tutor - uce · 2017. 5. 9. · informe del tutor en mi carácter de tutor del trabajo de...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
EFECTO DE DISTINTOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD
ESPERMÁTICA PRE Y POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE
TOROS REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN
Informe final de investigación presentado como requisito para optar el Título
de
Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR
CARLOS ANDRÉS ANCHATUÑA QUINGA
TUTOR
Dr. JORGE ADALBERTO MOSQUERA ANDRADE
QUITO, FEBRERO 2017
ii
DEDICATORIA
A Dios
Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para
lograr mis objetivos.
A mis padres Carlos y María
Por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi educación, tanto
académica, como de la vida, por su apoyo incondicional en todo momento.
A mis hermanos Stalin y Daniel
Por estar conmigo siempre y apoyarme, los quiero mucho.
A mis familiares
Mis queridos abuelos Isidro y Beatriz por ser mi guía y apoyo siempre. A mis
tios César, Inés, Consuelo y Bersabé por haberme ayudado a culminar este
proyecto.
A mis amigos
Que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que
hasta ahora, seguimos siendo amigos: Luis Romero, Daniel Arcos, Diego
Caroa, Sofia Monteros y especialmente a Teresa Quisilema por compartir los
buenos y malos momentos.
Y a todos aquellos que participaron directa o indirectamente en la
elaboración de esta tesis, familiares y amigos que no recordé al momento de
escribir esto.
¡Gracias a ustedes!
Carlos Andrés
iii
AGRADECIMIENTOS
A mi tutor, Dr. Jorge Mosquera por su paciencia, sus consejos y conocimientos
que permitieron la realización de este trabajo.
Al Ministerio de Agricultura, Ganaderia, Acuacultura y Pesca por haberme
permitido realizar este trabajo en tan importante institución.
A la Central Nacional de Producción y Mejoramiento Genético “El Rosario” por
cederme sus instalaciones para la realización de este trabajo.
Al equipo de Genética de la Central Nacional de Producción y Mejoramiento
Genetico “El Rosario”: Dra. Maricela Veloz, Dr. Francisco Gallegos, Dra.
Cristina Ramos, Ing. Sebastian De Trinidad, Karla Sonnenholzner y Cristian
Moya por sus conocimientos y ayuda para la realización de este trabajo.
Al Ing. Marcelo Hernández por el porte de sus conocimientos para la
culminación de este trabajo.
A todos los docentes de la Facultad, por proporcionarme su sabiduría dentro
y fuera de las aulas.
iv
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Carlos Andrés Anchatuña Quinga en calidad de autor del trabajo de
investigación “Efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad
espermática pre y post-congelación de semen bovino de toros reproductores
Holstein Friesian” autorizo a la Universidad Central del Ecuador, hacer uso de
todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta
obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido
en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad
Intelectual y su Reglamento.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio
virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 07 días del mes de Febrero del 2017.
Carlos Andrés Anchatuña Quinga
Cd. N° 1722462700
v
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Investigación, presentado por el señor:
CARLOS ANDRÉS ANCHATUÑA QUINGA, para optar por el Título o Grado
de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es “EFECTO DE DISTINTOS
TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA PRE Y
POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE TOROS
REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN”. Considero que dicho trabajo
reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
Quito, a los 07 días del mes de Febrero del 2017
Dr. JORGE ADALBERTO MOSQUERA ANDRADE
CI: 1702609197
vi
vii
viii
ix
ÍNDICE GENERAL
Titulo ............................................................................................. pág.
DEDICATORIA .............................................................................................. II
AGRADECIMIENTOS .................................................................................. III
© DERECHOS DE AUTOR .......................................................................... IV
INFORME DEL TUTOR ................................................................................. V
LISTADO DE GRÁFICOS ............................................................................ XI
LISTADO DE TABLAS................................................................................ XII
LISTADO DE CUADROS ........................................................................... XIII
RESUMEN.................................................................................................. XIV
ABSTRACT ................................................................................................. XV
CAPÍTULO I .................................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1
CAPÍTULO II ................................................................................................. 3
OBJETIVOS ............................................................................................... 3
GENERAL .............................................................................................. 3
ESPECIFICOS ....................................................................................... 3
CAPÍTULO III ................................................................................................ 4
MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 4
Crioconservación de semen ................................................................... 4
Antecedentes ...................................................................................... 5
Métodos de crioconservación .............................................................. 5
Efectos de la crioconservación sobre el espermatozoide .................... 6
Tiempo de equilibrio ............................................................................... 7
Diluyentes ............................................................................................... 8
Evaluación de semen ............................................................................. 9
Semen fresco ...................................................................................... 9
Evaluación macroscópica .................................................................... 9
Evaluación microscópica ................................................................... 10
Motilidad espermática ....................................................................... 10
Sistema de Análisis Seminal Computarizado (CASA) ....................... 12
CAPÍTULO IV ........................................................................................... 13
MATERIALES Y METODOLOGÍA ............................................................ 13
MATERIALES ....................................................................................... 13
Físicos .............................................................................................. 13
Biológicos.......................................................................................... 13
Químicos ........................................................................................... 13
x
Suministros de oficina ....................................................................... 14
METODOLOGÍA ................................................................................... 14
Ubicación .......................................................................................... 14
Tipo de investigación ........................................................................ 14
Factores en estudio ........................................................................... 14
Características de las unidades experimentales ............................... 15
Preparación de toros reproductores .................................................. 15
Procedimientos ................................................................................. 15
Protocolo para análisis de semen ..................................................... 15
Análisis macroscópico ....................................................................... 16
Análisis microscópico ........................................................................ 16
Análisis seminal - CASA.................................................................... 17
Tiempo de equilibrio .......................................................................... 18
Análisis pre-congelación ................................................................... 18
Análisis post-congelación .................................................................. 19
Tinción de vitalidad (Eosina-Nigrosina) ............................................. 19
Análisis estadístico ............................................................................ 20
CAPÍTULO V ............................................................................................... 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 21
a) “Motilidad Espermática Total” ........................................................ 22
b) “Motilidad Espermática Progresiva” ............................................... 24
c) “Espermatozoides Vivos/Muertos” ................................................. 25
d) “Morfología” (Espermatozoides Normales/Anormales)................... 26
CAPÍTULO VI .............................................................................................. 29
CONCLUSIONES .................................................................................... 29
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 30
ANEXOS ..................................................................................................... 34
ANEXO 3. REGISTRO DE ANÁLISIS SEMINAL PRE Y POS CONGELACIÓN PARA LOS
DIFERENTES TIEMPOS DE EQUILIBRIO. ........................................................... 34
ANEXO 4 FOTOGRAFÍAS .............................................................................. 35
xi
LISTADO DE GRÁFICOS
Pág.
GRÁFICO. N°1
Comparación de la Variable Motilidad Espermática Total
Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de
Equilibrio de Semen Bovino.
22
GRÁFICO N°2
Comparación de la Variable Motilidad Espermática
Progresiva Pre y Post Congelación para los Diferentes
Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino.
24
GRÁFICO N° 3
Comparación de la Variable Espermatozoides Vivos Pre y
Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio
de Semen Bovino.
25
GRÁFICO N° 4
Comparación de la Variable Espermatozoides Normales
Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de
Equilibrio de Semen Bovino.
27
xii
LISTADO DE TABLAS
Pág.
TABLA N°1
Unidades experimentales de laboratorio según los tiempos
de equilibrio.
15
TABLA N°2
Color y densidad del semen bovino.
16
TABLA N° 3
Análisis de la motilidad espermática masal
16
TABLA N° 4
Evaluación de la motilidad espermática individual.
17
xiii
LISTADO DE CUADROS
Pág.
CUADRO N° 1
Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en
la pre-congelación con diferentes tiempos de equilibrio.
21
CUADRO. N° 2
Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en
la post-congelación con diferentes tiempos de equilibrio.
22
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“EFECTO DE DISTINTOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD
ESPERMÁTICA PRE Y POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE
TOROS REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN”
Autor: Carlos Andrés Anchatuña Quinga
Tutor: Dr. Jorge A. Mosquera. A
Fecha: 17 de Enero del 2017
RESUMEN
La crioconservación de semen es una importante biotecnología que tiene como
objetivo la conservación de material genético por tiempo indefinido. Durante la
congelación y la descongelación de semen los espermatozoides sufren muchos
daños que pueden reducir su calidad hasta en un 50%. El objetivo del presente trabajo
fue evaluar el efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática
pre y post-congelación de semen bovino. Se utilizó el semen de un grupo de toros de
la raza Holstein Friesian, colectados con vagina artificial; el semen fue diluido y
envasado en pajuelas de 0.5 ml, las que fueron puestas en refrigeración a una
temperatura de 5ºC durante 7 tiempos de equilibrio diferentes (2, 4, 8, 12, 16, 20 y 24
horas); un grupo de pajuelas fue analizado al término de cada tiempo de equilibrio y
otro grupo sometido a crioconservación y analizado 72 horas post congelación. Se
evaluó motilidad, viabilidad y anomalías espermáticas. En los valores obtenidos se
encontraron diferencias estadísticamente significativas entre pre y post congelación.
La motilidad espermática total y progresiva pre congelación tuvieron resultados más
altos a las 2 horas de tiempo de equilibrio, mientras que en la post congelación los
mejores resultados se dieron a las 4 horas de tiempo de equilibrio. En la vitalidad
espermática pre congelación se obtuvo mayor porcentaje de espermatozoides vivos
a las 2 horas (78.23%) y en los resultados post congelación (68.69%) dentro de las
mismas 2 horas de tiempo de equilibrio. Con respecto a las anomalías espermáticas
el mejor tiempo de equilibrio con mayor porcentaje de espermatozoides normales fue
a las 2 horas tanto para la pre congelación (86.42%) como para la post congelación
(82.60%).
Palabras clave: bovinos, semen, tiempo de equilibrio, calidad espermática,
crioconservación.
xv
xv
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE
CAREER OF VETERINARY MEDICINE
“EFFECT OF DIFFERENT EQUILIBRATION TIMES ON THE SPERM
QUALITY PRE AND POST-FREEZING OF SEMEN BOVINE OF
REPRODUCERS BULLS HOLSTEIN FRIESIAN"
Author: Carlos Andrés Anchatuña Quinga
Tutor: Dr. Jorge A. Mosquera. A
Date: January 17, 2017 ABSTRACT
Cryopreservation of semen is an important biotechnology field which objective is to indefinitely preserve genetic material. During the process of freezing and thawing semen the sperms suffer many damages that might reduce their quality by up to 50%. The objective of this work is to evaluate the effect of different equilibrium times on pre and post-freezing sperm quality of bovine semen. Semen of a group of Holstein Friesian bulls was used, collected using artificial vagina. The semen was diluted and packaged in 0.5 ml straws, which were refrigerated at a temperature of 5 °C during 7 different equilibratig times (2, 4, 8, 12, 16, 20 and 24 hours); a group of straws was analyzed at the end of each equilibrating time and another group put into cryopreservation and analyzed 72 hours post-freezing. Motility, viability and sperm abnormalities were evaluated. Significant differences between pre and post freezing variables were found. Total sperm motility and progressive sperm motility showed higher pre-freezing scores at 2 hours of equilibrium time, while on post-freezing the best results were obtained at 4 hours of equilibrium time. About pre freezing sperm vitality, the highest percentage of living sperm was gotten at 2 hours (78.23%) the same as post-freezing results (68.69%) at 2 hour of equilibrium time. About spermatic anomalies, the best equilibrium time with the highest percentage of normal sperm was 2 hours for both pre-freezing (86.42%) and post-freezing (82.60%).
Key words: bovine, semen, equilibrium time, sperm quality, cryopreservation
Translated by MSc. Bersabé Quinga
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
Para que la industria ganadera sobreviva en la economía actual, el ganado
debe manejarse de tal manera que se pueda lograr un comportamiento
reproductivo más eficiente (Háfez, 2000). En el ganado bovino, el macho
reproductor juega un papel muy importante, dependiendo del método que se
utilice puede servir a varias hembras y mucho más si se utilizan las técnicas
de biotecnología. Sin embargo, su éxito o fracaso en la reproducción
dependerá de su salud sexual, de su capacidad para la monta y de la calidad
espermática que éste posea (Galina & Valencia, 2008).
La crioconservación de semen es una importante biotecnología reproductiva,
que busca promover la conservación del germoplasma masculino por tiempo
indeterminado; junto con la inseminación artificial proporcionan un ahorro en
la economía para el productor, al reducir los costos que implicaría el mantener
un macho reproductor, así como los riesgos de contagio de enfermedades de
transmisión sexual (Castelo et al., 2008). Durante la crioconservación, los
espermatozoides sufren muchos cambios que pueden dañar la integridad de
los mismos, lo que se puede ver reflejado en la disminución de la fertilidad
(González, 2004).
El tiempo de equilibrio es aquel en el que los espermatozoides permanecen
en contacto con el diluyente a temperatura de 5ºC, previo a la congelación, el
que puede durar entre 2 a 24 horas (Suárez & Coral, 2012).
Varios estudios han determinado que la calidad espermática post-congelación
varía en función del tiempo de equilibrio. Berndstone y Foote en 1972
propusieron un tiempo de equilibrado de 3 a 5 minutos con una temperatura
de 5ºC ó 25ºC, ya que demostraron que durante este tiempo el
2
glicerol penetra en los espermatozoides de toro (Muiño, 2007). El esperma se
puede mantener a 5ºC durante 24 horas antes de la crioconservación sin
alterar la fertilidad del semen (Purdy et al., 2010). En otro estudio, donde se
probaron 3 diferentes tiempos de equilibrio a 0, 2 y 4 horas a una temperatura
de 5ºC, se obtuvieron los mejores resultados a las 4 horas de equilibrio con
mayor supervivencia de espermatozoides (Leite et al., 2010).
Aún existe una controversia acerca de cuál sería el tiempo de equilibrio
recomendado en el que se obtendría una mayor calidad espermática posterior
a la congelación.
Actualmente en el Ecuador se han venido realizando estudios sobre calidad
de semen bovino, midiendo relaciones directas entre las características
andrológicas del reproductor y el semen, probando diferentes tipos de
diluyentes y adicionando varias sustancias al momento de la dilución de
semen. Sin embargo, en el país no existen trabajos donde se analicen las
características espermáticas de muestras seminales sometidas a distintos
tiempos de equilibrio.
En el presente trabajo, se analizaron las características seminales pre y post-
congelación probando distintos tiempos de equilibrio para determinar el efecto
que éste ejerce sobre la calidad espermática.
3
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad
espermática pre y post-congelación de semen bovino.
ESPECIFICOS
Realizar y comparar el espermatograma, mediante análisis CASA, de
bovinos reproductores antes y después de la congelación de semen
sometido a diferentes tiempos de equilibrio.
Determinar el tiempo de equilibrio en el que se obtenga la mejor
viabilidad espermática pre y post-congelación en los distintos grupos de
pajuelas con semen bovino.
4
CAPÍTULO III
MARCO TEÓRICO
Crioconservación de semen
La crioconservación es una técnica mediante la cual el material biológico
puede ser mantenido viable por tiempo indefinido (Medina et al., 2007); junto
con la inseminación artificial proporcionan un ahorro en la economía para el
productor, al reducir los costos que implicaría el mantener un macho
reproductor, así como los riesgos de contagio de enfermedades de transmisión
sexual (Castelo et al., 2008).
Durante la crioconservación, los espermatozoides sufren muchos cambios que
pueden dañar la integridad de los mismos, lo que se puede ver reflejado en
disminución de la fertilidad (González, 2004). Se trata de un complejo proceso
el cual integra varios factores como la dilución, la congelación, la
descongelación y la fisiología propia del semen de cada especie, a los que se
debe prestar mucha atención si lo que se busca son unos resultados
satisfactorios (Castelo et al., 2008).
La crioconservación de semen es importante para la preservación del
germoplasma masculino de animales de valor zootécnico que pueden morir
inesperadamente (Ribeiro-Peres et al., 2014). La aplicación de los
procedimientos de crioconservación ha sido más exitosa en bovinos que en
otras especies de animales domésticos, y tiene como finalidad obtener
preñeces por inseminación artificial de manera tan eficaz como después del
apareamiento natural (Háfez, 2000).
5
Antecedentes
El semen de animales domésticos se ha sometido a criopreservación
exitosamente desde hace más de 30 años y desde entonces se han venido
mejorando continuamente (Háfez, 2000); sin embargo, la historia de la
crioconservación comienza con el descubrimiento del espermatozoide que se
remonta al año de 1677, cuando el científico holandés Anthony Van
Leeuwenhoek reporta a la Real Sociedad de Londres haber encontrado
células móviles en el semen humano.
Casi 100 años después Abbe Lázaro Spallanzani (1775), sacerdote y profesor,
reportó que los espermatozoides humanos, de potros y de ranas podrían ser
congelados en la nieve por 30 minutos y posteriormente reactivados con calor
para la recuperación de su movilidad.
Paolo Mantegazza (1866) observó que el semen puede ser preservado al
reducirse la temperatura y demostró que los espermatozoides del semen
humano sobrevivieron luego de una congelación a -17ºC; éste fue uno de los
primeros reportes de recuperación de células de mamíferos después de haber
sido expuestas a bajas temperaturas en un punto de congelación.
Chang y Walton en 1940 sugirieron utilizar la reducción de temperatura para
deprimir la actividad metabólica de los espermatozoides y así prolongar su
vida. Phillips en 1939, utiliza por primera vez la yema de huevo como sustancia
crioprotectora, la que evita el shock térmico que sufren los espermatozoides al
ser sometidos a la congelación (Bonadonna, 1986; Bwanga, 1991)
El desarrollo de la criopreservación fue paralelo al de la inseminación artificial
en animales, hasta llegar a hoy en día en el que las dos se encuentran
fuertemente relacionadas.
Métodos de crioconservación
Un gran número de protocolos de congelación se han desarrollado
principalmente debido a la diferencia que existe entre especies. Por esta
circunstancia, las técnicas y procedimientos actuales deben ser validados
6
empleando el semen de la especie de interés, para de esta forma lograr su
conservación a largo plazo sin afectar significativamente su calidad (Medina et
al., 2007).
Existen dos métodos de congelación de semen, el convencional y el
automatizado.
Método convencional.- las pajuelas con semen son colocadas sobre una
gradilla metálica y refrigeradas en una nevera doméstica a una temperatura
de 4ºC durante 4 horas; luego, las pajuelas pasan a una caja de poliestireno
que contiene nitrógeno líquido; aquí las pajuelas son colocadas a 6 cm sobre
la superficie del nitrógeno durante 20 minutos. Para finalizar, las pajuelas son
sumergidas en nitrógeno líquido y, posteriormente, pasan a ser almacenadas
en un termo de nitrógeno (Vasconcelos-Filho, 2010).
Método automatizado.- luego del envase, las pajuelas son refrigeradas y
congeladas utilizando un equipo automatizado de congelación de semen; la
curva de congelación es dada por el software que posee el equipo y puede ser
predeterminada por recomendaciones del fabricante o modificada por el
operario según crea conveniente. Luego de la congelación, las pajuelas son
sumergidas en nitrógeno líquido y finalmente almacenadas en un termo de
nitrógeno líquido (Ribeiro-Peres et al., 2014).
Efectos de la crioconservación sobre el espermatozoide
Durante la crioconservación, los espermatozoides sufren muchos cambios que
pueden dañar la integridad de los mismos, lo que se puede ver reflejado en
disminución de la fertilidad comparada con semen fresco (González, 2004).
El efecto negativo se ve reflejado sobre la calidad espermática
posdescongelación, principalmente en la pérdida de viabilidad o daño
funcional de los espermatozoides sobrevivientes. La baja viabilidad se debe a
varios factores como: cambio de temperatura, estrés osmótico, la formación
de hielo intracelular y la toxicidad (Watson, 2000).
7
El congelamiento demasiado rápido puede causar un choque térmico y la
formación de cristales de hielo intracelulares; por el contrario, si la congelación
es muy lenta, las concentraciones de sal aumentan a medida que el agua se
congela. El incremento de la presión osmótica durante un largo periodo de
congelación puede dañar las proteínas y lipoproteínas que posee el
espermatozoide (Háfez, 2000).
Entre un 40 y 50% de la población de espermatozoides no sobrevive al proceso
de crioconservación y posdescongelación; sin embargo, un porcentaje de
espermatozoides sobrevivientes han sufrido daños que los vuelven incapaces
de fecundar. Por tal motivo, el protocolo de congelación no solo debe tener por
objetivo el conseguir solo un mayor número de células vivas sino también que
conserven su integridad (Stornelli & Stornelli, 2001).
Tiempo de equilibrio
Se define al tiempo de equilibrio como el tiempo en el cual los espermatozoides
permanecen en contacto con el diluyente de congelación a una temperatura
de 5ºC antes de ser congelado; durante este tiempo el crioprotector y otros
componentes de los diluyentes penetran la célula hasta que se logra un
balance de concentraciones (Díaz et al., 2015). Se plantea que el tiempo de
equilibrio ayuda a la estabilización de la membrana de los espermatozoides
para que pueda tolerar el intercambio de agua que se produce durante la
congelación (Patt & Nath, 1969).
Varios estudios plantean diferentes beneficios y desventajas del tiempo de
equilibrio, variando los efectos sobre los espermatozoides según el tipo de
diluyente, las concentraciones de azúcar, de glicerol y velocidad de
enfriamiento de la muestra de semen, además de variar según la especie
(Salamon & Maxwell, 2000).
Berndstone y Foote, en 1972 demostraron que el glicerol penetra en los
espermatozoides en un tiempo de 3 a 5 minutos a una temperatura de 5ºC o
25ºC (Muiño, 2007). El esperma puede mantenerse a 5ºC durante 24 horas
antes de la crioconservación sin alterar su fertilidad pero tampoco la mejoran
8
(Purdy et al., 2010). Varios estudios mencionan que un tiempo de equilibrio
más prolongado da como resultado mejor calidad espermática
poscongelación, mientras que otros coinciden en que el tiempo recomendable
seria entre 2 a 4 horas de tiempo de equilibrio (Díaz et al., 2015; Leite et al.,
2010). Sin embargo, aún existe la controversia entre cuál sería el tiempo de
equilibrio óptimo en el que se obtendría la mejor calidad espermática después
de la congelación.
Diluyentes
El empleo de medios conservadores permite prolongar la viabilidad de la célula
espermática, rentabilizar los eyaculados obtenidos y conservar las dosis por
un periodo prolongado de tiempo (Mesa, 2012).
Salisbury, VanDermark & Lodge, en 1982 afirman que las primeras sustancias
que se utilizaron para la dilución de semen fueron soluciones salinas o
azucaradas. Durante décadas se han venido estudiando diferentes soluciones
con las cuales poder diluir semen, de bovinos principalmente; en 1950 existían
diluyentes que permitían conservar semen solamente por un periodo de 4 días
a una temperatura de 4ºC; luego se descubrió los beneficios de utilizar la yema
de huevo, la cual brindaría la ventaja de disminuir el metabolismo de la célula
espermática y prolongar su fertilidad a 5ºC.
Háfez (2000) describe las funciones que deben realizar los agentes que
forman parte de un buen diluyente:
a. Aportan nutrimentos como una fuente de energía,
b. Protegen contra el efecto nocivo del enfriamiento rápido,
c. Son amortiguadores que impiden cambios perjudiciales en el pH al
formarse ácido láctico,
d. Mantienen la presión osmótica apropiada, el balance electrolítico e
inhiben la proliferación bacteriana,
e. Incrementan el volumen del semen de modo que éste pueda
emplearse para múltiples inseminaciones y,
f. Protegen a las células espermáticas durante la congelación.
9
Evaluación de semen
Semen fresco
El semen es una combinación de las secreciones de los testículos, de las vías
espermáticas de conducción y de las secreciones de las glándulas accesorias.
Contiene espermatozoides y diversas proporciones de secreción que aportan
los diferentes órganos y glándulas del aparato genital masculino, denominadas
en conjunto plasma seminal (Palma, 2006).
Evaluación macroscópica
Las características macroscópicas que se evalúan en el semen de bovinos
son: volumen, color, densidad, olor y pH.
Volumen.- se observa directamente sobre el tubo graduado, teniendo en
cuenta que un toro mayor de 2 años debe tener un eyaculado de no menos de
4ml. El volumen puede variar entre 2 y 12ml (Gómez & Migliorisi, 2015).
Color.- se consideran normales los colores que van del blanco al amarillento,
siendo patológicos los colores rosado, amarronado y verdoso (Gómez &
Migliorisi, 2015).
Densidad.- se encuentra relacionado con la cantidad de espermatozoides que
contiene; puede variar, desde un semen acuoso traslucido con menos de
250.000 esp/mm3 hasta un cremoso con 750.000 esp/mm3 (Ver Tabla 2)
(Gómez & Migliorisi, 2015).
pH.- Refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre
el pH alcalino de vesículas seminales y el ácido de la próstata (López Garcia
et al., 2012). El pH del semen bovino varía normalmente en un rango muy
estrecho entre 6,2 – 7,5 con un promedio de 6,8 (Gómez & Migliorisi, 2015).
Olor.- Las muestras de semen recolectadas higiénicamente, de toros sanos y
fértiles, tienen un débil olor sui géneris (Carpio, 2015).
10
Evaluación microscópica
Las características microscópicas a evaluar en el semen de bovinos son:
motilidad masal, motilidad individual, vitalidad, morfología y concentración
espermática.
Motilidad espermática
Para que un espermatozoide sea capaz de fecundar a un ovocito ha de reunir
una serie de requisitos, entre ellos, tener motilidad progresiva. Dicho
parámetro ha sido y sigue siendo el más utilizado para valorar la calidad de un
eyaculado o de una dosis seminal. Un eyaculado con un porcentaje bajo de
espermatozoides móviles, o ausencia de motilidad, automáticamente será
descartado para su conservación (Muiño, 2007).
Motilidad Masal.- Por movimiento en masa se entiende al movimiento en onda
de todos los espermatozoides, observado en los eyaculados densos (Carpio,
2015). Para su valoración se usa el semen fresco, colocando una gota de éste
sobre un porta objetos precalentado a 37ºC en una plancha térmica a la misma
temperatura y se observa bajo el microscopio con una lente 40x (Palma,
2006).
El movimiento en masa va a depender de tres factores: concentración,
porcentaje de células con movimiento progresivo y velocidad de movimiento
de los espermatozoides (Muiño, 2007). Para evaluar se usa una escala de 1
a 5, evaluando como 1 al semen que no presenta ondas y 5 cuando las ondas
se mueven rápidamente formado remolinos (Gómez & Migliorisi, 2015).
Motilidad individual.- La motilidad individual de una muestra de semen se
expresa como el porcentaje de células móviles bajo un campo microscópico.
Debido a que el semen bovino es muy concentrado, no se puede realizar este
análisis con semen fresco, por lo tanto, se lo debe diluir, colocar una gota sobre
un portaobjeto temperado a 37ºC y observado al microscopio en una lente de
100x (Carpio, 2015).
Morfología.- además de tener una buena motilidad progresiva, los
espermatozoides deben ser morfológicamente normales. Cualquier anomalía
11
que afecte a algún atributo del espermatozoide puede dificultar su migración
en el tracto genital de la hembra, impidiendo la unión con el ovocito (Muiño,
2007).
En general, un buen reproductor no deberá tener más del 30% de células
anormales en un eyaculado (Gómez & Migliorisi, 2015). Sin embargo, Háfez
(2000) menciona que una muestra de semen deberá tener menos del 20% de
células anormales para poder ser adecuado para la congelación.
Gómez & Migliorisi (2015) describen distintas clasificaciones de las anomalías
espermáticas atendiendo a distintos criterios:
a. Primarias y Secundarias.- aquellas que se originan dentro del testículo
durante la espermatogénesis (Malformaciones primarias) y aquellas
que se originan dentro del epidídimo (Malformaciones secundarias).
b. Mayores y Menores.- Esta clasificación la propuso Bloom en 1977;
aquellas que estaban asociadas con infertilidad (Malformaciones
Mayores), y aquellas que no se encontraban relacionadas con la
fertilidad en forma directa (Malformaciones Menores).
c. Compensables y No Compensables.- En 1994 Saacke y col.
propusieron clasificar los defectos como Compensables a aquellos en
los que el espermatozoide no llega a la vecindad del ovocito y no evita
que otro espermatozoide realice la fertilización y que se compensa
aumentando la concentración de la dosis seminal y, No Compensables
cuando el espermatozoide está perfectamente capacitado para llegar
hasta el ovocito, pero es incapaz de continuar el proceso de fertilización,
por lo que no se puede compensar aumentando la concentración en la
dosis seminal, ya que si la dosis posee un alto porcentaje de
espermatozoides con esta anormalidad no habría diferencia.
Concentración.- La concentración de espermatozoides se expresa como el
número de espermatozoides por mililitro el que deberá ser de mínimo 100
millones por mililitro (Háfez, 2000). Existe una variabilidad muy grande en la
12
concentración de un eyaculado a otro y de un toro a otro, siendo importante
conocer el número de espermatozoides por eyaculado, ya que de este
parámetro depende el número de hembras a inseminar (Carpio, 2015).
Sistema de Análisis Seminal Computarizado (CASA)
El Computer Assisted Semen Análisis (CASA) fue desarrollado en la
Universidad de Pennsylvania por Liu y Warne en 1977 y perfeccionado en
1980 por Amann y Hammersatedt; se introduce en el mercado a principio de
los 80, originalmente para la evaluación de semen humano. Al paso de los
años se ha ido perfeccionando y modernizándose. En la actualidad se utiliza
mucho en el campo veterinario, tanto en investigación, como en el de la
industria de los centros de inseminación artificial (Cuadrado et al., 2012).
El sistema está conformado por una cámara de video conectada a un
microscopio de fases y a una computadora que digitaliza las imágenes del
tamaño y de los movimientos espermáticos. Las imágenes digitalizadas
permiten analizar la velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular
o lateral (Brogliatti, 2016)
Los sistemas CASA brindan resultados como un espermatograma clásico pero
de una manera más rápida y objetiva de los diferentes parámetros como
motilidad total, motilidad progresiva, motilidad local, concentración, porcentaje
de vivos/muertos y morfología, logrando de esta manera, optimizar el
procesamiento de muestras seminales.
13
CAPÍTULO IV
MATERIALES Y METODOLOGÍA
MATERIALES
Físicos
Sistema CASA, Marca: Minitübe (Software SpermVision®)
Impresora automática para pajuelas, Marca: Minitübe, Modelo.
EasyCoder
Empacadora y selladora de pajuelas, Marca: Minitübe, Modelo: MPP
Congelador automático con monitor, Marca: Minitübe, Modelo: IceCube
14 MA
Vagina Artificial
Camisas y conos de látex
Tubos plásticos volumétricos para colecta de semen
Porta y cubre objetos
Planchas térmicas
Micro pipetas
Baño María
Nitrógeno líquido
Tanques de nitrógeno
Biológicos
Toros reproductores
Semen bovino
Químicos
Diluyente para semen
Agua bi-destilada
14
Suministros de oficina
Registros (hojas de papel bond)
Esferográfico
Cámara fotográfica
Libro de campo
Computadora
METODOLOGÍA
Ubicación
La investigación se llevó a cabo en la Central Nacional de Producción y
Mejoramiento Genético “El Rosario”, que forma parte del Proyecto Ganadería
Sostenible perteneciente al Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura
y Pesca (MAGAP), la que se encuentra ubicada en la Parroquia de Tambillo,
Cantón Mejía, Provincia de Pichincha, a una altitud de 2900 metros sobre el
nivel del mar, en las coordenadas 0°25'57.36"S; 78°34'29.85"O (Google maps,
2016). Con una temperatura promedio de 13.1 °C (Máxima 21.5 °C y mínima
6.4 °C), humedad relativa promedio de 84% y precipitaciones de 1500 mm al
año (MAGAP, 2016).
Tipo de investigación
Trabajo de campo y estudio experimental de laboratorio.
Factores en estudio
En esta investigación se evaluó y comparó el efecto que ejercen distintos
tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática de semen bovino antes y
después de la congelación. Se utilizó siete tiempos de equilibrio, tomando
como tiempo mínimo 2 horas, y otros seis tiempos con un intervalo de 4 horas
(4, 8, 12, 16, 20, 24 horas).
15
Características de las unidades experimentales
Bovinos machos reproductores de la raza Holstein Friesian, con edades
similares comprendidas entre 2 y 3 años, peso promedio de 700kg y que viven
bajo las mismas condiciones de alimentación y manejo.
Unidades experimentales de laboratorio.- se utilizó pajuelas de 0.5ml, en total
70 pajuelas de cada toro, 10 para cada tiempo de equilibrio, de las cuales la
mitad se analizó antes de la congelación y la otra mitad 72 horas posteriores
a la congelación.
Tabla 1. Unidades experimentales de laboratorio según los tiempos de
equilibrio
Tiempos
de
Equilibrio
Toro 1 Toro 2 Toro 3 Toro 4 Toro 5
PreC PostC PreC PostC PreC PostC PreC PostC PreC PostC
Número de pajuelas de 0.5ml
2 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
4 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
8 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
12 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
16 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
20 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
24 horas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
(PreC= pre-congelación, PostC= post-congelación)
Preparación de toros reproductores
Antes de la colecta de semen para el trabajo práctico se realizó una
evaluación de los reproductores y una colecta de limpieza.
Procedimientos
Protocolo para análisis de semen
Después de haber obtenido las muestras de semen, se las pasó al
laboratorio para su respectivo análisis.
El análisis se realizó manualmente a través de la observación directa,
evaluando las características macroscópicas de la muestra, y sus
características microscópicas a través del equipo CASA.
16
Análisis macroscópico
Color y densidad.- estos dos parámetros se midieron tomando en cuenta la
siguiente tabla:
Tabla 2. Color y densidad del semen bovino
Aspecto Valoración Concentración
Cremoso Muy bueno (MB) 750.000 esp/mm3
Blanco lechoso Bueno (B) 400 a 750.000 esp/mm3
Blanco acuoso Regular (R) 250 a 400.000 esp/mm3
Traslucido Pobre (P) Menos de 250.000 esp/mm3
Fuente:(Gómez & Migliorisi, 2015)
Volumen.- se tomó dos eyaculados por toro, en cada eyaculado se midió su
volumen observando directamente al tubo volumétrico graduado donde se
colectó el semen.
PH.- sobre una tira indicadora de pH se colocó una gota de semen sin diluir y
se procedió a leer.
Análisis microscópico
Motilidad espermática masal
La platina térmica, los cubre y porta objetos estuvieron previamente
temperados a 37ºC.
Se colocó 5 µl de semen sobre un portaobjetos, cubriéndolos
cuidadosamente con un cubreobjetos.
La muestra se evaluó inmediatamente con una lente 40x.
Se estableció el siguiente criterio para la valoración:
Tabla 3. Análisis de la motilidad espermática masal
Fuente: (Gómez & Migliorisi, 2015)
Valor descriptivo Aspecto del modelo % células móviles
Criterio evaluativo
Muy buena Movimiento en ondas vigorosas y en remolinos rápidos
>80% ++++
Buena Remolinos y ondas más lentas 60-80% +++
Regular Sin remolinos, pero con oscilaciones generalizadas
40-60% ++
Mala Escasa o ninguna motilidad <40% + o -
17
Motilidad espermática individual
Se realizó una dilución de semen 1:100 (10 µl de semen y 990 µl de
diluyente), se tomó una cantidad de 10 µl de esta dilución y se colocó
sobre el portaobjetos cubriéndolo cuidadosamente con el
cubreobjetos; se observó bajo el microscopio con objetivo de 40x y,
de esta forma, se evaluó de la motilidad individual.
La valoración se estimó de acuerdo a la siguiente tabla:
Tabla 4. Evaluación de la motilidad espermática individual
Valor (%) Clasificación Descripción
< 30 Pobre Muy lento y errático
40-49 Aceptable Lineal lento y generalizado
50-69 Bueno Lineal moderadamente rápido
>70 Muy bueno Lineal rápido
Fuente: (Gómez & Migliorisi, 2015)
Análisis seminal - CASA
Se preparó el diluyente mezclándolo con agua bi-destilada y se colocó
en el baño María a 37°C. Se calculó la cantidad de diluyente a utilizar,
según el volumen de semen que el reproductor haya donado.
El microscopio, platinas térmicas, portaobjetos, cubreobjetos y cámaras
estuvieron precalentados a 37°C.
Una vez estabilizado el semen en el baño María, se extrajo una muestra
de 25 µl de semen del tubo graduado con una pipeta y se colocó en un
tubo Eppendorf que se encontraba en la platina térmica previamente
marcado con el código del reproductor.
Usando otra pipeta, se tomó 900 µl del diluyente y se los colocó sobre
el semen (25 µl) en el tubo Eppendorf del reproductor en cuestión.
Se homogenizó el contenido del tubo Eppendorf, y se esperó que se
estabilice.
El semen restante que estaba en el Baño María se diluyó, usando una
fórmula de dilución 1:1.
18
Utilizando una pipeta extrajimos 3 µl del semen diluido del tubo
Eppendorf y con mucha precisión, se colocó en una cámara Leja
previamente calentada en la platina térmica.
Al iniciar el software SpermVision Production® se ingresó la información
del reproductor, y se procedió a observar la cámara Leja al microscopio
enfocando el área donde se encuentra la suspensión a analizar.
Luego de obtener el resumen de las características de la muestra de
semen con una motilidad total mayor al 70%, se procedió a la impresión
y llenado de pajuelas.
Tiempo de equilibrio
Se separó y etiquetó cada grupo de pajuelas por toro y para los
diferentes tiempos de equilibrio.
Se colocó todas las muestras debidamente identificadas en
refrigeración a 5ºC y se anotó en un registro la hora en la que inicio el
tiempo de equilibrio.
Se esperó el tiempo de equilibrio (2, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas)
respectivamente y se realizó el análisis pre congelación del grupo de
muestras destinados para este análisis, el otro grupo de muestras
ingresó a congelación.
Análisis pre-congelación
Una vez terminado el tiempo de equilibrio se procedió al análisis de las
muestras antes de su congelación.
Se escogió las pajuelas de cada lote y se las coloco en el baño María a
una temperatura de 37°C.
Se colocó el semen en un tubo Eppendorf previamente temperado y se
tomó una gota de la muestra.
Tomando 10 µl de la dilución, se puso sobre un portaobjetos
previamente temperado y se cubrió cuidadosamente con un
cubreobjetos y
19
Se llevó al microscopio para ser observado y evaluado con un objetivo
de 40X.
Análisis post-congelación
El análisis se lo realizó 72 horas después de la congelación de las muestras.
La platina térmica estuvo previamente temperada a 37ºC.
Se escogió las pajuelas de cada lote y se descongeló en el baño María
a 37ºC.
El semen descongelado se colocó en un tubo Eppendorf previamente
temperado.
Se tomó una cantidad de 10 µl de esta dilución, se colocó sobre el
portaobjetos y se cubrió la muestra cuidadosamente con el
cubreobjetos.
Finalmente se llevó al microscopio para su observación y análisis con
objetivo de 40X.
Tinción de vitalidad (Eosina-Nigrosina)
Luego de extraído el semen y después de observar la motilidad, se tomó
una gota de semen y se la colocó sobre un portaobjetos.
Se agregó una gota del colorante de eosina, se homogenizó la mezcla
y luego se agregó una gota de nigrosina.
Luego de 1 minuto se realizó el frotis.
Se observó al microscopio sin cubreobjetos con aumento 40x y se
procedió al recuento de células vivas y muertas
Se contó un total de 200 células distribuidas en el frotis, se estimó el
porcentaje de vivos, a partir de las 200 células contadas.
Los espermatozoides vivos en el momento de la coloración no se
tiñeron. Los muertos se observaron de color rosado.
Con el mismo frotis y bajo el mismo principio se realizó el conteo de
espermatozoides normales/anormales.
20
Análisis estadístico
Para el análisis de resultados se realizó ANOVA (análisis de varianza) junto
con la prueba LS Means (minimos cuadrados medios) para la comparación
entre los resultados obtenidos en la pre y post congelación y conocer si existió
diferencia estadísticamente significativa; posteriormente, se utilizó la prueba
estadística Duncan para determinar el mejor tiempo de equilibrio con mejores
resultados en todas las variables analizadas.
Para esto se utilizó el software estadístico SPSS Statistics y Microsoft Excel.
21
CAPÍTULO V
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Previo a la preparación de las dosis seminales para la experimentación se
realizó una evaluación de los toros y un análisis inicial del semen para verificar
que cumplían con los valores adecuados para su producción y posterior
congelación (Ver Anexos 1 y 2).
Las variables de estudio de la calidad de semen pre y post congelación fueron:
Análisis con Sistema CASA: Porcentaje de Motilidad Espermática Total
(MT%), Porcentaje de Motilidad Espermática Progresiva (MP%),
Análisis manual: Tinción de vitalidad (relación espermatozoides vivos/muertos)
y morfología espermática (Normales/Anormales),
Cuadro Nº1. Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la pre-congelación con diferentes tiempos de equilibrio.
Tie
mp
os d
e
eq
uilib
rio
(h
ora
s)
Motilidad Espermática
Total (%)
Motilidad Espermática
Progresiva (%)
Vitalidad Morfología
Espermatozoides Espermatozoides
Vivos (%)
Muertos (%)
Normales (%)
Anormales (%)
2 81.40 ± 7.40a 73.47 ± 9.65a 78.23 ± 6.54a 21.77 ± 6.54c 86.42 ± 1.99a 13.58 ± 1.99a
4 80.11 ± 4.47a 71.01 ± 8.05ab 76.52 ± 6.44ab 23.48 ± 6.44bc 85.74 ± 3.73a 14.26 ± 3.73a
8 79.80 ± 8.06a 69.88 ± 9.77ab 76.50 ± 6.94ab 23.50 ± 6.94bc 85.36 ± 3.83a 14.64 ± 4.02a
12 79.10 ± 9.43ab 69.31 ± 10.33ab 75.98 ± 7.99ab 24.02 ± 7.99bc 85.26 ± 2.57a 14.74 ± 3.29a
16 77.70 ± 7.75ab 66.91 ± 7.96b 74.98 ± 6.76abc 25.02 ± 6.76abc 85.30 ± 2.13a 14.70 ± 3.30a
20 76.99 ± 4.97ab 66.25 ± 5.98b 73.40 ± 4.20bc 26.60 ± 4.20ab 85.46 ± 2.89a 14.54 ± 2.89a
24 75.01 ± 5.59b 66.05 ± 7.50b 71.78 ± 5.05c 28.22 ± 5.05a 85.52 ± 2.91a 14.48 ± 2.91a
Los valores corresponden a Media ± Desv. Est. (n=25) abc valores con la misma letra son significativamente similares. Fuente: Investigación directa (2016);
Elaboración: El Autor.
En el Cuadro Nº1 se muestran los resultados obtenidos en el análisis seminal
antes del proceso de congelación al término de cada tiempo de equilibrio para
cada una de las diferentes variables que serán descritas mas adelante.
22
Cuadro Nº2. Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la post-congelación con diferentes tiempos de equilibrio.
Tie
mp
os
de
eq
uilib
rio
(ho
ras
)
Motilidad Espermática
Total (%)
Motilidad Espermática Progresiva
(%)
Vitalidad Morfología
Espermatozoides Espermatozoides
Vivos (%)
Muertos (%)
Normales (%)
Anormales (%)
2 69.16 ± 6.53a 60.75 ± 8.14a 68.69 ± 5.70a 31.31 ± 5.70b 82.60 ± 2.12a 17.40 ± 2.12b
4 69.94 ± 4.27a 61.11 ± 7.51a 68.46 ± 5.01a 31.54 ± 5.01b 81.30 ± 2.35ab 18.70 ± 4.23ab
8 65.99 ± 7.25bc 55.97 ± 2.31b 63.66 ± 7.21b 36.34 ± 7.21b 80.58 ± 3.81ab 19.42 ± 3.81ab
12 65.60 ± 5.17bc 54.66 ± 8.98b 63.46 ± 5.86b 36.54 ± 5.86b 80.30 ± 4.41b 19.70 ± 4.41a
16 65.06 ± 8.39bc 53.54 ± 9.00b 63.02 ± 8.32b 36.98 ± 8.32b 79.66 ±2.37b 20.34 ± 3.85a
20 64.54 ± 6.02c 52.79 ± 8.22b 62.76 ± 6.69b 37.24 ± 6.69a 79.56 ± 3.70b 20.44 ± 3.70a
24 63.49 ± 8.24c 51.98 ± 9.39b 61.88 ± 7.94b 38.12 ± 7.94a 79.58 ± 4.55b 20.42 ± 4.55a
Los valores corresponden a Media ± Desv. Est. (n=25) abc valores con la misma letra son significativamente similares. Fuente: Investigación directa (2016);
Elaboración: El Autor.
En el Cuadro Nº2 se muestran los resultados del análisis seminal depues de
ser sometido al proceso de congelación y descongelación para cada una de
las diferentes variables.
a) “Motilidad Espermática Total”
Gráfico Nº1. Comparación de la Variable Motilidad Espermática Total Pre y
Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino
Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor
50
55
60
65
70
75
80
85
2 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4
PO
RC
ENTA
JE
TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS)
MOTILIDAD ESPERMATICA TOTAL
MotilidadEspermáticaTotal Precongelación
MotilidadEspermáticaTotal Postcongelación
23
El Gráfico Nº1 muestra los valores de los resultados obtenidos de la variable
Motilidad Espermática Total antes y después de la crioconservación: estos
valores se encuentran descritos en los Cuadros Nº1 y Nº2; según el método
estadístico LS Means (Mínimos Cuadrados Medios) existe una diferencia
estadísticamente significativa entre los resultados pre y post congelación. Esta
diferencia estadísticamente significativa se presenta debido al estrés que sufre
la membrana por el cambio de temperatura, las lesiones producidas por el
congelamiento de las membranas solo se invierten parcialmente con el
descongelamiento (Watson, 2000). La motilidad post congelación se reduce a
valores entre 40 a 50% (Háfez, 2000).
El método estadístico Duncan clasificó por grupos los resultados en los
diferentes tiempos de equilibrio ordenándolos de mayor a menor, para de esta
manera determinar cuál fue el mejor tiempo de equilibrio; en el análisis pre
congelación se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa entre las 2
y 24 horas de tiempo de equilibrio y ubica como mejor resultado a las 2 horas
de tiempo de equilibrio.
En los resultados post congelación se obtuvo una mayor MT a las 4 horas de
tiempo de equilibrio, aunque no se encontró diferencia significativa entre las 2
y 4 horas, lo que indica que la congelación en cualquiera de estos dos tiempos
podrían dar los mismos resultados porque están sujetos al azar.
En un trabajo similar realizado con búfalo africano se encontró que un tiempo
de equilibrio superior a 4 horas puede ser perjudicial para los espermatozoides
(Herold et al., 2006) coincidiendo con los resultados del presente trabajo y de
otros autores en que se obtiene mayor motilidad total con tiempos de equilibrio
no tan prolongados, como Leite (2010) que probó 3 tiempos de equilibrio (0, 2
y 4 horas) obteniendo mejores resultados a las 4 horas; del mismo modo
Galarza, (2013) determinó que existe una mejor MT a las 2 horas de tiempo
de equilibrio, si bien los tiempos de equilibrio mayores a 4 horas muestran
diferencias estadísticamente significativas no disminuye la motilidad total como
para descartar su uso.
24
b) “Motilidad Espermática Progresiva”
En los Cuadros Nº1 y Nº2 se indican los valores de la motilidad espermática
progresiva, en los que se evidenció un efecto negativo provocado por la
crioconservación y por esta razón se obtuvieron diferencias altamente
significativas entre los resultados pre y post congelación, estos valores se
encuentran representados en el Gráfico Nº2.
Gráfico Nº2. Comparación de la Variable Motilidad Espermática Progresiva
Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen
Bovino
Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor
Con respecto a la variable motilidad espermática progresiva, la prueba
estadística Duncan ubica al tiempo de equilibrio pre congelación de 2 horas
(73.47%) como el mejor, en el que se obtuvo mayor porcentaje de MP, con
una mínima diferencia con el tiempo 4 horas (71.01%) y una diferencia
altamente significativa con el tiempo 24 horas (66.05%). Sin embargo, la
prueba de Duncan establece relaciones entre todos los demás tiempos de
equilibrio, lo que indica que se podrían dar resultados similares entre los
tiempos de equilibrio 8, 12, 16 y 20 horas.
En los resultados post congelación se obtuvo como mejor tiempo de equilibrio
al tiempo 4 horas (61.11%) de MP. A la prueba de Duncan se obtuvo dos
grupos, ubicando a los tiempos 2 y 4 horas en el Grupo A y a los tiempos 8,
40
50
60
70
80
2 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4
PO
RC
ENTA
JE
TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS)
MOTILIDAD ESPERMÁTICA PROGRESIVA
Motilidad EspermáticaProgresiva Precongelación
Motilidad EspermáticaProgresiva Postcongelación
25
12, 16, 20 y 24 horas en el Grupo B, lo que indica que no existe diferencia
significativa entre los tiempos que integran un mismo grupo, pero sí existe
diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos.
A diferencia de la motilidad total, que no diferencia entre movimiento rectilíneo
o circular de los espermatozoides, la motilidad progresiva indica la cantidad de
espermatozoides que avanzan hacia adelante; por tal motivo esta
característica es mucho más importante, ya que se trata del porcentaje de
espermatozoides capacitados para alcanzar el óvulo y fecundar. En estudios
realizados por Díaz (2015); Galarza (2013) y Leite (2010) obtuvieron mejores
resultados a las 2 y 4 horas de tiempo de equilibrio, a diferencia de otros
grupos experimentales sometidos a tiempos de equilibrio más prolongados,
resultados similares a los q se obtuvieron en el presente trabajo.
c) “Espermatozoides Vivos/Muertos”
Con los valores descritos en los Cuadros Nº1 y Nº2 se realizó el análisis
estadístico LS Means donde se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas en la variable espermatozoides vivos/muertos entre en el semen
sin congelar y el que fue sometido al proceso de congelación/descongelación.
Gráfico Nº3. Comparación de la Variable Espermatozoides Vivos Pre y Post
Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino
Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor
50
55
60
65
70
75
80
2 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4
PO
RC
ENTA
JE
TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS)
ESPERMATOZOIDES VIVOS
Espermatozoides vivosPre congelación
Espermatozoides vivosPost congelación
26
En el gráfico Nº3 se puede apreciar la diferencia que existió en la variable
espermatozoides vivos antes y después de ser sometidos al proceso de
crioconservación.
A la prueba Duncan, en los resultados pre congelación no existieron
diferencias significativas entre los tiempos de equilibrio, a excepción del tiempo
2 y 24 horas; el tiempo de equilibrio 2 horas se ubicó por encima de los otros
tiempos con un 78.23% de espermatozoides vivos. En los resultados post
congelación, los tiempos de equilibrio 2 y 4 horas (68.69% y 68.46%
respectivamente) no presentaron diferencia significativa y se ubicaron por
encima de los demás tiempos con el mayor porcentaje de espermatozoides
vivos. Leite en el 2010 realizó un estudio similar en toros Gyr y obtuvo
resultados similares a los del presente trabajo con un mayor porcentaje de
espermatozoides vivos en un tiempo de equilibrio de 4 horas; en otro estudio
realizado por Díaz en el 2015 indicó que existieron buenos resultados a las 4
horas de tiempo de equilibrio y que no existieron diferencias significativas entre
los tiempos de equilibrio más prolongados al igual que en la presente
investigación; sin embargo, a diferencia de nuestros resultados Díaz obtuvo
una mayor proporción de espermatozoides con membrana plasmática íntegra
a las 24 horas de tiempo de equilibrio.
Existió una disminución del porcentaje de espermatozoides vivos en el semen
sometido a crioconservación con relación al que se evaluó antes del proceso
de congelación. De la variable espermatozoides vivos/muertos se menciona
que las membranas celulares son las estructuras celulares que sufren mayor
daño en los procesos de congelación, debido a la pérdida de fluidez de sus
componentes lipídicos (González, 2004; Parks & Graham, 1992).
d) “Morfología” (Espermatozoides Normales/Anormales)
En los Cuadros Nº1 y Nº2 se presenta diferencia altamente significativa entre
el semen antes y después de la congelación para la variable espermatozoides
normales/anormales con una diferencia promedio de 5% para todos los
tiempos de equilibrio.
27
Gráfico Nº4. Comparación de la Variable Espermatozoides Normales Pre y
Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio en Semen
Bovino
Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor
El Gráfico Nº4 muestra claramente la diferencia que existió entre el porcentaje
de espermatozoides vivos antes y después de la congelación.
En el Cuadro Nº1, con respecto a la variable espermatozoides
normales/anormales pre congelación, se obtuvo como mejor resultado al
tiempo de equilibrio 2 horas con un porcentaje de 86.42% de espermatozoides
normales; sin embargo, el método estadístico Duncan muestra que no existe
una diferencia estadísticamente significativa entre todos los tiempos de
equilibrio y los ubica dentro de un mismo grupo.
El Cuadro Nº2 muestra los resultados del análisis post congelación, el mayor
porcentaje de espermatozoides normales se obtuvo a las 2 horas de equilibrio
(82,60%), en este caso la prueba Duncan forma 2 grupos, el Grupo A formado
por el tiempo de equilibrio 2 horas y el Grupo B formado por los tiempos 12,
16, 20 y 24 horas mostrando la diferencia que existió entre las muestras en los
diferentes tiempos, los tiempos 4 y 8 horas pueden formar parte del Grupo A
o B debido a que no poseen diferencia significativa con ambos grupos.
Galarza, (2013) realizó un trabajo probando 3 tiempos de equilibrio (2, 5 y 7
horas) y obtuvo resultados similares a los nuestros con un mayor porcentaje
76
78
80
82
84
86
88
2 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4
PO
RC
ENTA
JE
TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS)
ESPERMATOZOIDES NORMALES
EspermatozoidesNormales Precongelación
EspermatozoidesNormales Postcongelación
28
de espermatozoides normales a las 2 horas de tiempo de equilibrio, al igual
que con al variable anterior Leite (2010) tambien coincide con nuestros
resultados al haber obtenido mayor número de espermatozoides normales en
un tiempo de equilibrio no mayor a 4 horas.
Si la proporción de anormalidades espermáticas antes de la congelación es
más del 20%, nos encontramos ante un semen de baja fertilidad (Háfez, 2000).
La proporción de espermatozoides normales post congelación debe tener un
mínimo de 70% (Galarza, 2013).
29
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES
Existieron diferencias entre los resultados pre y post congelación en
todos los diferentes tiempos de equilibrio para las diferentes variables
(MT%, MP%, espermatozoides vivos/muertos y espermatozoides
normales/anormales), siendo menores los resultados post congelación,
esto debido a que las muestras seminales ya fueron sometidas al
proceso de congelación y descongelación sufriendo cambios drásticos
en la integridad de los espermatozoides a diferencia del otro grupo que
no se congeló y se mantuvo solamente en tiempo de equilibrio sin sufrir
cambios de manera tan drástica.
Los mejores resultados para las variables MT% y MP% pre congelación
se dieron a las 2 horas de tiempo de equilibrio, y los mejores resultados
post congelación para las mismas variables fueron a las 4 horas de
tiempo de equilibrio.
El mejor resultado para la variable espermatozoides vivos/muertos pre
y poscongelación se evidenció a las 2 horas de tiempo de equilibrio. En
la variable espermatozoides normales/anormales pre congelación no
existió diferencia significativa entre los diferentes tiempos de equilibrio,
mientras que en los resultados post congelación para la misma variable
se obtuvo menor porcentaje de anormalidades a las 2 horas de tiempo
de equilibrio.
30
BIBLIOGRAFÍA
Bonadonna, T. (1986). Reproducción Animal e Inseminación Artificial
(Primera Ed). Buenos Aires: Editorial Hemisferio Sur S.A.
Brogliatti, M. . (2016). El impacto de calidad seminal en los programas de
IATF. Sintex. Universidad Nacional Del Centro De La Provincia De
Buenos Aires, Buenos Aires.
Bwanga, C. (1991). Cryopreservation of boar semen. IA literature review.
Swedish University of Agricultural Sciences. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1818503
Carpio, S. (2015). Evaluación de dos diluyentes para la crioconservación de
semen bovino: yema de huevo vs leche descremada. Universidad
Politécnica Salesiana Sede Cuenca.
Castelo, T., Rodríguez, T., & Rodriguez, A. (2008). Considerations on goat
semen cryopreservation. Acta Veterinaria Brasilica, 2(3), 67–75.
Cuadrado, F., Cubero, M., & Goméz, C. (2012). Espermatozoides in vitro:
¿Qué Es El Sistema Casa? Retrieved from
http://invitrosperm.blogspot.com/2012/01/que-es-el-sistema-casa.html
Díaz, R., Torres, M., Painemil, S., Martins, S., De Andrade, A., Bravo, S., &
Sepulveda, N. (2015). Efecto Del Diluyente Y Tiempo De Equilibrio
Sobre La Motilidad E Integridad De Membrana Post-Descongelación De
Espermatozoides De Carnero. Spermova, 5(1), 67–70.
http://doi.org/10.18548/aspe/0002.15
Galarza, A. (2013). “Eficacia De Dos Diluyentes: Tris + Lecitina De Soya
(Andromed®) Y Tris + Yema De Huevo (Triladyl ®), En La
Crioconservación De Semen De Toro De La Raza Jersey En Cuenca –
Ecuador.” Universidad De Cuenca.
Galina, C., & Valencia, J. (2008). Reproducción de los Animales Domésticos.
México D.F: LIMUSA.
31
Gómez, V., & Migliorisi, L. (2015). Protocolo para la evaluacin de semen en
rumiantes. Unlp, 4–9. Retrieved from http://www.produccion-
animal.com.ar/informacion_tecnica/cria_toros/49-
ProtocoloEvalSemen.pdf
González, R. A. F. (2004). Efeito da criopreservação usando diferentes
técnicas de congelação e crioprotetores sobre parâmetros espermáticos
e a integridade de membranas do espermatozóide bovino. Universidade
de São Paulo, 94.
Háfez, E. S. E. and B. H. (2000). Reproducción e Inseminación Artificial en
animales. Séptima Edición.McGraw-Hill. México D.F.
Herold, F. C., de Haas, K., Colenbrander, B., & Gerber, D. (2006).
Comparison of equilibration times when freezing epididymal sperm from
African buffalo (Syncerus caffer) using Triladyl??? or AndroMed??
Theriogenology, 66(5), 1123–1130.
http://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2006.03.007
Leite, T. G., do Vale Filho, V. R., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C.,
Emerick, L. L., Zaffalon, F. G., … Andrade, V. J. de. (2010). Effects of
extender and equilibration time on post-thaw motility and membrane
integrity of cryopreserved Gyr bull semen evaluated by CASA and flow
cytometry. Animal Reproduction Science, 120(1–4), 31–38.
http://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2010.04.005
López Garcia, M. J., Urbano Felices, A., & Cárdenas Povedano, M. (2012).
Manual de laboratorio para el análisis del semen.
http://doi.org/http://dx.doi.org/10.3926/oss.5
MAGAP. (2016). Estación Metereológica “El Rosario.” Tambillo.
Medina, R., Carvajal, S., Velasco, S., & Cruz, C. (2007). Crioconservación de
semen bovino usando un congelador programable (CL-8800) y
determinación de su calidad postdescongelación por medio de un
32
sistema de analisis espermatico asistido. Revista Orinoquia, 11(1), 75–
86. Retrieved from
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/896/89611108.pdf
Mesa, A. (2012). Motilidad Individual Y Viabilidad De Espermatozoides
Caprinos A Diferentes Temperaturas De Mantenimiento En Semen
Diluido. Universidad Veracruzana.
Muiño, R. (2007). Evaluación De La Motilidad Y Vialidad Del Semen Bovino
Mediante El Uso De Sistemas Casa Y Citometría De Flujo: Identificación
De Subpoblaciones Espermáticas. Uclm.Es, 1–157. Retrieved from
http://www.uclm.es/irec/Ecologia/pdf/repro_tesis/Tesis Doctoral Olga
García Álvarez 2011.pdf
Palma, G. A. (2006). Biotecnología de la Reproducción. (Agro Vet, Ed.).
Buenos Aire -Argentina.
Parks, J. E., & Graham, J. K. (1992). Effects of cryopreservation procedures
on sperm membranes. Theriogenology, 38(2), 209–222.
http://doi.org/10.1016/0093-691X(92)90231-F
Patt, J. A., & Nath, J. (1969). Effects of diluents, equilibration time, and
feezing rates on the storage of ram semen. Cryobiology, 5(6), 1969.
http://doi.org/10.1016/S0011-2240(68)80018-5
Purdy, P. H., Mocé, E., Stobart, R., Murdoch, W. J., Moss, G. E., Larson, B.,
… Blackburn, H. D. (2010). The fertility of ram sperm held for 24 h at 5
oC prior to cryopreservation. Animal Reproduction Science, 118(2–4),
231–235. http://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2009.06.014
Ribeiro-Peres, A., Munita-Barbosa, L., Yumi-Kanazawa, M., Mello-Martins, M.
I., & Ferreira De Souza, F. (2014). Criopreservación de espermatozoides
bovinos extraídos de la cola del epidídimo utilizando los métodos
convencional y automatizado. Archivos de Medicina Veterinaria, 46(1),
31–38. http://doi.org/10.4067/S0301-732X2014000100005
33
Salamon, S., & Maxwell, W. M. C. (2000). Storage of ram semen. Animal
Reproduction Science, 62(1–3), 77–111. http://doi.org/10.1016/S0378-
4320(00)00155-X
Salisbury, G., VanDermark, N., & Lodge, R. (1982). Fisiología de la
Reproducción e Inseminación Artificial de los Bovinos. Zaragoza,
España: Acribia.
Stornelli, M., & Stornelli, M. (2001). Inseminación artificial con semen fresco,
refrigerado y congelado; aplicación y desarrollo en caninos. Analecta
Vet, 58–66. Retrieved from
http://old.fcv.unlp.edu.ar/analecta/vol21n1/056_VE21n1_stornelli_insemi
nacion_caninos.pdf
Suárez, R., & Coral, A. (2012). Técnicas de congelación y sexado del semen
bovino y su importancia en reproducción bovina. MVZ Córdoba, 12(23),
12–14. Retrieved from
http://open.mendeley.com/library/document/4989337562
Vasconcelos-Filho, W. (2010). Eficiência da congelação automatizada na
viabilidade de sêmen bovino. Universidade Federal Rural Do Rio De
Janeiro Instituto.
Watson, P. F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved
semen. Animal Reproduction Science, 60–61, 481–492.
http://doi.org/10.1016/S0378-4320(00)00099-3
34
ANEXOS
Anexo 1. Análisis inicial de comportamiento reproductivo de toros,
color y volumen de semen en 2 colectas
NOMBRE DEL
TORO LÍBIDO
NÚMERO DE
SALTOS
VOLUMEN EYACULADO (Salto 1) ml
VOLUMEN EYACULADO (Salto 2) ml
VOLUMEN TOTAL
ml COLOR
Orión 4 2 4,0 6,5 10,5 BC
Sham 4 2 6,0 4,5 10,5 BL
Onsite 4 2 3,5 4,0 7,5 BA
Iconic 4 2 4,0 4,5 8,5 BC
Probe 4 2 4,0 6,0 10,0 BL
(BC=Blanco Cremoso, BL= Blanco Lechoso, BA= Blanco Acuoso) Fuente: Investigación directa (2016); Elaboración: El Autor.
Anexo 2. Análisis inicial de semen fresco de toros
(MM= Motilidad Masal, MI%= Porcentaje de Motilidad Individual, MT%= Porcentaje Motilidad
Total, MP%= Porcentaje Motilidad Progresiva).
Fuente: Investigación directa (2016);
Elaboración: El Autor.
Anexo 3. Registro de análisis seminal pre y pos congelación para los
diferentes tiempos de equilibrio.
TIEMPO DE EQUILIBRIO
(HORAS) MT (%) MP (%)
VITALIDAD MORFOLOGIA
ESPERMATOZOIDES
VIVOS (%)
ESPERMATOZOIDES
MUERTOS (%)
NORMALES
(%)
ANORMALES
(%)
2
4
8
NOMBRE DEL TORO
pH MM (1-5) MI% CONCENTRACIÓN
(millones/ml) MT % MP %
Orión 7 5 85 1396,4 86,89 74,87
Sham 7 5 85 1030,0 79,37 72,34
Onsite 6 4 80 927,5 74,45 67,39
Iconic 7 3 70 1744,5 83,06 76,24
Probe 6 4 75 1025,3 86,47 82,35
35
12
16
20
24
(MT%= Porcentaje Motilidad Total, MP%= Porcentaje Motilidad Progresiva).
Fuente: Investigación directa (2016)
Elaboración: El Autor.
Anexo 4 Fotografías
Material para colecta de semen
Fuente: El Autor.
36
Armado de vaginas artificiales
Fuente: El Autor.
Toros reproductores Holstein Friesian
Fuente: El Autor.
37
Sala de colecta
Fuente: El Autor.
Maniquí
Fuente: El Autor.
38
Colecta de semen
Fuente: El Autor.
Equipos de laboratorio
Fuente: El Autor.
39
Análisis de las muestras de semen
Fuente: El Autor.
Análisis con Sistema CASA
Fuente: El Autor.
40
Muestras en refrigeración a 5ºC (tiempo de equilibrio)
Fuente: El Autor.
Congelación de muestras
Fuente: El Autor.