mayor

precisión y menor tiempo y costo por análisis.

2.4.5.1 Eficiencia de extracción.

Para evaluar la eficiencia de extracción se determinó el porcentaje de

recuperación de cada método. Se realizaron extracciones por triplicado de orina

de no fumadores adicionada con 100 ng mL-1 y se calculó el porcentaje según

la ecuación 6.

73

2.4.6 Validación del método de preparación de muestra seleccionado.

Para asegurar el comportamiento adecuado del método desarrollado

para el análisis de NNAL, se evaluaron la linealidad, precisión, exactitud, límite

de cuantificación y el límite de detección con base en lo recomendado por la

FDA,73 siguiendo un proceso semejante al descrito en la sección 2.3.4.1 a

2.3.4.5, utilizando las soluciones preparadas en la sección 2.2.9.

100

int

intRe%

estándarelen

ernoestándardeláreaanalitodelárea

extraídamuestralaenernoestándardelárea

analitodelárea

cuperación

Ecuación 6

74

2.4.7 Aplicación del método

Se realizó el análisis de 2 muestras de orina de sujetos fumadores y de

no fumadores adicionada a 2 ng mL-1, la cual es la concentración

correspondiente al límite de cuantificación del método desarrollado.

75

CAPÍTULO 3

RESULTADOS

3.1 Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS)

En esta sección se presentan los resultados obtenidos en el desarrollo

del método cromatográfico.

76

3.1.1 Confirmación de la identidad de los analitos.

Con la finalidad de asignar las identidades de los picos cromatográficos

obtenidos, se analizaron individualmente soluciones estándares de 25 µg mL-1

del NNAL e iso-NNAL d3, empleando las condiciones iniciales para cada

columna cromatográfica, mencionadas en las tablas 3 a la 5. En las figuras 5 y

6 se muestran los espectros de masas obtenidos para cada compuesto en el

rango de 50 a 350 m/z.

77

Figura 5 Espectro de masas de una solución estándar de NNAL de 25 µg mL-1 obtenido con el programa inicial de temperatura para

la columna HP-5MS.

78

Figura 6 Espectro de masas de una solución estándar de iso-NNAL d3 de 25 µg mL-1 obtenido con el programa inicial de

temperatura para la columna HP-5MS.

79

3.1.2 Optimización de las condiciones de separación cromatográfica y selección

de columna.

Para la separación cromatográfica, se evaluaron diferentes columnas, para

lo cual se partió de las condiciones iniciales propuestas en las tablas 3 a la 5. Se

realizaron modificaciones a las rampas de temperatura con el fin de obtener una

separación adecuada. En las figuras 7 a la 12 se muestran los cromatogramas

obtenidos y el programa de temperatura utilizados. Las figuras 7 y 8 corresponden

a la columna HP 5MS, las figuras 9 y 10 presentan los cromatogramas

correspondientes a la columna DB 17 y finalmente, de la figura 11 y 12 a los

cromatogramas obtenidos con la columna DB 1701.

80

Gas acarreador Helio a 1 mL/min

Temperatura Inyector: 230 °C

Programa de temperatura:

Inicial: 80 °C mantener 2 min

Rampa 1: 10 °C/min hasta 160 °C y mantener 1 min

Rampa 2: 2 °C/min hasta 200 °C mantener 2 min.


iso-NNAL d3

NNAL

TIC

Figura 7 Desarrollo del programa de temperatura para la columna HP-5MS. Programa inicial.

81

Figura 8 Desarrollo del programa de temperatura para la columna HP-5MS. Programa final.

82








iso-NNAL d3

NNAL

TIC

Figura 9 Desarrollo del programa de temperatura para la columna DB-17. Programa inicial.

83







Condiciones del detector:

Temperatura Auxiliar: 260 °C

Temperatura Fuente: 230 °C

Temperatura del analizador: 150 °C

Modo de adquisición de datos: Barrido completo

de 50-350 m/z.

iso-NNAL d3

NNAL

TIC

Figura 10 Desarrollo del programa de temperatura para la columna DB-17. Programa final.

84








iso-NNAL d3

NNAL

TIC

Figura 11 Desarrollo del programa de temperatura para la columna DB-1701. Programa inicial.

85












Modo de adquisición de datos: Barrido completo

de 50-350 m/z.

iso-NNAL d3

NNAL

TIC

Figura 12 Desarrollo del programa de temperatura para la columna DB-1701. Programa final.

86

3.1.3 Establecimiento de los parámetros de adquisición de datos.

Mediante el análisis de los espectros de masas obtenidos, mostrados en las

figuras 5 y 6, se determinaron los iones principales para cada compuesto, siendo

los iones 148 y 108 m/z para el NNAL y los iones 150 y 117 para el iso-NNAL d3.

Una vez obtenidas las mejores condiciones para la separación cromatográfica, se

cambió la adquisición de datos de barrido completo a monitoreo de ión selectivo,

con la finalidad de aumentar la sensibilidad del método cromatográfico

desarrollado. Para ello se establecierondos ventanas de adquisición de datos; los

iones incluidos y el tiempo de monitoreo de cada ventana, se indica en la tabla 12.

Los cromatogramas obtenidos mediante este modo de adquisición de datos, se

muestran en las Figuras 13 a la 15.

Tabla 12 Ventanas de monitoreo para el modo SIM

Columna Tiempo (min) Iones monitoreados

(m/z) Compuesto

HP 5MS 5 - 20.5 150 y 117 iso-NNAL d3

20.5- 37.5 148 y 108 NNAL

DB-1701 5 -20 150 y 117 iso-NNAL d3

20 - 33 148 y 108 NNAL

DB-17 y

DB-17MS

5 - 23.5 150 y 117 iso-NNAL d3

23.5 - 37 148 y 108 NNAL

87






Rampa 2: 2 °C/min hasta 210 °C mantener 2 min.






Modo de adquisición de datos: SIM

iso-NNAL d3

NNAL

SIR

Figura 13 Cromatograma obtenido con programa final de temperatura para la columna HP-5MS, adquisición de datos SIM.

88











Modo de adquisición SIM

iso-NNAL d3

NNAL

SIR

Figura 14 Cromatograma obtenido con programa final de temperatura para la columna DB-17, adquisición de datos SIM.

89












Modo de adquisición de datos: SIMiso-NNAL d3

NNAL

SIR

Figura 15 Cromatograma obtenido con programa final de temperatura para la columna DB-1701, adquisición de datos SIM.

90

3.1.4 Selección de Columna Cromatográfica.

3.1.4.1 Resolución de los picos cromatográficos.

Con los programas de temperatura finales para cada columna, se

analizaron por duplicado soluciones estándares de la mezcla de NNAL e

iso-NNAL-d3 con una concentración de 25 µg mL-1 para cada compuesto y se

calculó la resolución de los picos cromatográficos del NNAL y del iso-NNAL-d3.

Los resultados se muestran en la tabla 13.

Tabla 13 Resoluciones de los picos cromatográficos con las diferentes columnas.

Columna Cromatográfica Resolución

HP-5MS 1.44

DB-17 6.00

DB-1701 3.33

91

3.1.4.2 Asimetría de los picos cromatográficos.

Con los programas de temperatura finales para cada columna, se

analizaron por duplicado soluciones estándares de la mezcla de NNAL e

iso-NNAL-d3 con una concentración de 25 µg mL-1 para cada compuesto y se

calcularon los factores de asimetría de cada columna; los resultados se muestran

en la tabla 14, donde se puede observar que la columna DB-1701 presenta los

mejores factores de asimetría, es decir valores cercanos a la unidad.

Tabla 14 Factores de asimetría del iso-NNAL-d3 y el NNAL con cada columna cromatográfica.

aLas medidas están expresadas en mm.

Debido a que se cambió el modo de adquisición de datos, de barrido

completo o full scan a monitoreo de iones únicos o SIM, se calcularon los factores

de asimetría cuando se adquirieron los datos en modo SIM, los cuales se

muestran en la tabla 15.

Columna iso-NNAL-d3 NNAL

aa ba wa TF aa ba wa TF

HP 5 MS 4.25 6.5 10.75 1.27 7.75 10 17.75 1.14

DB-17 7.25 4 11.25 0.78 3.75 2.25 6 0.80

DB-1701 4.25 4.5 8.75 1.03 5.75 5.5 11.25 0.98

92

Tabla 15 Factor de asimetría para cada columna cromatográfica en cromatogramas obtenidos por SIM.

Las columnas DB-17 y la DB-1701 presentaron un TF menor a 1, lo cual

indica que hay distorsión frontal de los picos cromatográficos, mientras que la

columna HP-5MS da un TF cercano a 1.

3.1.4.3 Límites de detección.

Los resultados obtenidos al realizar estas pruebas se muestran en la tabla

16, donde se puede observar que la mínima concentración detectada bajo el

sistema de adquisición de datos SIM fue de 0.5 µg mL-1 para las columnas

HP-5MS y DB-17 mientras que para las columnas DB-1701 y DB-17MS fue de

0.001 µg mL-1.

Columna

iso-NNAL-d3 NNAL

aa ba wa TF aa ba wa TF

HP 5 MS 5.75 5.75 11.5 1.01 10 9 19 0.95

DB-17 7.25 3.25 10.5 0.72 3.5 1.5 5 0.71 DB-1701

4.5 4.25 8.75 0.97 7.25 4 11.25 0.78

93

Tabla 16 Resultados de sensibilidad obtenidos (n=2). Concentración

(µg mL-1) Columna HP-5MS

Columna DB-1701

Columna DB-17

Columna DB-17MS

Área Área Área Área

1x10-5

N.D. N.D. N.D. N.D.

1x10-4

N.D. N.D. N.D. N.D.

1x10-3

N.D. 2280 N.D. 1208

1x10-2

N.D. 3035.5 N.D. 1221

0.1 N.D. 13805 N.D. 16318 0.5 3684 51924 2707 188052 1 11178.5 123474.5 9258.5 226243 5 135660 1056425.5 102103.5 N.R.

25 2659882 10573100 1062989 N.R. N.D.= No detectado N.R.= No realizado

3.1.4.4 Prueba preeliminar del desempeño de la columna con extractos de orina.

Con las columnas DB-1701 y la DB-17, se analizaron extractos de orina,

obtenidos mediante extracción líquido-líquido y utilizando los programas finales

para cada columana, en las figuras 16 y 17 se muestran los cromatogramas

obtenidos.

94

Figura 16 Cromatograma de extracto de orina adicionada a 15 ng mL-1 obtenido con la columna DB-1701

95

Figura 17 Cromatograma de extracto de orina adicionada a 15 ng mL-1 obtenido con la columna DB-17.

iso-NNAL-d3

NNAL

96

3.1.4.5 Modificaciones al programa de temperaturas para la columna DB-17.

Al utilizar la columna DB-17, se observó que las formas de los picos

cromatográficos habían cambiado, por lo que se plantearon modificaciones para

volver a ajustar las formas de los mismos; en la tabla 17 se muestra el programa

de temperatura final para la columna.

Tabla 17 Condiciones cromatográficas para el análisis por GC-MS con la columna DB 17 y DB-17 MS.




Inicial:

Rampa 1:

Rampa 2:

Rampa 3:

80 °C mantener 1 min

15 °C/min hasta 190 °C y mantener 12 min



Temperatura de la interfase 260 °C

Temperatura del analizador 150 °C

Temperatura de la fuente 230 °C

Adquisición Monitoreo de ion selectivo (SIM)

97


3.1.5.1 Linealidad.

Para validar el sistema cromatográfico se construyeron curvas de

calibración con el método de estándar interno (9 niveles de concentración por

triplicado), por lo que en la construcción de las mismas se graficó la relación de

áreas del NNAL/iso NNAL d3. En la figura 18 se puede observar el tipo de curva

obtenida, la cual al realizar la inspección visual no ajusta a una regresión lineal,

además de que el coeficiente de determinación (r2) fue inferior al 0.99, valor

recomendado por la FDA.73

Figura 18 Curva de calibración de NNAL con regresión lineal.

98

Se realizó un análisis, donde se encontró que los datos presentaron buen

ajuste a una ecuación de segundo grado (r2= 0.997), como se puede observar en

la figura 19.

Figura 19 Curva de calibración con regresión polinomial de segundo grado.

3.1.5.2. Precisión.

Los resultados obtenidos para la evaluación de la precisión intradía, se

muestran en la tabla 18, donde el % DER fue menor al 6 %.

99

Tabla 18 Precisión intradía (n=3).

Concentración (µg mL-1) Relación promedio % DER

0.1 0.0638 5.90

1 0.7301 4.64

5 9.0660 3.85

3.1.5.3 Exactitud.

Con la finalidad de evaluar la exactitud del sistema, se realizó el cálculo de

concentraciones utilizando la ecuación obtenida de la curva de calibración.

Posteriormente se graficó la concentración nominal de los estándares de

calibración y la concentración calculada para cada estándar aplicando la ecuación

de la recta de la curva de calibración. La gráfica obtenida se muestra en la Figura

20, en la cual podemos observar un valor de r2 de 0.998 y una pendiente con un

valor de 1.006, un valor cercano a la unidad.

Además, se calculó el error relativo de cada nivel de concentración, cuyos

resultados se muestran en la tabla 19.

100

Figura 20 Gráfica para el análisis de correlación entre las concentraciones para evaluar

exactitud.

Tabla 19 Valores de error absoluto y % de error relativo para la evaluación de la exactitud del método cromatográfico (n=3).

Concentración esperada (µg mL-1)

Concentración promedio calculada

(µg mL-1)

Error absoluto promedio (µg mL-1)

Error relativo (%)

0.1 0.09 0.01 14.66

0.2 0.15 0.05 22.52

0.3 0.23 0.07 23.58

0.4 0.36 0.04 8.94

1 1.06 0.06 6.48

2 2.09 0.09 4.40

3 3.01 0.05 1.82

4 3.91 0.09 2.16

5 5.04 0.07 1.47

r2 = 0.998

101

3.1.6.4 Límite de detección y límite de cuantificación.

Para evaluar la sensibilidad del sistema cromatográfico, se determinaron

experimentalmente los límites de detección y cuantificación. El límite de detección

fue de 0.001 µg mL-1, mientras el límite de cuantificación se estableció en

0.05 µg mL-1 con un % DER de 18 %.

3.2 Preparación de Muestras

En esta sección se muestran los resultados obtenidos al desarrollar los

distintos métodos para la preparación de muestra.

102

3.2.1 Extracción con Polímeros Molecularmente Impresos.

Se utilizaron cartuchos de extracción en fase sólida con polímeros

molecularmente impresos de 25 mg de fase extractante y 10 mL de capacidad, se

preparó el cartucho según lo descrito en la sección 2.4.1 y el procedimiento se

realizó según lo descrito en la tabla 6 de la sección 2.4.1.1.


Con la finalidad de determinar el volumen de elución a utilizar, se realizó el

perfil de elución, los resultados obtenidos se muestran en la tabla 20. Se decidió

realizar la elución con un volumen de 4 mL de la mezcla Metanol:DCM (9:1 v/v) y

para asegurar que el cartucho esté libre de analitos, se lavó con 4 mL del solvente

de elución.

103

Tabla 20 Áreas obtenidas en el perfil de elución (n=2).

mL Área NNAL Área iso-NNAL d3

1 453753 3752225

2 618 5951

3 124 1232

4 79 586

5 0 0

6 0 0

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 0 0

El método desarrollado de SPE-MIP para el análsis de NNAL se muestra en la

Tabla 21.

Tabla 21 Condiciones del método de SPE-MIP final. Fase Variable Condición

Carga de muestra

Volumen de muestra 5 mL Velocidad de flujo 0.5 mL min-1

Lavado Agua 2 porciones de 1 mL Vacío alto 10 min Tolueno 1 mL

Tolueno:DCM (9:1 v/v) 1 mL Tolueno: DCM (4:1 v/v) 1 mL

Vacío 2 min Elución DCM:Metanol (9:1 v/v) 4 porciones de 1 mL, aplicar

vacío entre cada porción. Velocidad de flujo 0.2 mL min-1

104

Figura 21 Cromatograma de una muestra de orina adicionada con 0.1 µg mL-1 del NNAL y del estándar interno obtenido con el método SPE-MIP descrito en la tabla 21.

3.2.2 Microextracción en fase sólida (SPME).

Se utilizaron 4 fibras de extracción en fase sólida para compuestos volátiles

y semivolátiles.

105

3.2.2.1 Selección de fibra.

Para seleccionar el recubrimiento más adecuado para la SPME, se

probaron cuatro fibras disponibles comercialmente. Los resultados obtenidos se

muestran en la Figura 22, en donde se observa que las fibras DVB-CAR-PDMS y

CARBOXEN-PDMS no extraen a los analitos.

Figura 22 Selcción de la fibra de SPME más adecuada.

106

También se puede observar que la fibra de PA extrajo mayormente al estándar

interno, las áreas obtenidas con la fibra fueron de 25202 con un 31.03 % DER de

para el NNAL y de 53059 con un 20.98 % DER de para el iso-NNAL-d3. Por otro

lado, la fibra de DVB-PDMS extrajo tanto al NNAL como al iso-NNAL-d3 con áreas

obtenidas de 52141 con un 16.07 % DER para el NNAL y de 17799 con un 21.32

% DER para el iso-NNAL-d3, siendo el NNAL el que mejor se extrajo.

3.2.2.2 Optimización del proceso de desorción.

En la tabla 22 se muestran los resultados obtenidos en cada uno de los

experimentos planteados, se tomó como límite la temperatura de 260 °C ya que en

esta temperatura se comenzó a observar que los picos cromatográficos

cambiaban de forma. Además de la suma de áreas se consideró la relación de

áreas obtenidas, las cuales fueron mayores a 250 °C por 3 minutos, por lo que se

establecieron estas condiciones como óptimas.

107

Tabla 22 Diseño Simplex Secuencial Básico para la optimización de la desorción térmica de la fibra DVB-PDMS.

Experimento Temperatura

(°C) Tiempo (min)

Suma áreas

1 230 3 30395

2 250 3 88928

3 240 5 83800

4 260 5 165850

5 260 3 156003

3.2.2.3 Optimización del proceso de extracción


experimentos planteados en el diseño factorial fraccionado. Al examinar el ajuste

de las variables en estudio y las respuestas obtenidas, mediante el uso de

regresión lineal múltiple (MRL). El valor del porcentaje de variación explicada por

el modelo matemático (R2) fue de 0.938 y el valor de la varianza para la respuesta

predicha mediante validación cruzada (Q2) fue de -1.615. Para comprobar si este

valor mejoraba, se realizó un análisis por ajuste de mínimos cuadrados parciales

(PLS), donde se observó que el valor Q2 presentó un aumento, por lo que se

108

Tabla 23 Respuesta obtenidas de los experimentos del diseño factorial fraccionado para la optimización de la extracción de la SPME.

Exp Tiempo de extracción

(min)

Tiempo de

equilibrio (min)

Temperatura de

Extracción (°C)

Adición de NaCl

(%)

Adición de

Solvente orgánico

(5 %)

Volumen de

muestra (mL)

Agitación (rpm)

Relación de áreas

1 60 10 60 5 Metanol 10 700 4.438 2 60 30 60 0 Acetonitrilo 5 700 1.844 3 60 30 80 0 Metanol 10 400 3.116 4 30 30 80 5 Metanol 5 700 1.95 5 60 10 80 5 Acetonitrilo 5 400 2.058 6 30 30 60 5 Acetonitrilo 10 400 2.228 7 30 10 80 0 Acetonitrilo 10 700 1.818 8 30 10 60 0 Metanol 5 400 1.989 9 45 20 70 2.5 Ninguno 8 550 2.972 10 45 20 70 2.5 Ninguno 8 550 2.876 11 45 20 70 2.5 Ninguno 8 550 2.224

realizó un análisis de descarte variable por variable para identificar cuál era la que

presentó problemas en el ajuste del modelo. Se observó que al eliminar la variable

de la agitación y volver a realizar el ajuste del modelo mediante MRL, se

obtuvieron coeficientes aceptables. De lo anterior se obtuvo la ecuación 7.

Ecuación 7

109

De esta ecuación podemos observar que el tiempo de equilibrio (t equilibrio), la

temperatura de extracción (T° ext) y la adición de solvente orgánico presentan

coeficientes negativos lo que indica que el sistema mejora la respuesta al

disminuir el valor adoptado por cada variable. Mientras las varibles tiempo de

extracción (t Ext), adición de cloruro de sodio (adición NaCl) y el volumen de

muestra presentaron un coeficiente positivo, es decir que la relación de áreas

mejora al aumentar el valor adoptado por variable.

Del gráfico de coeficientes, presentado en la Figura 23a, se observó que las

variables tiempo de extracción, adición de solvente orgánico y volumen de la

muestra son las que tienen mayor significancia para optimizar la respuesta de

acuerdo al valor presentado de los coeficientes observados en la ecuación 7 así

como del intervalo de confianza.

Se realizó un análisis de gráficas de contorno de 2 variables a la vez donde se

obsrva la tendencia de los valores de las variables y como se interrelacionan entre

ellas. Y al utilizar la aplicación ―Optimizer‖ del software, el cual trabaja con

modelos simulados por medio de un diseño de experimento simplex, se obtuvieron

las condiciones que se muestran en la tabla 24 como óptimas.

110

Figura 23 Gráfica de coeficientes de las variables investigadas en la optimización de la extración. TExt=Tiempo de extracción, TEq= Tiempo de equilibrio, Temp= Temperatura de extracción, NaCl= Adición de cloruro de sodio, SOrg= Adición de solvente orgánico y Vmta= Volumen de la muestra.

Para corroborar el resultado obtenido mediante el "Optimizer" se realizó un

análisis por triplicado de muestras de orina y se calculó la desviación estándar

relativa (% DER), se obtuvo una relación de 4.40 con un 6.7 % DER, en la Figura

24 se muestra el cromatograma del análisis de una muestra de orina adicionada.

111

Tabla 24 Condiciones óptimas para el método de HS-SPME del NNAL.

EXTRACCIÓN Tiempo de equilibrio 10 minutos

Tiempo de extracción 60 minutos Temperatura de extracción 60 °C

Adición de NaCl 5 % Adición de solvente

orgánico Metanol 5 %

Volumen de Headspace 5 mL Volumen de muestra 10 mL

Agitación 700 rpm Desorción

Temperatura 250 °C Tiempo 3 minutos

Figura 24 Cromatograma de una muestra de orina adicionada con 4 µg mL-1 del NNAL y 1 µg mL-1 del estándar interno obtenido con el método HS-SPME descrito en la tabla 24.

112

3.2.3 Extracción en fase sólida con cartuchos tC18.

Se realizó la optimización del método de extracción utilizando cartuchos

Sep Pack t C18 de 1g con capacidad de 6 mL. Se acondicionaron con 10 mL de

metanol y 10 mL de agua bidestilada.

3.2.3.1 Optimización del método de extracción


experimentos planteados en el diseño factorial fraccionado. Al examinar el ajuste

de las variables en estudio y las respuestas obtenidas, mediante el uso de

regresión lineal múltiple (MRL), se observó que el porcentaje de la variación

explicada por el modelo (R2) de 0.809, al igual que la validez del modelo y la

reproducibilidad, sin embargo el valor de Q2 indica que el modelo no presenta una

113

buena predicción de nuevos datos de acuerdo a los resultados obtenidos en la

validación cruzada (Q2= 0.135). Para comprobar si este valor mejoraba, se realizó

un análisis por ajuste de mínimos cuadrados parciales (PLS). Se examinó el

comportamiento de las variables, encontrando que la velocidad de carga y la

velocidad de elución no erán correctamente descritas por el modelo. Al eliminar

estas variables se obtuvieron coeficientes aceptables al repetir el ajuste del

modelo mediante MRL; con el nuevo ajuste se obtuvo la ecuación 8.

Tabla 25 Respuesta obtenidas de los experimentos del diseño factorial fraccionado para

la optimización de la extracción de la SPE tC18.

Exp. No

velocidad de carga (mL/min)

% Metanol en la solución de

lavado

Volumen de solvente de lavado (mL)

Velocidad de elucion

(mL/min)

Área del NNAL

1 0.5 5 2 0.2 5005360 2 5 5 2 2 4804780 3 0.5 20 2 2 3632190 4 5 20 2 0.2 3929300 5 0.5 5 6 2 3763970 6 5 5 6 0.2 3873700 7 0.5 20 6 0.2 225738 8 5 20 6 2 62087 9 2.75 12.5 4 1.1 4534500 10 2.75 12.5 4 1.1 3694290 11 2.75 12.5 4 1.1 3944030

Ecuación 8

114

En el gráfico de coeficientes presentado en la Figura 25, se observó que las

variables % de Metanol en la solución de lavado y el volumen de solución de

lavado mostraron tener influencia en el desempeño de la extracción, se observó

que la recuperación del analito aumentaba al disminuir las variables, lo cual se

indica en la ecuación 8 donde los coeficientes de las variables son negativos. Se

utilizó la aplicación Optimizer del software, el cual trabaja con modelos simulados

empleando un diseño de experimento simplex, para ellos se cambiaron las

condiciones límites para el porcentaje de metanol en la solución de lavado siendo

el límite 1 % de metanol y se obtuvieron las condiciones que se muestran en la

tabla 26 como óptimas.

Figura 25 Gráfica de coeficientes de las variables investigadas en la optimización de la

extración por SPE tC18.

115

Tabla 26 Condiciones óptimas para el método de SPE tC18 del NNAL.

EXTRACCIÓN Velocidad de carga 3 mL min-1

% metanol en la solución de lavado

1 %

Volumen de solución de lavado 2 mL

Velocidad de elución 1 mL min-1

En la tabla 27 se muestran los resultados obtenidos con el método de extracción

óptimo para SPE tC18; también se realizó un experimento con 5 % de metanol en

la solución de lavado y se compararon los resultados obtenidos.

Tabla 27 Comparación de áreas de NNAL con solución de lavado de diferente composición.

1 % MEOH 5 % MEOH

Réplica 1 4362509 4999695

Réplica 2 4792136 4855044

Réplica 3 4968351 4817562

Promedio 4707665.33 4890767.00

DE 270540.88 96177.99

%DER 5.75 1.97

116

Se realizaron pruebas de significancia para ver si existía diferencia entre los

valores de área del NNAL, dando como resultado que los métodos no presentan

una diferencia significativa, con un 95 % de confianza, en la precisión ni en el

área de analito recuperada, por esta razón se seleccionó utilizar una solución de

lavado que contenga 5 % de metanol.


El perfil de elución que presentan tanto el analito como el estándar interno

se muestra en la tabla 28. De acuerdo con estos resultados, en los experimentos

subsecuentes se seleccionó eluir con 3 mL de metanol al 100 %.

117

Tabla 28 Áreas obtenidas en el perfil de elución de SPE tC18 (n=2).

Fracción (mL)

Área NNAL

Área iso-NNAL-d3

1 1197201 6601009.5 2 90188.5 691544 3 936 39917 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0

El método optimizado de SPE tC18 para la extracción de NNAL en orina se

presenta en la tabla 29. Con este método se realizó una extracción por triplicado

de muestra de orina de no fumador adicionada a 100 ng mL-1 y se obtuvo una

desviación estándar relativa de 1.6 % de la relación de áreas del NNAL/iso-NNAL-

d3; en la figura 26 se presenta el cromatograma obtenido.

Tabla 29 Condiciones finales para el método de SPE tC18 del NNAL.

EXTRACCIÓN Velocidad de carga 3 mL min-1

% Metanol en la solución de lavado

5 %

Volumen de solución de lavado

2 mL

Secado 2 min a alto vacío Elución

Volumen 3 mL de metanol al 100 %

Velocidad de elución 1 mL min-1

118

Figura 26 Cromatograma de una muestra de orina adicionada con 0.1 µg mL-1 del NNAL y del estándar interno obtenido con el método SPE-MIP descrito en la tabla 29.

3.3 Selección del método de extracción para la preparación de Muestras

Debido a que el método desarrollado para la extracción del NNAL por

HS-SPME mostró una baja recuperación, 40 veces menor a la observada con los

119

métodos de extracción en fase sólida, no se siguió trabajando con este método de

preparación de muestra. En la tabla 30 se muestran los resultados de

recuperación de los métodos de SPE-MIP y de SPE tC18 para el NNAL.

Tabla 30 Comparación de los métodos desarrollados (n=3).

Método % Recuperación %DER Tiempo Costo

SPE-MIP 120.0 8.3 120 min +++++

SPE tC18 130.3 10.0 60 min +++

3.4 Validación del método SPE-MIP para la determinación de NNAL

Se seleccionó el método de SPE-MIP como el que presentó mejor

desempeño. Los resultados obtenidos de la validación del método por SPE-MIP

para la determinación de NNAL en muestras de orina se muestran en la tabla 31.

120

Tabla 31 Datos obtenidos de la validación del método SPE-MIP desarrollado.

Parámetro Resultados

Linealidad

Regresión de segundo grado y= -7x10-5x2 + 0.010x +0.004

r2= 0.994

Precisión intradía 2 ng mL-1 10 ng mL-1 25 ng mL-1

8 % DER 4.7 % DER 1.3 % DER

Exactitud 2 ng mL-1 10 ng mL-1 25 ng mL-1

11.9 % Error Relativo 9.3 % Error Relativo 5.8 % Error Relativo

Correlación entre concentración

calculada y real

m= 1.040 r2= 0.993

Límite de detección 0.7 ng mL-1

Límite de cuantificación 2 ng mL-1, DER = 8 %.

3.5 Aplicación del método SPE-MIP para la determinación de NNAL en muestras de orina

En la tabla 32 se muestran los resultados del análisis de dos muestras de orina de

sujetos fumadores y de no fumadores adicionadas a 2 ng mL-1.

121

Figura 27 Cromatograma de mestra de orina de fumador extraída con el método de SPE-MIP.

122

Figura 28 Cromatograma de muestra de orina de no fumador adicionada a 2 ng mL-1 extraída con el método de SPE-MIP.

123

Tabla 32 Resultados del análisis de muestras de orina de fumador y no fumador

adicionadas (n=2).

Tipo de muestra Concentración

Orina fumador No detectado

Orina de no fumador adicionada 2.20 ng mL-1 ± 0.24 ng mL-1

124

CAPÍTULO 4

DISCUSIÓN

4.1 Cromatografía de Gases-Masas (GC-MS)

125

4.1.1 Establecimiento de las condiciones de separación cromatográfica.

Para obtener una separación satisfactoria de todos los analitos y el

estándar interno se evaluó el comportamiento de cuatro columnas

cromatográficas, las cuales se han reportado en diferentes referencias

bibliográficas.26, 74 Para cada una fue necesario evaluar diferentes programas de

temperatura hasta elegir aquel en el que las señales tanto del NNAL como del

iso-NNAL-d3 presentaran tiempos de retención diferentes y no solapados, es

decir, hasta obtener un cromatograma con buena resolución.

Para la identificación de los analitos, se realizaron inyecciones de los

estándares individuales y se obtuvo el espectro de masas promedio, los cuales se

muestran en las Figuras 5 y 6. Debido a que la versión de la biblioteca NIST con la

que se cuenta en el software del equipo, no se encuentran los espectros de masas

del NNAL e iso-NNAL-d3 se comparó con el espectro de masas reportado por

Sleiman et al.,75 siendo los espectros de masas obtenidos semejantes a lo

reportado.

En las figuras 7 a la 12 se muestran los cromatogramas obtenidos con las

diferentes columnas y las diversas modificaciones al programa de temperaturas.

Para evaluar el desempeño de la columna HP-5MS, se comenzó a trabajar con el

126

programa de temperatura previamente reportado por Bernet et al. 26 y como puede

observarse en el cromatograma mostrado en la figura 7, los picos cromatográficos

no se encuentran resueltos (Rs = 1.05) y presentan una forma asimétrica. Con la

finalidad de plantear las modificaciones pertinentes, se analizó el programa de

temperaturas y se determinó que la elución de estos analitos se produce a una

temperatura de 184 °C, con una velocidad de cambio de temperatura de

2 °C min-1.

Se realizaron diferentes modificaciones del programa de temperatura, así

como de la temperatura de la interfase, ya que el coleo puede ser ocasionado por

una incompatibilidad de temperaturas, es decir que la temperatura final del

programa de temperatura del horno este muy por debajo o muy por encima de la

temperatura de la interfase. En la Figura 8 se muestra el cromatograma obtenido

con el programa final de temperaturas presentado en la sección 3.1.2, en el cual

se logró una mejor resolución de los analitos y se mejoró la forma de los picos

cromatográficos; la resolución obtenida fue de 1.44.

Para evaluar el desempeño de la columna DB-17, se comenzó a trabajar

con el programa de temperatura previamente reportado por Bernert et al.26 En la

Figura 9 se puede observar el cromatograma obtenido con este programa de

temperatura, con el cual se logró una buena resolución (Rs = 1.81), pero los picos

cromatográficos presentaron una forma asimétrica. Se probó otro programa de

127

temperatura reportado por Zhou et al.74 quienes utilizaron una columna VF-17MS

con características de polaridad idénticas a la de la columna utilizada y se obtuvo

el cromatograma que se presenta en la figura 10, en el cual se logró una buena

resolución de los picos de los analitos y una forma de pico cromatográfico

simétrico.

Para la columna DB-1701, se comenzó a trabajar con el programa de

temperatura previamente reportado por Hencht et al.43 En la Figura 11 se muestra

el cromatograma obtenido con este programa de temperatura, en el cual los picos

cromatográficos presentaron una buena resolución (Rs= 4.4) pero fue difícil

evaluar la asimetría de los picos, puesto que los analitos eluían en una parte de

elevación de la línea base. Con la finalidad de plantear las modificaciones

pertinentes, se analizó el programa de temperaturas y se determinó que la elución

de estos analitos se produce a una temperatura de 210 °C, en un tiempo en que la

corrida cromatográfica presenta temperatura isotérmica.

Se realizaron diferentes modificaciones a las rampas de temperatura

propuestas inicialmente. En la Figura 12 se muestra el cromatograma con el

programa final de temperaturas, en el cual se logró una resolución de los analitos

adecuada y las formas de los picos cromatográficos se acercaron a lo deseado, es

decir, picos simétricos.

128

Con la finalidad de mejorar la sensibilidad y selectividad del método

desarrollado, una vez establecidas las condiciones óptimas de separación

cromatográfica para cada columna, se cambió la modalidad de adquisición de

datos de barrido completo (Full Scan) al modo de monitoreo selectivo de iones

(SIM); para lo cual, se establecieron 2 ventanas de adquisición de datos, la cuales

se muestran en tabla 12; en las figuras 13 a la 15 se pueden observar los

cromatogramas obtenidos utilizando esta forma de adquisición de datos. Las

pruebas de sensibilidad para cada columna, se obtuvieron mediante SIM ya que

en Full Scan se obtuvieron valores mayores ya que al tener una mayor ventana de

iones a analizar el tiempo de adquisición para cada uno es menor y la sensibilidad

disminuye, caso contrario a SIM.

La selección de columna se basó, como se mencionó en el capítulo 2, en la

resolución del cromatograma obtenido, ver Tabla 13, la forma de los picos

cromatográficos, mostrado en las Tablas 14 y 15, así como en los límites de

detección observados con cada columna, mostrados en la Tabla 16. Se pudo

observar que la columna HP-5 MS presentó picos asimétricos y poco resueltos y

un límite de detección de 0.5 µg mL-1, con la columna DB-17 se logró detectar

hasta 5 µg mL-1 y los picos cromatográficos obtenidos mostraron un poco de

fronteo y finalmente, con la columna DB-1701 se determinó una sensibilidad de

0.001 µg mL-1 y los picos cromatográficos fueron asimétricos. No obstante que la

columna DB-1701 presentó los mejores factores de asimetría al utilizar la

adquisición de datos mediante barrido completo, mostró un aumento considerable

129

de la línea base en la región de elución de los analitos, lo que podría interferir en

la cuantificación de los mismos a niveles bajos de concentración.

Se realizaron pruebas preeliminares para evaluar la capacidad de la

columna de resolver señales que pudieran coeluir con las señales de los analitos

de interés, por lo cual se realizó una extracción líquido-líquido, utilizando

diclorometano como fase extractante, de orina de fumador adicionada con NNAL.

Se probó primero la columna DB-1701, pero debido al aumento en la linea base

del cromatograma que esta columna presentó, mostrado en la Figura 16, no fue

posible detectar la señal del analito; por esta razón se probó el comportamiento de

la columna DB-17 con un extracto semejante y se logró observar señales de los

analitos, aunque los picos cromatográficos obtenidos fueron anchos y coleados, lo

cual se puede observar en la Figura 17, por lo que se modificó el programa de

temperatura, el cual se presenta en la tabla 17.

A pesar de que las columnas DB-17 y DB-1701 han sido reportadas para el

análisis de NNAL, no están diseñadas para efectuar cromatografías de un amplio

rango de muestras de niveles traza ya que presentan una degradación del

polímero de la fase estacionaria, debido al tipo de entrecruzamiento de la fase

estacionaria, lo cual provoca que la línea base aumente al incrementar la

temperatura de elución,76 lo cual podría perjudicar al momento de realizar el

análisis de muestras reales. Debido a que se trabajó con un cromatógrafo de

130

gases con espectrometría de masas, se recomienda el uso de columnas de bajo

sangrado, es decir columnas MS, por lo que se realizaron pruebas con la columna

DB-17MS la cual presenta una química de siloxanos específica y un proceso de

desactivación superficial, lo cual conlleva a tener una mayor estabilidad y por lo

tanto menor sangrado de la fase estacionaria a altas temperaturas. Se realizaron

pruebas con la columna DB-17MS utilizando el programa establecido para la

columna DB-17 en la tabla 17 y se realizó la prueba de sensibilidad, dando un

resultado equiparable con la columna DB-1701 por lo que, esta columna se

seleccionó para el desarrollo del método.


Con la finalidad de validar el método cromatográfico desarrollado para la

determinación de NNAL, se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión,

exactitud, límites de detección y cuantificación para el NNAL mediante la técnica

de estándar interno.

131

Como puede verse en la figura 18, al graficar la curva de calibración se

observa que la regresión no se comporta de manera lineal, en el trabajo reportado

por Xia et al. en el 2005,77 realizaron la evaluación de la linealidad con datos

ponderados, aunque no mencionan el tipo de manejo que realizaron a los datos,

en este trabajo, en la Figura 19, se observó que los datos ajustan en un modelo

polinómico de segundo grado. Este tipo de comportamiento ya se ha observado en

los métodos actuales para la determinación de nitrosaminas, compuestos volátiles,

entre otros analitos, por técnicas cromatográficas y en el Método 8000D de la

Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (U.S. EPA)78 se menciona

cómo evaluar los métodos cromatográficos que ajusten a regresiones polinómicas,

para lo cual se indica que se debe trabajar con al menos 6 estándares de

calibración.

En el caso de linealidad, el coeficiente de determinación (r2) para el NNAL

fue mayor al criterio de aceptación de un valor de 0.99. Para la precisión intradía

se calculó el % DER de las señales obtenidas de estándares de concentraciones

de 0.1, 1 y 5 µg mL-1, que se muestran en la Tabla 18, los cuales se encontraron

en un rango de 3.85 a 5.90 %, lo cual es aceptable porque se cumple el criterio de

aceptación indicado en la sección 2.3.4.2. La exactitud fue buena, presentando

porcentaje de error relativos, los cuales se muestran en la Tabla 19 y fueron

menores al 24 %, por lo que son acepatables de acuerdo a lo establecido por la

EPA en el método 8000 D (<30%). También se realizó un ensayo de correlación

132

entre la concentración nominal y la concentración calculada mediante la ecuación

polinómica de segundo grado, representado en la Figura 20, donde se pudo

observar una pendiente de 1.006 indicando que si existe una concordancia entre

los datos.

Los límites de detección y cuantificación para el NNAL se determinaron

experimentalmente utilizando las condiciones finales de análisis (tabla 17). El

límite de detección del sistema se estableció en 0.001 µg mL-1 y el límite de

cuantificación en 0.05 µg mL-1, con un 18 % DER (n=4).

4.2 Métodos de Preparación de Muestra.

Se evaluaron distintos métodos de preparación de muestras, cuya

aplicación al análisis de NNAL en diversas matrices se ha reportado

anteriormente.

133

4.2.1 SPE-MIP.

Se aplicó el procedimiento reportado por el proveedor para el análisis del

NNAL con cartuchos molecularmente impresos, específicos para el NNAL. En este

estudio se logró la recuperación del NNAL así como del iso-NNAL-d3. Ya se ha

observado anteriormente que los cartuchos pueden extraer nitrosaminas distintas

al NNAL aun en el cartucho específico.52 En el perfil de elución, mostrado en la

Tabla 20, observamos que aun es posible distinguir señales a 4 mL de elución,

contrario a lo que indica el protocolo estándar de los cartuchos (2 mL). Lo que nos

interesa es poder recuperar la mayor cantidad de masa de los analitos, por lo que

se decidió recolectar 4 mL de eluato, llevarlo a sequedad y reconstiruirlo en 150 µL

de metanol para su posterior análisis. Algo semejante lo observaron Yao et al. en

el 2012, donde para mejorar la extracción del NNAL extrajeron 3 mL en lugar de

los 2 mL recomendados por el fabricante.79 También, Xia et al. en el

2005, 77 indican que en perfil de elución siguen apareciendo señales del analito

hasta la octava fracción de 0.5 mL del solvente de elución, lo cual concuerda con

lo observado en este trabajo. En la Tabla 21 se muestran las condicones

establecidas para la extracción mediante esta técnica y en la Figura 21 se muestra

el cromatograma de una muestra de no fumador adicionada, donde se puede

134

observar que no hay interferentes de la matriz en los tiempos de retención

cercanos a los analitos.

4.2.2 SPME

El reporte encontrado de la aplicación de la SPME para la determinación de

TSNAs, ha sido de SPME en tubo acoplada en línea con un análisis por HPLC.80

No se ha reportado anteriormente el uso de SPME por headspace para el análisis

de NNAL en muestras de orina: esta modalidad de SPME se utiliza principalmente

para la extracción de analitos volátiles y semivolátiles a partir de una fase de vapor

en equilibrio con la muestra a extraer (ya sea gaseosa, líquida o sólida), además

que proporciona la ventaja de evitar o minimizar el daño de la fibra por

componentes de la matriz. Debido a la disponibilidad de una variedad de fibras de

diferente polaridad, se preseleccionaron 4 tipos de fibras, disponibles

comercialmente, recomendadas para el análisis de compuestos volátiles y

semivolátiles.

135

Se probaron las fibras: PA, CARBOXEN-PDMS, DVB-PDMS Y CAR-DVB-PDMS.

La fibra de DVB-CAR-PDMS, dado la mezcla de polímeros que presenta, se

recomienda para el análisis de compuestos trazas; por otro lado, la fibra

CARBOXEN-PDMS se sugiere para el análisis de gases y compuestos de bajo

peso molecular, es ideal para el análisis de moléculas de dos a doce carbonos ya

que moléculas más grandes de doce carbonos pueden ser altamente retenidas

sobre la superficie de las partículas y difíciles de desorber.

Los resultados obtenidos en los experimentos de selección de la fibra de SPME

más adecuada para la extracción del NNAL e iso-NNAL-d3 se muestran en la

Figura 22, en donde se observa que las fibras DVB-CAR-PDMS y

CARBOXEN-PDMS no extraen a los analitos.

La fibra de PA, recomendada para la extracción de compuestos polares, extrajo

mejor al estándar interno que al NNAL y presentó mayor variación en los

resultados, mientras que la fibra de DVB-PDMS, la cual se recomienda para el

análisis de compuestos volátiles, aminas y compuestos aromáticos nitrados que

son las características del NNAL, extrajo mayor cantidad del NNAL que del

estándar interno y las variaciones observadas fueron menores que las obtenidas

con la fibra de PA. En base a esto se continuó trabajando con la fibra DVB-PDMS

para la optimización de la extracción y de la desorción.

136

En la tabla 22 se pueden observar los resultados obtenidos en cada uno de los

experimentos planteados; se tomó como límite la temperatura 260 °C ya que en

esta temperatura se comenzó a observar que los picos cromatográficos

cambiaban de forma lo cual dificulta la integración de los analitos. De este

experimento, se seleccionó la combinación que dio las mejores formas de las

señales cromatográficas y los mejores resultados tanto de la suma de áreas del

NNAL y del iso-NNAL-d3, así como de la relación de áreas obtenidas. Las

condiciones que se establecieron como óptimas fue una temperatura de desorción

de 250 °C por un tiempo de 3 minutos.

Para seleccionar las variables que pueden tener un efecto en la eficiencia de la

extracción se realizó una búsqueda bibliográfica. Se empleó un diseño de

experimentos de Plackett-Burman a dos niveles y completamente aleatorizado

para observar los efectos de cada variable y seleccionar solamente las principales,

ya que cabe resaltar que este tipo de diseño no permite un análisis completo de

las interacciones que se presentan entre las variables.81 Los resultados se

presentaron en la Tabla 23.

Mediante el uso de regresión lineal múltiple (MRL), se examinó el ajuste de las

variables en estudio y las respuestas obtenidas; se observó que el porcentaje de

la variación explicada por el modelo (r2 0.938) ya que los valores deben de ser

cercanos a 1, se consideró que existe un buen ajuste entre los factores y las

137

respuestas. Los experimentos con valores centrales de las variables, permitieron

determinar que la validez y la reproducibilidad del modelo fueron satisfactorias. es

bueno, al igual que la validez y la reproducibilidad del mismo; sin embargo, el valor

de Q2 indica que el modelo no presentó una buena predicción de nuevos datos de

acuerdo a los resultados obtenidos en la validación cruzada. Para comprobar si

este valor mejoraba, se realizó un análisis por ajuste de mínimos cuadrados

parciales (PLS), donde se observó que el valor Q2 presentó un aumento,

sugiriendo la presencia de un problema entre la relación de las variables y la

respuesta, por este motivo se realizó un análisis de descarte variable por variable

hasta identificar cuál era la variable que presentó problemas en el ajuste del

modelo. El análisis realizado sugirió que la varible de agitación era la que

presentaba problemas de ajustes, por lo cual se eliminó dicha variable y se volvió

a realizar el ajuste del modelo mediante MRL y se obtuvieron coeficientes

aceptables.

Del diseño de experimentos, Figura 23 a, se encontró que las variables tiempo de

extracción, adición de solvente orgánico y volumen de la muestra son las que

tienen mayor significancia para optimizar la respuesta de acuerdo al valor

presentado de los coeficientes así como del intervalo de confianza.

Debido a que la técnica SPME está basada en el equilibrio alcanzado entre las

fases, se puede ver que a mayor tiempo de exposición entre el analito y la fibra

138

hay una mayor extracción; sin embargo, el llegar a las condiciones de equilibrio

puede ser un proceso demasiado largo, por ello, se puede establecer un tiempo de

extracción en un punto intermedio, el cual no comprometa la respuesta del analito

ni la reproducibilidad del método. Probar un tiempo mayor de extracción podría

reflejar una mayor respuesta del analito, pero como se trata de una técnica manual

se podrían analizar un menor número de muestras si se aumentara el tiempo de

extracción, por lo que el tiempo de 60 minutos fue el límite máximo para esta

variable. Al ver el efecto de la temperatura de extracción, se ve que se requiere

menor temperatura para mejorar la respuesta, esto debido a que a mayor

temperatura se extrae mejor el estándar interno lo que provoca una menor relación

de áreas. Por último, de los dos solventes orgánicos probados, el metanol tiene

una influencia positiva en el comportamiento de la respuesta, lo que significa que

es un buen solvente auxiliar para promover la migración del NNAL a la fase

gaseosa.

Al realizar un análisis de gráficas de contorno con dos variables a la vez, las

cuales se muestran en la Figura 23b a 23d, se puede observar la relación

existente entre las dos variables y la respuesta deseada, donde las mayores

relaciones de área se obtienen cuando el tiempo de extracción es el máximo, el

solvente adicionado es metanol y el volumen de muestra es el máximo evaluado,

lo cual se puede observar en la ecuación 7. Además, al utilizar la aplicación

Optimizer del software, el cual emplea la ecuación construida para describir el

modelo y un diseño de experimento simplex, para obtener una proyección de los

139

valores de las variables a los cuales la respuesta aumenta, resultó en las

condiciones que se presentan en la tabla 24 como las óptimas para el proceso de

HS-SPME.

Se aplicó el método optimizado a un análisis por triplicado de muestras de orina de

no fumadores adicionada, en la Figura 24 se muestra un cromotograma de este

análisis. Se observó que la relación de las señales de NNAL/ iso-NNAL-d3

promedio fue de 4.40 con un 6.7 % DER, lo cual concuerda con los datos

obtenidos mediante la función "Optimizer".

4.2.3 SPE-tC18

La SPE es una técnica de preparación de las muestras con la cual se

pueden llevar a cabo extracciones cuantitativas rápidas, fáciles de realizar y que

pueden ser automatizadas, así como también, se reduce el empleo de disolventes

y tiempo de laboratorio.82

140

La SPE se utiliza para preparar muestras líquidas y extraer analitos semivolátiles o

no volátiles. Esta técnica es excelente para la extracción de la muestra, la

concentración y la limpieza de la misma.82

Comercialmente se encuentran disponibles una amplia variedad de adsorbentes,

por lo que seleccionar el producto más adecuado para cada aplicación y cada

muestra es importante.

Los cartuchos tC18, son fases ligadas basadas en sílice que presentan un fuerte

carácter hidrófobo con una química de unión trifuncional, la cual le da un mayor de

estabilidad para la hidrólisis que la C18 convencional. Se utiliza para adsorber

analitos incluso con hidrofobicidad débil de soluciones acuosas, como lo pueden

ser fármacos y sus metabolitos en suero, plasma u orina, desalación de péptidos,

compuestos orgánicos traza en muestras de agua medioambientales, ácidos

orgánicos en bebidas.83

En la Tabla 25 se presenta el diseño de experimentos planteado para la

optimización de este método de preparación de muestra. Se analizaron las

variables de velocidad de carga, composición del solvente de lavado, volumen de

solvente de lavado y velocidad de elución. De los resultados obtenidos del diseño

de experimentos, Figura 25 y ecuación 8, se observó que el rango de velocidades

141

probadas no tiene influencia en la recuperación del analito, mientras que la

composición del solvente de lavado, así como el volumen del mismo tienen una

influencia inversa, es decir al aumentar el contenido de metanol en la mezcla, se

recuperaba menor cantidad de analito, lo mismo pasó con el volumen de solvente

de lavado.

Los solventes utilizados en SPE se eligen de manera que sus propiedades de

miscibilidad, viscocidad, el poder de solvatación, la pureza, volatilidad y su

naturaleza cromofórica, es decir su comportamiento al ser irradiado por luz

ultravioleta o visible, se integren para dar velocidad, simplicidad, limpieza efectiva

de las muestras y la recuperación cuantitativa en los pasos relevantes del

proceso84. En este caso en particular, se partió de protocolos generales para el

empleo de cartuchos C18, en donde se ultiliza metanol como solvente de elución y

una mezcla agua-metanol como solvente de lavado. El metanol utilizado en

durante el proceso fue metanol para el análsis de trazas que posee una mayor

pureza y no interfiere en la cuantificación del NNAL.

Al realizar el diseño, se observó que a mayor concentración de metanol en el

solvente de lavado se perdía señal del analito, lo cual coincide con lo reportado

por Wang et al., quienes observaron que al aumentar de un 10 % a un 20 % de

metanol disminuía la recuperación de las TSNAs.85 Estos mismos autores no

observaron diferencia significativa en la recuperación de las TSNAs cuando se

utilizó un contenido de metanol entre 2 y 10 % y ya que el metanol tiene un gran

142

poder de elución, se recomienda utilizar concentraciones altas del mismo para

mejorar el poder de limpieza de la solución de lavado. En los experimentos de

optimización, Tabla 27, se estudió la respuesta encontrada cuando la solución de

lavado contenía 1 y 5 % de metanol, no encontramos diferencia significativa en la

señal en estas condiciones, pero el extracto que se lavó con 5 % de metanol

ensució menos el liner del equipo, lo cual asegura el comportamiento del

cromatógrafo al inyectar varias muestras en un mismo liner, por esta razón se

seleccionó un solvente de lavado con metanol al 5 %.

En el caso del volumen de solvente de lavado, se marcó como límite 2 mL, este

valor está cercano al volumen de retención de 1.9 mL para los cartuchos utilizados

86.

Al igual que lo observado en el procedimiento de SPE-MIP, el principal interés es

recuperar la mayor cantidad de masa de los analitos, por lo que al analizar el perfil

de elución mostrado en la Tabla 28, se decidió recolectar 3 mL de eluato y llevarlo

a sequedad para su posterior recuperación.

El método de SPE para el NNAL final presentado en la Tabla 29, mostró una

buena precisión (DER de 1.6 %) al analizar un triplicado de muestra de orina de no

fumador adicionada a 100 ng mL-1, el cromatograma correspondiente se puede

observar en la Figura 26, donde se observa en tiempos muy cercanos a las

señales del analito, picos intensos provenientes de la matriz de orina.

143

4.3 Selección del método de preparación de muestra.

Como se muestra en la tabla 30 los porcentajes de recuperación encontrados con

los métodos son mayores al 100 % y las DER son menores al 10 %. La mejor

recuperación se obtuvo con los cartuchos de SPE-MIP, pero presentan una mayor

dispersión de los resultados.

La recuperación del NNAL concuerda con los reportes presentados por el

fabricante, donde a concentraciones 100 pg mL-1 se obtienen recuperación del

87 %, así como indica que es posible obtener recuperaciones mayores al 90 %

con el empleo de estándar interno y un análisis por HPLC-MS-MS.87

144

4.4 Validación del método SPE-MIP.

Con la finalidad de validar el método desarrollado para la determinación de NNAL,

se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión, exactitud, límites de

detección y cuantificación para el NNAL mediante la técnica de estándar interno,

los resultados se presentan en la Tabla 31.

Al igual que en la evaluación de la linealidad del sistema cromatográfico, la

curva de calibración tuvo un comportamiento de segundo grado, ver sección 4.1.2.

En el caso de linealidad, el coeficiente de determinación (r2) para el NNAL

fue mayor a 0.99. Para la precisión intradía se calculó el % DER de las señales

obtenidas de estándares de concentraciones de 2, 10 y 25 ng mL-1, los cuales se

encontraron en un rango de 1.3 a 8 %. La exactitud fue buena, presentando

porcentaje de error relativos menores al 11.9 %. Los valores obtenidos son

aceptables de acuerdo a lo establecido por la EPA en el método 8080 D (<30%).

Los límites de detección y cuantificación para el NNAL se determinaron

experimentalmente utilizando las condiciones finales de análisis (Tabla 21). El

145

límite de detección del método fue de 0.7 ng mL-1 y el límite de cuantificación se

determinó en 2 ng mL-1, con un 8 % DER (n=3). No se han encontrado reportes en

la literatura en los que se emplee la SPE-MIP en combinación con la CG-MS para

la determinación del NNAL. Los límites de detección obtenidos con este método

son superiores a los reportados por Bernert et al. en el 2005,26 que utilizaron un

método de preparación de muestra que consistía en una combinación de LLE y

SPE y posterior análisis con GC-HRMS donde el límite de detección fue de 0.6 pg

mL-1. La baja sensibilidad observada en el presente método concuerda con lo

reportado por Ramirez et al. en el 2012,88 quienes desarrollaron un método para la

determinacion de N-nitrosaminas en deposiciones de polvo dentro de hogares de

fumadores, para realizar el análisis, compararon el desempeño de un GC-MS y

sistema de GC en linea con detector quimioluminiscencia de nitrógeno (GCxGC

NCD), en el cual descartaron el uso del GC-MS por la baja sensibilidad lograda

por este sistema. Kim et al. en el 2005 compararon el desempeño de un método

cromatográfico para la determinación de metanfetamina (MA) y anfetamina (AMP)

en cabello humano mediante el uso de GC-LRMS y GC-HRMS, donse observaron

que los LOD para MA y AMP fueron 2.4-4.4 veces más bajos con HRMS que los

obtenidos con LRMS, esto debido a la eliminación de señales de ruido de origen

biológico.89 El método desarrollado por Sleiman et al. en el 2009 para la

determinación de TSNAs en humo de segunda mano mediante la filtración del aire

a traves de una membrana de celulosa y posterior extracción líquido-sólido y el

análisis por cromatografía de gases con trampa de iones (GC-IT-MS)75 donde el

límite de detección alcanzado para el NNAL fue de 340 pg mL-1, valor que es un

146

50 % menor al obtenido en el método desarrollado. El límite de detección

alcanzado en el método de SPE-MIP-GC-MS, desarrollado en este trabajo, esta

muy por encima al determinado en el primer reporte del empleo de SPE-MIP para

el análisis de NNAL en muestras de orina,77 en el cual se utilizó para el análisis la

cromatografía de líquidos de alta resolución con ionización a presión atmosférica y

un sistema de detección de masas en tandem (HPLC-API-MS/MS). para el que

presentó un límite de detección de 1.7 pg mL-1.

4.5 Aplicación del método de SPE-MIP.

Los cromatogramas de los dos tipos de muestras analizadas se presentaron en la

Figuras 27 y 28. En la Tabla 32 se muestran los resultados de la cuantificación de

estas muestras. La muestra de orina de no fumador adicionada (n=2) a 2 ng mL-1

a la cual se le determinó una concentración de 2.20 ± 0.24 ng mL-1. El segundo

tipo de muestra fue orina de fumadores donde no fue posible detectar al analito, es

decir la concentración está por debajo del límite de detección del método, el cual

es de 0.7 ng mL-1. Este resultado concuerda con lo reportado por Kavvadias et al.

en el 2009,52 donde la concentración reportada fue de 152.5 ±132.1 pg mL-1.

147

CAPÍTULO 5

CONCLUSIONES

Se desarrolló un método de cromatografía de gases-espectrometría de

masas de baja resolución para el análisis de NNAL en muestras de orina.

De los tres métodos de preparación de muestra evaluados, el que mostró mejores

resultado fue SPE-MIP ya que proporciona extractos más limpios y mejores

valores de recuperación, esto posiblemente debido a la selectividad que posee la

fase extractante utilizada en comparación con método de SPE tC18 que mostró

148

buenas recuperaciones pero los cromatogramas obtenidos mediante esta técnica

de preparación de muestras presentaron señales de la matriz a tiempos de

retención cercanos al NNAL que interfieren en la integración del mismo. Por

último, el método de HS-SPME que obtuvo pobres recuperaciones.

La aplicación de una regresión de segundo grado fue adecuada para la

descripción de los datos y permitió obtener resultados con una precisión y

exactitud aceptables.

El método de SPE-MIP-GC/LRMS para el análisis de NNAL en muestras de orina

que fue desarrollado no puede ser utilizado para la medición del analito en la

matriz debido a que la sensibilidad alcanzada no permite la determinación de las

concentraciones del NNAL esperadas en orina.

149

PERSPECTIVAS

Combinar técnicas de preparación de muestra para lograr una mayor

limpieza de los extractos y de esta manera mejorar la sensibilidad del

método.

Buscar reactivos derivatizantes para el NNAL para mejorar su volatilidad,

estabilidad térmica o mejorar su detección.

150

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RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO

Magdalena Escobar Saucedo

Candidato para el Grado de

Doctor en Ciencias con Orientación en Química Biomédica

Tesis: DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DEL TABACO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS.

Área de estudio: Química Analítica. Biografía:

Nacida en Monterrey Nuevo León el día 1 de Julio de 1983, hija de Manuel Escobar Martínez y Francisca Saucedo Cruz.

Estudios realizados:

Egresada de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido de Químico Farmacéutico Biólogo en 2005. Egresada de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido de Maestro en Ciencias con Orientación en Química Biomédica en 2009.

Experiencia profesional.

Personal profesional no docente de Tiempo Completo de la Universidad Autónoma de Nuevo León desde 2008 a la fecha.

The whole of science is nothing more than a

refinement of everyday thinking.

Albert Einstein

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