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7/23/2019 UN INNOVADOR microplaca de ensayo para facilitar la detección de actividad antimicrobiana en extractos de plantas

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UN INNOVADOR microplaca de ensayo para facilitar la detección de actividadantimicrobiana en extractos de plantas

Y. SULTANBAWA1, CUSACK A., CURRIE M. y C. DAVISTecnologías Innovadoras Alimentos

Departamento de Industrias Primarias y PescaHamilton, BrisbaneQueensland 4007, Australia Aceptado para su publicación 30 de abril 2009

RESUMEN

Una microplaca de ensayo fue modificada para la detección de actividadantimicrobiana en extractos de plantas. El objetivo era desarrollar un ensayo in vitro

que podría rápidamente cribar extractos de plantas para proporcionar datoscuantitativos sobre la inhibición del crecimiento microbiano. Un ensayoespectrofotométrico utilizando una microplaca con diluciones seriadas del extracto dela planta y las bacterias se desarrolló. Dos bacterias, Staphylococcus aureus yEscherichia coli, se utilizaron para este estudio. Los aceites esenciales, orégano(Origanum vulgare) y mirto de limón (Backhousia citriodora), y tres componentesactivos carvacrol, timol y citral se evaluaron. La reproducibilidad del ensayo fue alta,con coeficientes de correlación (r2) de las réplicas de limón mirto y el orégano con S.aureus y E. coli entre 0,9321 y 0,9816. Del mismo modo, los valores de R2 paracarvacrol, timol y citral tenían entre 0,8455 y 0,9814. Este ensayo también podría ser

utilizado para medir la actividad antimicrobiana en extractos de plantas que puedenvariar en pH y el color.

APLICACIONES PRÁCTICAS

Esta investigación se podría utilizar para la determinación cuantitativa de la actividadantimicrobiana en extractos de plantas. Como la inhibición de crecimiento se expresacomo un porcentaje de 0 a 100, este método también puede ser usado para estudiar las sinergias dentro de extractos de plantas para mejorar la actividad antimicrobiana

para futuros estudios. Cuando los extractos de plantas se utilizan en los alimentoscomo conservantes naturales, el desafío consiste en utilizar una concentración que nointerfiera con el sabor del producto alimenticio. En general, la cantidad de extracto dela planta requerida para extender la vida de almacenamiento de los alimentos esmayor que la requerida para producir un sabor aceptable. La ventaja de conocer elporcentaje de inhibición se relaciona con el efecto de sinergia cuando las inhibicionesmenos de 100% puede ser mejorado con otros extractos de plantas antimicrobianos,reduciendo así la cantidad de extracto de planta requerido.

INTRODUCCIÓN



El interés en la actividad antimicrobiana de extractos de plantas y su aplicación para laextensión de la duración de conservación de los alimentos ha resurgido debido a lapercepción negativa de conservantes químicos por el consumidor. Especias y hierbascomo la pimienta, cúrcuma, canela, orégano y tomillo se han utilizado tradicionalmenteen la conservación de alimentos y se sabe que tienen propiedades antimicrobianas

(Cowan 1999; Nychas y Skandamis 2003;. Singh et al 2007). Estudios recientes hanindicado que la actividad antimicrobiana de extractos de plantas se podría mejorar mediante el uso de ellos en combinación con la preservación de nuevo y lastecnologías de procesamiento como electrolizada soluciones de cloruro sódico,procesamiento de alta presión, quelantes químicos y ácidos orgánicos (Mahmud et al2006;. Vurma et al . 2006, Zhou et al 2007).. Esto ha hecho que la planta extrae unaprometedora tecnología emergente para prolongar la vida de almacenamiento dealimentos frescos y procesados. Los investigadores y los fabricantes de alimentosestán buscando nuevo material vegetal con actividad antimicrobiana. En esteescenario, es importante tener un método de cribado rápido para identificar y comparar

material vegetal con actividad antimicrobiana.

Muchos estudios han revelado la poca precisión y la naturaleza laboriosa de agar y losensayos de difusión en disco que se utilizan tradicionalmente para detectar la actividadantimicrobiana de extractos de plantas. Los ensayos utilizando placas demicrotitulación de 96 pocillos han aumentado la precisión y el rendimiento (Casey et al2004;. Turcotte et al 2004;. Patton et al 2006;. Rufián Henares-y Morales 2006).Desarrollo de la microplaca de ensayo se basa en la correlación del crecimientobacteriano con el efecto inhibidor del extracto de planta. Parece que no hayestandarizado en método de cribado in vitro para comparar la actividad antibacterianade los extractos de plantas diferentes. En la literatura publicada, hay variaciones en

medio de cultivo, el tamaño del inóculo, la elección del emulsionante, método deensayo más adecuado y definición de la concentración inhibidora mínima (MIC) (Burt2004). Devienne y Raddi (2002) han señalado que los métodos utilizados para estudiar el potencial antimicrobiano de la amplia gama de compuestos de plantas que lacomparación de los países de ingresos medios obtenidos muy difícil, y estandarizadopruebas in vitro son necesarios para las pruebas de detección. Estudios MIC debellevarse a cabo, comparando los extractos de plantas para un aceptable agenteantimicrobiano sintético (por ejemplo, antibióticos).

Aceites de orégano y limón mirto esenciales (AEs) fueron seleccionados para este

estudio porque la literatura ha reportado su actividad antimicrobiana (Lambert et al2001;. Wilkinson et al 2003;. Dupont et al 2006;. Gutiérrez et al 2008).. La actividadantimicrobiana de EO como orégano se ha atribuido a la de compuestos fenólicoscarvacrol y timol (Moleyar y Narasimham 1992; Kim et al 1995;.. Lambert et al 2001).El uso de orégano y limón mirto EOs que se ha estudiado extensamente en laliteratura para la actividad antimicrobiana se dan una buena indicación de que elmétodo sugerido como sensible, robusto y reproducible en la detección de la actividadantimicrobiana en extractos de plantas conocidas.

La idea de la dilución en serie de la sustancia potencial antimicrobiano y números de

bacterias se informó por Smith et al. (2008). Algunos estudios han reportado el uso dedos niveles de inoculación (Chorianopoulos et al 2006;.. Santiesteban-López et al



2007), pero ninguno ha reportado serie de dilución de los microorganismos en elestudio de los extractos de plantas. Este método muy sensible expone laconcentración más baja de las células bacterianas a la mayor concentración deextracto de la planta, maximizando así el potencial de detectar actividadantimicrobiana. La novedad del presente estudio es que la inhibición se calcula como

un porcentaje y se expresa como MIC de MIC0-100. Esto permitiría a los estudios enlos sinergismos, donde se encuentra el MIC inferior (MIC10-90) de un extracto deplanta en particular mejorada con otros extractos de plantas antimicrobianas. Estopodría resultar en el uso de una menor cantidad de extracto vegetal que seríaparticularmente útil en EOS, que tienen aromas intensos. El método fue probado enlas organizaciones de empleadores de orégano y limón mirto, carvacrol y timol (dos delos compuestos puros que se encuentran en orégano EO), citral (el principalcompuesto encontrado en limón mirto) y antibióticos (oxitetraciclina y penicilina G). Lamicroplaca de ensayo también incluyó un control negativo o esterilidad de los mediosde comunicación sólo, y un control positivo del organismo de prueba sin EO.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método simple, robusto y reproduciblepara permitir la detección rápida de extractos de plantas con una buena correlaciónentre el porcentaje de inhibición (MIC0-100) y la concentración de OE. Una vez que elporcentaje de inhibición se sabe, este ensayo puede ser utilizado para estudiar lassinergias en cantidades más bajas de los extractos de plantas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Dos organismos de prueba fueron utilizados en el ensayo, la cepaStaphylococcus aureus 6571 (NCTC - Colección Nacional de Cultivos Tipo,Protección de la Salud Centro de la Agencia para la infección, Londres, ReinoUnido) y la cepa de Escherichia coli 9001 (NCTC). Los organismos de ensayose cultivaron durante 24 h en caldo de triptona soja de levadura extracto(TSYEB) (Oxoid CM 129B, Basingstoke, Reino Unido), 30 g de extracto / L y delevadura (Oxoid CM19), 6 g / L. El inóculo se cuantificó midiendo la densidadóptica (absorbancia) a 540 nm y se ajustó a 0,5 con absorbancia TSYEB.

Preparación y dilución de cepas bacterianas

Los cultivos de S. aureus cepa 6571 y la cepa de E. coli 9001 se almacenaronen perlas en un congelador-80C. Un cordón de cada uno de S. aureus y E. colise transfirió asépticamente a 10 ml de TSYEB y se incubaron a 37 º C durante24 h. De este caldo, una pendiente de agar peptona extracto de levadura y unaplaca de pureza (recuento estándar en placa, agar, Oxoid CM0463) serealizaron y se incubaron a 37 º C durante 24 h. El cultivo en esta pendientepura se almacenó a 4 º C y se utiliza para un máximo de 4 semanas. Para cadaejecución, un asa de cultivo de la pendiente se colocó en 10 ml de TSYEB y seincubaron a 37 º C durante 24 h.

Este cultivo se ajustó a una densidad óptica de 0,5 a 540 nm utilizando el caldoTSYEB. Un inóculo se preparó por dilución en serie (1:1) el cultivo de una



noche de S. aureus cepa 6571 y la cepa de E. coli 9001 en TSYEB caldo de 22veces. Las diluciones 11 a 22 se utilizaron en la microplaca de 96 pocillos.Después de las diluciones se hicieron, la menor dilución se sembró en agar derecuento en placa (Oxoid CM0463) para confirmar el número de bacterias.

Preparación de componentes EOS y activo

Dos organizaciones de empleadores, el orégano (Origanum vulgare) y limón mirto(Backhousia citriodora) de productos botánicos de Australia (Victoria, Australia) seutilizaron en este estudio. Los componentes principales de orégano EO fueroncarvacrol (72,9%), timol (4,1%) y p-cimeno (5,1%). El componente principal de limónmirto era citral (citral A / geranial 51,65% y citral B / Neral 39,47%). Pure carvacrol,timol y normas de citral se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania).

Estabilización y dilución de empleadores y componentes activos

Una solución stock (0,2% w / v) de agar (agar bacteriológico N º 1, Oxoid) se preparó.Esta solución se sometió a autoclave y se enfrió a temperatura ambiente (agar descuidado). Una concentración de OE de 2,5% (v / v) se logró mediante la mezcla de975 l de agar descuidado con 25 l de EO. Literatura informa de 0.02-1% en el rango deactividad antibacteriana para EOS (Burt 2004). Once diluciones en serie (1:1) de la EO2,5% se hizo con el agar descuidado. La concentración de la disolución final era0,001%. La concentración de la EO través de la fila fromcolumn 1 a la columna 12 fuede entre 0,625 y 0,0003% (v / v). A 900 l de agar descuidado, 100 l de carvacrol, timoly citral se añadió y se mezcló a fondo. Esto produjo una concentración de 10% (v / v).

Once diluciones en serie (1:1) de 10% del componente activo se hicieron con el agar descuidado. La concentración de la dilución final fue de 0,005% (v / v). Laconcentración de la EO través de la fila de la columna 1 a la columna 12 fue de entre2,5 y 0,001% (v / v). El agar se utiliza para dispersar el EO, ya que evita lainterferencia potencial de los agentes emulsionantes (por ejemplo, Tween 80) ydisolventes (por ejemplo, etanol) en la determinación de la actividad antimicrobiana enEO (Remmal et al. 1993a, b). Wilkinson et al. (2003) reporta niveles variables desusceptibilidad microorganismo cuando 0,5% de Tween 80 se añade al ensayo dedifusión en disco y recomienda no utilizar ningún agentes solubilizantes para el ensayode EOS.

Preparación de soluciones de antibióticos

Los antibióticos (penicilina G y clorhidrato de oxitetraciclina a partir de Sigma-Aldrich,St. Louis, MO) se utilizaron en este estudio. La penicilina y oxitetraciclina, 0,1 g cadauna, se disolvieron en 2 ml de agua desionizada estéril.

La dilución de las soluciones de antibióticos

Las soluciones de antibióticos de penicilina G (Sigma-Aldrich, Penk) y oxitetraciclina(Sigma, 05875-10 g) se diluyeron en agua desionizada estéril (1:1), a partir de una



concentración de 0,0625% (w / v) y se diluyó a 0,00003 % (w / v) Rufián-Henares yMorales (2006) han informado anteriormente usando una concentración de 0,0001%de penicilina y oxitetraciclina. La concentración del antibiótico a través de la fila de lacolumna 1 a la columna 12 fue de entre 0,016 y 0,000008% (v / v).

Microplaca procedimiento de bioensayo

El fondo plano 96-y placas de microtitulación estériles con tapa para evitar lacontaminación cruzada (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) se utilizaron para el estudio.Cada 96 - placa de microtitulación bien apoyado una fila de pocillos que contienen elmedio solo (esterilidad y control negativo). Tres filas de pocillos contenían diluciones1:01 de S. aureus o E. coli (controles bacterianas) equivalentes a 105 ufc / ml (en elextremo izquierdo pocillo) a 102 ufc / ml (en el extremo derecho bien). La

concentración de OE fue de la concentración más alta (0,625% v / v) a laconcentración más baja (0,0003% v / v). Los siguientes tres filas de pocillos conteníandiluciones bacterianas similares pero el EO fue de menor a la concentración más alta(0,0003% v / v a 0,625% v / v). Cada una de las combinaciones de células EO ybacteriana se realizó por triplicado. La otra fila contenía diluciones bacterianas conmedio de crecimiento y no EO (el control positivo). Repeticiones (n = 6) del controlpositivo sin EO se ejecute en una placa separada para S. aureus y E. coli. La media, ladesviación estándar y coeficiente de variación fueron calculados para las réplicas delos pocillos de ensayo y los controles positivos. Las placas de 96 pocillos para cadaEO (orégano y mirto limón) fueron replicados (n = 4). Similares placas de 96 pocillos

de microplacas fueron preparados para carvacrol, timol, citral, penicilina yoxitetraciclina.

Cada pocillo contenía 300 l 50 l de inóculo, 50 L de EO o componente activo o unantibiótico y 100 l de caldo TSYEB. Cada control negativo o esterilidad bien contenía200 l de caldo TSYEB. Cada pocillo de control positivo contenía 50 l de inóculo y 150 lde caldo TSYEB.

La penicilina G y el clorhidrato de oxitetraciclina se utilizaron como estándares de

referencia para determinar la sensibilidad de S. aureus y E. coli, y comparar laactividad antimicrobiana de la EOS con la de los antibióticos.

La densidad óptica (DO) se determinó en un espectrofotómetro Sunrise-Basic Tecan(Grödig, Austria) a 540 nm. OD se determinó antes de la incubación (T0). Las placasse colocaron en una incubadora a 37 º C y se incubaron durante 22 h. Las solucionesen las placas se mezclaron usando una pipeta multicanal para evitar la formación degrumos antes de la lectura de la OD en el espectrofotómetro después de 22 h (T22).

Análisis de los resultados

El cálculo de porcentaje de inhibición se basa en los estudios realizados por Casey et



al. (2004) y Patton et al. (2006).

Porcentaje de inhibición = (1 - Prueba de OD y / densidad óptica del control positivocorrespondiente bien)) × 100.

Porcentaje de inhibición = (1 - (T22 - T0) (C22-C0)) × 100

La OD para cada repetición en el tiempo cero (control positivo [C0] y prueba de pozo[T0]) se restó de la OD para cada réplica a las 22 h (control positivo [C22] y prueba depozo [T22]). La definición de MIC propuesto por Patton et al. (2006) para la miel fueutilizado y modificado la terminología para los extractos de plantas. MIC0 se definecomo la concentración más alta de extracto de la planta que da como resultado que nohay inhibición del crecimiento, CIM50 es la concentración del extracto de la planta que

da como resultado 50% de inhibición de crecimiento y MIC100 es la concentraciónmás baja del extracto de la planta que da como resultado 100% de inhibición decrecimiento . Todas las CIMs entre 0 y 100 puede ser determinado por el trazado deun gráfico como se muestra en las Figs. 1 y 2. El análisis estadístico para elcoeficiente de correlación se determinó utilizando el software Microsoft Excel.

RESULTADOS

El análisis de las curvas de porcentaje de inhibición y MIC Basado en dilucionesseriadas de EO y inóculo

Curvas representativas obtenidas de trazado el porcentaje de inhibición frente a laconcentración de la EO (mirto de limón) y el recuento de log de E. coli se presentan enla figura. 1. La concentración de limón mirto EO utilizado fue

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