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UDELAR Fac. de Ciencias

Licenciatura en Bioquímica

Trabajo especial I: Metabolismo del nitrógeno en cianobacterias formadoras de heterocistos

Bach. Mª Cecilia Callejas Orientadora: Dra Silvia Batista

Realizado en el Dpto. Bioquímica del IIBCE, Unidad Asociada a Fac. de Ciencias.

Montevideo, mayo 2007

Agradecimientos

En primer lugar quisiera agradecer a mi tutora, Silvia Batista por guiarme en

vez de moldearme, por acompañarme y por confiar en mí durante la elaboración de

este trabajo y a Paul Gill por plantearme una interrogante que contestar.

También quisiera agradecerles a todas las personas que de alguna forma u

otra me apoyaron y alentaron en esta empresa; a mis compañeras de laboratorio Ana

Inés Catalán, María Morel, Martha Ubalde, Cecilia Martínez y Susana Castro. A Elena

y su troupe: Vane, Fede R., Rufo, Dani, Ceci T., a toda le gente de Ecología

Microbiana Alicia, Nati, Gastón, Leti, Pati, Ma. Lis. Uriel y Ceci R.

Agradezco a mis queridas amigas Alicia y Magui por alentarme y por brindarme

gran parte de los artículos que cito en este trabajo. Y finalmente agradezco a mi familia

y a Antonio, sin los cuales hubiese sido imposible llegar hasta donde estoy hoy. A

todos, muchas gracias.

Índice

1

Índice Índice .................................................................................................................. 1

Resumen .................................................................................................................... 3

Capítulo 1: Cianobacterias ............................................................................... 5

1.1 Estructura celular .................................................................................................................. 8

1.1.1 Protoplasma ................................................................................................... 8

1.1.2 Membranas y aparato fotosintético ................................................................. 10

1.1.3 Ficobilisomas y ficobiliproteínas ...................................................................... 11

1.2 Pared celular .......................................................................................................... 13

1.2.1 Envoltura y membranas externas .................................................................... 13

1.2.2 Capa o envoltura superficial .......................................................................... 16

1.3 Sistemática de las cianobacterias ........................................................................... 17

1.3.1 Clasificación según criterios bacteriológicos ..................................................... 18

1.3.2 Clasificación según criterios botánicos ............................................................ 18

1.3.3 Criterios actuales para la clasificación ............................................................. 19

1.4 Metabolismo ........................................................................................................... 21

Capítulo 2: Cianobacterias diazotrofas .............................................................. 23

2.1 El complejo nitrogenasa ......................................................................................... 23

2.1.1 Estructura .................................................................................................... 24

2.1.2 Clasificación ................................................................................................. 25

2.1.3 Evolución de las nitrogenasas ........................................................................ 26

2.2 Clasificación de las cianobacterias diazotrofas ....................................................... 27

2.2.1 Cianobacterias sin especialización celular ....................................................... 27

2.2.2 Cianobacterias con especialización celular ...................................................... 28

2.3 Moléculas señal en cianobacterias filamentosas con heterocistos ........................... 29

2.3.1 2-oxoglutarato (2-OG) ................................................................................... 29

2.3.2 Ión Calcio .................................................................................................... 31

2.3.3 Factores 32

2.3.4 Proteína PII .................................................................................................. 33

Índice

2

Capítulo 3: El Heterocisto ..................................................................................... 36

3.1 Estructura del heterocisto ....................................................................................... 37

3.1.1 Protoplasma ................................................................................................. 37

3.1.2 Pared celular ................................................................................................ 37

3.2 Metabolismo del heterocisto ................................................................................... 39

3.3 Protección del complejo nitrogenasa del O2 ............................................................ 41

3.4 Diferenciación del heterocisto ................................................................................. 42

3.4.1 Señales que inducen la diferenciación ............................................................. 42

3.4.2 Estadios de desarrollo ................................................................................... 43

3.4.3 Eventos moleculares involucrados en el programa de diferenciación .................. 44

3.5 Genes más relevantes durante la diferenciación ...................................................... 46

hanA ................................................................................................................... 46

hepA ................................................................................................................... 46

hepK ................................................................................................................... 46

hetR .................................................................................................................... 47

hetF .................................................................................................................... 48

hetC y hetL .......................................................................................................... 48

hetN .................................................................................................................... 48

ntcA .................................................................................................................... 48

patA .................................................................................................................... 49

patB .................................................................................................................... 49

patS .................................................................................................................... 50

Otros genes pat .................................................................................................... 50

Capítulo 4: Metabolismo del N en cianobacterias ........................................... 51

4.1 Rutas de asimilación de N ....................................................................................... 51

4.1.1 Asimilación de nitrato y nitrito ......................................................................... 52

4.1.2 Fijación de nitrógeno ..................................................................................... 53

4.1.3 Asimilación de urea y degradación de cianato .................................................. 53

4.1.4 Incorporación de amonio ............................................................................... 54

4.1.5 Incorporación de aminoácidos ........................................................................ 55

4.2 Regulación del metabolismo nitrogenado................................................................ 56

4.2.1 Regulación transcripcional ............................................................................. 57

4.2.2 Regulación postraducccional .......................................................................... 58

Conclusiones ................................................................................................... 60

Bibliografía ...................................................................................................... 65

Resumen

3

Resumen

El nitrógeno (N) forma parte de la estructura de los aminoácidos y ácidos

nucleicos y esta característica lo convierte en un elemento esencial para la vida.

La mayor reserva de este elemento se encuentra en la atmósfera, en una forma

diatómica relativamente inerte (N2), no asimilable por la mayor parte de los

organismos vivos.

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) representa la principal fuente de

transformación química del nitrógeno atmosférico a una forma disponible

biológicamente. Este proceso puede ser efectuado únicamente por organismos

procariotas en condiciones de vida libre o en simbiosis. Los organismos capaces

de realizar la FBN se denominan en su conjunto como diazotrofos. Dentro de este

grupo particular de procariotas se encuentran algunas especies de cianobacterias

que participan en el ciclo biogeoquímico del elemento, aportando N asimilable a la

biosfera.

Las cianobacterias son organismos fotoautótrofos procariotas muy antiguos

con amplia distribución ecológica. Podrían haber surgido hace unos 3500 millones

de años y la teoría endosimbiótica los propone como precursores de los

cloroplastos. Si bien las cianobacterias son un grupo monofilético, exhiben una

gran diversidad morfológica. Pueden encontrarse en ambientes tan extremos

como los polos o los géiseres o tan comunes como los océanos, cursos de agua

dulce o efluentes de residuos industriales.

Resumen

4

En la actualidad se dispone de las secuencias completas de los genomas

de Synechocystis PCC6803, Anabaena PCC7120, Anabaena variabilis

ATCC29413, Nostoc punctiforme ATCC29133, Prochlorococcus marinus MED4 y

Synechococcus WH8102 y otros proyectos genoma como los de Gloeobacter

violaceus PCC7421, Nostoc punctiforme, Trichodesmium erythraem,

Synechococcus PCC7002, Synechococcus PCC 6301 y Synechococcus

PCC7942, están en proceso de culminación.

Históricamente, el interés científico por las cianobacterias ha estado

restringido a determinados grupos de investigación. Los conocimientos acerca del

metabolismo y la ecología de estos organismos son parcialmente comprendidos y

sólo se han estudiado algunos aspectos de los mismos. Particularmente, la

información existente acerca de las cianobacterias formadoras de heterocistos es

escasa y se encuentra dispersa. Por esto he pretendido compilar parte de la

información disponible actualmente acerca de las cianobacterias diazotrofas, con

especial atención en las formadoras de heterocistos.

He realizado la búsqueda bibliográfica en base a artículos on line recientes,

publicados en revistas de divulgación científica y he organizado dicha información

con un criterio arbitrario, de acuerdo al proceso que he ido experimentando

durante mi conocimiento acerca del tema. Este trabajo comienza describiendo los

aspectos más generales de estos organismos y continúa con otros más

complejos y específicos, como algunos de los mecanismos moleculares que

intervienen en el programa de diferenciación celular del heterocisto. Finalmente,

describo algunos de los mecanismos que regulan el metabolismo del nitrógeno en

las cianobacterias que forman filamentos.

Capítulo 1: Cianobacterias

5

Capítulo 1

Cianobacterias

Las cianobacterias constituyen el grupo de procariotas fotosintéticos más

grande, diverso y distribuido del planeta. Estos organismos son capaces de llevar

a cabo los procesos de fotosíntesis oxigénica y respiración en el mismo

compartimiento simultáneamente. Esta singular característica les permite

sobrevivir y prosperar en un amplio rango de condiciones ambientales (Vermaas,

2001). Pueden definirse como organismos procariotas con un aparato fotosintético


6

muy similar a nivel molecular, funcional y estructural al contenido en los

cloroplastos de células eucariotas (Stanier y Cohen Bazire, 1977).

La principal diferencia entre las bacterias fotosintéticas y las cianobacterias

se basa en el tipo de pigmentos fotosensibles que producen. Las cianobacterias

contienen clorofila a al igual que las algas eucariotas y las plantas verdes. Las

moléculas de agua sirven como donadoras de electrones y debido a la fotólisis de

éstas, se genera oxígeno como producto. El resto de las bacterias fotosintéticas

contienen bacterioclorofila a o b (bacterias púrpuras), mientras que las bacterias

verdes contienen bacterioclorofila c o d (Moat y col., 2002). Los pigmentos

cosechadores de luz como las ficobiliproteínas son similares a los de las rodofitas

o algas rojas (Stanier y Cohen Bazire, 1977).

Las cianobacterias además, representan una de las líneas filogenéticas

principales en el árbol de la vida (Fig. 1) y muestran un parentesco lejano con las

bacterias (Madigan y col., 1999).

Algunos de estos organismos poseen la capacidad de vivir de forma

mutualista y en asociaciones simbióticas con una amplia variedad de organismos

eucariotas, incluyendo plantas tales como briofitas, cycadas y angiospermas (Rai

y Bergman, 2000) o formar parte de matas microbianas compactas, con una

estratificación vertical característica, conteniendo grupos microbianos

funcionalmente distintos (Howard-Williams y Vincent,1990; Paerl y Steppe, 2000).

Figura. 2 Algunas cianobacterias: A) Oscillatoria, especie filamentosa comúnmente encontrada en agua dulce y géiseres; B) Nostoc, especie que suele desarrollar vainas; C) Anabaena, especie filamentosa, en la foto se puede observar un heterocisto (tercer célula desde la derecha) y un acineto (célula grande brillante); D) Synechococcus, especie unicelular que puede encontrarse en habitats marinos y géiseres. Este es el procariota fotosintético más importante de los habitats marinos, estimándose que sería responsable de hasta un 25% de la producción primaria del planeta. Adaptado de: http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html.

http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html


7

Este grupo ubicuo de procariotas exhibe una diversidad citomorfológica y

fisiológica muy amplia (Fig. 2), habiéndose descrito básicamente formas

unicelulares, filamentosas o en colonias. Las formas unicelulares, por ejemplo

dentro del orden Chroccocales, se caracterizan por poseer células cilíndricas,

ovoides u esféricas. Pueden encontrarse células únicas que se separan luego de

la fisión binaria o agregadas, formando colonias irregulares, en las cuales una

matriz de naturaleza viscosa es secretada por las células durante el crecimiento

de la colonia (Mur y Utkilen, 1999).

A través de una serie de divisiones celulares más o menos regulares,

combinada con la formación de una vaina, se pueden producir colonias más

ordenadas. La morfología filamentosa es el resultado de divisiones celulares

repetidas en un mismo plano, sucediéndose en ángulos rectos al eje principal del

filamento (Fig. 3) (Mur y Utkilen, 1999). Como resultado se produce una hilera de

células contiguas denominada tricoma, que puede ser recto o enrollado

(Thajuddin y Subramanian, 2005). Cuando el tricoma se encuentra recubierto por

una vaina se denomina filamento.

Algunos filamentos pueden desarrollar heterocistos (células especializadas

en fijar o reducir el N2), acinetos para sobrevivir en condiciones adversas como el

frío o la desecación u hormogonios para la taxis. (Rai y Bergman, 2000).

Figura. 3. Los tricomas pueden organizarse en formas simples rectas (A) o formar agregados (B) y/o espirales (C). El tricoma con la vaina que lo envuelve se denomina filamento (D, E). En algunas formas, los tricomas son envueltos por el mismo filamento (F). Pueden ser ramificados con las células organizadas en arreglos uniseriados o multiseriados (G). Además de las ramificaciones verdaderas, también existen formas ramificadas falsas (H). Adaptado de Thajuddin, 2005.


8

Figura 4. Diagrama de una célula de cianobacteria donde se representan estructuras y organelos característicos de estos organismos. Adaptado de: http://hypnea.botany.uwc.ac.za/phylogeny/classif/cyan2.htm

Aproximadamente el 50% de las cianobacterias estudiadas son organismos

fotoheterótrofos facultativos capaces de utilizar compuestos orgánicos como

fuente de carbono y luz como fuente de energía. Se estima que aproximadamente

el 20% son capaces de crecer como quimioheterótrofos en la oscuridad, cuando

la fuente de energía y carbono proviene de compuestos orgánicos. Algunas

cianobacterias también son capaces de realizar fotosíntesis anoxigénica en la

cual otras moléculas distintas al agua (ácido sulfhídrico o hidrógeno molecular)

proporcionan como moléculas donadoras de electrones (Adams y Duggan, 1999).

1.1 Estructura celular

La organización celular básica se caracteriza por la presencia de

membranas intracelulares profusas denominadas tilacoides y por un citoplasma

con variedad de inclusiones granulares con distinta composición y función.

1.1.1 Protoplasma

Al igual que otros

organismos procariotas, las

cianobacterias carecen de

organelos tales como

mitocondrias, núcleo, aparato

de Golgi, retículo

endoplasmático, ni tampoco

presentan vacuolas unidas al

tonoplasto. En cambio, pueden

encontrarse gránulos de

polifosfato o carboxisomas

(también conocidos como

cuerpos poliédricos) que

cumplen la función de reserva

de la enzima Rubisco o gránulos de poli -hidroxibutirato (Fig. 4) (van den Hoek y

col., 1995).


9

Los pigmentos se encuentran concentrados en la parte más externa del

protoplasma, denominada cromatoplasma. Este a su vez se ensambla con el

centroplasma, que se define como la región más interna que contiene el material

genético. La región del centroplasma que ocupa el ADN se denomina

nucleoplasma (Wolk, 1973).

El material de reserva más importante de carbono (C) es un glucano con

unidades de glucosa conectadas mediante enlaces β-1,4 -almidón cianoficiano- el

cual es muy similar al glucógeno y a la fracción de amilopectina del almidón

encontrado en las plantas superiores. Este poliglucano es almacenado en

gránulos entre los tilacoides (van den Hoek y col. , 1995).

La cianoficina es otro biopolímero que se acumula en forma de gránulos en

el protoplasma de las cianobacterias (Fig. 4). A diferencia de los gránulos de

almidón, los gránulos de cianoficina son visibles mediante microscopio óptico y

pueden identificarse por sus formas angulares (van den Hoek y col., 1995). Estos

se acumulan cerca de las paredes celulares o en los espacios entre el

centroplasma y el cromatoplasma (Sherman y Sherman, 2000).

La cianoficina representaría el material de reserva de N en algunas

especies de cianobacterias. Está compuesto por un esqueleto lineal de residuos

Asp al cual se unen residuos de Arg a través de enlaces amida entre el grupo α-

amino de la Arg y β-carboxilo del residuo Asp (Sherman y Sherman, 2000). Es un

polímero aminoacídico de origen no ribosomal (non ribosomal polipeptide o NRP).

Esto significa que se sintetiza sin la participación de ribosomas y que los residuos

aminoacídicos son incorporados enzimáticamente mediante la participación de la

cianoficina sintetasa (Berg y col., 2000).

En el heterocisto la cianoficina se acumula en los polos celulares

adyacentes a las células vegetativas vecinas. Las actividades de las enzimas

necesarias para su síntesis y degradación, la cianoficina sintetasa y la

cianoficinasa, son 30 a 70 veces superiores a las determinadas en células

vegetativas (Picossi y col., 2004).


10

En las cianobacterias que separan temporalmente la fijación de N2 y la

fotosíntesis, este polímero se considera como una reserva dinámica de nitrógeno.

Dichos organismos degradan la cianoficina durante el período de luz y la

sintetizan durante el período de oscuridad, cuando se produce la FBN (Picossi y

col., 2004).

1.1.2 Membranas y aparato fotosintético

La membrana tilacoidal o tilacoide contiene las enzimas involucradas en las

cadenas de transporte de electrones para los procesos de fotosíntesis y

respiración, mientras que la membrana citoplasmática contiene únicamente los

componentes para el proceso de respiración. En la membrana tilacoidal ambas

cadenas se solapan y utilizan en común algunos componentes, como el pool de

plastoquinonas (PQ), el complejo de citocromo b6f y los sistemas solubles del

lumen que actúan como transportadores de electrones (Vermaas, 2001).

Los tilacoides de las cianobacterias se organizan de modo tal que

recuerdan la forma de una vasija, las membranas se disponen de a pares y cada

uno de estos está envuelto por el siguiente, al estilo de las muñecas rusas (Fig.

5). El espacio entre cada par de membranas tilacoidales se denomina lumen

tilacoidal. En este espacio los protones son acumulados como producto del

transporte de electrones y generan el gradiente empleado en la síntesis de ATP.

El espacio entre dos pares de membranas tilacoidales es continuo con el

citoplasma de la célula (Vermaas, 2001).

Figura 5. Bosquejo de las membranas y compartimientos en una célula de cianobacteria. La membrana citoplasmática separa el citoplasma del periplasma; en esta membrana se desarrolla el proceso de respiración pero no el de fotosíntesis. El color amarillo refiere a la presencia de compuestos carotenoides. Las membranas tilacoides contienen componentes proteicos que catalizan los procesos de respiración y fotosíntesis, el color verde simboliza la presencia de clorofila. Adaptado de: Vermaas, 2001.


11

En algunas ocasiones se pueden observar configuraciones reticuladas,

siendo el plano que las contiene paralelo u ortogonal a la superficie celular.

Aunque los tilacoides se observan usualmente como múltiples estructuras

discretas, también se ha observado la presencia de una única membrana

tilacoidal periférica o rodeando el centroplasma (Wolk, 1973).

A diferencia de los organismos fotosintéticos eucariotas, los tilacoides de

las cianobacterias se encuentran libres en el citoplasma y separados de forma

equidistante, en vez de apilarse dentro de los cloroplastos (van den Hoek y col,

1995). En estos se encuentran insertos los pigmentos fotosintéticos,

principalmente la clorofila a, que junto con los pigmentos accesorios constituyen el

aparato fotosintético de la célula.

1.1.3 Ficobilisomas y ficobiliproteínas

Las ficobiliproteínas representan los principales pigmentos accesorios y

son las moléculas responsables del color de las cianobacterias (Fay, 1992).

Dichos colores son el resultado de la absorción de luz por cromóforos

tetrapirrólicos lineales asociados covalentemente a las apoproteínas (Grossman y

col., 2001).

Estas cromoproteínas pueden representar hasta un 30% de las proteínas

totales de la célula, se encuentran compuestas por heterodímeros (subunidades

y que se asocian para formar trímeros ()3 o hexámeros ()6 (Grossman y

col., 2001). Las más abundantes son la ficocianina que absorbe luz a una longitud

de onda máxima (λmáx) de 620nm, la aloficocianina con una λmáx de 650nm y la

ficoeritrina máx de 565nm (Fig. 6) (Stanier y Cohen-

Bazire, 1977).

Otra característica del aparato fotosintético -que comparten con los

cloroplastos de las rodofitas- es la localización extratilacoidal de las

ficobiliproteínas (Stanier y Cohen-Bazire, 1977).


12

La ficobiliproteínas se encuentran contenidas en ficobilisomas, los cuales

se anclan a las membranas externas de los tilacoides. Los ficobilisomas pueden

visualizarse como cuerpos discoidales de aproximadamente 40nm de diámetro,

dispuestos en hileras, separando tilacoides adyacentes (Stanier y Cohen-Bazire,

1977). Estos complejos proteicos periféricos de membrana captan la energía

lumínica eficientemente y la transfieren a los centros de reacción fotosintéticos.

Como se muestra en la figura 7, los ficobilisomas se organizan en dos dominios

estructurales, denominados núcleo y bastones. Los polipéptidos L facilitan el

ensamblaje de los agregados de ficobiliproteínas y modulan las características de

absorción de éstas, promoviendo el flujo de energía unidireccional hacia los

centros de reacción (Grossman y col., 2001).

La energía de excitación es transferida desde la ficoeritrina a la clorofila en

los centros de reacción a través de la ficocianina y la aloficocianina. Las

ficobiliproteínas pueden encontrarse en muy altas concentraciones y quizás sirvan

como reserva de proteínas, son solubles en agua y se disocian fácilmente de la

membrana tilacoidal (Fay, 1992).

Figura 6. Pigmentos tetrapirrólicos de las cianobacterias. a) Clorofila a; b) ficocianina, c) ficoeritrina. Adaptado de Wolk, 1973.


13

Figura 7. Estructura de ficobilisomas de cianobacterias irradiados con luz verde (LV) o roja (LR). Cada disco en los bastones representa un hexámero de ficobiliproteínas. Los discos rojos representan la ficoeritrina y los azules la ficocianina. Adaptado de: Grossman y col., 2001.

Estudios recientes sugieren que los ficobilisomas poseerían un mecanismo

alternativo para disipar el exceso de energía absorbida. Este mecanismo

fotoprotector se caracterizaría por un efecto de quenching mediante el cual se

produce la fluorescencia inducida por luz azul de un carotenoide asociado a una

proteína soluble (Orange Carotenoid Protein, OCP). Esta proteína soluble,

codificada por el gen slr1963 en Synechocystis PCC 6803, interactuaría con los

tilacoides y actuaría tanto como fotorreceptor así como mediador en la de la

reducción de la cantidad de energía transferida desde los ficobilisomas hasta los

fotosistemas (Eckardt, 2006; Wilson y col., 2006).

1.2 Pared celular

A pesar de ser organismos del tipo Gram negativo (-), presentan muchas

características típicas de los organismos Gram positivos (+), como el espesor de

la capa de peptidoglicano, el grado de entrecruzamiento y la presencia de

polisacáridos unidos covalentemente al mismo. La pared celular está constituida

por dos membranas: la citoplasmática y la externa (lipopolisacárido), separadas

por una capa electrón-densa de peptidoglicano (Hoiczyk y Hansel, 2000).

1.2.1 Envoltura y membrana externas

A pesar de su estructura Gram (-), la capa de peptidoglicano en las

cianobacterias es considerablemente más gruesa (Fig. 8). El análisis químico de

los peptidoglicanos de Synechocystis sp. PCC6714 ha revelado que el grado de

entrecruzamiento entre las cadenas de peptidoglicanos es muy superior al

descrito para bacterias Gram (-) y de hecho es más similar a los valores

determinados en las Gram (+) (Hoiczyk y Hansel, 2000).


14

Por otra parte, la mayoría de los pentapéptidos que participan del

entrecruzamiento contienen el aminoácido ácido meso-diaminopimélico, típico de

las bacterias Gram (-), en contraste con el ácido L-diaminopimélico o L-lisina

presentes en los tetrapéptidos de los peptidoglicanos de las bacterias Gram (+).

Otro constituyente típico de los peptidoglicanos, el ácido teicoico, también se

encuentra ausente en la pared celular de las cianobacterias (Hoiczyk y Hansel,

2000).

Sin embargo, los peptidoglicanos de las cianobacterias se encuentran

asociados en forma de complejos con polisacáridos específicos de un modo muy

similar a la organización presente en bacterias Gram (+). La capa de

lipopolisacárido (LPS) también contiene algunas características típicas de los

organismos Gram (-), como la baja cantidad de enlaces fosfato y la ausencia

del componente cetodoxioctonato (Hoiczyk y Hansel, 2000).

Además, en las membranas externas se encuentran presentes algunos

ácidos grasos poco comunes en las bacterias Gram (-) como el ácidohidroxi

palmítico (Hoiczyk y Hansel, 2000).

Otro grupo de moléculas presentes en la pared celular de las

cianobacterias pero poco frecuente en los organismos Gram (-), es el repertorio

Figura 8. Comparación de micrografías electrónicas de las envolturas celulares de la cianobacteria Phormidium unicatum (A) y Escherichia. Coli (B). Ambas bacterias han sido procesadas mediante criosustitución. Nótese la combinación de características Gram positivas y Gram negativas presentes en la pared celular de la cianobacteria, como el grosor de la capa de peptidoglicano y la membrana externa. CM: membrana citoplasmática, EL: capa externa, OM: membrana externa, P: capa de peptidoglicano. Barras, 100nm. Adaptado de Hoiczyk y Hansel, 2000.


15

de compuestos carotenoides específico de cada especie. En la membrana de la

envoltura externa de los cloroplastos también se encuentra presente el mismo tipo

de compuestos carotenoides, lo que apoya la hipótesis de que la envoltura del

plástido sería otra reliquia de un evento endocítico que promovió el desarrollo de

dicho organelo (Hoiczyk y Hansel, 2000).

Se ha sugerido que los compuestos carotenoides de las cianobacterias

tendrían una función de protección contra las altas intensidades de luz,

particularmente en el rango UV. De todos modos, éstas no serían las únicas

sustancias fotorreactivas encontradas en la envoltura de las cianobacterias

(Hoiczyk y Hansel, 2000).

En especies como Nostoc commune se identificaron pigmentos aromáticos

como la escitonemina (scytonemin) o aminoácidos (aas) tipo micosporina (MAAs)

que absorben la luz UV de una forma eficiente. Los MAAs son derivados imino-

carbonil del cromóforo de ciclohexenona de las micosporinas y tienen conjugado

en el anillo sustituyentes nitrogenados (con sustituyentes amino), aminoácidos o

sus amino-alcoholes correspondientes: la glicina es el aminoácido más común

presente en los MAAs (Korbee y col., 2006). Se ha propuesto que estos

Característica Gram (+) Gram( -) Cianobacteria

% de entrecruzamiento

entre las cadenas de peptidoglicano y

mureína

20-33%

Gram (+)

Presencia de

aminoácidos (aas) en los polipéptidos de entrecruzamiento

ácido L-

diaminopimélico, L-lisina, tetrapéptidos

ácido meso-

diaminopimélico, pentapéptidos

Gram (–) y Gram (+)

( L-lisina)

Presencia de ácido

teicoico

si

No

Gram (-)

Presencia de polisacáridos específicos

-- -- Gram (+)

Tabla 1. Resumen de algunas características Gram (+) y Gram (–) de la capa de peptidoglicanos en cianobacterias. Adaptado de: Hoiczyk y Hansel., 2000


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Figura 9. Las capas superficiales (capas S) en las eubacterias y cianobacterias Gram (-) se encuentran unidas a la membrana externa por interacciones no covalentes. Adaptado de: Smarda y col., 2002

mecanismos de fotoprotección habrían surgido en respuesta a las condiciones

presentes en la Tierra hace unos 3500 millones de años (Hoiczyk y Hansel, 2000).

1.2.2 Capa o envoltura superficial

Las capas superficiales de la

pared celular en los procariotas se

denominan capas S (Fig. 9), están

formadas por un red cristalina

bidimensional de subunidades

proteicas (proteínas y glicoproteínas)

idénticas que se auto-ensamblan en un

proceso dirigido entrópicamente

(Šmarda y col, 2002). En las cianobacterias, las capas S se han encontrado

principalmente en especies unicelulares del género Chrococcales, mientras que

han sido descritas excepcionalmente en especies filamentosas de los órdenes

Nostocales y Stigonematales (Šmarda y col., 2002).

La capa S se ubica entre la vaina o capa mucilaginosa y la membrana

externa (Fig. 9), con la cual establecen interacciones no covalentes. Participan en

los procesos de adhesión y reconocimiento celular, además de actuar como un

potentes alérgenos (Šmarda y col., 2002).

También pueden cumplir funciones de protección mecánica como cubiertas

protectoras, de tamiz molecular y de trampa para captar iones y moléculas. Existe

poca información acerca de la composición proteica de esta capa, aunque se han

descrito dominios para el anclaje de exoenzimas hidrolíticas y porinas (Šmarda y

col., 2002).

Finalmente, la capa más externa en la pared celular de las cianobacterias

se compone de exopolisacáridos (EPS). Estos organismos producen una amplia

variedad de arreglos de EPS que pueden formar, por ejemplo, una vaina unida

firmemente a las células, la cual es a menudo fibrilar y a veces cristalina. En otros

casos pueden permanecer como polisacáridos liberados al medio extracelular o


17

también pueden formar una cubierta mucilaginosa, asociada débilmente a las

células. Esta misma cubierta mucilaginosa puede forman un tubo en filamentos

móviles (Nobles y col., 2001).

Se ha descrito la biosíntesis de celulosa y la presencia de posibles

secuencias nucleotídicas que presentan similitud con el gen que codifica para la

enzima celulosa sintasa en las cepas Anabaena UTEX 2576 y Nostoc punctiforme

ATCC 29133. También se describió la presencia de celulosa en tubos

mucilaginosos de tricomas móviles, vainas y cubiertas mucilaginosas, de seis

cepas pertenecientes a cinco géneros de cianobacterias. De todos modos, el

porcentaje de celulosa en estas estructuras sería pequeño en relación al EPS

total. Estudios de filogenia del gen cesA que codifica para la celulosa sintasa,

sugieren que la celulosa sintasa de las plantas vasculares también se habría

originado a partir de las cianobacterias (Nobles y col., 2001).

1.3 Sistemática de las cianobacterias

El tipo de fotosíntesis que llevan a cabo la mayoría de estos organismos,

junto con su tamaño y su morfología, determinó que fuesen clasificados

originalmente como algas verde azules (Cianophyta). De todos modos, luego del

descubrimiento de su naturaleza procariota en la década del setenta, el nombre

de cianobacteria fue más aceptado (Adams y Duggan, 1999).

Desde el año 1979 las cianobacterias se encuentran sujetas a dos

sistemas de clasificación: el del Código Botánico del International Code of

Botanical Nomenclature (Cianophyta, algas verde azules) y por otro lado el

Código Bacteriológico del International Commitee on Systematic Bacteriology

(Oren, 2004).

La sistemática de las cianobacterias es aún tema de discusión entre

Botánicos (Cianophyta) y Bacteriólogos (Cianobacterias), principalmente por la

confusión y el desorden que podría generarse al asignar nuevos nombres a

taxones ya existentes y reconocibles morfológicamente (Oren, 2004).


18

1.3.1 Clasificación según criterios bacteriológicos

La clasificación bacteriológica se basa en la información genética y

filogenética de las cianobacterias que han podido ser aisladas en cultivos puros

(cepas axénicas). Actualmente, el phylum Cianobacteria incluye a los fotótrofos

oxigénicos, a los prochlorales que contienen ambos tipos de clorofila

(prochlorophyta) y a las cianobacterias (Wacklin, 2006).

Las cianobacterias fueron agrupadas en cuatro sub-secciones, las cuales a

su vez fueron divididas en subgrupos y géneros. Aún en la actualidad, las sub-

secciones y los géneros se definen principalmente en base a criterios

morfológicos. Esto se debe a la carencia de suficientes aislamientos

caracterizados genética y fenotípicamente (Wacklin, 2006).

Asimismo, en el año 2002, Cavallier-Smith propuso que la “División

Cianobacteria” -una de las ocho Divisiones propuestas para los procariotas-

estaría compuesta por dos subdivisiones, tres clases y seis ordenes (Tabla 2)

(Oren, 2004).

1.3.2 Clasificación según criterios botánicos

De acuerdo con la clasificación morfológica tradicional, este grupo de

organismos procariotas fue dividido en cinco subsecciones. Las subsecciones I

(Chroococcales) y II (Pleurocapsales) contienen cianobacterias cocoides

unicelulares. Las células de la sub-sección I se dividen por fisión binaria, mientras

División Subdivisión Clase Orden

Cianobacteria Gloeobacteria Oxiphotobacteria (+) Chrococcales

Phycobacteria Chroobacteria Gloeobacterales

Gloeobacteria Nostocales

Hormogoneae Oscillatoriales

Pleurocapsales

Prochlorales (*)

Stigonematales

Tabla 2. Nombres de los taxones publicados por la IJSEM/ IJSB o validados en las Listas de Validación de la publicación hasta noviembre del 2003. Todos han sido propuestos por Cavallier-Smith en 2002, excepto los que están marcados, (+) Murray 1984, 1988, (*)Florenzano et al., 1986. Adaptado de: Oren, 2004


19

que las de la subsección II también son capaces de dividirse por fisión múltiple,

produciendo células reproductivas pequeñas y fácilmente dispersables llamadas

baeocitos (Tomitani y col., 2006).

Las cianobacterias de las subsecciones III al V forman filamentos que

varían en su complejidad morfológica. La subsección III (Oscillatoriales) incluye a

los filamentos compuestos exclusivamente por células vegetativas, mientras que

en las subsecciones IV (Nostocales) y V (Stigonematales), algunas células

vegetativas pueden diferenciarse en heterocistos o acinetos, células morfológica y

ultraestructuralmente distintas. Además, las cianobacterias de la subsección V

puede presentar patrones de ramificación complejos (Tomitani y col, 2006).

La revisión de la clasificación según el código botánico realizada por

Komârek en 1985 agrupó a las cianobacterias (cianoprocariotas) en cuatro

órdenes - Nostocales, Stigonematales, Chroococcales y Oscillatoriales- que

fueron divididos en familias, subfamilias, géneros y especies (Tabla 2) (Wacklin,

2006). Este sistema de clasificación se basa principalmente en la identificación de

las especies directamente en las muestras naturales colectadas sin previo

aislamiento, lo cual ha sido usualmente empleado como herramienta para el

estudio de la diversidad de cianobacterias por los Ecólogos (Wacklin, 2006).

Sin embargo, en las últimas dos décadas se ha intentado adoptar un

criterio único para la clasificación de estos organismos, respetando la

nomenclatura de los Códigos Botánico y Bacteriológico (Komârek, 1990).

1.3.3 Criterios actuales para la clasificación

Actualmente se sugiere que el único método aceptable y recomendable

para la evaluación taxonómica moderna de los cianoprocariotas sería a través de

un abordaje polifásico, empleando métodos de caracterización fenotípica,

ultraestructural, ecológica, bioquímica y molecular (Tabla 3) (Komârek, 1990).

A continuación se presenta una tabla que describe los criterios empleados

para la clasificación de las cianobacterias según el Manual Bergey´s de


20

Sistemática Bacteriológica, Komârek y Anagnostidis y Hoffmann, Komârek and

Kaštovský. Clasificación según el

Manual Bergey`s de

Sistemática

Bacteriológica (Boone &

Castenholz 2001)

Clasificación según

Komârek y Anagnostidis

(Anagnostidis y Komárek

1985; Komârek y Anagnostidis

1988, 1999, 2005)

Clasificación según Hoffman, Komârek y

Kaštovský (2005)

Subsección I:

Unicelulares o colonias,

división por fisión binaria en 1

o 3 planos o por gemación

Chrococcales:

Unicelular o colonias

Gloeobacterales:

Cocoides, sin tilacoides

Synechococcales 2:

Organizaciones de tilacoides

paralelas a la superficie celular,

unicelulares o colonias

Subsección II:

Uniceluares o colonias,

división por fisión múltiple o en

combinación con fisión binaria

Chrococcales:

Organización radial de los

tilacoides, unicelulares o

colonias

Subsección III:

Filamentos sin heterocistos

Oscillatoriales:

Filamentos sin heterocistos

Oscillatoriales 1:

Organización radial de los

tilacoides, filamentos grandes

Pseudoanabaenales 2:

Organizaciones de tilacoides

paralelas a la superficie celular,

filamentos delgados

Subsección IV:

Filamentos con heterocistos,

no ramificados

Nostocales:


acinetos, ramificaciones falsas

Nostocales:

Cianobacterias filamentosas

con heterocistos

Subsección V:


ramificados

Stigonematales:


acinetos, ramificaciones

verdaderas

Tabla 3. Clasificación de las Cianobacterias de acuerdo a los sistemas bacteriológico (Manual Bergey´s de Sistemática Bacteriológica) y botánico (Komârek and Anagnostidis; Hoffmann, Komârek and Kaštovský). Adaptado de: Wacklin, 2006


21

1.4 Metabolismo

Las cianobacterias son organismos fotoautótrofos aerobios que emplean

las reacciones de la fotosíntesis oxigénica para dirigir la biosíntesis, a expensas

de nutrientes inorgánicos (CO2, N2). Algunas cianobacterias de origen marino

tienen como requerimiento esencial para su crecimiento la presencia de vitamina

B12; con esta excepción, no se ha demostrado hasta el momento el requerimiento

de ningún otro factor de crecimiento orgánico (Stanier y Cohen-Bazire, 1977).

En general, la ruta primaria de asimilación de carbono es la vía de las

pentosas fosfato (ciclo de Calvin-Benson) en la cual participan dos enzimas clave

como la fosforibuloquinasa y la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa

(Rubisco). El transporte de electrones de la cadena respiratoria se localiza

aparentemente en la membrana plasmática y también en la membrana tilacoidal,

en la cual compartiría algunos componentes con el sistema de transporte de

electrones del aparato fotosintético (Fay, 1992).

A su vez, la oxidación de la glucosa 6-fosfato a través de la vía de las

pentosas fosfato podría acoplarse con la oxidación del piruvato a través de las

reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TAC). Sin embargo, el ciclo de

los ácidos tricarboxílicos no funcionaría como una vía metabólica completa en las

cianobacterias, debido a que estos organismos no sintetizan la enzima -

oxoglutarato deshidrogenasa (Stanier y Cohen-Bazire, 1977).

Actualmente se propone que el transporte de electrones dentro del pool de

plastoquinonas, en las membranas de los tilacoides, no se desarrollaría

principalmente a partir del NAD(P)H, en vez de esto, el flujo de electrones se

debería principalmente a la actividad de la succinato deshidrogenasa. El NAD(P)H

se emplearía entonces de forma preferencial en los procesos de fijación de

carbono. El corolario de este nuevo concepto es que las cianobacterias son

capaces de generar succinato como un intermediario de la cadena respiratoria,

logrando de este modo adquirir o expresar un ciclo de los ácidos tricarboxílicos

modificado (Vermaas, 2001).


22

También son capaces de fotoasimilar el acetato y convertirlo a acetil-CoA;

aunque el acetato no es respirado como resultado del bloqueo del TAC a nivel del

2-oxoglutarato. Por esto se considera que el resto de las enzimas del ciclo de los

ácidos tricarboxílicos (TCA) que son igualmente sintetizadas por las

cianobacterias, tienen una función biosintética, por ejemplo, participando en la

síntesis de aminoácidos de la familia de la glutamina. Las cianobacterias, al igual

que los metilótrofos y los organismos quimiolitótrofos, pertenecen a la categoría

de procariotas que poseen un ciclo de los ácidos tricarboxílicos incompleto

(Stanier y Cohen-Bazire, 1977).

Recientemente se ha demostrado la ausencia del complejo 2-oxoglutarato

deshidrogenasa en Synechocystis PCC 6803, en base al análisis de su secuencia

genómica. Sin embargo, también se ha sugerido que este organismo sería capaz

de convertir 2- oxoglutarato en succinato, en ausencia del complejo 2-oxoglutarato

deshidrogenasa tradicional, empleando una vía alternativa (Cooley y col., 2000).

Por otra parte, experimentos en los cuales se utilizaron técnicas de

radiomarcado (radiolabelling) y ensayos enzimáticos con distintas cepas de

cianobacterias, indican que la vía de las pentosas fosfato es la principal pero no la

única ruta de catabolismo del glucógeno endógeno para la supervivencia en los

períodos de oscuridad. Tampoco sería la única vía de degradación de

carbohidratos exógenos, los que a su vez proveen de intermediarios biosintéticos

para el crecimiento heterótrofo en la oscuridad. Luego, el NAD(P)H generado en

el catabolismo de los carbohidratos aportaría el poder reductor para la fijación de

nitrógeno y la respiración en heterocistos y para la respiración de células

vegetativas durante la oscuridad (Summers y col., 1995).

Capítulo 2: Cianobacterias diazotrofas

23

Capítulo 2

Cianobacterias diazotrofas

La fijación biológica de N2 es un proceso que puede ser efectuado

exclusivamente por organismos procariotas, aunque sólo algunas especies son

capaces reducir el nitrógeno atmosférico a una forma biológicamente útil.

Todos los diazotrofos, incluyendo las cianobacterias fijadoras de nitrógeno,

tienen los mismos requerimientos generales para desarrollar este proceso: ATP

como fuente de energía, un mecanismo generador de poder reductor, un

ambiente parcialmente anaerobio y la expresión de un complejo enzimático

nitrogenasa (Böhme, 1998). La expresión de este complejo enzimático involucra

aproximadamente veinte genes (Zehr y Jenkins, 2003) y se encuentra regulada a

nivel transcripcional, traduccional, por modificaciones covalentes y moduladores

alostéricos (Aparicio-Tejo y col., 2000).

2.1 El complejo nitrogenasa

El complejo enzimático nitrogenasa está codificado por los genes nif, muy

conservados en la evolución (Zehr y Jenkins, 2003). El conocimiento de la

filogénesis de estos genes se ha incrementado significativamente gracias al

aumento de las secuencias nucleotídicas disponibles obtenidas a partir de

distintos organismos aislados y del ADN purificado de muestras ambientales de

diversos orígenes (Raymond y col., 2004).


24

La información ha sido obtenida principalmente a partir de secuencias del

gen nifH, pero también a partir de secuencias de los genes nifD, nifK, nifE y nifN,

menos conservados durante la evolución (Raymond y col., 2004). El gen nifH

codifica para una de las subunidades estructurales del complejo nitrogenasa

(dinitrogenasa reductasa, homodímero 2). El banco de secuencias más

importante y amplio de los genes nif corresponde al de este gen. Por este motivo

se lo ha empleado para realizar estudios de evolución de la nitrogenasa y como

marcador molecular para identificar organismos (Zehr y col., 2003).

Dentro de los operones nif se encuentran agrupados los genes nifH, nifD y

nifK y generalmente otros dos genes adyacentes, nifE y nifN. Aunque de forma

variable, estos genes se ordenan típicamente del siguiente modo: nifHDKEN. Las

proteínas NifE y NifN poseen una similitud importante con las proteínas NifD y

NifK, respectivamente. Se ha sugerido que estas dos proteínas (NifE y NifN)

podrían haberse originado a partir de una duplicación ancestral del operón nifDK

(Raymond y col., 2004). Los genes nifA y nifL forman otro operón y sus productos

tienen una función reguladora, afectando la expresión de los otros genes nif

(Aparicio-Tejo y col., 2000).

De acuerdo al análisis de las filogenias de nifH y del gen que codifica para

la subunidad 16S del ARNr (a partir de organismos cultivados), no es posible

asegurar la transferencia horizontal de dichos genes. Además, el análisis de

similitud entre las secuencias nifH sugiere que la nitrogenasa habría evolucionado

hace mucho tiempo a partir de un ancestro común (Zehr y col., 2003).

2.1.1 Estructura

Este complejo está compuesto de dos ferrosulfoproteínas. La Fe-proteína

(dinitrogenasa reductasa, componente II) acopla la hidrólisis del ATP con la

transferencia de electrones que permiten la reducción del N2. Es un homodímero

codificado por el gen nifH. La Fe-Mo proteína (dinitrogenasa, Componente I)

contiene el sitio activo para la reducción de N2 y está formado por dos

heterodímeros . La subunidad está codificada por el gen nifD y la por nifK

(Aparicio-Tejo y col., 2000).


25

Las nitrogenasas convencionales contienen molibdeno (Mo) en el centro

Fe-S, anclando las subunidades. En la nitrogenasas alternativas, el Mo es

remplazado por vanadio (V, genes vnf) o por hierro (Fe, genes anf). Estas

enzimas tienen cinéticas de reacción y especificidades distintas y se expresan en

determinados organismos sólo cuando la concentración de Mo es limitante (Zehr y

col., 2003). Estos complejos enzimáticos alternativos podrían representar

nitrogenasas primitivas que se han mantenido en algunos linajes procariotas, en

vez de haber derivado como genes parálogos de la nitrogenasa convencional

(Raymond y col., 2004).

La reacción catalizada por este complejo enzimático es altamente

endergónica y metabólicamente costosa. Su estequiometría es:

N2 + 16ATP +10 H+ + 8e- → NH4+ + H2 + 16 ADP +16 Pi

En condiciones fisiológicas, los electrones (e-) son utilizados para reducir el

N2 a amonio y en menor cuantía los iones H+ a H2.

La regulación a nivel transcripcional de la fijación de N2 se da en respuesta

a los niveles ambientales de oxígeno y amonio. Debido a que los componentes de

la nitrogenasa son lábiles al oxígeno molecular, es ventajoso para la bacteria

reprimir la transcripción en presencia de éste. También representa una ventaja

reducir la expresión de un sistema metabólicamente costoso como la nitrogenasa,

cuando los niveles celulares de nitrógeno fijado son altos. El grado de respuesta a

cada estímulo es característico de cada organismo, aunque los diazotrofos de

vida libre son especialmente sensibles a los niveles intracelulares de amonio

(Halbleib y Ludden, 2000).

2.1.2 Clasificación

El análisis filogenético de las proteínas NifH, NifD y NifK del complejo

nitrogenasa ha permitido clasificarlas en cuatro grupos. El grupo I comprende a

las Mo-Fe nitrogenasas, expresadas principalmente por proteobacterias y

cianobacterias.


26

En el grupo II se encuentran las Mo-Fe nitrogenasas anaerobias

expresadas por una amplia variedad de organismos anaerobios como clostridios,

bacterias acetogénicas y varias metanogénicas. El grupo III contiene las

nitrogenasas alternativas Mo-independientes codificadas por los genes anf y vnf.

Por último, el grupo IV incluye organismos con genes homólogos a los nif pero

detectados únicamente en organismos metanogénicos y algunas bacterias

fotosintéticas anoxigénicas no caracterizadas aún (Raymond y col., 2004).

2.1.3 Evolución de las nitrogenasas

La función de las nitrogenasas primitivas y las presiones selectivas que

participaron en su evolución son actualmente estudiadas y discutidas. Las

condiciones atmosféricas de los océanos primitivos y la disponibilidad de trazas

de elementos como el Fe, Mo y V en el ambiente, habrían sido factores

determinantes de su evolución (Berman-Frank y col., 2003).

En base a modelos físicos de la radiación solar se ha sugerido que la

atmósfera primitiva fue medianamente reductora, habiéndose desarrollado un

efecto invernadero por la abundancia de metano y dióxido de carbono. En este

contexto se han propuesto distintas explicaciones sobre la evolución del complejo

enzimático nitrogenasa. Una de las hipótesis plantea que el amonio pudo haber

sido abundante inicialmente y las formas primitivas de las nitrogenasas habrían

funcionado como enzimas respiratorias (siendo el N2 una fuente receptora de

electrones para los heterótrofos) (Berman-Frank y col., 2003) o como detoxicasas,

utilizadas en la detoxificación de cianuros y otras moléculas persistentes en los

océanos (Fani y col., 2000).

Otra hipótesis propone que la atmósfera poseía una muy baja

concentración de dióxido de carbono (CO2), limitando la formación de especies

NOX a partir del N2 y CO2, y causando así una limitación del N fijado. La fijación

biológica de nitrógeno habría sido entonces seleccionada como mecanismo de

obtención de N, aproximadamente 3500 millones de años atrás, antes de la

oxigenación de la atmósfera y la nitrificación. Luego, el cambio de la atmósfera

anóxica a oxigénica pudo haberse producido debido a la fotosíntesis llevada a


27

cabo por las cianobacterias, en un período comprendido entre 2200 y 2400

millones de años atrás (Fani y col., 2000).

El modelo del Último Ancestro Común se basa en la observación de que

las nitrogenasas se encuentran presentes en distintas bacterias y arqueas y

propone que esta familia de enzimas pudo haber evolucionado a partir del último

ancestro común de los tres dominios de la vida. Esta hipótesis supone que la

pérdida de genes ha sido el factor dominante para explicar la presencia o

ausencia de este complejo proteico en los distintos dominios. Otra hipótesis

sostiene que los genes de la nitrogenasa evolucionaron a partir de organismos

metanogénicos por eventos de duplicación y de transferencia horizontal de dichos

genes (Raymond y col., 2004).

2.2 Clasificación de cianobacterias diazotrofas

Las cianobacterias han coevolucionado junto a los distintos estados de

oxidación de los océanos y la atmósfera que se sucedieron durante la evolución

del planeta y han logrado de esta forma acomodar la maquinaria necesaria para la

fotosíntesis oxigénica y la fijación de N2 en la misma célula o colonia de células

(Berman-Frank y col., 2003).

Tradicionalmente han sido distinguidos dos tipos de mecanismos que

involucran la separación espacial y temporal de los procesos, pero ésta ha sido

una explicación simplista a la evolución de dichos procesos. Estudios recientes

revelan un patrón de adaptación más complejo, que puede ser monitoreado

ecológica y filogenéticamente (Berman-Frank y col., 2003).

2.2.1 Cianobacterias sin especialización celular

Dentro de las cianobacterias existen algunos miembros en los cuales la

capacidad de fijar nitrógeno se perdió durante la evolución o nunca estuvo

presente (Synechococcus, Oscillatoria), otros son capaces de fijar nitrógeno sólo

en condiciones microaerobias como Plectomena (Misra y Tuli, 2000) o

Phormidium (Grupo I), mientras que otros pueden efectuar el proceso en

condiciones aeróbicas durante los períodos oscuros dentro de ciclos de


28

Figura 10. Filamentos de cianobacterias donde se muestran células vegetativas y heterocistos. A: Anabaena cilíndrica (ATCC29414) donde se observan acinetos (A) y heterocistos (H). B: cepa 9v aislada de Mkindo (Tanzania) donde se observan heterocistos intercalados y terminales. Adaptado de Herrero y col., 2004

luz/oscuridad (Grupo II) (Berman-Frank y col., 2003). Estos organismos fijan el N

gaseoso separando temporalmente la fijación del N2 de la fotosíntesis. Así,

durante el día tiene lugar la fotólisis del agua y la formación de ATP y durante la

noche se hace posible la fijación de N2 por la disminución de la pO2 intracelular, la

respiración y la reserva de energía química (Aparicio-Tejo y col., 2000).

2.2.2 Cianobacterias con especialización celular

Existen además otros dos grupos de organismos capaces de desarrollar

distintas formas celulares: unas especializadas en desarrollar la fijación de N2 y

otras la fotosíntesis de forma separada y simultánea. El Grupo III incluye sólo dos

géneros, Trichodesmium y Katagnymene, capaces de realizar la fijación de N2

durante los períodos de luz concentrando la nitrogenasa en un número reducido

de células contiguas o tricomas. En el grupo IV se encuentran todas las

cianobacterias que forman heterocistos (Fig. 10) y que son por lo tanto capaces la

fijar N2 en condiciones de aerobiosis y en presencia de luz (Berman-Frank y col.,

2003).

Muchas cianobacterias pertenecientes a los géneros Nostocales y

Stigonematales desarrollan heterocistos (Holt y col., 1994) a distancias regulares

a lo largo del filamento. Los heterocistos son células vegetativas completamente

diferenciadas que han perdido la capacidad de dividirse y que mantienen un

ambiente microóxico para el óptimo funcionamiento y protección del complejo

nitrogenasa (Meeks y Elhai, 2002).

El análisis filogenético del gen 16S ARNr de 15 géneros distintos de

cianobacterias filamentosas sugiere que si bien estos organismos se agrupan


29

morfológicamente, tendrían orígenes polifiléticos. Por otra parte, los taxones

capaces de desarrollar acinetos y heterocistos formarían un grupo monofilético.

La monofilia de las subsecciones IV y V (formadoras de heterocistos) fue

coherente con el análisis del gen rbcL que codifica para la subunidad mayor de la

enzima Rubisco, hetR que codifica para una proteína esencial para la

diferenciación del heterocisto y con los genes nifH y nifD ya mencionados

(Tomitani y col., 2006).

En la figura 11 se muestra esquemáticamente la clasificación de las

cianobacterias en los cuatro grupos descritos con algunas características de cada

uno, como la morfología de las células o las colonias, la ubicación del complejo

nitrogenasa, la distribución temporal de la fijación de nitrógeno y la fotosíntesis y

la eficiencia del proceso de fijación de nitrógeno.

2.3 Moléculas señal en cianobacterias diazotrofas

2.3.1 2-oxoglutarato (2-OG)

En el ciclo de los TAC se forma 2-OG por la decarboxilación del isocitrato.

Dicha reacción es catalizada por la enzima isocitrato deshidrogenasa (codificada

por el gen icd), luego el 2-OG es decarboxilado

Figura 11. Adaptaciones morfológicas que permiten la fijación de nitrógeno en distintos grupos de cianobacterias. Las áreas coloreadas en gris indican la presencia de la nitrogenasa y las líneas sólidas negras designan las velocidades de fijación de nitrógeno. La fotosíntesis se simboliza con la línea punteada doble. La eficiencia refiere a la comparación de los valores reportados en la literatura midiendo la actividad en condiciones aeróbicas como nmol de etileno reducido chl a-1 h-1 . Adaptado de: Berman-Frank, 2003


30

Fig. 12. Esquema del ciclo de Krebs incompleto en las cianobacterias. Se destaca la ausencia de la enzima 2-OG deshidrogenasa y la utilización del 2-OG como esqueleto carbonado por la GS-GOGAT, durante la fijación de N. Adaptado de: Laurent y col., 2005)

por la enzima 2-OG deshidrogenasa para producir succinil-CoA y continuar el

ciclo (Madigan y col., 1993).

En las cianobacterias, el ciclo de los TAC se desarrolla de forma

incompleta debido a la ausencia de la enzima 2-OG deshidrogenasa (Fig. 12), por

lo que se presume que el 2-OG se utilizaría principalmente para la biosíntesis de

glutamato y compuestos derivados del glutamato (Zhang y col., 2006).

En estos organismos, el 2-OG

sería utilizado como esqueleto carbonado

para la incorporación de amonio a través

del ciclo de la glutamina sintetasa-

glutamato sintasa (GS-GOGAT). En

experimentos en los cuales se indujo la

diferenciación de heterocistos en

Anabaena PCC 7120 a través de la

limitación de nitrógeno combinado en el

medio, se verificó la acumulación

transitoria de 2-OG en las células,

sugiriendo que esto podría constituir una

señal temprana en el programa de

diferenciación celular (Laurent y col.,

2005).

Ensayos de incorporación 2-[14C]OG llevados cabo en una cepa de

Synechococcus, en la cual se introdujo el gen que codifica para una permeasa

heteróloga de 2-OG de Escherichia coli (Vázquez-Bermúdez y col., 2000), apoyan

la hipótesis propuesta en el párrafo anterior en lo que refiere a la función

señalizadora del 2-OG. Las células de Synechoccocus capaces de expresar dicha

permeasa exhibieron la mayor intensidad de señal (moléculas de 2-OG) -y por

consiguiente de concentración intracelular- de glutamina y glutamato. Además, el

rol predominante del 2-OG como esqueleto carbonado para la asimilación de

nitrógeno sugiere que este compuesto sería un sensor del balance C/N en las

cianobacterias (Herrero y col., 2001).


31

El derivado fluorado no metabolizable del 2-OG, el ácido 2,2-

difluoropentanedioico (DFPA) ha sido muy útil para estudiar in vivo la función de

señalización del 2-OG. Este compuesto puede ser incorporado a la célula

mediante permeasas heterólogas introducidas por ingeniería genética y debido a

la presencia del átomo de 19F, el proceso de su acumulación pudo ser

monitoreado mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de

rotación en ángulo mágico (MAS NMR) (Laurent y col., 2005).

Además, se ha demostrado que la expresión del gen icd es mayor en

condiciones de estrés por limitación de N en la cepa PCC 6803 de Synechocystis

sp. o en condiciones de fijación de N2 en la cepa PCC 7120 de Anabaena sp., que

en condiciones de no limitación de nitrógeno (Herrero y col., 2001).

2.3.2 Ión Calcio

El rol del Ca2+ en las actividades celulares de las bacterias es menos

comprendido en comparación con los organismos eucariotas. En algunas

bacterias, la concentración intracelular del calcio es regulada estrictamente y

existe evidencia de que es de importancia crítica en algunos procesos celulares

como la esporulación en Bacillus, la quimiotaxis en E. coli, y la diferenciación de

los heterocistos en cianobacterias. En las cianobacterias que desarrollan

heterocistos, el Ca2+ libre se acumula en las células durante el proceso de

diferenciación y en los heterocistos maduros, por lo que la concentración de este

ión parece ser crítica en las primeras etapas del proceso (Torrecilla y col., 2004).

La determinación de la concentración de Ca2+ intracelular durante el

proceso de diferenciación a heterocisto en una cepa recombinante de Anabaena

PCC7120 incubada en condiciones de limitación de N, permitió demostrar la

existencia de una liberación transitoria de este ión. En dichos experimentos se

sugiere que el aumento en la concentración intracelular de Ca2+ se produciría en

el marco de un conjunto de parámetros temporales y cinéticos (Torrecilla y col.,

2004). Recientemente se describió en la cepa de Anabaena PCC7120 una

proteína de unión a calcio denominada CcbP que podría participar regulando el

proceso de diferenciación celular a la forma de heterocistos. La sobre-expresión

de esta proteína provocó la supresión del desarrollo de heterocistos, mientras que


32

la ausencia de esta proteína promovió el desarrollo de mutantes formadores de

heterocistos contiguos múltiples (fenotipo Mch) (Zhao y col., 2005).

Basándose en estos resultados se ha sugerido que en presencia de

suficiente nitrógeno asimilable en el medio, la proteína CcbP se uniría al ión Ca2+

intracelular y mantendría una concentración baja de este ión en su forma libre y el

complejo CcbP- Ca2+ serviría así como reserva de Ca2+. En condiciones de

limitación de N combinado, la proteína CcbP se inactivaría por algún mecanismo

desconocido especialmente en las células en desarrollo, lo cual provocaría un

incremento en la concentración intracelular de Ca2+ y promovería la

diferenciación del heterocisto (Zhang y col., 2006).

2.3.3 Factores

Las ARN polimerasas de las cianobacterias y de los cloroplastos poseen un

núcleo compuesto por cinco subunidades, levemente distinto al núcleo de las

polimerasas en otras eubacterias, que poseen un tetrámero (’). En el caso de

las cianobacterias, este núcleo se compone por las subunidades siendo

las subunidades ’ correspondientes a las subunidades ’’’ de la polimerasa en

otras eubacterias (Muro-Pastor y col., 2001).

La modulación de la actividad de la ARN polimerasa por diversos factores

sigma alternativos es un mecanismo bastante común en los procesos de

diferenciación celular de algunos organismos procariotas. En cianobacterias,

particularmente en la cepa de Anabaena PCC 7120, se han identificado al menos

siete factores sigma alternativos, incluyendo algunos que sólo se expresan en

condiciones de estrés por limitación de N (Muro-Pastor y col., 2001) aunque

ninguno es específico de heterocistos, ni esencial para el desarrollo de éstos

(Adams y Duggan, 1999).

El factor sigma más importante descrito en Anabaena PCC 7120, está

codificado por el gen sigA y es expresado en filamentos durante el crecimiento en

presencia y ausencia de N combinado en el medio. Los genes sigB y sigC

también codifican para factores sigma, pero se expresan transitoriamente luego


33

de la remoción de N combinado en el medio. Estos últimos no son considerados

esenciales para el desarrollo del heterocisto o la fijación de N (Golden y Yoon,

2003).

Recientemente se han clonado y caracterizado otros tres genes que

codifican para factores sigma alternativos. La inactivación de los genes sigD, sigE

o sigF por inserción de elementos genéticos mediante técnicas recombinantes no

afectó el crecimiento de los mutantes en presencia de nitrato, ni el proceso de

diferenciación de los heterocistos. Los mutantes dobles sigD sigE pudieron

diferenciarse en la forma de pro-heterocistos pero fueron incapaces de crecer de

forma diazotrofa debido a la fragmentación exhaustiva de los filamentos (Golden y

Yoon, 2003).

2.3.4 Proteína PII

La proteína PII (Fig. 13) se considera como una de las moléculas señal más

conservada entre los procariotas y todas las proteínas similares a PII identificadas

hasta el momento participan en la señalización de metabolismo del N. La primer

proteína PII caracterizada en profundidad fue la de E. coli, codificada por el gen

glnB y forma parte del sistema responsable de controlar la actividad del complejo

enzimático glutamina sintetasa (Lee y col., 2000).

Luego se identificaron secuencias de genes similares a la proteína PII de E.

coli en los genomas de cianobacterias así como en varias plantas y algas rojas.

En las plantas, estas proteínas contienen secuencias amino terminales

adicionales que presumiblemente permitan su localización en el cloroplasto

(Forchhammer, 2004).

La proteína PII es trimérica y tiene el potencial de responder a tres señales

metabólicas centrales: al estatus energético mediante la concentración intracelular

de ATP, al nivel de carbono mediante la detección de la concentración de 2-OG y

al nivel de nitrógeno a través de la concentración de glutamina (Forchhammer,

2004).


34

Figura 13. Diagrama de las estructuras superpuestas de las proteínas PII de E. coli (negro) y S. elongatus (magenta). Vista superior de las estructuras donde se muestran los tres ejes de simetría de las proteínas triméricas. Adaptado de : Forchhammer, 2003

En Synechococcus elongatus se ha estudiado exhaustivamente una

proteína perteneciente a la familia de las proteínas de señalización del tipo PII,

codificada por el gen glnB. Esta proteína trimérica puede encontrarse en cuatro

formas distintas, una no modificada y otras tres con distinto número de residuos

aminoacídicos fosforilados. La fosforilación máxima se alcanza cuando las células

son incubadas en condiciones de limitación de N. Las diferentes formas de la

proteína GlnB en este organismo varían en respuesta a los niveles de N

intracelular. El mecanismo de detección de N involucraría la maquinaria de

asimilación del mismo mediante la vía GS-GOGAT. En caso de inhibición de

cualquiera de estas dos enzimas se incrementa el nivel de fosforilación de PII.

Las proteínas PII de cianobacterias monitorean el estatus de N en la célula

mediante la concentración interna de 2-oxoglutarato (2-OG). Las actividades

quinasa o fosfatasa de la proteína PII dependen de su estado conformacional, el

cual es determinado por la unión cooperativa de ATP y 2-OG. Un incremento de la

concentración de 2-OG favorece la fosforilación de PII y la situación contraria se

observa en presencia de bajas concentraciones de 2-OG. La proteína PII

fosforilada también señalizaría la deficiencia de N a la proteína NtcA –factor de

transcripción que controla el metabolismo de N-, en ausencia de N combinado en

el medio (Forchhammer, 2004).

El mecanismo molecular de acción de esta proteína aún no se conoce con

detalle, pero se presume que PII interactuaría directamente con NtcA, o en su

defecto con NtcA a través de otro factor desconocido hasta el momento

(Forchhammer, 2004).


35

A pesar de la similitud estructural y de ligandos que existe entre las

proteínas de E. coli y Synechococus sp. PCC 7942, el modo de transducción de

señales es distinto. La proteína PII de proteobacterias se encuentra uridilada en el

residuo tirosilo (Y51), localizado en la punta de un loop expuesto al solvente (loop

T). La proteína homóloga de cianobacterias se encuentra fosforilada en un

residuo serilo (S49), localizado dos aminoácidos antes del residuo tirosilo

conservado. Además, en E. coli la señal de N más importante es la glutamina,

mientras que en cianobacterias esta señal sería el pool intracelular de 2-OG por lo

que la fosforilación de esta proteína estaría controlada por dicho metabolito (Lee y

col., 2000).

Esto contrasta con el mecanismo observado en las proteobacterias, en las

cuales el estatus de nitrógeno (N) es monitoreado mediante la actividad de una

enzima modificadora de PII, dependiente de glutamina. El empleo de 2-OG como

molécula señal para sensar los niveles de N en las cianobacterias (en lugar de

glutamina) permite a la célula tamponear el pool de glutamina intracelular, el cual

puede ser repuesto mediante un recambio (turnover) proteico, sin interferir el

control de nitrógeno (Forchhammer, 2004).

Capítulo 3: El heterocisto

36

Capítulo 3

El heterocisto

Como ya ha sido mencionado, las funciones del heterocisto son las de

proporcionar un ambiente microaeróbico para el óptimo funcionamiento del

complejo nitrogenasa y abastecer con N combinado a las células vegetativas del

filamento (Adams y Duggan, 1999). Los heterocistos se desarrollan a distancias

regulares -aproximadamente 1 cada 10 células vegetativas- o en los extremos del

filamento habiéndose generado modelos que explican este patrón unidimensional

de desarrollo (Golden y Yoon, 2003; Adams y Duggan, 1999).

Una vez que el programa de diferenciación se inicia se producen cambios

importantes en la fisiología y bioquímica de la célula vegetativa. Se sintetizan al

menos dos capas nuevas en la pared. Esto disminuye la difusión de los gases, de

modo que todo el oxígeno intracelular se utiliza en la respiración y la cantidad de

N2 que puede difundir es suficiente para saturar al complejo nitrogenasa (van den

Hoek y col., 1995).

Otro gran cambio involucra el desensamblaje de algunos componentes del

fotosistema II. Esto causa la pérdida de la producción de O2 y el reciclaje de los

aminoácidos contenidos en las ficobiliproteínas. Debido a que las ficobiliproteínas

pueden representar aproximadamente un 50% de todas las proteínas solubles en

la célula, los heterocistos nuevos no presentan la fluorescencia característica

asociada a dichos pigmentos (Zhang y col. 2006). Por otra parte, el fotosistema I


37

persiste y durante los períodos de luz genera ATP y el poder reductor necesario

para la reducción de N2 (Meeks y Elhai, 2002).

3.1 Estructura del heterocisto

3.1.1 Protoplasma

Los heterocistos tienen una citomorfología reconocible al microscopio

óptico. En general son células más grandes que las vegetativas y su protoplasma

hialino se caracteriza por la ausencia de gránulos de reserva o vacuolas. La pared

celular es más gruesa en comparación con las células vegetativas y esta

característica es aún más pronunciada en ambos extremos celulares, donde se

proyecta el nódulo polar. Los heterocistos terminales poseen solo un nódulo polar

(van den Hoek y col., 1995).

3.1.2 Pared celular

El espesor de la pared aumenta debido a la formación de tres capas

nuevas que se acumulan sobre la envoltura celular normal (Fig. 14). La capa más

interna se denomina laminada y se compone principalmente por glicolípidos. La

siguiente es la capa denominada homogénea, formada por polisacáridos y por

último se encuentra la capa más externa denominada fibrosa, la cual

probablemente se encuentra compuesta por las mismas cadenas de polisacáridos

que las de la capa homogénea, pero organizadas de forma menos compacta

(Adams y Duggan, 1999). La capa de glicolípido (laminada) es la responsable de

reducir la difusión del oxígeno hacia el heterocisto y la capa de polisacárido

(homogénea y fibrosa) posee la función de proteger la frágil capa de glicolípidos

(Zhang y col., 2005).

La síntesis de la capa fibrosa es uno de los cambios fisiológicos más

tempranos que se pueden visualizar en el microscopio electrónico, luego puede

observarse la formación de la capa homogénea y finalmente la fibrosa. Estas

capas o envolturas adicionales -particularmente la capa de glicolípidos- reduce la


38

Figura 14. A) Heterocisto de Anabaena sp. donde se observa la capa de polisacárido que envuelve (B) la capa laminar de glicolípidos. PS, capa de polisacárido, GL; capa de glicolípido. Adaptado de Zhou, 2003

difusión de gases hacia el heterocisto, manteniendo el ambiente microaeróbico de

la célula (Adams y Duggan, 1999).

La importancia de las capas adicionales en los heterocistos se ha

demostrado en aquellos mutantes de Anabaena PCC 7120, incapaces de efectuar

la FBN en condiciones aeróbicas pero capaces de realizar dicho proceso en

condiciones de anaerobiosis (Ernst y col., 1992; Adams y Duggan, 1999). Estos

mutantes se obtuvieron por inserción del transposón Tn5 en el genoma y se

denominaron en su conjunto como mutantes Fox-. Los genes fox se definen como

aquellos que participan específicamente en el proceso de fijación de N en

condiciones aerobias (Huang y col., 2005).

Los mutantes Fox presentan fallas en la envoltura del heterocisto

convirtiéndola en una barrera inefectiva del oxígeno. La identificación de los

mutantes Fox- permitió la identificación de varios genes que participan en la

biosíntesis y organización de las capas de polisacárido y glicolípido del

heterocisto (Adams y Duggan, 1999; Huang y col., 2005).

La síntesis y estabilización de la capa homogénea de polisacárido requiere

de la expresión de tres genes hetA, hetB (posteriormente denominados hepA y

hepB respectivamente) (Ernst y col., 1992) y hepC. HepA posee similitud con las

proteínas de transporte de unión al ATP (Khudyakov y Wolk, 1997). Su

transcripción depende de

hetR (gen esencial para el

desarrollo del heterocisto) y

se inicia unas 5 a 7 horas

luego de la eliminación del

nitrato del medio de cultivo y

unas horas antes que los

cambios morfológicos

asociados con la formación

del heterocisto se hagan

evidentes mediante microscopía (Wolk, 1973; Holland y Wolk, 1990).


39

A medida que el proceso de diferenciación avanza, el septo que lo separa

de las células vegetativas adyacentes disminuye su diámetro considerablemente

hasta convertirse en un poro estrecho, denominado nódulo polar. El número de

conexiones plasmáticas (microplasmodesmata) que atraviesan el septo también

disminuye de 3 a 5 veces, alcanzando diámetros de aproximadamente 8nm (Fay,

1992).

3.2 Metabolismo del

heterocisto

El proceso de fijación de

nitrógeno al igual que el de

respiración requiere de poder

reductor.

Este poder reductor es

generado en las cianobacterias a

través del proceso de fotosíntesis (Wolk, 1996).

Como fue descrito anteriormente, la reducción de una molécula de N2 a

amonio mediante el complejo nitrogenasa, requiere de al menos 8 electrones y 16

moléculas de ATP (ver pág. 22). El ATP necesario para el proceso de fijación de

N2 en el heterocisto sería generado durante los períodos de luz por el fotosistema

Figura 15. Diagrama que ilustra las características estructurales y las actividades metabólicas de un heterocisto (H) en relación a las células vegetativas (CV) adyacentes. Abreviaciones: PC; Pared Celular, MP; Membrana plasmática, PP; Cuerpos de Polifosfato, T; Tilacoide, G; Gránulo de Glucógeno, CS; Carboxisoma, L; gota lipídica, CP; Gránulo de cianoficina, S; septo con microplasmodesmos, CF, CH y CL; Capas Fibrosa, Homogénea y Laminada, respectivamente, AA; aminoácidos, Glu; Glutamato, Gln; Glutamina, Red. PPP; Vía reductora de las Pentosas Fosfato, Ox. PPP; Vía oxidativa de las Pentosas Fosfato, G1P; Glucosa 1-fosfato, Fd; Ferredoxina, Resp. e.t; cadena respiratoria de transporte de electrones


40

I mediante fotofosforilación cíclica o por fotofosforilación oxidativa en los períodos

de oscuridad (Summers y col., 1995).

Estas células poseen entonces los componentes del fotosistema I para

generar ATP pero carecen del fotosistema II que produce O2. (Wolk, 1996).

Debido a ésto han perdido la capacidad de fijar CO2 fotosintéticamente, por lo que

la actividad de fijación de N en estas células depende del abastecimiento de

compuestos de carbono reducidos por las células vegetativas adyacentes. Estas

moléculas sirven como fuentes de poder reductor y como sustrato para la

incorporación del amonio derivado de la reducción de N2. Se considera que la

sacarosa sería la molécula vehículo del carbono reducido (Herrero y col., 2004).

Los estudios de las actividades enzimáticas y los sustratos capaces de

sustentar la actividad nitrogenasa en extractos de heterocistos permitieron

establecer la participación de las enzimas iniciales de la vía de las pentosas

fosfato o de la vía glicolítica (Embden-Meyerhof-Parnas) como las fuentes de

poder reductor para la conversión de N2 a amonio y el consumo del O2 para la

respiración (Fig. 15), (Summers y col., 1995).

Aproximadamente, la mitad del poder reductor generado por la fotosíntesis

en un filamento se emplea para abastecer los requerimientos del proceso de

diferenciación, respiración y fijación de nitrógeno en los heterocistos del mismo

(Wolk, 1996). Así, el poder reductor utilizado por los heterocistos, es generado en

las células vegetativas vecinas. Además, la tasa respiratoria en estas células es

más elevada que en las células vegetativas para poder mantener bajas presiones

de O2 (Wolk, 1996).

Como contrapartida, los heterocistos abastecen a las células vecinas

(vegetativas) con aminoácidos sintetizados durante el proceso de la fijación de

nitrógeno (Golden y Yoon, 2003). La glutamina sería el principal metabolito

involucrado en la exportación del N fijado desde el heterocisto y a pesar de que el

mecanismo de transferencia aún no se conoce en detalle, se han propuesto dos

mecanismos de transporte entre el heterocisto y las células vegetativas. En uno

de estos mecanismos se propone que los aminoácidos serían exportados hacia el


41

espacio periplásmico -que es continuo a lo largo del filamento- y una vez allí

serían incorporados por las células vegetativas a través de permeasas específicas

(Herrero y col., 2004). El otro mecanismo propone que las conexiones o poros

que comunican células adyacentes (microplasmodesmata), representarían la ruta

de transporte de metabolitos entre células contiguas (Wolk, 1996).

Según este último mecanismo, los gases y especialmente el O2, se verían

imposibilitados de difundir hacia el interior del heterocisto debido a que la

permeabilidad del poro para su difusión sería menor que la de la pared (Fay,

1992). Además, estas conexiones estarían formadas por membranas conteniendo

oxidasas que reducirían el nivel interno de oxígeno. Lamentablemente aún no se

dispone de resultados experimentales que apoyen esta hipótesis (Wolk, 1996).

También existe una distribución funcional de algunas enzimas para la

fijación de N entre las células vegetativas y los heterocistos. Por ejemplo, la

glutamina sintetasa (GS) se encuentra presente en ambos tipos de células, pero

el complejo GOGAT es casi indetectable en los heterocistos. La enzima isocitrato

deshidrogenasa también se expresaría en ambos tipos celulares pero sólo se

encontraría activa en los heterocistos (Meeks y Elhai, 2002).

3.3 Protección del complejo nitrogenasa del O2

Al igual que las nitrogenasas de otras bacterias estudiadas, las

nitrogenasas de las cianobacterias son inactivadas de forma irreversible en

presencia de O2. Debido a esto, los organismos fijadores de nitrógeno han

desarrollado distintos mecanismos para evitar la inactivación del complejo

enzimático (Fay, 1992; Soto-Urzúa y Baca, 2001).

Dentro de dichos mecanismos se ha observado la disminución de la

difusión del O2 mediante la secreción de mucopolisacáridos (slime) en la pared

celular y la disminución de la pO2 intracelular a través del aumento de la tasa

respiratoria. También existen otras estrategias como la inactivación del complejo

enzimático por cambios conformacionales cuando la pO2 intracelular es alta, o el


42

consumo de O2 intracelular mediante la actividad hidrogenasa del complejo

nitrogenasa (Fay, 1992).

Asimismo, las especies reactivas del oxígeno como el radical superóxido

(O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH.), producidas en la

respiración y la fotosíntesis oxigénica, son eliminadas por las enzimas superóxido

dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa (Fay, 1992).

3.4 Diferenciación del heterocisto

La cianobacteria filamentosa Anabaena PCC 7120 - antes conocida como

Nostoc PCC 7120- se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de la

diferenciación de los heterocistos así como de los patrones de diferenciación

celular y la fijación de nitrógeno de las cianobacterias en general (Kaneko y col.,

2001).

Se han desarrollado protocolos de manipulación genética y métodos de

conjugación de alta eficiencia para este organismo y actualmente se cuenta con la

secuencia completa de su genoma. Esta fue obtenida empleando la técnica de

shotgun y consta de 7.211789 pb distribuidas en un cromosoma de 6.413 771 pb

y seis plásmidos denominados como pCC7120 y . Mediante

cálculos computacionales se han identificado 6228 genes potenciales (que

eventualmente deberían codificar para proteínas), de los cuales 5368 se

encontrarían en el cromosoma (Kaneko y col., 2001).

3.4.1 Señales necesarias para la inducción de la diferenciación

¿Qué induce a una célula determinada a desviarse del ciclo celular normal

y diferenciarse? El programa de desarrollo de los heterocistos se enciende en

respuesta a la señal externa de agotamiento o falta de una fuente de nitrógeno

combinado en el medio (Golden y Yoon, 2003), mientras que es inhibido

fuertemente en presencia de amonio.


43

Otro requerimiento para formación del heterocisto sería la multicelularidad,

esto se determinó en experimentos donde se realizaron ablaciones celulares,

evitándose así el desarrollo de heterocistos en el filamento (Cai y Wolk, 1997).

3.4.2 Estadios de desarrollo

El primer estadío en el

proceso de diferenciación dura

aproximadamente 10 horas

(dependiendo de la cepa y las

condiciones) y culmina con la

formación del proheterocisto (Fig.

16) (El-Shehawy y Kleiner, 2003).

Estos pueden distinguirse

mediante el microscopio óptico

como células menos granuladas

que las vegetativas, pero aún sin

la presencia de la pared celular

engrosada (El-Shehawy y Kleiner,

2003)

Es durante este estadío que comienza la degradación específica de

algunas proteínas. Esto conlleva la pérdida de varias funciones, como la actividad

del fotosistema II, así como la supresión y destrucción de partes de la maquinaria

de fijación de CO2 (El-Shehawy y Kleiner, 2003). A pesar de que la formación del

proheterocisto involucra cambios celulares profundos, es un proceso reversible:

luego de agregar nitrógeno combinado (nitrato u amonio) al medio, el

proheterocisto revierte hacia la forma de célula vegetativa (El-Shehawy y Kleiner,

2003).

El segundo estadío consiste en la transformación del proheterocisto en un

heterocisto maduro (Fig. 16). La pared celular se engrosa, en ésta se sintetizan y

acumulan glicolípidos y polisacáridos específicos que reducen la difusión del O2 y

Figura16. Eventos morfológicos característicos durante la

formación del heterocisto. Adaptado de El-Shehawy y

Kleiner., 2003


44

Figura 17. Modelo hipotético de la activación secuencial en la expresión de genes durante el desarrollo de un heterocisto. Las flechas negras representan la expresión del gen desde la transcripción hasta la proteína madura correspondiente. Las flechas rojas continuas indican la activación transcripcional de distintos genes promovida directamente por la proteína NtcA. Las flechas discontinuas indican la acción positiva que ejerce NtcA (rojo) y HetR (azul) en la expresión de dichos genes. La progresión temporal de los cambios morfológicos (célula vegetativa, proheterocisto, heterocisto maduro) es aproximada. Adaptado de Herrero A. et al, 2004.

se produce además el rearreglo genómico que lleva a la expresión funcional de la

nitrogenasa y otras enzimas (El-Shehawy y Kleiner, 2003). Se ha sugerido que el

establecimiento de una barrera de difusión para el O2 en el heterocisto podría

constituir un punto de control (checkpoint) durante el desarrollo y que una vez

superado éste se dispararía el proceso de maduración (Herrero y col., 2004).

3.4.3 Eventos moleculares involucrados en el programa de diferenciación

Durante un período de deficiencia de N en el medio, las reservas celulares

de este elemento se agotan rápidamente elevando el cociente carbono / nitrógeno

(C/N) desde el valor usual de 4,1 hasta 8,1. Sin embargo, la diferenciación del

heterocisto se inicia aparentemente cuando dicho cociente supera el valor de 6,1

(Fay, 1992).

La deficiencia de N combinado incrementa rápidamente el nivel de 2-OG

intracelular hasta una concentración límite. Esta molécula se une y activa la

proteína NtcA que actúa como factor de control de la transcripción. Luego, el

efecto de señalización del 2-OG puede ser amplificado a través del proceso de

autorregulación positivo de NtcA (Li y col., 2003).

+

2-OG


45

Como resultado de este loop regulatorio, los niveles de transcripción del

gen ntcA alcanzan el nivel máximo, permitiendo que esta proteína actúe sobre sus

promotores blanco (Fig.17) (Li y col., 2003).

NtcA es una proteína reguladora que se une a secuencias de ADN

específicas corriente arriba de muchos promotores regulados por N y

generalmente potencia su transcripción. Dentro de los genes que induce NtcA se

encuentra el de la proteína HetR, aunque probablemente esta inducción se

efectúe mediante una proteína tipo histona denominada HanA (El-Shehawy y

Kleiner, 2003).

hetR es considerado como un gen maestro en el desarrollo del heterocisto

y el producto de su expresión, la proteína HetR, es la señal positiva que activa de

manera aún desconocida a una gran cantidad de genes. Existe además un

regulador negativo, PatS, el cual difunde desde el heterocisto en desarrollo y

previene que las células vecinas se diferencien. Utilizando fusiones con el gen

que codifica para la GFP (green fluorescent protein) y monitoreando la

diferenciación celular in vivo, Zhang y colaboradores (Li y col., 2003) demostraron

que las células más viejas son más propensas a diferenciarse cuando se retira el

N del medio (Armitage y col., 2005).

Además, el hecho de que el mutante hetR de Anabaena sp. PCC7120,

incapaz de desarrollar heterocistos también incremente la concentración

intracelular de Ca2+ en condiciones de privación de N, sugiere que éste sería un

evento previo a la inducción de la expresión de hetR (Torrecilla y col., 2004).

Las cianobacterias formadoras de heterocistos poseen diferencias

fundamentales en la organización de los genes nif con respecto a aquellas que

son incapaces de desarrollar este tipo de células (Kallas y col., 1985). En el caso

de Anabaena PCC7120, se produce el rearreglo de tres genes: nifD que codifica

para la subunidad de la nitrogenasa, fdxN que codifica para una ferredoxina

bacteriana y hupL que codifica para la subunidad mayor de una hidrogenasa

(Adams y Duggan, 1999; Meeks y Elhai, 2002).


46

Al igual que en otros procesos de diferenciación celular, los rearreglos

genómicos determinan de forma irreversible el ordenamiento de genes que tendrá

finalmente la célula diferenciada. Una vez culminado este proceso, el filamento

consta de dos tipos de células distintos e interdependientes.

3.5 Genes expresados durante la diferenciación

Si bien los genes más relevantes durante la diferenciación del heterocisto

son hetR, ntcA y patS,, también se han estudiado otros genes que participan en

este proceso. Como la información que se dispone acerca de la implicancia y

relevancia de dichos genes durante el desarrollo es parcial, considero que el

mejor criterio para ordenarlos será el alfabético.

hanA

El gen hanA codifica para una proteína con similitud a la histona HU y

también es necesario para que se inicie la diferenciación. Los genes ntcA y hanA

no se expresan exclusivamente en los heterocistos y por esta razón se presume

que no son responsables directos de la formación del patrón de diferenciación de

heterocistos en el filamento (Khudyakov y Golden, 2004).

hepA

El producto de este gen es una proteína del sistema de transporte del tipo

ABC, esencial para la síntesis de polisacáridos de la envoltura. Este gen es

controlado por HepK (una presuntiva tirosín quinasa), HepC (una proteína con

similitud a una galactosil PP-undecaprenol sintasa) y dos proteínas de unión al

ADN poco frecuentes (Zhou y Wolk, 2000).

hepK

En Anabaena PCC7120 la proteína HepK tiene similitud con las histidín

quinasas de algunos sistemas sensor-regulador de dos componentes. Junto con

la proteína DevR, formarían dicho sistema regulador y participarían en la

señalización que dispara la síntesis de polisacáridos de la envoltura del

heterocisto (Zhou y Wolk, 2000).


47

hetR

HetR es un regulador clave en el desarrollo del heterocisto, mutantes hetR

en Anabaena PCC7120 son incapaces de producir heterocistos, mientras que la

sobre-expresión del gen en trans -empleando un plásmido con copias extra de

hetR- provoca el fenotipo de heterocistos contiguos múltiples (Mch) (Golden y

Yoon, 2003).

La inducción de hetR comienza luego de la remoción del N en el medio y al

cabo de 2 a 3,5 horas su transcripción aumenta considerablemente en ciertas

células que son en realidad heterocistos en desarrollo (Adams y Duggan, 1999).

Esta proteína es una serín proteasa inusual ya que requeriría del ion Ca2+ in vivo,

es modificada pos-traduccionalmente, se escinde a sí misma y cuando forma un

homodímero presenta motivos de unión al ADN (Huang y col., 2004; Zhang y col.,

2006 ).

La proteína HetR seria modificada por fosforilación y esto a su vez sería la

señal para evitar su autodegradación (El-Shehawy y Kleiner , 2003). Dos residuos

serina, Ser-152 y Ser-179, son necesarios para la autoproteólisis y la

diferenciación, siendo la Ser 152 el residuo del sitio activo de esta proteasa (Dong

y col., 2000).

Recientemente se demostró que los homodímeros de HetR se unen a

fragmentos de ADN conteniendo regiones de los promotores de hetR, patS y

hepA (Khudyakov y Golden, 2004). La actividad de HetR es inhibida por el

pentapéptido RGSGR, presente en el extremo C terminal de PatS. Este

pentapéptido inhibe la unión de HetR al ADN y previene la autorregulación

positiva de este gen (Huang y col., 2004). Aunque su rol bioquímico durante el

desarrollo aún es desconocido, HetR posiblemente actuaría degradando

represores de genes que deben ser encendidos y activadores de genes que

deben ser apagados (Adams y Duggan, 1999).

Ambos genes ntcA y hetR son autorregulados positivamente y el loop

regulador que conforman es central en el desarrollo de los heterocistos. Si bien

NtcA es responsable de la regulación de otras actividades celulares aparte del


48

desarrollo del heterocisto, no sucede lo mismo con HetR. La expresión se HetR es

necesaria y quizás suficiente para la formación del heterocisto. Además de ntcA

se requieren otros genes como hetF y patA para aumentar la transcripción de

hetR (Zhang y col., 2006).

hetF

El gen hetF de N. punctiforme se requiere para la expresión localizada de

HetR y para disparar el inicio del desarrollo del heterocisto en la célula vegetativa.

Este gen ha sido identificado sólo en cianobacterias formadoras de heterocistos,

por lo que se ha propuesto que la proteína HetF restringiría de algún modo la

expresión y la acumulación de hetR en los heterocistos en diferenciación (Golden

y Yoon, 2003). La proteína HetF aparentemente integra una familia única de

proteasas con dominios caspasa-hemoglobinasa (caspase-hemoglobinase fold-

domain protease) (Khudyakov y Wolk, 2004).

hetC y hetL

Se han identificado otros genes como hetC, que se expresa en pro-

heterocistos y heterocistos y codifica para una proteína similar a los exportadores

bacterianos del tipo ABC. La sobre-expresión del gen hetL estimula la formación

de heterocistos y se demostró que esta proteína interviene en etapas tempranas

del desarrollo del mismo (Golden y Yoon, 2003).

hetN

El producto del gen hetN exhibe un porcentaje alto de similitud con las

ceto-acil reductasas. Cuando Anabaena PCC 7120 es cultivada en presencia de

N combinado en el medio, la proteína HetN se encuentra presente en todas las

células vegetativas de filamento, mientras que luego de la remoción de éste, la

proteína sólo puede detectarse en los heterocistos maduros (Khudyakov y

Golden, 2004).

ntcA

NtcA es un factor de transcripción perteneciente a la familia de los

receptores de AMP cíclico (AMPc), muy conservado entre las cianobacterias. En

Anabaena PCC7120, ntcA es necesario en los estadíos tempranos del desarrollo


49

y también para la completa activación de los genes involucrados en el

metabolismo del nitrógeno, así como en la regulación de varios otros genes. Por

ejemplo, NtcA se une al promotor de un operón (devBCA) que codifica para un

transportador del tipo ABC esencial para la maduración del heterocisto, siendo

necesario para su transcripción (Golden y Yoon, 2003). También existen

evidencias de que esta proteína sería el principal sensor de los niveles de 2-OG

durante la iniciación del heterocisto.

patA

La secuencia proteica de PatA indica que actúa como regulador de

respuesta a los cambios en el medio y que forma parte de un sistema de dos

componentes. PatA contiene un residuo Asp conservado el cual podría ser

fosforilado por una histidin quinasa, aunque no se ha identificado un gen que

codifique para un posible sensor quinasa en las cercanías del mismo. Los

reguladores de respuesta de la clase de PatA poseen una de tres funciones:

pueden fosforilar otras proteínas, pueden unirse al ADN y activar la transcripción

de los genes cuyo promotor fue reconocido o pueden causar la rotación de un

motor flagelar (Buikema y Haselkorn, 2000).

Se ha demostrado que el producto del gen patA afecta la actividad de HetR

a nivel post transcripcional, probablemente por interacciones proteína-proteína.

PatA podría interactuar directamente con HetR previniendo la autoproteólisis o

promoviendo la inhibición de unión al ADN mediada por PatS (Zhang y col., 2006).

patB

La proteína PatB presenta dominios con homología a la ferredoxina

(ferredoxin-like domains) en su extremo amino terminal y un dominio de unión al

ADN en su extremo carboxi terminal. Esto sugiere que dicha proteína podría

actuar como factor de transcripción y que además su actividad estaría modulada

por el estado redox de la célula. La expresión de patB se induce 12 horas

después de la remoción del N combinado en el medio y está confinada a los

heterocistos. Por otra parte, las mutaciones en patB resultan en la diferenciación

retardada de los heterocistos y poco o nada de crecimiento diazotrofo (Khudyakov

y Golden, 2004).


50

patS

patS codifica para un pequeño péptido que controla el patrón de desarrollo de los

heterocistos a lo largo del filamento. La señal difusible PatS es producida por las

células en diferenciación e inhibe este proceso en las células vecinas. El receptor

de PatS se localizaría en el citoplasma de las células vegetativas, lo cual es

consistente con la inhibición directa que ejerce sobre la función de HetR. (Wu y

col., 2004).

Cuando se anula este gen del organismo y se retira el N del medio, resulta

un patrón aberrante con fenotipo Mch (Khudyakov y Golden, 2004). El inhibidor

PatS y el activador HetR podrían satisfacer los requerimientos primarios del

modelo de regulación del patrón de desarrollo por inhibición lateral (Wu y col.,

2004). Los genes patS y hetN poseen funciones distintas pero complementarias

en la determinación y mantenimiento del patrón de desarrollo de los heterocistos

en el filamento (Khudyakov y Golden, 2004).

Otros genes pat

Otros dos genes, patN y patU han sido recientemente descritos en la

formación del patrón unidimensional de desarrollo en N. punctiforme. Se

encontraron genes ortólogos en Anabaena PCC7120, pero las proteínas no

muestran similitud con otras descritas hasta el momento (Khudyakov y Golden,

2004).

Capítulo 4: Metabolismo del N en cianobacterias

51

Capítulo 4

Metabolismo del N en cianobacterias

Las cianobacterias participan activamente en el ciclo biogeoquímico del N,

incorporándolo a la biosfera. Son capaces de asimilar este elemento del ambiente

en distintas formas químicas, por ejemplo, cuando se encuentra formando

compuestos inorgánicos como nitrato y amonio o en moléculas orgánicas

pequeñas como urea o aminoácidos o aún en su forma biatómica.

4.1 Rutas de asimilación de N

Debido a que la concentración de compuestos que contienen N es

generalmente muy baja en el ambiente (menos de 1uM), la incorporación de los

mismos a las células se efectúa mediante transportadores activos de alta afinidad

localizados en la membrana citoplasmática (Flores y Herrero, 2005).

Como ocurre con todas las bacterias, la fuente de N preferida por estos

organismos es el amonio, aunque también son capaces de asimilar otras

moléculas pequeñas como nitrito, nitrato y urea (Fig.18). Asimismo, se han

descrito otras cepas capaces de asimilar algunos aminoácidos, particularmente

arginina, glutamina, etc. Muchas cianobacterias también son capaces de reducir

el N2 gaseoso, a través del proceso de FBN.


52

A continuación se describen más detalladamente los genes principales que

participan en las vías de incorporación de los distintos compuestos nitrogenados.

4.1.1 Asimilación de nitrato y nitrito

La incorporación de nitrato o nitrito a las células se efectúa mediante una

permeasa codificada por los genes ntrA, ntrB, ntrC y ntrD en Synechococcus

PCC7942 y en Anabaena PCC7120. Estos genes se agrupan con los genes

estructurales de la enzima nitrito reductasa nirA y nitrato reductasa narB. Juntos

constituyen el operón nir, de estructura: nirA-ntrABCD-narB que es fuertemente

expresado sólo cuando hay nitrito o nitrato pero no amonio en el medio (Herrero y

col., 2001).

Estas permeasas del tipo ABC (tipo primario) utilizan ATP para incorporar

sus sustratos y así concentrarlos en el interior de la célula. Se han reportado

transportadores del tipo ABC (ATP binding cassette) para la asimilación de

nitrato/nitrito, urea y en el transporte de arginina y glutamina en distintas

cianobacterias. Sin embargo, en algunas cepas también se ha descrito la

incorporación de nitrato/nitrito a través de permeasas del tipo secundarias (Flores

y Herrero, 2005).

En cianobacterias marinas como Synechoccocus PCC7002 y

Trichodesmium WH9601 la incorporación de nitrito se efectúa a través de un

transportador secundario perteneciente a la superfamilia de facilitadores

principales, codificado por un gen conocido con dos nombres, a saber ntrP o napA

(Wang y col., 2000). Una vez internalizado el nitrato, el mismo es reducido a

amonio en dos reacciones secuenciales catalizadas por las enzimas ferredoxina

nitrato reductasa y ferredoxina nitrito reductasa.

El mecanismo de incorporación de nitrato, en general, parece estar

regulado por algún sistema que integra los metabolismos de biosíntesis de

aminoácidos a través de la fotosíntesis y la asimilación de C. Los transportadores

de nitrito/nitrato de varias cianobacterias requieren que las células fijen CO2 para

funcionar correctamente y se encuentran sujetos a una rápida inhibición reversible


53

por amonio, el cual debe además debe estar siendo metabolizado por la enzima

GS para que este efecto inhibidor tenga lugar (Herrero y col., 2001).

4.1.2 Fijación de nitrógeno

Los genes necesarios para la fijación de nitrógeno han sido caracterizados

en detalle en dos tipos de organismos formadores de heterocistos: Anabaena

PCC7120, Anabaena variabilis ATCC29413 y en la cianobacteria unicelular

Synechococcus RF-1 (Herrero y col., 2001).

La nomenclatura de los genes nif es la misma que en las otras bacterias,

identificándose quince genes directamente responsables o relacionados con la

fijación de nitrógeno, incluyendo los estructurales nifHDK. Estos se agrupan del

modo siguiente: nifB-fdxN-nifS-nifU-nifH-nifD-nifK-nifE-nifN-nifX-orf2-nifW-hesA-

hesB-fdxH. Además, en este grupo pudieron identificarse al menos seis unidades

transcripcionales (Herrero y col., 2001).

Los genes nif, junto a otros relacionados con la fijación de nitrógeno no se

expresan en presencia de N combinado en el medio. La regulación de estos

genes puede ser muy compleja, ya que en algunas cianobacterias parece estar

sujeta a los ritmos circadianos (Misra y Tuli, 2000) y en las especies formadoras

de heterocistos, la fijación de nitrógeno estaría confinada a éstos.

4.1.3 Asimilación de urea y degradación de cianato

La urea representa una fuente de N importante para las cianobacterias en

su ambiente natural. En Anabaena PCC7120 se ha caracterizado un

transportador activo primario del tipo ABC codificado por cinco genes, con alta

afinidad por la urea y reprimible por amonio (Herrero y col., 2001). En general, las

cianobacterias poseen ureasas algunas expresadas constitutivamente y otras

reprimibles por amonio. También se ha identificado una ureasa cuyos genes

estructurales se denominan ureA, ureB, y ureC (Herrero y col., 2001).


54

Una vez en la célula, la urea es degradada a amonio y anhídrido carbónico

mediante una reacción catalizada por una ureasa dependiente del ión Ni+2 (Flores

y Herrero, 2005).

Del mismo modo, se han detectado niveles altos de la enzima cianasa en

dos cepas de Synechococcus, además de identificarse el gen cynS que

codificaría para esta enzima. La cianasa cataliza la descomposición del cianato en

anhídrido carbónico y amonio. La actividad de esta enzima, junto con la expresión

del gen cynS y sus genes relacionados, son reprimidos en presencia de amonio

(Herrero y col., 2001).

4.1.4 Incorporación de amonio

Como se mencionó anteriormente, el amonio es la fuente de N preferencial

de las cianobacterias. Aunque es sabido que el amoníaco (NH3) es capaz de

atravesar las membranas biológicas, a pH ácido (pH de muchos hábitats como

suelos y aguas) este compuesto se encuentra en la forma ionizada como amonio

(NH4+).

Esta molécula cargada positivamente es incapaz de difundir al interior

celular, además debemos tener presente el hecho de que las concentraciones de

amonio en el ambiente son muy bajas. Por estas razones, las células necesitan

de transportadores para ingresar el amonio, especialmente cuando su

concentración en el ambiente es inferior a 1uM.

Se han identificado transportadores secundarios pertenecientes a la familia

Amt (Flores y Herrero, 2005). Estas permeasas han sido identificadas en ensayos

bioquímicos de incorporación y acumulación del análogo no metabolizable 14C

metilamonio por la cianobacteria unicelular Synechocystis PCC6803 (Montesinos

y col., 1998)

Estudios análogos en Anabaena variabilis ATCC29413 sugieren que las

permeasas Amt de los heterocistos funcionan para la retención cíclica del


55

amoníaco producido por la nitrogenasa (El-Shehway , 1999) . También les

atribuye la función de sensar la concentración de amonio en el medio.

4.1.5 Incorporación de aminoácidos

La cantidad de información existente acerca del transporte de aminoácidos

en cianobacterias formadoras de heterocistos es escasa. Se ha sugerido que en

Anabaena PCC7120 algunas permeasas serían las responsables del pasaje

intercelular de metabolitos en el filamento. La caracterización fisiológica de

mutantes espontáneos en el transporte de aminoácidos en éste organismo ha

permitido determinar que expresa al menos cinco permeasas de aminoácidos

distintas. Aparentemente se expresarían dos transportadores activos específicos

para

aminoácidos neutros, un transportador activo de alta afinidad para aminoácidos

básicos, un sistema pasivo de baja afinidad para aminoácidos básicos y un

transportador para aminoácidos ácidos (Herrero y Flores, 1990).

Figura 18. Principales rutas de asimilación de N en las cianobacterias. Las fuentes de N combinado son incorporadas mediante permeasas específicas y metabolizadas a amonio, el cual se incorpora a los esqueletos carbonados a través de la vía GS-GOGAT. El N luego es distribuido en forma de glutamina o glutamato a otros compuestos orgánicos. Nrt: transportador de nitrito/nitrato del tipo ABC. Urt: transportador de urea del tipo ABC. Amt: permeasa de amonio. Nar: nitrato reductasa. Nir: nitrito reductasa. NifHDK: complejo nitrogenasa. FdxH: ferredoxina específica de heterocisto. PEP carboxilasa: fosffoenolpiruvato carboxilasa.2-OG:2-oxoglutarato. GS: glutamina sintetasa. GOGAT: glutamato sintasa. Adaptado de: Flores y Herrero, 2005.


56

La permeasa N-I transporta una variedad de aminoácidos neutros polares e

hidrofóbicos y se encuentra codificada por los genes nat. Esta permeasa

representa casi la única vía de asimilación de Pro y sería la vía de asimilación

principal de Gly, Phe Leu ( y probablemente de Ile y Val) y una vía importante de

asimilación de Thr, Ala y Ser en Anabaena sp. (Picossi y col., 5). Los genes nat

serían expresados diferencialmente en las células vegetativas y en los

heterocistos. En las células no diferenciadas la expresión de este operón sería

constitutiva y en los heterocistos el operón estaría reprimido (Picossi y col., 2004).

Estos resultados son concordantes con el mecanismo propuesto para el

transporte de aminoácidos entre el heterocisto y las células vegetativas contiguas.

A través del mismo se produciría la transferencia de ciertos aminoácidos desde el

heterocisto al espacio periplásmico. Luego estos aminoácidos difundirían (quizás

unidos a proteínas transportadoras) hasta ser incorporados por permeasas de

células vegetativas adyacentes (Montesinos y col., 1995; Armitage y col., 2004).

Todos los sistemas de transporte descritos anteriormente, junto con la

batería de enzimas que acompaña a cada uno, finalmente asegura que cualquier

fuente de N incorporada para el crecimiento del organismo sea transformada en

amonio intracelular, el cual a su vez es inmediatamente incorporado para la

síntesis de aminoácidos por la vía de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa

(GS-GOGAT).

4.2 Regulación del metabolismo nitrogenado

La regulación o control de los niveles de N puede describirse como la

represión de una vía de asimilación de determinada fuente de nitrógeno, cuando

se encuentra disponible otra más fácilmente asimilable para la célula. Por

ejemplo, cuando una suspensión de cianobacterias es incubada a una

concentración de amonio limitante pero con una fuente de carbono adecuada,

estos organismos determinan la relación C/N como alta y comienzan expresar

genes para la asimilación de fuentes alternativas de N y para el transporte activo

de amonio de modo de reestablecer la relación.


57

4.2.1 Regulación transcripcional

La activación de la expresión del conjunto de genes que participan en la

regulación del nitrógeno requiere un factor transcripcional perteneciente a la

familia de los CAP (proteína receptora de AMP cíclico o activador por catabolito) y

que en el caso de las cianobacterias, se ha denominado NtcA. Estudios de

difracción de rayos X, junto con el estudio de modelado computacional de la

proteína a nivel teórico (realizado a partir de la estructura de CAP), confirman la

similitud de NtcA con el factor CAP y la presencia de un motivo de unión al ADN

hélice vuelta-hélice en su extremo C terminal (Flores y Herrero, 2005 ).

El sitio de unión de NtcA al ADN se encuentra 22 nucleótidos corriente

arriba de la secuencia ubicada en la posición –10 del promotor, siendo esta

estructura muy similar a la de los promotores clase II de bacterias. A pesar de que

el mecanismo preciso de la modulación de NtcA aún no es conocido, se han

identificado metabolitos tales como el 2-OG y la proteína PII (codificada por el gen

glnB) capaces de influenciar la actividad de esta proteína (Flores y Herrero, 2005).

Empleando la técnica de geles de retardo se pudo demostrar que el 2-OG

incrementa la afinidad de unión de NtcA al promotor de glnA (gen estructural de

GS) de Synechococcus PCC7942. Esto permitió sugerir que el 2-OG actuaría

como regulador alostérico positivo del factor transcripcional NtcA (Vázquez-

Bermúdez y col., 2002).

El papel que juega la proteína transductora de señales del tipo PII en la

regulación del N o en la modulación de NtcA es menos claro. Se ha propuesto

que PII no sería estrictamente necesario en la regulación a nivel transcripcional

(Arcondéguy y col., 2001; Herrero y col., 2001) pero indirectamente tendría un

efecto modulador sobre NtcA a través de su unión al 2-OG ( Laurent y col., 2004;

Flores y Herrero 2005)


58

4.2.2 Regulación postraduccional

La mayoría de los genes que codifican para permeasas o enzimas

involucradas en la asimilación de compuestos nitrogenados son reprimidos por

amonio en las cianobacterias. El control transcripcional es el principal mecanismo

de regulación de la asimilación de nitrógeno en estos organismos, aunque

también se han descrito algunos casos de regulación postraduccional (Herrero y

col., 2001).

Algunos ejemplos de esta inactivación post traduccional son: la inactivación

de la nitrogenasa reductasa por palmitiolación (en Gleothece ATCC27152), la

inhibición a corto plazo por amonio, de la incorporación de nitrato o la inactivación

reversible de la glutamina sintetasa por unión no covalente de un compuesto

fosforilado, probablemente PII (Herrero y col., 2001).

La Fe proteína del complejo nitrogenasa puede ser modificada a una forma

inactiva in vitro al ser incubada en condiciones de pO2 altas y oscuridad o en

presencia de amonio. Recientemente se ha sugerido este tipo de modificación

podría operar a través de la palmitoilación de la proteína en la cianobacteria

unicelular Gloeothece sp. ATCC 27152 (Herrero y col., 2001).

La presencia de amonio en el medio de cultivo también provoca la

inactivación de la glutamina sintetasa en Synechocystis sp. PCC 6803. Dicha

actividad es recuperada paulatinamente, en respuesta al decremento del amonio

en el medio. Experimentos realizados in vitro con esta proteína sugieren que la

inactivación podría deberse a una modificación de la misma debida a la unión no

covalente de algún compuesto fosforilado (Herrero y col., 2001).

Se ha sugerido que la proteína PII sería el compuesto responsable de la

inhibición de la asimilación de amonio y nitrito, en Synechoccocus PCC7942. El

mecanismo que explicaría la inhibición propone que existen distintas formas

fosforiladas de la proteína PII, siendo este nivel de fosforilacion dependiente de la

relacion C/N (Herrero y col., 2001).


59

De este modo, PII se encontraría completamente defosforilada en presencia

de amonio en el medio y se fosforilaría en distintos grados, en presencia de nitrato

o en ausencia de cualquier fuente nitrogenada. El grado de fosforilación de la

proteína también sería dependiente de la concentración de CO2. En resumen, de

acuerdo al mecanismo propuesto, PII defosforilada inhibiría el transporte de nitrato

(Herrero y col., 2001).

Como en E. coli, en Synechoccocus la proteína PII puede unir como

ligandos las moléculas de ATP y 2-oxoglutarato de forma cooperativa. Se

presume que en Synechoccocus estos dos ligandos unidos a PII serían sustrato

de una quinasa dependiente de ATP. En cambio, la proteína fosforilada pero sin el

ligando 2 -oxoglutarato sería sustrato para una fosfatasa (Herrero y col., 2001).

También se ha propuesto otro sistema de inactivación en el cual se

produciría la unión a la proteína de uno o dos factores de transcripcion (IF7 e

IF17), que serían inducidos rápidamente luego de agregar amonio a células de

Synechocystis (Herrero y col., 2001).

Conclusiones

60

Conclusiones

Las cianobacterias son organismos procariotas muy antiguos que han

evolucionado junto a los cambios químicos que sufrieron los océanos y la

atmósfera a través de la historia. Se ha propuesto que fueron responsables de

oxigenar la atmósfera, (como consecuencia de la fotosíntesis oxigénica que llevan

a cabo) en un período comprendido entre 2200 y 2400 millones de años atrás.

También se ha propuesto que las cianobacterias habrían sido los organismos

precursores de los cloroplastos, en un evento endocítico temprano en la

evolución.

Aunque presentan diámetros celulares que van desde 0,5m hasta 200

m, el tamaño celular es, en general, superior al del resto de las bacterias. Esta

característica permite observar fácilmente su morfología con un microscopio

óptico. El citoplasma suele presentar carboxisomas, vesículas de gas, gránulos de

poli -hidroxibutirato y de cianoficina. Los tilacoides no se encuentran contenidos

en cloroplastos, sino que se organizan en un sistema de membranas profusas que

se distribuyen en el citoplasma. Los tilacoides contienen el aparato molecular de

la fotosíntesis y se forman por invaginación de la membrana plasmática, con la

que suelen conservar comunicación.

Poseen un solo tipo de pigmento fotosintético, clorofila a, aunque también

poseen pigmentos accesorios de la fotosíntesis, denominados ficobilinas o

ficobiliproteínas. Las ficocianina, una clase de ficobilproteína (azul), junto con la

clorofila, (verde) dan el color verde azul característico de estos organismos. Las

ficobiliproteínas se organizan en un nivel estructural superior denominado

ficobilisoma.

La envoltura celular es del tipo Gram-negativa, compuesta por una

membrana plasmática y una membrana externa, situándose entre ambas una

http://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_plasm%C3%A1tica

Conclusiones

61

pared de mureína (peptidoglucano). Además, en su capa más externa, secretan

una serie de exopolisacáridos que pueden dar origen a estructuras tipo vaina o a

capas mucilaginosas (más solubles) que envuelven colonias o filamentos móviles

o que en su defecto, pueden permanecer como exopolisacáridos secretados al

ambiente.

La diversidad morfológica de estos organismos es considerable: se han

descrito formas unicelulares cocoides (esferoidales), agregadas en una cápsula

mucilaginosa, o formando hileras simples de células contiguas, denominadas

tricomas. Se denomina filamento al tricoma rodeado de una vaina o capa

mucilaginosa. Los filamentos pueden aparecer agregados en haces, envueltos por

mucílago, o de una manera que aparenta ramificación. Existen además

cianobacterias que forman filamentos con ramificación verdadera. Este tipo de

organización contradice la idea de que los procariotas no se organizan en

estructuras pluricelulares.

Este grupo de organismos fue clasificado históricamente como algas verde

azules (Cianophyta). Luego del descubrimiento de su naturaleza procariota las

cianobacterias se encuentran sujetas a dos sistemas de clasificación: el del

Código Botánico del International Code of Botanical Nomenclature y por otro lado

el Código Bacteriológico del International Commitee on Systematic Bacteriology.

La sistemática de las cianobacterias es aún tema de discusión entre

Botánicos (Cianophyta, algas verde azules) y Bacteriólogos (Cianobacterias),

aunque la tendencia actual es intentar unificar estos criterios para lograr una

única clasificación consistente. Actualmente se sugiere que la evaluación

taxonómica moderna de este grupo de organismos se debería realizar a través de

un abordaje polifásico, empleando métodos de caracterización fenotípica,

ultraestructural, ecológica, bioquímica y molecular.

Dada su amplia distribución y su abundancia en distintos ambientes,

juegan un papel importante en la circulación de nutrientes, incorporando nitrógeno

a la biosfera. Las cianobacterias son en general organismos fotosintéticos, pero

algunos son heterótrofos o poseen un metabolismo mixto.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mure%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglucano

Conclusiones

62

Algunas cianobacterias participan en el proceso de Fijación Biológica de

Nitrógeno (FBN), siendo capaces de reducir el N2 gaseoso a amonio (NH4+), en

una reacción catalizada por el complejo nitrogenasa. Durante este singular

proceso metabólico, el organismo consume una cantidad importante de energía.

El complejo enzimático nitrogenasa, muy conservado a través de la evolución, se

encuentra codificado por los genes nif y es inhibido en presencia de O2. Por este

motivo, las cianobacterias han desarrollado distintas estrategias para proteger la

nitrogenasa del oxígeno. Algunas separan temporalmente la fijación de N2,

(esencialmente microaerofílica) de la fotosíntesis (proceso productor de O2).

Otras forman agregados de células en hileras, denominados tricomas y

generan un ambiente microaerobio en el centro de éste, donde se concentra el

complejo nitrogenasa y se produce la fijación de N. Esta estrategia también

permite que la fotosíntesis que se realice simultáneamente en células que se

encuentran en la zona más externa del tricoma.

Algunas cianobacterias filamentosas son capaces de diferenciar un

determinado porcentaje de sus células, ubicadas a intervalos regulares, en

heterocistos capaces de reducir el N2 atmosférico. Los heterocistos son células

vegetativas completamente diferenciadas (han perdido la capacidad de dividirse)

que mantienen un ambiente micro-óxico para el óptimo funcionamiento y

protección del complejo nitrogenasa. Luego que el programa de diferenciación se

inicia, se producen cambios importantes en la fisiología y bioquímica de la célula

vegetativa. Se sintetizan capas nuevas en la pared (capas laminada, homogénea

y fibrosa), lo que disminuye la difusión del O2 al interior celular y se produce el

desensamblaje de algunos componentes del fotosistema II, causando la pérdida

de la producción de O2 en la célula. Desde hace un tiempo se ha confirmado

además, la presencia de celulosa en la pared celular de algunas especies

filamentosas.

El programa de diferenciación celular de los heterocistos se enciende en

respuesta a la señal externa de agotamiento o falta de una fuente de nitrógeno

combinado en el medio, mientras que es inhibido fuertemente en presencia de

amonio. La molécula que señaliza el aumento de la relación C/N (déficit de N) en

las células es el 2-oxoglutarato (2-OG). En condiciones de déficit de N aumenta

Conclusiones

63

concentración celular de 2-OG hasta un valor máximo, uniéndose y activando la

proteína NtcA. Esta proteína es muy importante en la regulación del metabolismo

del N, ya que actúa como factor de transcripción de muchos promotores

regulados por N. NtcA induce el gen hetR, considerado un gen maestro en el

desarrollo del heterocisto. La proteína HetR es la señal positiva que activa de

manera aún desconocida varios genes involucrados en el proceso de

diferenciación de las células vegetativas a heterocistos. Existe además un

regulador negativo, PatS, el cual difunde desde el heterocisto en desarrollo y

previene que las células vecinas se diferencien.

Además, otro requerimiento para formación del heterocisto sería la

multicelularidad. Desde el punto de vista morfológico se pueden distinguir dos

estadíos de desarrollo, el de pro-heterocisto (aún reversible) y el de heterocisto

maduro (irreversible).

Una vez diferenciado el heterocisto, el poder reductor necesario para la

fijación de nitrógeno es suministrado por las células vegetativas vecinas y como

contrapartida, éstas son abastecidas con aminoácidos (glutamina) sintetizados

durante el proceso de la fijación de nitrógeno por el heterocisto. Se han propuesto

dos mecanismos para el transporte de la glutamina desde el heterocisto hacia las

células vegetativas: en uno el transporte se daría a través de los

microplamosdesmos ubicados entre el heterocisto y las células vegetativas

adyacentes y en el otro se propone la extrusión del aminoácido desde el

heterocisto al espacio periplásmico y la reicorporación del mismo por las células

vegetativas continuas, a través de permeasas específicas.

Cuando el N se encuentra presente en forma de compuestos asimilables

en el ambiente, las cianobacterias los incorporan a través de transportadores

activos de alta afinidad, localizados en la membrana citoplasmática. La fuente de

N preferida por estos organismos es el amonio, aunque también son capaces de

asimilar otras moléculas pequeñas como nitrito, nitrato y urea. Asimismo, se han

descrito otras cepas capaces de asimilar algunos aminoácidos, particularmente

arginina y glutamina. En estos organismos, la mayoría de los genes que codifican

para permeasas o enzimas involucradas en la asimilación de compuestos

nitrogenados son reprimidos por amonio. El control transcripcional es el principal

Conclusiones

64

mecanismo de regulación de la asimilación de nitrógeno en estos organismos,

aunque también se han descrito algunos casos de regulación postraduccional.

El estudio de las cianobacterias comprende una gran variedad de temas de

interés científico, que abarcan líneas de investigación básicas así como aplicadas.

Debido a su antigüedad, estos organismos contienen en su genoma información

muy valiosa, que ha sido empleada en el estudio y reconstrucción filogenética de

la vida. El conocimiento acerca del programa de diferenciación celular que se

ejecuta para formar un heterocisto ha avanzado significativamente en los últimos

años, pero aún no se han podido responder preguntas como la relación existente

entre el ciclo celular de las células vegetativas y el comienzo del desarrollo del

heterocisto. También quedan planteadas interrogantes acerca de la naturaleza de

las señales que operan entre las células de un filamento y los mecanismos de

transducción de señal que sensan y responden a esas señales.

Por otra parte, debido a su amplia distribución y a su diversidad metabólica,

integran una variedad de comunidades microbianas en las cuales cumplen

principalmente la función de productores primarios. Esta función además

contribuye de forma importante al balance entre CO2 y O2 en la atmósfera. Por

esto, también han sido objeto de estudios ecológicos. Finalmente, el estudio de

las poblaciones presentes en ambientes extremos ofrece la posibilidad de

descubrir enzimas o vías metabólicas con interés biotecnológico. Todo esto

convierte a las cianobacterias en un objeto de estudio que ofrece una cantidad

casi inabarcable de temas de investigación, este grupo singular de organismos

aún nos ofrece más interrogantes que respuestas.

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trabajo especial i : metabolismo del nitrógeno en ......udelar fac. de ciencias licenciatura en...

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