Ríos Flavio Nicolás

Biología IITrabajo Práctico Nº4

“Cuantificación del crecimiento celular (Tubidimetría)”Introducción

El método colorimetrico independientemente de cual sea su tipo consiste en la determinación de la presencia cualitativa de un analito mediante el estudio de la dispersión que forma el disolvente.

Cuando un haz de luz monocromática, de longitud de onda no absorbible choca contra las partículas de una sustancia que está en suspensión, cambia la dirección de propagación del haz de luz (en realidad sólo cambian de dirección algunos fotones del haz). Este efecto es usado para determinar la presencia de un analito en suspensión ya que ese cambio de dirección del haz y de su intensidad depende de muchos factores que una vez relacionados y cuantificados permiten obtener los valores buscados.

En primer lugar hay que tener en cuenta que la longitud de onda de la radiación incidente, transmitida y dispersada son iguales.En segundo lugar la determinación de la concentración de partículas en suspensión puede ser determinada midiendo la disminución de la Energía radiante incidente al atravesar la cubeta o midiendo la radiación dispersada a un ángulo determinado. La elección del método depende de la concentración de la suspensión. Si la concentración es alta se medirán las energías radiante incidente y la transmitida, es lo que se conoce como turbidimetría.

La turbidimetría puede realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta. Cuando la concentración de partículas en suspensión se mide por turbidimetría, la suspensión se pone en una cubeta, que permite realizar las medidas de las energía incidentes y transmitidas. Si ponemos en la cubeta suspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que influya sobre los resultados dando valores excesivamente altos. Los turbidímetros pueden incorporar cualquier detector que sea sensible a la longitud de onda transmitida.

Objetivos:• Conocer y distinguir los distintos metodos analiticos para la cuantificacion de

crecimiento celular (Conteo de colonias en medio solido, Turbidimetria).• Evaluar el crecimiento bacteriano de E. Coli por Turbidimetria.

Material:

• Cultivo de E. Coli en fase exponencial.• Erlenmeyers / botellas de cultivo.• Caldo Luria Bertani (LB).• Tubos Eppendorf.• Gradilla para tubos eppendorf.• Micropipetas. • Tips Esteriles.• Espectrofotometro, cubetas.• Baño Termostatizado.

Métodos-Procedimientos:

UNSAM ECyT Biologia II Cuantificación del crecimiento celular (Turbidimetría)

Ríos Flavio Nicolás

1. Largar un Cultivo en medio LB utilizando como inoculo conocido el cultivo previamente crecido

2. Realizar una dilucion 1/20 con un volumen final de 50 ml 3. Pipetear 0,5 mL de volumen del cultivo inoculado y medir a una Longitud de onda

de 600 nm4. Colocar el Cultivo a 37º C con agitacion 5. Medir cada 30 min. En absorbancia6. Graficar abosorbancia en funcion del tiempo7. comparar con el metodo del T.P. Anterior

Resultados:

Hemos tomado resultados del turno tarde, hemos medido la Densidad Optica de un cultivo con agitacion y otro sin agitacion. Procedimos a realizar los graficos.

(I) (II)

Conclusiones:En este trabajo aprendimos de como es el manejo de la turbidimetria y el manejo de

aparatos como el espectrofotometro, en la cuantificacion del crecimeinto de bacterias.Con respecto a el último dato de la densidad óptica dió muy parecido al anterior

cuando paso medio hora de tiempo lo que da cuenta de que podriamos haber pasado de una fase exponencial a una fase estacionaria en donde el número de células que son producidas iguala al número de células que mueren se establece un equilibrio dinámico en el cual no existe un mayor crecimiento puede deberse a un agotamiento de algún nutriente.

En referencia a la experiencia tambien podemos decir que la DO es proporcional a la cantidad de celulas que crecen para la E. Coli 1OD = 108 Células / mL asi que para cada absorbancia media podemos sacar la relacion de la cantidad de celulas por mL.

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Horario Agitacion (I) No Agitacion (II) 0 0,000 0,000

30 0,044 0,03460 0,098 0,07390 0,163 0,125

240 0,327 0,266270 0,312 0,251

00:00:00 01:12:00 02:24:00 03:36:00 04:48:000,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350f(x) = 1,72x + 0,02R² = 0,97

00:00:00 01:12:00 02:24:00 03:36:00 04:48:000,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300f(x) = 1,4x + 0,01R² = 0,97

Ríos Flavio Nicolás

Bibliografia: Brock, Biología de los Microorganismos - Autor: Michael T. Madigan, John M. Martinko Publisher: Pearson Educacion Hans G. Schlegel, Microbiologia General – Omega http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioRecuento.htm http://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/02_Capitulo_02.pdf Vogel, Arthur Quimica Analitica Cualitativa Volumen II Editorial Kapelusz.

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