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1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Fundamentos

de la

UHPLC.

Isidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

UHPLC MasterClass Junio 2013

Agenda

1. Fundamentos de la UHPLC:

• Historia e Introducción Fundamentos

– Ecuación de Van Deemter

– Aumento de la capacidad de

separación en gradientes al aumentar

el flujo de trabajo

2. Conclusiones.

Página: 2

Agenda






el flujo de trabajo

2. Conclusiones.

Página: 3

Pequeña historia de la UHPLC 198X Ya existían en el mercado columnas de 1.5 µm (x30mm long.)

……

2003 Agilent 1100 Binario Columnas 1.8µm RRHT UFLC

2004 Waters Acquity Columnas 1.7µm BEH UPLC

2006 Agilent 1200 RRLC 2ª generación 1.8µm UHPLC

Thermo Accela Columnas 1.9µm

Jasco Xtreme-LC

2007 Shimadzu UFLCxr

Hitachi LaChrom Ultra

Scient. Syst. Ultra HP

2008 Dionex RSLC

Knauer Platin Blue

2009 PE Flexar

Agilent 1290 Binario

…

2012 Agilent 1290 Cuaternario

10 New UHPLC Systems in 5 Years – All different. 10 nuevos sistemas UHPLC en 5 años -Todos con características diferentes

Página: 4

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Fundamentos UHPLC

1. Ecuación de Van Deemter:

• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:

– De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm)

– Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).

2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:

• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.

Página: 5

Columnas UHPLC “versus” HPLC

• UHPLC:

• Columnas que permiten trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia:

– Rellenos totalmente porosos de pequeño tamaño de partícula (<2µm).

– Rellenos superficialmente porosos (fino espesor de fase estacionaria 0.5µm) con núcleo sólido (1.7µm). Tipo “Poroshell-120”

• Los cromatógrafos de 400 bars se pueden adaptar para trabajar con columnas de UHPLC tipo Poroshell-120 (hasta 10cm long.) y totalmente porosas de 1.8µm (hasta 5cm long.) con acetonitrilo/agua.

• HPLC:

• Columnas tradicionales de 3.5 y 5µm de tamaño de partícula.

Página: 6

Agenda






el flujo de trabajo

2. Conclusiones.

Página: 7

Longitudinal diffusion

Optimización del Flujo de Fase Móvil. Ecuación

Van Deemter: Inverso Eficacia “ vs“ Flujo

Pla

te H

eig

ht

H:

H

EP

T

1/N

Linear Velocity u

Eddy Diffusion *

H Sum Curve: Van Deemter

Resistance to Mass Transfer *

u opt

H min

C

H = + + u

u

A B C

A

* Peak Broadening due to the A term reduces proportionally with Dp

* Peak Broadening due to the B: at low velocity, time in mobile phase is longer, diffusion decreases N, increasing H. More concentrated

band of sample diffuses more rapidly than a less concentrated band under the same conditions

* Peak Broadening due to the C term: 1.-at higher velocity, solutes undergo fewer transitions, N is smaller, H is larger

2.- reduces proportionally with Dp2

B

Static Mobile Phase

Diffusion Path Deviations

into pores of particle

Porous Particles

Página 8

Efecto en la Eficacia del Tamaño de Partícula.

HPLC vs UHPLC: Gráfico Van Deemter

Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18

Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)

Eluyente: 85:15 ACN: Agua

Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente

1/ 2.5

+ EFI

CA

CIA

-

HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:

EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS

Partícula H_min

5 μm 9,1 μm

3,5 μm 5,8 μm

1,8 μm 3,7 μm

N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)

1.6 x Rs(5µm)

0.0000

S.T.M.: Sub Two Microns

Ultra Fast LC

Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia

N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)

* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

HPLC

GC: Diám. col. cap.

Espesor film f.estac. N

/ Diámetro Columna & Espesor Film (GC)

Página 9

4.6 x 150, 1.8um

490 bar

N = 28669

RS = 1.80 (+ 57%)

S/N = 44

7 Impurezas

Las 7 Separadas

a línea de base

4.6 x 150, 5um

93 bar

N = 7259

RS = 1.15

S/N = 42

Ejemplo de un cliente

Método Impurezas Isocr.

Zoom zona critica

rango tiempo @ 7min

4.6 x 150, 3.5um

165 bar

N = 14862

RS = 1.37

S/N = 50

7 Impurezas

6 No Separadas

a línea de base

Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs

UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µm Ejemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución

4 Impurezas

2 No Separadas

a línea de base

HPLC UHPLC

Página 10

2.1mm x 50mm 1.8µm

1.00ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 0.9 min

Analysis Time= 1.1min

UHPLC/RRLC, 40°C

10x faster

PW = 0.5 sec

min 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0

Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent 1200-RRLC (600bars)

HPLC, 40°C

PW = 3.4sec

4.6 x 150mm, 5µm

1.20ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 10.8 min

Analysis Time = 11min

min 0 2 4 6 8 10

0.2 0.6 0 0.4 min

2.1mm x 50mm 1.8µm

2.40ml/min, 95°C

Grad.: 35-95% en 0.38 min

Analysis Time: 0.4min

UHPLC/RRLC, 95°C

27x faster

PW = 197msec

150mm > 50mm: 3x

1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x

Hasta 20x más rápido que un HPLC. Manteniendo la resolución

Página 11

Efecto de la Temperatura en Gráfico de “Van Deemter”

Al aumentar la temperatura el óptimo se desplaza a flujos mayores

25°C, 45%ACN 60°C, 40%ACN 90°C, 35%ACN 120°C, 28%ACN

uo, opt

25ºC

60ºC

90ºC

120ºC

H = f (u) – butilparaben Tamaño partícula: 5 µm

7.00

9.00

11.00

13.00

15.00

17.00

19.00

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

u (mm/s)

H (

µm

)

HTLC: HPLC a Alta Temperatura permite trabajar a mayores flujos sin pérdida

de eficiencia y con mejor transferencia de masa (curva más plana a flujos altos)

Agenda



– Ecuación de Van Deemter.



el flujo de trabajo.

2. Conclusiones.

Página: 13

• La Capacidad de Separación de picos con Gradientes de concentración, es DIRECTAMENTE proporcional al FLUJO y al tiempo del gradiente:

• x2 flujo gradiente x2 nº de picos que puedo separar*.

• x3 flujo gradiente x3 nº de picos que puedo separar*.

• …..

• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradiente por unidad de tiempo:

• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357

• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243

* El nº de picos que se pueden separar aumentará algo menos con columnas de 5um (por la ligera perdida de eficacia al subir el flujo), pero aún así compensa la pérdida de eficacia.

¿Porqué es Importante en Gradiente poder trabajar

a FLUJOS Elevados en HPLC y UHPLC?

K‘ α F x Tg

Página: 14

HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar

de Columna para Reducir Tiempos SIN perder Resolución Incluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µm

Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/min

Tg = 3 min

3 min

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F = 3.0 mL/min

Tg = 2 min

2 min

• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá

mejorar la resolución/capacidad de separación.

• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de

eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.

K‘ = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)

Si mantenemos Tg=3 ( y F=3) obtendremos:

+Resolución y un tiempo análisis < 3min

Página: 15

Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18

Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)

Eluyente: 85:15 ACN: Agua

Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente 1/ 2.5

+ EFI

CA

CIA

-

EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS

Partícula H_min

5 μm 9,1 μm

3,5 μm 5,8 μm

1,8 μm 3,7 μm

N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)

1.6 x Rs(5µm)

0.0000

Ultra Fast LC

* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

HPLC

Página: 16

El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de

eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.:

• 5µm 0.75 mL/min: Eficacia/2.4 pero Capacidad Separación x7

• 3.5µm 0.85 mL/min: Eficacia/2 pero Capacidad Separación x6

K‘ = (87 x F x Tg) / ( Δ % x V0 x S)

Las columnas de 1.8µm NO conviene

que trabajen a flujos bajos; empiezan a

perder eficacia por debajo de

0.8mL/min (en columnas 4.6mm d.i //0.16

mL/min con 2.1mm d.i..)

La Ventaja de Subir el Flujo Trabajando con

Gradientes Incluso en HPLC (columnas 3.5 y 5µm)

ó Poroshell 120

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/min 1290 Infinity Cuaternario

Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8

Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min

Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando Pmáx

columna: 400bars) 40ºC.

Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-

terfenilo en metanol)

8min

4.5min

3.3min

Al subir flujo se reduce el

tiempo y el ancho de los picos

Página: 17

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5

ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/min Al subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el

ancho de los picos y en especial de los del principio

mejora la capacidad de separación de picos

8min

4.5min

3.3min

Peak width:

0.0546

Peak width:

0.0242

Peak width:

0.0171

Peak width:

0.0496

Peak width:

0.0542

Peak width:

0.0696

Página: 18

Peak width:

0.0696

Peak width:

0.0446

Peak width:

0.0371

Flujo

mL/

min

Capacidad

Separación Nº picos

(ref.1º)

Capacidad

Separación Nº picos

(ref.3º)

1 35 30

3 45 35

5 55 40

Nº de picos que se pueden

separar con resolución hasta

línea de base en función del

ancho en línea de base del 1er

(zona inicial) y 3er pico (zona

central) del cromatograma a

distintos flujos con la columna de

5µm totalmente porosa

Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una

columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

min 2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500

DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0401.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)

1.9

63

2.6

62

5.4

15

10.6

43

min 2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500


0.6

72

0.9

09

1.8

32

3.5

89

min 2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500


0.4

07

0.5

50

1.1

15

2.2

04

HPLC ISOCRÁTICO: Pérdida de Eficacia con 5 µm a Flujos Elevados Comparación Isocrático a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

Flujo: 1 ml/min. ACN/H2O 70/30

Flujo: 3 ml/min. ACN/H2O 70/30

Flujo: 5 ml/min. ACN/H2O 70/30 Isocrático: ACN/H2O 70/30

Inyección: 5 µl muestra (isocrática:1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-terfenilo en metanol

Detección: DAD 240/80 nm ref:360/100nm, slit 8nm y frecuencia de adquisición a 0.01 y 0.05min Celda 6mm y 5µl

N= 15.700 N= 16.200

N= 10.000 N= 9.900

N= 6.900

N= 6.500

• En ISOCRÁTICO Con 5µm hay una pérdida

de eficacia al pasar de 1 a 3-5 ml/min, pero

mantiene una buena resolución.

• 5ml/min con columna 4.6mm d.i.: N(1.8µm)

= 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)

Comparación Normalizada

min 2 4 6 8 10

1mL/min

3mL/min

5mL/min

Página 19

Entre 1 y 3ml/min

apenas se aprecia

pérdida de resolución

Agenda






el flujo de trabajo

2. Conclusiones.

Página: 20

Conclusiones: UHPLC “versus” HPLC

Página: 21

UHPLC permite MAXIMIZAR:

• Reducción de Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.

• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.

HPLC (400 bars) -incluso sin cambiar de columna- permite:

• Simplemente SUBIENDO el FLUJO de trabajo* Reducir Tiempos y

Aumentar la Resolución.

* Trabajando con gradientes de concentración

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Serie 1200 Infinity: la Máxima Flexibilidad

para trabajar en HPLC y UHPLC,

en Todo Tipo Aplicaciones.

Hasta 5mL/min*

para máxima eficacia y

mínimo tiempo de análisis

incluso con las

tradicionales y robustas

columnas de 4.6mm d.i

*hasta 10mL/min con bombas

cuaternarias

Página: 22

Agilent 1290 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atención

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem

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