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Ci tCinvestavUnidad Saltillo
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE
EXTRACCIÓN DE ALICINA EN AJO Y SUEXTRACCIÓN DE ALICINA EN AJO Y SU
CUANTIFICACIÓN POR HPLC
Dra. Lourdes Díaz JiménezQ K l Ji é Ló
23 de octubre de 2008
Q. Karla Jiménez López
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
Antecedentes
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Antecedentes
Origen
Centro y sur de Asia.
En el siglo XV es gintroducido al continente americano.
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Antecedentes
Actividad biológicag
• EnfermedadesEnfermedades respiratorias
• TuberculosisTuberculosis• Antimicrobial• Anticancérigenog• Reductor de colesterol• Anti-inflamatorio
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Antecedentes
Química del ajo
*Compuestos sulfuradosDi lf d lil- Disulfuro de alilo
- s- alilcisteína- ALICINA- ALICINA
*Compuestos no sulfuradosCompuestos no sulfurados- Saponinas- Macronutrientes
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Antecedentes
Alicina
• Formación de la alicina
- Sustrato aliina
- Enzima aliinasa
- Rompimiento del tejido
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AntecedentesCaracterísticas
• 70% de los compuestos sulfurados.
• Olor característico
• Propiedades curativas
• Inestable
• Descomposición
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Antecedentes
Cuantificación de alicina
• Dificultades.Dificultades.- Inestabilidad - Dificultad para obtener un estándar- Dificultad para obtener un estándar- Falta de concenso
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Antecedentes
• Diversos métodos analíticos• Diversos métodos analíticos
Mét d INAMétodo INACondiciones estrictas en la temperatura.
Método propuesto por Dowell (1999)Tiempo de reposo
Lawson y Wang (2001)T t d 12 15 °C ti dTemperatura de 12- 15 °C y tiempo de reposo.
Lawson y Wang, 2001, J. Agric. Food Chem. Vol 49.
Bocchini y col. 2001, Analytica Chemica Vol. 441/1
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Antecedentes
Validación
•Confirmar
•AceptabilidadAceptabilidad
•FiabilidadFiabilidad
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AntecedentesParámetros de validación
• Linealidad • Selectividad oespecificidad
E actit d
especificidad
• Exactitud
• Robustez• Precisión- RepetibilidadRepetibilidad- Reproducibilidad
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
ObjetivoObjetivoValidar un método de extracción y cuantificación de alicina en ajo ycuantificación de alicina en ajo y extractos de ajo.
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
M t d l íMetodología
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Metodología
Material biológico
La materia prima fue proporcionada por laN t ilit S d R L d C Vempresa Nutrilite S. de R.L. de C.V.
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Metodología
Tratamiento de la muestraTratamiento de la muestra
*F *Li fili d *S*Fresco *Liofilizado *Seco
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Metodología
Extracción
HOMOGENIZADO
AJOETILPARABENO INCUBACIÓN 30
MIN.CENTRIFUGADO
3500 rpm10 MINHOMOGENIZADO
2.5 MIN.10 MIN
2 ml DEAFORADOFILTRA Y 2 ml. DE SOBRENADANTE
AFORADO CON AC. CITRICO
FILTRA Y DEPOSITA EN VIAL
ANÁLISIS EN HPLC
Condiciones HPLC: MeOH/Agua 45/55, Flujo 0.80 mL/min, λ= 230 nm
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MetodologíaValidación
• Selectividad o especificidad: se utilizó polvo deajo estandarizado, concentración de alicina alajo estandarizado, concentración de alicina al1.023%
• Linealidad: Concentraciones de 20, 40, 60, 80 y100% realizando dos replicas por cada nivel deconcentración
•Repetibilidad: concentraciones de 20, 50 y 100%,li d 8 é li d i l drealizando 8 réplicas por cada nivel de
concentración (análisis realizados por el mismoanalista, equipo y día).
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Metodología
Validación…
•Reproducibilidad: concentración al 100% realizando 2réplicas de concentración, por dos analistas diferentes.réplicas de concentración, por dos analistas diferentes.
•Exactitud: concentraciones del 20, 50 y 100%realizando 3 réplicas por cada nivel.
• Robustez: se evaluaron las diferentes condiciones que• Robustez: se evaluaron las diferentes condiciones quepueden llegar a representar cambios significativos, lasmodificaciones que se hicieron al método fueron laconcentración de fase mó il dos col mnas deconcentración de fase móvil, dos columnas dediferentes marcas, cambios de analistas.
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
Resultados y ydiscusión
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Resultados y discusión
Calidad de la materia prima
1 - Compuestos1
3
1.- Compuestos sulfurados
2.-Allyl metano i lfi M il 23
4
tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato.
3.- Alicina
3
44.- Etilparabeno2
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Resultados y discusión
Determinación del método de conservación del ajo
•Ajo deshidratado (por calentamiento)
-Liberación de sustrato y
2
sustrato y enzima
-Degradación de
1
22Degradación de
alicina
1.- Compuestos sulfurados
2.- Etilparabeno
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Resultados y discusión
• Ajo deshidratado (por liofilización)
1Congelamiento muy rápido
2Inactivación de la aliinasa
1.- Compuestos sulfurados
2.- Etilparabeno
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Resultados y discusión• Ajo congelado a – 80°C
1 -Congelado a -80 °C
-Refrigeración previa antes al análisis.
-Temperatura
2
34
Temperatura ambiente.
1.- Compuestos sulfurados
2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato.
3.- Alicina
4.- Etilparabeno
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Resultados y discusión• Fase móvil
45/5513
42 4 1.- Compuestos sulfurados
2.- Allyl metano ti lfi t M til 250/50
13
4
tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato.
3.- Alicina
4 Etil b2 4 4.- Etilparabeno
60/401
42 3
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Resultados y discusión• Columnas
Agilent Zorbax1
3
2
34
1.- Compuestos sulfuradossulfurados
2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato.
Waters Symmetry1
3.- Alicina
4.- Etilparabeno
3 4
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Resultados y discusión
Cinética de formación de alicina
4
Area (10-7 mUA)
3
4 -Cañizares y col. (2004) y Lawson y Wang (2001)
-Tiempo de extracción
1
2-Tiempo de extracción
- Temperatura adecuada entre 19-26°C
00 50 100 150 200
tiempo (min)p ( )
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Resultados y discusión• Validación del método
Selectividad o especificidad
Inhibición de
1
Inhibición de la enzima aliinasa
432
1
24
1.- Compuestos sulfurados
2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato.
3.- Alicina
4.- Etilparabeno
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Resultados y discusión
• LinealidadR2 = 0.984
20
30Area (10-6 mUA)
10
20
00 1 2 3 4 5
Concentración (g)
• PrecisiónRepetibilidad
Concentración Valores obtenidos.X media = 1951337Repetibilidad 20% S= 77887CV= 4%
50%X media = 4527597Criterio establecido: <5% 50% S= 201086CV= 4.4%
100%X media =7788429S= 135570S= 135570CV= 1.7%
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Resultados y discusión
• Reproducibilidad Concentración Valores obtenidos.
X media = 27118989Analista 1
media
S= 120527
CV= 0.4%
X 29522974
Criterio establecido: <3%
Analista 2X media = 29522974
S= 447329
CV= 1.5%
Concentración Valores obtenidos.• Exactitud20%
X media = 1.92S= 0.04CV= 2.2 %Criterio establecido: <3%
50%X media = 4.55S= 0.07CV= 1.5 %X 26 4
100%X media =26.4S= 0.21CV= 0.8 %
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Resultados y discusión
•RobustezRobustez
Fase móvilNo presentan cambiossignificativos en elColumna
Analistas
significativos en elmétodo
Analistas
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
ConclusionesEl método de cuantificación y extracción de
li i dó lid d b l
Conclusionesalicina quedó validado en base a losresultados de los principales parámetrosevaluados: coeficiente de correlación en laevaluados: coeficiente de correlación en lalinealidad (0.984), coeficientes de variaciónen reproducibilidad (<2 %) y repetibilidad(<5 %)(<5 %).
De igual manera ha sido demostrada laDe igual manera ha sido demostrada laprecisión, selectividad y robustez.
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VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO
Y SU CUANTIFICACION POR HPLC
G iGracias por su atención
Dra Lourdes Díaz JiménezDra. Lourdes Díaz JiménezRecursos Naturales y Energéticos
Cinvestav-Unidad Saltillolourdes diaz@cinvestav edu [email protected]