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EVALUACIÓN DE LOS CAMBIOS EN LA MARCACIÓN DE PROTEÍ NA FOS EN DOS PROTOCOLOS DE APRENDIZAJE ESPACIAL EN EL LABERI NTO

CIRCULAR DE BARNES

SANDRA CONSTANZA ORTEGA FERREIRA

Trabajo de grado presentado para optar al título de Magíster en Psicología con énfasis en la línea: Efectos del estrés sobre e l aprendizaje con el uso de

modelos experimentales

DIRIGIDO POR: MARISOL LAMPREA RODRÍGUEZ MSc., PhD.

CODIRECTORA: ANDREA MILENA GARCÍA BECERRA MSc., PhD.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Departamento de Psicología

Facultad de Ciencias Humanas Bogotá, 2010

ii

RESUMEN

El presente trabajo investigativo tuvo como objetivo determinar las diferencias en

los indicadores comportamentales de aprendizaje y memoria, así como en la

inmunoreactividad de la proteína Fos en secciones seriales del cerebro de ratas expuestas a

protocolos de ocho o dieciséis ensayos de adquisición de una tarea espacial en el laberinto

circular de Barnes. Para esto se utilizó un diseño factorial 3 X 2 con las variables

independientes Protocolo de entrenamiento (Entrenamiento, Sobre-entrenamiento y Sin

entrenamiento) y Prueba de aprendizaje (PCC y No PCC). Las variables dependientes

evaluadas fueron el número de células Fos positivas en cada una de las estructuras

cerebrales de interés y los indicadores comportamentales de aprendizaje (Latencia de

llegada al agujero meta, Distancia total recorrida, Errores de agujero y Errores ponderados).

Los sujetos experimentales fueron cuarenta y ocho ratas Wistar macho distribuidas

aleatoriamente entre los seis grupos (cuatro grupos experimentales y dos de control). Se

encontró que el entrenamiento genera una disminución paulatina y significativa en los

diferentes indicadores de aprendizaje y una activación diferencial de la amígdala, el séptum

y el área Ca1 del hipocampo, mientras que el sobre-entrenamiento genera estabilidad en el

comportamiento, mejora la ejecución e implica la activación diferencial de estructuras

como el hipocampo y el caudado-putamen. Estos hallazgos son consistentes con diversos

estudios que demuestran que el sobre-entrenamiento genera diferencias en la activación del

estriado y cambios comportamentales relacionados con la estabilidad, contrarrestando el

efecto deletéreo de diversos factores amnésicos como el estrés, tal como ha sido descrito

por el grupo de Neurofisiología Comportamental.

Palabras clave: Aprendizaje Espacial, Sobre-entrenamiento, Genes Inmediatos Tempranos,

Laberinto Circular de Barnes, Hipocampo, Caudado-putamen.

iii

ABSTRACT

The purpose of this research work was to determine the differences in behavioral

indicators of learning and memory, as well as Fos protein immunoreactivity in serial

sections of the brain of rats exposed to an eight or sixteen trials of learning protocol in a

Barnes circular maze spatial task. A 3 X 2 factorial design was used with Protocol Training

(Training, Over-training and no training) and learning test (PCC and no PCC) as

independent variables. The dependent variables evaluated were the number of Fos positive

cells in each of the brain structures of interest and behavioral indicators of learning

(latency, distance, errors and weighted errors). Forty-eight male Wistar rats were randomly

distributed among the six groups (four experimental groups and two control). It was found

that training creates a significant and steady decline in indicators of learning and

differential activation of the amygdala, the septum and hippocampus CA1 area, while over-

training leads to a stable behavior, improves performance and involves differential

activation in structures such as hippocampus and caudate-putamen. These findings are

consistent with several studies showing that overtraining causes differences in striatal

activation and behavioral changes related to stability, counteracting the deleterious effect of

several amnesic factors such as stress as described by Behavioural Neurophysiology group.

Keywords: Spatial Learning, Over-training, Immediate Early Genes, Barnes Circular Maze,

Hippocampus, Caudate-putamen.

iv

AGRADECIMIENTOS

Quisiera dedicar este trabajo de grado a mi familia, especialmente a mis padres,

hermano, esposo y abuelitos y a la familia Fernández Ferreira, por apoyarme de manera

incondicional y alentarme siempre en los momentos de mayor dificultad.

Agradezco enormemente la orientación y ayuda incansable de mi supervisora,

profesora Marisol Lamprea, quien durante el desarrollo de la maestría, fue mi mayor

soporte, tanto en el plano académico como profesional y personal. Agradezco también la

instrucción, colaboración y aliento siempre oportunos de mi co-directora de tesis, profesora

Andrea Milena García.

Mi agradecimiento especial a los profesores Alejandro Múnera y Julieta Troncoso

por su consejo y colaboración a lo largo de la investigación, así como a los profesores

Telmo Peña y Germán Gutiérrez, quienes en el transcurso de la maestría, fortalecieron en

mí los conocimientos y el amor por la psicología experimental.

Agradezco muy especialmente a mis compañeros del grupo de Neurofisiología

Comportamental, Viviana Vargas, Diana Rodríguez, Nina Lamprea, Fabio Sierra, Mayerli

Prado, Carolina Cárdenas, Milady García, William Patarroyo y Lina González, por su

apoyo incondicional y aliento constante a lo largo de la elaboración de la tesis.

Finalmente, agradezco a la Universidad de la Sabana, que financió la presente

investigación.

v

CONTENIDO

Pág.

Resumen ii

Abstract iii

Agradecimientos iv

Contenido v

Lista de Figuras y Cuadros vi

Introducción y Marco Teórico 1

Aprendizaje y Memoria 1

Justificación 19

Objetivos 21

Objetivo General 21

Objetivos Específicos 21

Hipótesis 22

Materiales y Métodos 23

Sujetos Experimentales 23

Materiales y Equipos 24

Procedimientos 24

Aprendizaje en el Laberinto Circular de Barnes 24

Perfusión Intracardíaca 27

Inmunohistoquímica para Proteína Fos 27

Consideraciones Éticas 29

Tipo de Investigación y Diseño 29

Análisis Estadísticos 31

Resultados 32

Resultados Comportamentales 32

Análisis Inmunohistoquímico 38

Discusión y Conclusiones 44

Referencias 57

Anexos 73

Curriculum Vitae 88

vi

LISTA DE FIGURAS Y CUADROS

Pág.

Figura 1. Eventos moleculares de la PLP 5

Figura 2. Clasificación de la memoria a largo plazo 13

Figura 3. Vista superior del instrumento 25

Figura 4. Procedimiento utilizado 27

Cuadro 1. Diseño experimental 30

Figura 5. Ejecución durante la primera sesión 33

Figura 6. Ejecución durante la segunda sesión 35

Figura 7. Ejecución durante la prueba de adquisición 37

Cuadro 2. Comparación de la cuantificación Fos entre los grupos control 38

Figura 8. Cuantificación de células Fos positivas en hipocampo y séptum 40

Figura 9. Cuantificación de células Fos positivas en diferentes estructuras cerebrales 42

Figura 10. Fotografías seleccionadas para la cuantificación de células Fos positivas 43

Aprendizaje Espacial, Sobreaprendizaje y c-fos

1

INTRODUCCIÓN Y MARCO TEÓRICO

Aprendizaje y Memoria

El aprendizaje es definido como un cambio relativamente duradero en los

mecanismos de la conducta que comprende estímulos y/o respuestas específicos y que

resulta de la experiencia previa con estímulos y respuestas similares. El aprendizaje no debe

confundirse con otras fuentes de cambio conductual tales como la fatiga, la maduración y la

evolución. Por su parte, la memoria se define como el proceso por medio del cual el

conocimiento es codificado, almacenado y más tarde, recuperado, es decir, la persistencia

del aprendizaje en un estado que permite manifestarlo siempre que sea necesario. De esta

manera se reconoce una estrecha relación entre ambos conceptos, pues para que el

aprendizaje pueda manifestarse en un cambio conductual debe haber sido almacenado

previamente por la memoria (Domjan, 1999; Rosenzweig y Leiman, 1992; Soriano y cols.,

2007). Clásicamente se acepta la existencia de dos tipos de aprendizaje: el aprendizaje no

asociativo y el aprendizaje asociativo, el primero implica a un solo estímulo ó una serie de

estímulos inconexos e incluye los efectos de habituación y sensibilización. El efecto de

habituación se define como la disminución en la responsividad del individuo frente a un

estímulo relativamente débil producto de la repetición de dicho estímulo, cabe aclarar que

esta disminución no se debe a la adaptación sensorial o a la fatiga de respuesta. Por su

parte, el efecto de sensibilización se define como el incremento en la responsividad del

individuo frente a un estímulo relativamente débil producto de la repetición de dicho

estímulo. El segundo tipo de aprendizaje, el aprendizaje asociativo implica el

establecimiento de relaciones entre dos o más eventos (contingencias) e incluye a los dos

tipos de condicionamiento: clásico y operante. El Condicionamiento Clásico se define

como el establecimiento de una contingencia entre dos estímulos, uno de ellos inicialmente

relevante desde el punto de vista biológico (Estímulo Incondicionado – EI) y otro en

principio irrelevante o neutro (EN). Antes de iniciar el condicionamiento, el EI genera

respuestas intensas en el individuo (Respuestas Incondicionadas o RI), mientras que el EN

produce a lo sumo respuestas de orientación. A fuerza de repeticiones de ensayos

caracterizados por la contigüidad entre los estímulos, se genera una asociación entre ellos


2

que se hace evidente cuando el EN comienza a producir respuestas relevantes (Respuestas

Condicionadas o RC) en el organismo, convirtiéndose así en un Estímulo Condicionado

(EC). En algunas ocasiones la RC presenta una forma similar a la RI, pero en otras, estas

pueden llegar a ser opuestas. Por su parte, el Condicionamiento Operante consiste en el

establecimiento de una triple contingencia entre un estímulo ambiental o Estímulo

Discriminativo (ED), una Respuesta Operante dada por el individuo (RO) y una

Consecuencia ambiental (C). El ED se encarga de informar al individuo acerca de la

vigencia de la situación operante, caracterizada por la disponibilidad o no disponibilidad de

la Consecuencia contingente a la emisión de la Respuesta por parte del individuo. La

consecuencia puede tener el efecto de incrementar la probabilidad de emisión de la

Respuesta Operante (Reforzamiento) o disminuirla (Castigo). La contingencia que se

establece entre la Respuesta y la Consecuencia puede ser positiva (cuando el estímulo

administrado como Consecuencia aparece a causa de la emisión de la Respuesta) o negativa

(cuando la Respuesta suprime o evita la aparición de la Consecuencia) (Domjan, 1999;

Pérez, 1995). El aprendizaje asociativo requiere un entrenamiento en el que se haga

evidente la contingencia o relación entre los eventos implicados en la situación de

aprendizaje. Diversos estudios han puesto en evidencia el efecto que el número de sesiones

o ensayos de entrenamiento tiene sobre el aprendizaje. Hasta el momento, esa evidencia

reposa en los estudios que demuestran la existencia de un efecto protector del sobre-

entrenamiento en el aprendizaje que contrarrestaría los efectos deletéreos de diferentes

tratamientos sobre la recuperación en diversas tareas de aprendizaje. De esta manera, se ha

encontrado que el estrés agudo por restricción de movimientos puede actuar en detrimento

de la recuperación de una tarea espacial en el laberinto circular de Barnes cuando los

sujetos son entrenados en una única sesión de ocho ensayos (Troncoso y cols., 2010),

mientras que el mismo tipo de estresor puede mejorar la recuperación de esta tarea cuando

es sobre-entrenada durante 16 ensayos de adquisición (Torres, 2006). En una serie de

estudios se entrenó a gatos y ratas para presionar una palanca durante un número bajo,

intermedio o alto de sesiones y se inactivó, mediante la microinyección de potasio, el

núcleo caudado en gatos (Prado-Alcalá y Cobos Zapiaín, 1979) y el cuerpo estriado en ratas

(Prado-Alcalá y cols., 1980), encontrándose un efecto protector del sobre-entrenamiento en


3

la recuperación de la tarea, en contraposición al efecto deletéreo que tuvo la inactivación de

las estructuras cuando se entrenó la tarea con un número bajo de sesiones. Por otra parte,

experimentos conducidos por van Groen, Kadish y Wyss, (2002), evaluaron la forma en

que el pre-entrenamiento puede modificar los efectos deletéreos que tiene el envejecimiento

sobre una tarea de aprendizaje espacial en el laberinto acuático de Morris; en un primer

experimento, se entrenó durante una semana a dos grupos de ratas de veinticuatro meses de

edad, uno de los grupos había recibido una semana de pre-entrenamiento a los doce meses

de edad, encontrándose que los animales pre-entrenados tuvieron un mejor desempeño que

los animales que no recibieron este tratamiento. En un segundo experimento, el

entrenamiento y el pre-entrenamiento tuvieron una duración de dos semanas, allí, no sólo se

encontró una latencia de llegada más baja en los animales pre-entrenados, sino que estos

mostraron un desempeño similar al exhibido por los animales jóvenes (de doce meses de

edad), lo que sugiere que un incremento en la cantidad de sesiones de entrenamiento puede

proteger al aprendizaje de los efectos deletéreos del envejecimiento. Otros procedimientos

conductuales, como la manipulación de la magnitud del reforzamiento parecen tener efectos

similares al sobre-entrenamiento, así, se ha encontrado que las situaciones operantes que

proveen mayores magnitudes de reforzamiento son más resistentes a diferentes tipos de

disrupción, tal como lo predice la teoría del ímpetu conductual (Nevin y cols., 1983), según

la cual, la conducta operante es el producto de dos procesos independientes: su tasa de

ocurrencia y su resistencia al cambio (Brown y White, 2009). En este sentido, también se

ha reportado que la magnitud del reforzador es uno de los principales determinantes de la

conducta de escape en situaciones de condicionamiento, por encima de factores como la

intensidad de los estímulos aversivos que motivan dicho comportamiento (Woods y cols.,

1964).

De la misma forma que el aprendizaje, la memoria ha sido clasificada en términos

de la duración de la retención de la misma. Atkinson y Shiffrin en 1968 propusieron las

bases para la distinción entre las memorias correspondientes a los distintos intervalos de

tiempo. El primer almacén de la memoria es conocido como Memoria Sensorial y se

caracteriza por ser transitoria (tiene una duración de décimas de segundo), por contener

toda la información del ambiente capturada por los sentidos y no requerir atención, pues


4

cuando se atiende a alguna parte de dicha información, ésta se transfiere al siguiente

almacén. La Memoria a Corto Plazo o MCP, que constituye el siguiente depósito de la

memoria donde se ubica la información que ha sido seleccionada a través de la atención, es

fácilmente accesible, tiene una duración muy corta (pocos segundos) y una capacidad

limitada (aproximadamente siete elementos). La información que es procesada a través de

la elaboración, se transfiere al siguiente almacén llamado Memoria a Largo Plazo o MLP

que constituye el mayor depósito de información, parece tener un tamaño ilimitado y es de

larga duración (la información puede permanecer en este almacén por años) (Smith y cols.,

2003). Este modelo clásico ha sido ampliamente utilizado, pero en la actualidad se sabe que

no existe necesariamente una linealidad entre los diferentes almacenes y que, contrario a lo

que se pensaba, tampoco existen estructuras asociadas exclusivamente a cada tipo de

memoria, sino más bien, que se trata de procesos que ocurren en paralelo (Opitz, 2010).

Modelos más contemporáneos establecen que la memoria es un proceso complejo

compuesto por tres subprocesos secuenciales: Adquisición, consolidación y recuperación.

En la primera fase de la memoria, la información captada del medio es representada en el

sistema nervioso, es decir, es codificada; en la segunda fase, la información codificada es

almacenada mediante un proceso dinámico que involucra diversas estructuras cerebrales y

procesos moleculares (McGaugh, 2000). La tercera y última fase es la recuperación,

proceso que permite al sujeto acceder a la información almacenada a partir de las demandas

que el medio le presente (Rains, 2004). Muchos de los estudios en los que se examinan los

mecanismos que subyacen a la adquisición del aprendizaje asociativo, se han enfocado en

el condicionamiento clásico del temor y se ha encontrado que este tipo de proceso es

sensible a las lesiones de hipocampo (McEchron y cols., 1998). Otras formas de memoria,

tales como la memoria espacial, al parecer involucran otras estructuras cerebrales del

lóbulo temporal medial además del hipocampo (Riedel y cols.,1999; Morgado, 2005).

La investigación relacionada con las bases moleculares de la memoria ha hecho

especial énfasis en los mecanismos de adquisición incluyendo formas de plasticidad

sináptica como la Potenciación a Largo Plazo (PLP). La PLP consiste en un aumento en los

potenciales excitatorios postsinápticos producido por un tren corto de estímulos de alta

frecuencia sobre la misma neurona. Esta facilitación puede prolongarse en el tiempo

durante horas, días e incluso semanas

hipocampo se han enfocado en el papel del receptor

eventos producidos por el influjo de calc

factor crítico para la adquisición de la memoria, al igual que la activación de la

kinasas A y C (PKA y PK

representa esquemáticamente la participación de la PLP en la a

consolidación de la memoria.

Figura 1: Eventos moleculares que subyaceestimulación de receptores de glutamato tipo NMDA por la unión del glutamato facilita la entrada de Ca2+ a la neurona postsináptica, lo que calcineurina. La PLP de larga duradeníl ciclasa a través de la unión de la proteína G, lo que produce un incremento en los niveles de AMPc, activando PKA que se desplaza al núcleo donde fosforila a CREB. Figura reproducida con modificac

Aprendizaje Espacial, Sobreaprendizaje y c

5

s e incluso semanas. Los estudios sobre PLP en el área CA1 del

hipocampo se han enfocado en el papel del receptor N-Methyl-D-Aspartato (

eventos producidos por el influjo de calcio a través de este receptor, debi

factor crítico para la adquisición de la memoria, al igual que la activación de la

A y PKC) (Abel y Lattal, 2001; Kandel y cols., 1997

mente la participación de la PLP en la adquisición

consolidación de la memoria.

Eventos moleculares que subyacen a las fases temprana y tardía de la PLP. La estimulación de receptores de glutamato tipo NMDA por la unión del glutamato facilita la entrada de Ca2+ a la neurona postsináptica, lo que genera la activación de CaMKII, PKC y calcineurina. La PLP de larga duración ocurre cuando la entrada de Ca2+ estimula a la

a través de la unión de la proteína G, lo que produce un incremento en los niveles de AMPc, activando PKA que se desplaza al núcleo donde fosforila a CREB. Figura reproducida con modificaciones de la presentada por Abel y Lattal


. Los estudios sobre PLP en el área CA1 del

Aspartato (NMDA) y los

io a través de este receptor, debido a que este es un

factor crítico para la adquisición de la memoria, al igual que la activación de las Protein-

s., 1997). La Figura 1

dquisición y en la

a las fases temprana y tardía de la PLP. La estimulación de receptores de glutamato tipo NMDA por la unión del glutamato facilita la

genera la activación de CaMKII, PKC y ación ocurre cuando la entrada de Ca2+ estimula a la

a través de la unión de la proteína G, lo que produce un incremento en los niveles de AMPc, activando PKA que se desplaza al núcleo donde fosforila a CREB.

iones de la presentada por Abel y Lattal (2001).


6

En la fase de adquisición hay una cascada de AMP cíclico (AMPc) que inicia con

una activación neuronal a corto plazo que permite la entrada de Ca2+ a la neurona, lo que

activa la Calcineurina y proteínquinasas como CAMKII y PKC. El Glutamato se une al

receptor (normalmente su receptor ionotrópico NMDA), que tiene asociada una proteína G,

se envía un mensaje a dicha proteína que, al recibirlo, sustituye en su subunidad alfa al

GDP por GTP, lo que promueve la separación de dicha subunidad. Esta subunidad se

desplaza y se une a la proteína adenilato ciclasa (AC) que cataliza la reacción para obtener

AMP cíclico (AMPc) y PPi a partir de ATP. PKA es una proteínquinasa que posee cuatro

subunidades, dos de ellas receptoras y dos más catalizadoras, el AMPc se une a las

subunidades receptoras produciendo la activación de dicha enzima: se separan las

subunidades receptoras y se liberan los sitios activos de las subunidades catalizadoras. Las

proteínquinasas viajan al núcleo de la neurona, donde las subunidades catalizadoras

fosforilan proteínas blanco tales como CREB, que quedan activas. (Abel y Lattal, 2001;

Kandel y cols., 1997).

Müller y Pilzecker (1900) propusieron que los procesos que subyacen al

almacenamiento de nueva información inicialmente persisten en un estado frágil y se

consolidan a través del tiempo. Esta es una idea que se planteó hace más de un siglo y que

en la actualidad prevalece en el ámbito investigativo de las neurociencias. Al parecer, la

memoria a largo plazo y los diferentes estadios de la memoria no están unidos

secuencialmente, sino que están basados en procesos independientes que actúan en

paralelo. Los estadios tardíos de consolidación que resultan en memorias que prevalecen

por toda la vida, probablemente involucran la interacción de sistemas cerebrales que

reorganizan y estabilizan las conexiones distribuidas (McGaugh, 2000). Las fases de

adquisición y consolidación parecen compartir algunos mecanismos moleculares; estos

mecanismos son activados por estímulos ambientales durante la adquisición, mientras que

en la consolidación los estímulos ya no se encuentran presentes. Se han planteado diversas

posibilidades acerca de los mecanismos que activan el proceso de consolidación, la primera

opción, a nivel celular, tiene que ver con una activación de los procesos moleculares por

largos períodos de tiempo que se produce desde la adquisición, tales como la generación de

una activación prolongada de PKA que sigue a la entrada de serotonina a las neuronas


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sensoriales de la Aplysia (Abel y Kandel, 1998). La segunda posibilidad es que la

adquisición inicie una cascada de eventos moleculares que se prolonga por distintos

períodos de tiempo y la tercera, a nivel de sistemas, es que la consolidación involucre una

“reactivación” de los eventos neuronales que ocurren durante el entrenamiento (Abel y

Lattal, 2001). Así como sucede en el almacenamiento de la memoria, la PLP ha demostrado

tener diferentes fases temporales, una fase temprana (que típicamente tarda entre una y tres

horas), independiente de la síntesis de proteínas y una fase tardía que es más persistente

(tarda más de ocho horas y su duración depende del organismo y del tipo de memoria) y es

dependiente de la expresión génica y la síntesis de proteínas (Stanton y Sarvey, 1984;

Hernández y Abel, 2008). Aunque la PLP generalmente se encuentra asociada con la

activación de receptores NMDA, otros sistemas de receptores pueden estar implicados. La

PLP dependiente de NMDA es característica de las regiones CA1 y CA3 del hipocampo.

(Kesner y Martínez, 2007).

A pesar de los mecanismos comunes entre las fases de adquisición y consolidación

de la memoria, la segunda se caracteriza por incluir en sus procesos la expresión de genes y

la síntesis de proteínas, que permiten generar los cambios estructurales que darán paso al

almacenamiento de la información a largo plazo. Como se mencionó anteriormente, durante

las horas que siguen a la inducción de PLP, los receptores de las neuronas activan sistemas

de segundos mensajeros que resultan en la fosforilación de proteínas diana, tales como

CREB, que, a su vez, se encarga de modular la transcripción de cerca de 4000 genes, entre

ellos algunos inmediatos tempranos (IEGs por su sigla en inglés), que constituyen el primer

grupo de genes expresados tras la activación sináptica (Guzowski, 2002). Estos, se

encargan de codificar factores de transcripción que regulan la expresión de genes de

respuesta tardía, vinculados a los cambios a largo plazo relacionados con la plasticidad

sináptica (Kesner y Martínez, 2007). La inducción y mantenimiento de la PLP produce el

inicio de la fosforilación de CREB (Bito, 1998), mientras que CaMKIIα y MAPK2

despliegan un estado de fosforilación aumentada que es claramente dependiente de la

síntesis de proteínas (Ahmed y Frey, 2005). CREB modula la transcripción de genes que

contienen elementos responsivos a AMPc (sitios CRE) y es comúnmente activado por la

proteínquinasa IV dependiente de calcio/calmodulina (CaMKIV). Una vez expresado el


8

gen, inicia la síntesis de proteínas que ocurre mediante mecanismos diferentes en células

procarióticas y eucarióticas. En el primer caso, la traducción se lleva a cabo

simultáneamente al proceso de transcripción, mientras que en células eucarióticas la

estructura nuclear separa temporal y físicamente estas dos estructuras, por tanto, la

transcripción se lleva a cabo en el núcleo y posteriormente, el ARNm viaja al citoplasma

para realizar la traducción (Jiménez y Merchant, 2003). Las neuronas son células

eucarióticas (Kesner y Martínez, 2007), en este tipo de células la transcripción se lleva a

cabo en un proceso que implica una serie de acontecimientos que inician cuando las

secuencias de ADN son copiadas a ARN a través de la acción de ARN polimerasa,

produciendo el ARN mensajero (ARNm) (transcripción). Durante el proceso de traducción,

el ARNm sale del núcleo dirigiéndose hacia el citoplasma con la información necesaria

para producir una proteína determinada, en el citoplasma se une al ribosoma y se asocia el

ARN de transferencia (ARNt) mediante su anticodón al codón del ARNm según la

complementariedad de las bases. Los aminoácidos transportados por el ARNt se irán

encadenando hasta formar la proteína. Una vez finalizada la síntesis se disocia todo el

aparato creado para tal fin (Delvin, 2004). Al parecer, la síntesis de proteínas inducida por

PLP genera cambios morfológicos que son esenciales para la reestructuración sináptica,

tales como incrementos en el número de espinas dendríticas, el aumento del área de la

espina y la redistribución de vesículas sinápticas, observados tanto presinápticamente como

postsinápticamente (Lynch, 2004).

Como se mencionó anteriormente, es muy importante el papel que la síntesis de

proteínas desempeña en la memoria a largo plazo, los genes tempranos-inmediatos

neuronales codifican factores de transcripción, proteínas citoesqueléticas, factores de

crecimiento, enzimas metabólicas y proteínas involucradas en la transducción de señales.

La evidencia experimental sugiere que los genes codificadores de Factores de

Transcripción Inducible (ITFs por sus siglas en inglés), se expresan de manera rápida y

transitoria durante la adquisición y las fases tempranas de la consolidación de la memoria

en ciertas estructuras del cerebro de vertebrados, bajo condiciones de aprendizaje, lo que

sugiere que los ITFs desempeñan un papel en la transición de la MCP a la MLP. A la fecha

se ha conocido la existencia de aproximadamente cuarenta de ellos. Entre los productos de


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IEG mejor caracterizados se encuentran las familias de ITFs Fos, Jun y Krox, que son

codificados por IEGs como c-fos, fra-1, fra-2, fos-B, c-jun, jun-B, Jun-D y Krox-20

(Lanahan y Worley, 1998; Tischmeyer y Grimm, 1999). Se sugiere que la proteína Fos,

producto del proto-oncogén c-fos, activa a los genes efectores tardíos al formar, junto con

las proteínas JUN, el factor de transcripción heterodimérico AP-1 (Proteína Activadora 1)

(Morgan y Curran, 1991). Este factor de transcripción contiene una estructura dimérica

formada por una cremallera de leucina, está implicado en la expresión de genes

relacionados con la respuesta a diversos estímulos y controla una serie de procesos

celulares incluyendo diferenciación, proliferación y apoptosis. Así, la expresión de esta

proteína es considerada un mecanismo por medio del cual los estímulos breves pueden

producir cambios a largo plazo en la expresión de los genes y alterar las propiedades

estructurales y funcionales de las células nerviosas (Goelet y cols., 1986). El oncogén c-fos

está altamente vinculado con la PLP en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo, aunque el

papel específico que desempeña en el almacenamiento de la memoria aún no ha sido

completamente caracterizado (Kesner y Martínez, 2007).

Algunos investigadores interesados en determinar la participación de estructuras

cerebrales en el aprendizaje y la memoria de tipo espacial han utilizado la

inmunoreactividad de la proteína Fos como marcador de actividad celular. Dado que esta

proteína permanece en el núcleo celular por un período corto de tiempo, su detección ha

sido ampliamente usada para localizar los cuerpos neuronales activados por estímulos

específicos (Bekinschtein y cols., 2007; Conrad y cols., 2004; Lamprea y cols, 2002). Por

ejemplo, He y cols., (2002) compararon la expresión de c-fos en dos tareas de aprendizaje

espacial con recompensa fija o variable y encontraron una clara participación de la corteza

cerebral y el hipocampo en las dos tareas. Santín y cols., (2003) por otro lado, compararon

la memoria de referencia y la memoria de trabajo en el laberinto acuático de Morris en

diferentes núcleos del hipocampo, mediante el registro de la expresión c-fos. Estos autores

encontraron una actividad diferencial de los núcleos del hipocampo según el tipo de

memoria que requería la tarea (de referencia o de trabajo). Así, nuevamente, la expresión de

la proteína Fos refleja la actividad neuronal y permite determinar las estructuras cerebrales

vinculadas a las diferentes tareas de aprendizaje y memoria. Algunos autores han


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encontrado cambios en la marcación de la proteína Fos dependientes del momento de

observación y del entrenamiento. Papa y cols., (1993) reportaron que el procesamiento de

información asociado al aprendizaje no asociativo toma lugar en regiones de la formación

reticular, complejo caudado-putamen, neuronas granulares y piramidales del hipocampo,

neuronas granulares del cerebelo y todas las capas de la corteza somatosensorial.

Resultados similares fueron encontrados por Romanelli y cols., (2007) quienes observaron

una mayor marcación de proteína Fos en regiones del hipocampo, el cerebelo y la corteza

somatosensorial de ratas expuestas por primera vez a un ambiente nuevo.

Durante una prueba de memoria, se expone al individuo ante un estímulo o

situación experimental donde se ha llevado a cabo un entrenamiento particular, a fin de

evaluar la capacidad del sujeto para recordar lo que previamente aprendió en relación con

dicho contexto. Los investigadores interesados en caracterizar las bases biológicas de la

recuperación de la memoria han tenido que enfrentar un gran desafío, dada la dificultad

para desligar los efectos que tiene una manipulación particular sobre la recuperación, de sus

efectos sobre el desempeño de la tarea conductual (Abel y Lattal, 2001). Hace algunos

años, se planteó una teoría alternativa para explicar la consolidación de la memoria a largo

plazo, llamada Teoría de Huella Múltiple (MTT por sus siglas en inglés) (Nadel y

Moscovitch, 1997) que plantea que la memoria toma tiempo en estabilizarse y consolidarse

en una o varias regiones cerebrales. En este sentido, se ha sugerido que el hipocampo es

esencial para el almacenamiento y recuperación de memorias detalladas episódicas y

espaciales (Medina y cols., 2008), independientemente de lo antiguo que pueda ser el

recuerdo, de hecho, se ha postulado que las memorias remotas se almacenan en la

neocorteza, pero el hipocampo mantiene un papel crítico en su recuperación (Teixeira y

cols., 2006). Así, se argumenta que el hipocampo no contiene la huella de memoria que

representa a una experiencia, sino que provee un índice que posibilita el acceso a la

información para que esta pueda ser recuperada.

En cuanto a los mecanismos moleculares que subyacen a la fase de Recuperación de

la Memoria, se ha planteado que el receptor NMDA y la proteín-kinasa C (PKC) que, como

ya se dijo, son factores críticos en la adquisición de la memoria y la PKA que es

fundamental en la consolidación, no lo son en la fase de recuperación. Adicionalmente, la


11

síntesis de proteínas que se requiere para la consolidación, no es necesaria en la

recuperación (Abel y Lattal, 2001). Algunos estudios sugieren que la recuperación puede

compartir el requerimiento de ciertas moléculas de señalamiento con la adquisición y la

consolidación, así, la sobre-expresión de CaMKIIα y calcineurina puede empeorar la

recuperación, pero los estudios aún no son concluyentes. (Mansuy y cols., 1998; Mayford

y cols., 1996).

Recientemente se ha propuesto que la formación de la memoria es un proceso de

múltiples fases durante el cual la información persiste en un estado inactivo interrumpido

por reactivaciones de la huella que desencadenan eventos relacionados con la plasticidad

(Dudai, 2004). Adicionalmente, se ha sugerido que dichas reactivaciones pueden

presentarse en respuesta a la estimulación exógena en el proceso de recuperación o puede

ocurrir de manera endógena en el curso del mantenimiento de la huella de memoria (Dudai

y Eisenberg, 2004). Esta reactivación endógena constituiría una fase diferente de la

memoria, llamada reconsolidación, que consiste en que la nueva activación de una

memoria ya consolidada, la vuelve nuevamente lábil y capaz de alterarse o recomponerse si

en ese momento se introduce nueva información o un tratamiento particular (Morgado,

2005). Se ha postulado que la reconsolidación podría corresponder a la manifestación de un

proceso de consolidación persistente, donde los períodos más extensos de reactivación

producirían una plasticidad de amplio alcance en la memoria de larga duración, lo que

permite predecir la existencia de ventanas temporales recurrentes de sensibilidad a los

bloqueadores de consolidación a lo largo de horas, días o incluso semanas. En este sentido,

la síntesis de proteínas en el hipocampo podría ser interpretada como evidencia de una

reactivación endógena del rastro que conduce a una retención de memoria más duradera

(Bekinschtein y cols., 2007). Estudios más recientes indican que tras el entrenamiento en

tareas hipocampo-dependientes, existe una fase tardía dependiente de la síntesis de

proteínas y la expresión del gen c-fos en el hipocampo dorsal, crítica para la persistencia

pero no para la formación de la memoria a largo plazo (Katche y cols., 2010). Se ha

encontrado que la reconsolidación, como la consolidación, implica la síntesis de proteínas

(Nader y cols., 2000) y la inducción de factores de transcripción (Kida y cols., 2002), sin

embargo, parecen corresponder a procesos diferentes, aunque solapados, de señalización


12

intracelular, implicando la participación de distintos factores de transcripción (Lee y cols.,

2004), lo que indicaría que la reconsolidación no genera una nueva huella de memoria, sino

que activa un proceso celular distinto, útil para el mantenimiento de la memoria ya

existente.

Como proceso cognitivo, la memoria a largo plazo ha sido clasificada según su

contenido en memoria declarativa y memoria no declarativa. Esta clasificación ha sido

homologada a la distinción entre memoria Implícita (que correspondería a la memoria no

declarativa) y Explícita (que corresponde a la declarativa) (Squire y cols., 1990). En la

Figura 2 se presenta de manera esquemática la clasificación de la memoria a largo plazo. La

memoria implícita es concebida como una colección heterogénea de capacidades de

aprendizaje no conscientes. Contiene información acerca de los hábitos cognitivos y

motores y procedimientos, no se accede a ella de manera deliberada, se expresa a través de

la demostración de una habilidad y suele ser difícil de verbalizar; se caracteriza por ser una

memoria rígida y duradera, derivada de tipos de aprendizaje básico y filogenéticamente

antiguos y su principal lugar de almacenamiento radica en estructuras subcorticales, como

el neoestriado (caudado y putamen), adicionalmente, se ha encontrado una activa

participación de la amígdala en este tipo de memoria, especialmente en el ampliamente

estudiado paradigma de miedo condicionado en roedores (Maren y cols. 2003). La memoria

Implícita incluye a la memoria procedimental, el aprendizaje no asociativo, el

condicionamiento clásico y el fenómeno de facilitación o priming (Squire y Zola, 1996;

Smith y cols., 2003; Morgado, 2005). Este tipo de memoria corresponde al aprendizaje de

habilidades y hábitos y es procesado por el complejo estriado. El aprendizaje no asociativo

implica la experiencia con un solo estímulo o varios estímulos inconexos y el sustrato

neural de este tipo de aprendizaje corresponde a las vías reflejas. Por su parte, el

condicionamiento clásico implica el establecimiento de una relación contingencia entre dos

estímulos y ha sido asociado a la actividad de la amígdala y el cerebelo (Domjan, 1999;

Squire y cols., 1990). Finalmente, la facilitación o priming es el efecto por el cual la

exposición a un estímulo influye en la respuesta del individuo frente a un estímulo

subsecuente. Este fenómeno ha sido asociado al funcionamiento de la neocorteza (Squire y

cols., 1990).

Explícita (Declarativa)

Lóbulo temp. medial

Semántica Episódica

Autonoética Noética

Por otro lado, la memoria

manera consciente la información relacionada con hechos y eventos

episódica y semántica (Squire y Zola, 1996).

un sistema que incluye a la regi

la corteza cerebral para su

memoria puede adquirirse

contextos y modos diferentes

relacional, que consiste en analizar, comparar y contrastar diferentes tipos de información.

La memoria Semántica se relaciona con

identificados en espacio y tiempo, mientras que la m

consciente de acontecimientos personales específicos y

autobiográfica (Soriano y cols., 2007).

Figura 2: Clasificación de la Memoria a Largo Plazo según su contenido. Figura reproducida con modificaciones de la presentada por

Un subtipo de memoria que ha recibido particular atención en las últimas décadas es

la memoria espacial. Se considera


13

Memoria

Noética

Implícita (No declarativa)

FacilitaciónNeocorteza

ProcedimentalCuerpo estriado

Cond. Clásico

Respuestas Emocionales

Amígdala

a memoria Explícita se define como la capacidad para recolectar de

manera consciente la información relacionada con hechos y eventos e incluye a la memoria

episódica y semántica (Squire y Zola, 1996). Este tipo de memoria implica la activación de

la región parahipocampal y el hipocampo para su adquisición y a

para su almacenamiento definitivo (Eichenbaum, 2002).

memoria puede adquirirse en uno o pocos ensayos, se destaca por poder expresarse en

contextos y modos diferentes a los del aprendizaje original y resulta del aprendizaje


se relaciona con el conocimiento general de hechos y conceptos no

spacio y tiempo, mientras que la memoria Episódica

imientos personales específicos y también es denomin

autobiográfica (Soriano y cols., 2007).

Clasificación de la Memoria a Largo Plazo según su contenido. Figura reproducida con modificaciones de la presentada por Sweatt (2010).


la memoria espacial. Se considera que ésta es posible gracias al aprendizaje espacial


Implícita

Cond. Clásico

Musculatura Esquelética

Cerebelo

Apz. No asociativo

Vías reflejas

define como la capacidad para recolectar de

ncluye a la memoria

implica la activación de

ón parahipocampal y el hipocampo para su adquisición y a

aum, 2002). Este tipo de

se destaca por poder expresarse en

del aprendizaje original y resulta del aprendizaje


el conocimiento general de hechos y conceptos no

implica el recuerdo

es denominada memoria

Clasificación de la Memoria a Largo Plazo según su contenido. Figura


aprendizaje espacial que es


14

de tipo asociativo e implica la memoria episódica, dado que registra datos concernientes a

la experiencia del sujeto en un contexto espacio-temporal, permitiéndole ubicarse en este

contexto mediante el uso de las claves presentes y la elaboración de mapas que le permiten

adaptarse efectivamente (Redish, 1999; Moscovitch y cols., 2005). Básicamente se

conocen dos tipos de navegación espacial, la Alocéntrica y la Egocéntrica, la primera se

caracteriza por el uso de claves provenientes del entorno e incluye la información olfatoria,

auditiva y visual, mientras que en la segunda, las claves provienen de los movimientos del

mismo animal y son obtenidas por los sistemas vestibular, propioceptivo y somatosensorial

(Save y Poucet, 2005). Han sido desarrollados diversos modelos para el estudio del

aprendizaje espacial, principalmente el relacionado con la navegación alocéntrica, no sólo

en lo concerniente al proceso cognitivo, sino también a los mecanismos neurobiológicos

implicados. Dentro de estos modelos se distinguen el laberinto en forma de T (Small,

1899), la tarea de preferencia de lugar (Rossier y cols., 2000), el laberinto radial (Olton y

Samuelson, 1976); el laberinto acuático de Morris (Morris y cols, 1982) y el laberinto

circular de Barnes (Barnes, 1979) en los que los sujetos deben utilizar estrategias espaciales

para la obtención de un reforzador o para la evitación de una situación aversiva. El

laberinto en forma de T o de Y se basa en la tendencia de los roedores a optimizar su

conducta de forrajeo, de tal forma que evitan entrar a lugares que ya han visitado, donde el

alimento ya ha sido consumido previamente. En este laberinto se conducen dos tipos de

tareas que tienen que ver con el comportamiento de alternación, la primera corresponde al

paradigma de alternación espontánea y la segunda es la tarea de alternación demorada de

elección forzada. La tarea de preferencia de lugar se lleva a cabo en una plataforma elevada

en la que la rata debe aprender a localizar una zona no marcada (zona objetivo) a partir de

las claves extralaberínticas, la elección de dicha zona se refuerza positivamente a través de

la entrega de 20 mg. de alimento (Save, E. y Poucet, B., 2005). Por su parte, el laberinto

radial consiste en un aparato con un área de elección central de la cual se desprenden

brazos equidistantes, al final de cada uno de los cuales puede ser depositado un reforzador

(normalmente comida). El laberinto acuático de Morris consiste en una piscina circular que

cuenta con una plataforma de escape la cual se encuentra sumergida por debajo del nivel

del agua para evitar que se convierta en una pista visual. En este modelo, el animal aprende


15

rápidamente a localizar la plataforma para salir del agua y mantiene la preferencia por el

cuadrante donde se encontraba la plataforma, una vez ésta es retirada (Santín y cols., 2001).

El laberinto de Barnes está compuesto por una plataforma circular elevada a un metro del

suelo localizada en un área intensamente iluminada, con dieciocho agujeros en la periferia,

uno de los cuales conduce a una caja meta (un espacio reducido, cerrado y oscuro) que el

sujeto puede utilizar como escape de la situación aversiva. Al igual que en el Laberinto de

Morris, en este modelo las ratas aprenden rápidamente la localización del agujero que las

conduce a la caja de escape, utilizando estrategias espaciales (Harrison y cols, 2006).

Existen básicamente cinco estrategias que un animal puede utilizar para resolver una

tarea espacial, la primera corresponde a la búsqueda al azar de la plataforma (en el caso del

laberinto acuático de Morris) o agujero meta (en el laberinto circular de Barnes), se utiliza

cuando el animal no posee información acerca de su localización y es llamada Navegación

Aleatoria. Un segundo tipo de estrategia es la Navegación Táxica y suele usarse cuando el

animal puede encontrar una clave hacia la cual dirigirse (si, por ejemplo, la caja meta es

visible). La tercera estrategia es denominada Navegación Práxica y se caracteriza por la

ejecución de un programa motor constante y solamente es útil cuando el animal inicia todos

los ensayos de entrenamiento desde la misma posición y orientación. La Navegación de

Ruta es la cuarta estrategia; allí, el animal aprende a planear una secuencia de sub-objetivos

para alcanzar la meta y se piensa que se logra encadenando secuencias de subestrategias

táxicas y práxicas. La quinta y última estrategia se denomina Navegación Local y permite

al animal aprender la localización de la plataforma o agujero meta en relación con una

constelación de claves y con la opción de construir un mapa que facilite la navegación a

partir del conocimiento de la ubicación del agujero meta, de las claves y de sí mismo

(Redish, 1999).

En psicología, el primer autor en abordar el tema del aprendizaje espacial y de la

elaboración de mapas cognitivos, fue Edward Tolman (1948), quien realizó la descripción

de diversos estudios en los que ratas deprivadas de alimento eran probadas en múltiples

modalidades de laberintos. Este autor concluye que los sujetos expuestos a tareas espaciales

construyen un mapa cognitivo tentativo de su entorno, que les indica las rutas, vías y

relaciones espaciales y que determina las respuestas que el individuo emite finalmente, en


16

oposición a la postura clásica de Estímulo – Respuesta predominante en la psicología

conductual, en ese momento histórico. Dada la importancia de estos postulados para la

explicación del comportamiento, el tema del aprendizaje espacial ha suscitado entre los

investigadores un marcado interés, especialmente en el área de las neurociencias. Así, se ha

desarrollado una amplia variedad de estudios que buscan determinar el sustrato neural de la

memoria espacial (Mumby y cols., 1999; Savage y cols, 1997; Vicens y cols., 2003). En

este sentido, consistentemente se ha involucrado al hipocampo como estructura moduladora

del aprendizaje en diferentes protocolos (D’Hooge y De Deyn, 2001). Ya en 1971 O’Keefe

y Dostrovsky encontraron que el hipocampo posee células que se activan cuando el animal

se encuentra en una localización concreta dentro de un ambiente, por lo que las

denominaron células de lugar. Al parecer, estas células no solo permiten la elaboración de

un mapa cognitivo que contenga las claves necesarias para la navegación espacial, sino que

facilitan la determinación de la orientación del individuo en dicho mapa (Redish, 1999).

Más adelante, O’Keefe y Nadel (1978), propusieron que el hipocampo podría ser la

estructura cerebral a través de la cual se forma el mapa cognitivo que permite al animal

navegar en el espacio. Estos autores asumen que existen dos componentes básicos en el

sistema de elaboración de mapas, el primero es llamado mapeo del espacio y consiste en un

grupo de lugares (áreas del hipocampo que se activan ante la presencia de lugares físicos

determinados) interconectados, cada uno de los cuales es receptivo a una gran cantidad de

inputs potenciales. El segundo componente corresponde al mecanismo de localización que

efectúa las modificaciones en la representación de los ítems en respuesta a los cambios

ambientales, así que permite la continua actualización de los mapas cognitivos. A partir de

entonces, son numerosos los reportes que involucran al hipocampo con el almacenamiento

de información de contenido espacial. Más recientemente, Ergorul y Eichenbaum (2004)

demostraron que el hipocampo es una estructura crítica para que las ratas puedan relacionar

e integrar información de memoria sobre ‘qué’, ‘dónde’ y ‘cuándo’ tuvo lugar un evento.

Adicionalmente, se ha encontrado que las lesiones del hipocampo interfieren con la

orientación alocéntrica, en el laberinto acuático de Morris, mientras que este mismo tipo de

aprendizaje es facilitado en ratones transgénicos que sobreexpresan una subunidad (R2B)


17

del receptor NMDA y producen potenciales excitatorios postsinápticos más duraderos que

los sujetos control en el hipocampo y otras regiones del encéfalo (Tang y cols., 1999).

Además del hipocampo y sus conexiones, se ha propuesto que la memoria espacial

implicaría la acción coordinada de otras estructuras. Por ejemplo, ha sido descrito que la

actividad de algunas células de la corteza parietal estaría relacionada con la orientación de

la cabeza con respecto al entorno, apoyando la hipótesis de que la corteza parietal integra y

procesa tanto información visual como relativa al movimiento. Los efectos deletéreos de las

lesiones de la corteza parietal sobre la ejecución de tareas espaciales parecen corroborar

dicha hipótesis (Vicens y cols., 2003). Otros estudios han mostrado que las lesiones del

núcleo accumbens, deterioran la ejecución en el laberinto de Morris (Ploeger y cols.,1994).

Igualmente, se ha sugerido que el cuerpo estriado intervendría en la organización espacial

de la conducta participando en la localización «alocéntrica» (relacionada con la formación

de mapas cognitivos), mientras que el núcleo caudado participaría en la localización

«egocéntrica» (basada en la propia situación del cuerpo) de los sujetos (Devan y cols.,

1996). Adicionalmente, se ha encontrado que las lesiones bilaterales en el estriado afectan

el desempeño en el laberinto acuático de Morris (Whishaw y cols., 1987) y al parecer

tienen efectos deletéreos sobre los aspectos cognitivos y motores de la tarea (Furtado y

Mazurek, 1996), así, algunos autores sugieren que el estriado estaría involucrado en la

consolidación de los aspectos procedimentales de las tareas espaciales, especialmente en el

laberinto acuático de Morris (D’Hooge y De Deyn, 2001). Por su parte, las lesiones

cerebelosas y de los núcleos basales también producen déficits en la ejecución en tareas

espaciales, sugiriendo su implicación en los aspectos procedimentales de la tarea

(D’Hoodge y De Deyn, 2001). Otras regiones como el tálamo y la corteza prefrontal (la

corteza del polo anterior, caracterizada por la proyección recíproca con el núcleo

mediodorsal del tálamo) también participarían en la modulación del aprendizaje espacial

(Conway, 1998), así, se ha encontrado que las lesiones en la corteza prefrontal afectan la

adquisición de una tarea espacial en el laberinto acuático de Morris (Morgensen y cols.,

1995). Del mismo modo, se ha encontrado que las ratas con lesiones prefrontales son

capaces de encontrar la plataforma escondida en el mismo laberinto, pero presentan

dificultades en los procesos de planeación (Granon y Poucet, 1995). Otras estructuras


18

cerebrales están implicadas en el aprendizaje espacial en el laberinto circular de Barnes en

relación con las características específicas de esta tarea, es el caso de la Sustancia Gris

Periacueductal (PAG por sus siglas en inglés) que está relacionada con las respuestas de

escape ante la estimulación aversiva, lo que representa justamente la base de esta tarea

espacial. La PAG constituye una región celular densa que rodea el acueducto de Silvio

(Keay y Bandler, 2004). Por su parte, estructuras como el Hipotálamo Paraventricular, la

Amígdala y el Séptum parecen estar implicadas en las respuestas emocionales implícitas en

esta tarea, pues se ha demostrado a través de la determinación de los niveles de

corticosterona en suero, que la exposición a la tarea espacial en el laberinto circular de

Barnes genera ansiedad endógena moderada (Harrison y cols., 2009). Así, la actividad del

núcleo paraventricular del hipotálamo (ubicado en la región posterior, zona periventricular

del hipotálamo) estaría directamente relacionada con las respuestas de estrés, pues contiene

neuronas que promueven la secreción de la hormona liberadora de corticotropina que

genera la activación del eje Hipotálamo-Hipófisis-Suprarrenal (HHS) (Simerly, 2004). El

cuerpo amigdaloide, un conglomerado relativamente amplio de sustancia gris que yace en

la profundidad del lóbulo temporal anteromedial, solía verse como una estructura unitaria

pero actualmente se asume como un complejo heterogéneo involucrado en diferentes

funciones tales como el tono emocional de la memoria y el aprendizaje y la modulación de

funciones neuroendocrinas y patrones complejos de conducta integrada (De Olmos y cols.,

2004). Los núcleos laterales y mediales del séptum, una estructura constituida por la pared

medial interventricular del telencéfalo, están implicados tanto en las respuestas

emocionales como en la memoria y otras funciones cognitivas, lo que sugiere una estrecha

relación de esta estructura con la tarea de aprendizaje espacial en el laberinto circular de

Barnes (Risold, P., 2004), de esta manera, se ha encontrado que las lesiones del séptum

medial inducidas con una inyección ácido quiscuálico, un agonista de los receptores AMPA

y de los receptores metabotrópicos de glutamato del grupo I, afectan el desempeño en el

laberinto acuático de Morris (Brandner y Schenk, 1998).


19

JUSTIFICACIÓN

Durante los últimos cuatro años, el grupo de Neurofisiología Comportamental de la

Universidad Nacional de Colombia ha desarrollado una serie de trabajos relacionados con

el estudio del estrés y la memoria. Estos estudios evalúan los efectos de la inducción de

estrés principalmente por restricción de movimientos, (aunque se ha trabajado por otras

vías como separación temprana e inyección sistémica de corticosterona) sobre el

aprendizaje en diferentes tareas de memoria espacial (aprendizaje en el laberinto circular de

Barnes) y episódica (memoria de reconocimiento de objetos). Estos trabajos han

demostrado que el efecto del estrés sobre la memoria está modulado por diferentes factores

como el tipo de tarea de memoria a la que se expone al sujeto (Trujillo, 2006; Usme, 2005),

la intensidad del estrés inducido (Troncoso y cols., 2010) y la intensidad del entrenamiento

(Torres, 2006; Troncoso y cols., 2010). En cuanto a las diferencias en el tipo de tarea,

hemos encontrado que el estrés agudo por restricción de movimientos tuvo un efecto

deletéreo sobre la capacidad de los animales para explorar preferentemente objetos

novedosos de otros ya conocidos (Trujillo, 2006), mientras que el mismo tipo de estresor

(Torres, 2006) y la aplicación sistémica de corticosterona (Carvajal, 2006), mejoran la

recuperación de la ubicación de la caja de escape en el laberinto circular de Barnes cuando

el entrenamiento es realizado veinticuatro horas antes, en dos sesiones de ocho ensayos

cada una. De manera interesante, el mismo tipo de estresor actuó en detrimento de la

recuperación de la localización de la caja de escape cuando la tarea fue entrenada en una

única sesión de ocho ensayos (Troncoso y cols., 2010). Estos resultados aparentemente

contradictorios permiten suponer la existencia de diferentes mecanismos de memoria

implicados en el aprendizaje espacial dependiendo de la cantidad de ensayos de

adquisición, que serían responsables de los efectos diferenciales del estrés ya descritos. Esta

suposición nos lleva a proponer el presente estudio que tiene como objetivo la

determinación de diferencias en la activación de diversas estructuras cerebrales en los dos

protocolos de aprendizaje a través de la cuantificación de la expresión de la proteína Fos en

secciones seriales del cerebro de ratas. La selección de esta estrategia se basa en que uno de

los primeros eventos de transcripción en la activación neuronal es la expresión del gen c-

fos. Estudios recientes han sugerido que la cuantificación de la inmunoreactividad del


20

producto de este proto-oncogen puede usarse como marcador de la actividad neuronal ya

que provee información por ejemplo, acerca de las regiones cerebrales que subyacen al

aprendizaje y la memoria (Cammarota y cols., 2000; Santín y cols., 2003; Conrad y cols.,

2004) o al inicio de reacciones emocionales en situaciones de peligro (Lamprea y cols.,

2002). De esta manera, los resultados obtenidos a partir del presente proyecto permitirán

una mejor comprensión de los mecanismos neurales implicados en el aprendizaje espacial

de diferentes características y su relación con los efectos del estrés agudo.


21

OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar las posibles diferencias en la inmunoreactividad de la proteína Fos en secciones

seriales del cerebro de ratas expuestas a protocolos de ocho o dieciséis ensayos de

adquisición de una tarea espacial en el laberinto circular de Barnes.

Objetivos Específicos

a) Determinar las posibles diferencias en los indicadores comportamentales de

aprendizaje y memoria, en ratas expuestas a protocolos de ocho o dieciséis ensayos

de adquisición de una tarea espacial en el laberinto circular de Barnes.

b) Determinar las diferencias en la inmunoreactividad de la proteína Fos en secciones

seriales del cerebro de ratas no expuestas a ninguna tarea de aprendizaje, ratas

expuestas a la tarea y ratas expuestas y no expuestas a una prueba de aprendizaje

posterior al enrenamiento o al sobre-entrenamiento.


22

HIPÓTESIS

Se espera encontrar diferencias en la inmunoreactividad de la proteína Fos en las

secciones seriales del cerebro de ratas, en función del protocolo de aprendizaje espacial

utilizado.

a) Se espera encontrar diferencias comportamentales en el aprendizaje en la tarea en el

laberinto circular de Barnes en relación con el protocolo.

b) Se espera encontrar diferencias en la inmunoreactividad de la proteína Fos en

secciones seriales del cerebro de ratas después de la evaluación de la memoria

espacial realizada veinticuatro horas después del entrenamiento o del sobre

entrenamiento.


23

MATERIALES Y MÉTODOS

Sujetos Experimentales

Cuarenta y ocho ratas Wistar macho con un peso de 320 ± 20 g. provenientes del

Bioterio Central de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad

Nacional de Colombia. Las ratas fueron alojadas en cajas comunitarias de polietileno con

cuatro animales por cada caja con libre acceso a agua y comida, excepto durante los

periodos de entrenamiento y pruebas. Los animales fueron mantenidos en un ciclo de

luz/oscuridad de doce horas, con luces encendidas a las 7:00 AM. Antes de iniciar cualquier

procedimiento experimental las ratas fueron aclimatadas al bioterio durante un periodo de

tres días durante los cuales fueron manipuladas (cada uno diez minutos diarios) por el

experimentador.

Treinta y seis de los cuarenta y ocho animales fueron expuestos a una sesión de

entrenamiento, un subgrupo de veinte fue entrenado nuevamente veinticuatro horas

después, mientras que a otro grupo de ocho animales le fue evaluado el aprendizaje

mediante una prueba de retención veinticuatro horas después. Finalmente un subgrupo de

trece animales tomados aleatoriamente de aquellos entrenados en dos sesiones fue evaluado

en una prueba de retención veinticuatro horas después del último entrenamiento. Así, los

animales fueron distribuidos en los grupos experimentales y de control de la siguiente

manera:

Grupo 1 (8E): Sujetos procesados una hora y treinta minutos después del último ensayo de

entrenamiento en un protocolo de ocho ensayos (n = 8).

Grupo 2 (16E): Sujetos procesados una hora y treinta minutos después del último ensayo de

entrenamiento en un protocolo de dieciséis ensayos (n = 7).

Grupo 3 (8E+PCC): sujetos procesados una hora y treinta minutos después de la sesión de

evaluación con caja posterior a ocho ensayos (n=8)

Grupo 4 (16E+PCC): sujetos procesados una hora y treinta minutos después de la sesión de

evaluación con caja posterior a dieciséis ensayos (n=13)


24

Grupo 5 (CTRL1): Sujetos no entrenados que permanecieron cinco (n = 6) días en el

laboratorio.

Grupo 6 (CTRL2): Sujetos no entrenados que permanecieron seis días (n = 6) en el

laboratorio.

Materiales y Equipos

El laberinto de Barnes consiste en una plataforma circular 1.22 metros de diámetro

de acrílico negro elevada un metro del suelo. En la periferia de dicha plataforma se

encuentran 18 orificios bajo los cuales se puede insertar una caja de escape. Los animales

inician la exploración del laberinto desde una caja de salida localizada en el centro de la

plataforma que es retirada a través de un sistema de poleas (Figura 3).

Las sesiones fueron registradas a través de un circuito cerrado de televisión y

grabadas con la ayuda de un aparato grabador de DVD para su posterior análisis con el

software X-Plo-Rat 2005.

Adicionalmente, se utilizó un criostato (marca Leica CM1850) que permitió la

obtención de las secciones seriales de cerebro con un grosor de 60 micras, para la posterior

aplicación de la técnica de inmunohsitoquímica.

Para la observación de las estructuras y toma de fotografías que permitirían el

posterior conteo de células FOS positivas se utilizó un microscopio marca Nikon Eclipse

ME600 con un objetivo de 10 aumentos y una cámara acoplada marca BOSCH Dinion

Color Camera que tenía un aumento de 3,6 X, para un total de 36 aumentos. La captura de

las fotos y el conteo de células requirieron el uso del software Image Pro-Plus 5.1.

Procedimientos

Aprendizaje en el Laberinto Circular de Barnes

Posterior al período de aclimatación al bioterio, los animales pertenecientes a los grupos

experimentales fueron entrenados individualmente en el aprendizaje de la tarea de escape

en el laberinto circular de Barnes mediante el siguiente protocolo:


25

Día 1. Habituación

Los animales fueron retirados de su caja hogar y trasladados al laberinto en una caja

de transporte. Posteriormente fueron introducidos directamente en la caja meta durante un

periodo de dos minutos, para luego ser retirados de la caja meta y llevados nuevamente a la

caja de transporte para un periodo de descanso de un minuto. Después de este intervalo, se

introdujeron nuevamente en la caja meta, pero esta vez por uno de los orificios de la

plataforma, permitiendo su permanencia por un periodo adicional de dos minutos.

Finalmente, las ratas fueron llevadas nuevamente a la caja de transporte por un minuto y

luego colocadas en la caja de salida durante dos minutos, para trasladarlas posteriormente

en la caja de transporte a su caja hogar.

Figura 3: A. Vista superior del instrumento. 0 corresponde al agujero meta. B. los animales son ubicados en la caja de salida (caja celeste) antes de iniciar el ensayo. C. se activa el sistema de poleas y la caja de salida se eleva de la plataforma a la vez que se enciende la luz y el ruido blanco. El agujero gris indica el agujero meta, que tiene la caja meta emplazada. Figura reproducida de Troncoso y cols., (2010).


26

Días 2 y 3. Entrenamiento

Veinticuatro horas después, los animales fueron retirados de su caja hogar en la caja

de transporte y ubicados en la caja de salida por un periodo de treinta segundos. Trascurrido

este periodo, se activó el sistema de sonido y se encendieron las luces que iluminan el

laberinto (estimulación aversiva para los roedores), al tiempo que la caja de salida fue

retirada por medio de un sistema de poleas para permitir la exploración libre del animal. El

ensayo finalizaba cuando la rata se introducía por sí misma al agujero que la conducía a la

caja meta, o cuando se cumplían cuatro minutos de exploración, en cuyo caso, el animal era

conducido por el experimentador al agujero correspondiente. Al finalizar el ensayo, el

animal permanecía en la caja meta durante un minuto y luego era llevado a otra caja donde

permanecía por un periodo de cuatro minutos antes de comenzar un nuevo ensayo. Cada

sesión diaria tuvo un total de ocho ensayos, en los cuales la ubicación de la caja meta no

varió. En el intervalo de cuatro minutos entre cada uno, se limpiaba el laberinto con alcohol

etílico al 10% para borrar rastros de olor.

Día 4. Evaluación del Aprendizaje

Veinticuatro horas después del entrenamiento, los animales eran sometidos a una

prueba (prueba con caja) que consistía en un ensayo igual a cualquiera de los ensayos

realizados durante el entrenamiento. Posteriormente, los animales eran depositados

nuevamente en su caja hogar.

En las sesiones de entrenamiento y de prueba con caja fue registrada la latencia total

de escape (duración del ensayo hasta que el animal llega a la caja meta o es depositado en

ella), la distancia recorrida por el animal, el número de errores totales por ensayo

(exploraciones en agujeros diferentes al agujero donde se encuentra la caja meta) y se llevó

a cabo una ponderación de los errores en función de su distancia respecto al agujero meta.

El procedimiento llevado a cabo se encuentra ilustrado en la Figura 4.

Figura 4. Diagrama esquemático del padquisiciones: IEE: Intervalo entre ensayos. PCC: Prueba con caja (prueba de memoria).

Una hora y treinta minutos después de finalizados los procedimientos

comportamentales, los animales fueron profundamente anestesiados

dosis de 1,6 gr./kg. vía intraperitoneal

seguido de una solución de

Inmunohistoquímica para P

Tras la perfusión intracardíaca, los cerebros de los animales fueron removidos,

inmersos en solución fijadora por

de sacarosa al 25% para crioprotección

Posteriormente fueron congelados en isopentano y cortados en tajadas de 60

con la ayuda de un criostato. Fueron recolectadas diez secciones coronales (a

2.70mm, 0.70mm, 0.20mm,

desde bregma) elegidas para visualizar bilateralmente las siguientes estructuras:

prefrontal (a AP 2.70mm desde bregma),


27

Diagrama esquemático del procedimiento utilizado. IEA: Intervalo entre adquisiciones: IEE: Intervalo entre ensayos. PCC: Prueba con caja (prueba de memoria).

Perfusión Intracardíaca

treinta minutos después de finalizados los procedimientos

comportamentales, los animales fueron profundamente anestesiados con uretano en una

vía intraperitoneal y perfundidos intracardiacamente con PBS 0,1 M

paraformaldehído al 4% preparada en PBS (pH 7.4).

Inmunohistoquímica para Proteína Fos


inmersos en solución fijadora por veinticuatro horas y a continuación colocados en solu

% para crioprotección por un periodo de cuarenta y ocho

Posteriormente fueron congelados en isopentano y cortados en tajadas de 60

con la ayuda de un criostato. Fueron recolectadas diez secciones coronales (a

0.70mm, 0.20mm, -1.30mm, -2.80mm, -3.14mm, -4.16mm, -5.20mm y

desde bregma) elegidas para visualizar bilateralmente las siguientes estructuras:

desde bregma), séptum medial, séptum lateral y


IEA: Intervalo entre adquisiciones: IEE: Intervalo entre ensayos. PCC: Prueba con caja (prueba de memoria).

treinta minutos después de finalizados los procedimientos

con uretano en una

y perfundidos intracardiacamente con PBS 0,1 M

paraformaldehído al 4% preparada en PBS (pH 7.4).


horas y a continuación colocados en solución

por un periodo de cuarenta y ocho horas.

Posteriormente fueron congelados en isopentano y cortados en tajadas de 60-µm de espesor

con la ayuda de un criostato. Fueron recolectadas diez secciones coronales (a AP 3.20mm,

5.20mm y -6.30mm

desde bregma) elegidas para visualizar bilateralmente las siguientes estructuras: corteza

ial, séptum lateral y caudado-putamen


28

(a AP 0.20mm desde bregma), núcleo paraventricular del hipotálamo (a AP -1.30mm desde

bregma), amígdala e hipocampo (a AP -3.14mm desde bregma) y sustancia gris

periacueductal (a AP -6.30mm desde bregma). El procedimiento de marcación

inmunohistoquímica fue realizado en el laboratorio de Psicología Experimental de la

Facultad de Psicología de la Universidad de la Sabana. Las series de tejido fueron

recolectadas en solución anticongelante y procesadas en cubetas de acuerdo con el

protocolo de avidina-biotina, utilizando el kit ABC de Vectastain (Vector, USA, Ref. PK

6101) de acuerdo con las especificaciones descritas por Lamprea y cols., (2002). Las

secciones fueron inicialmente lavadas cinco veces por tres minutos con PBS, incubadas en

H2O2 1% y lavadas cuatro veces más con PBS y luego con PBS-Tritón (0,2%).

Posteriormente, fueron incubadas por diecisiete horas en anticuerpo primario (SC-52

policlonal producido en conejo, Santa Cruz Biotecnology), en una concentración 1:2000 en

PBS 0.1 M, triton-X 0,2 % y albumina bovina. Después de ocho lavados de tres minutos

con PBS, las secciones fueron encubadas por una hora en el anticuerpo secundario

biotilinado anti IgG de conejo producido en caballo (Laboratorios Vector) en una

concentración 1:400. Después de otra serie de lavados con PBS las secciones fueron

incubadas en solución de avidina-biotina para ser nuevamente lavadas con PBS e iniciar el

proceso de revelación con una solución de 3,3'-diaminobenzidina (DAB 0,05%) durante

cinco a ocho minutos. Para suspender el proceso de revelado las secciones fueron

nuevamente lavadas con PBS y montadas en láminas histológicas para su posterior lectura.

La cuantificación de la marcación de células positivas para Fos se realizó sobre

láminas de histología de 1,6 mm2, con la ayuda de un microscopio de luz y siguiendo como

guía el Atlas de Coordenadas Estereotáxicas de Paxinos y Watson (2008). Para cada rata se

evaluó una porción de tejido igual en cada estructura. Todas las regiones cerebrales fueron

cuantificadas bilateralmente en varias secciones dependiendo del tamaño de la misma. Los

núcleos fueron contados individualmente y expresados como número de núcleos positivos

para Fos por 0,1 mm2 (Radulovic y cols., 2000).


29

Consideraciones Éticas

Las condiciones de alojamiento, la totalidad de los procedimientos experimentales y

la disposición de los residuos biológicos y químicos se realizaron observando las

normativas nacionales e internacionales pertinentes: Resolución n° 008430 de 1993 del

Ministerio de Salud y Ley 84 del 27 de diciembre de 1989; también se observaron los

procedimientos para el manejo y cuidado de animales de laboratorio recomendados por la

normativa de la Unión Europea (8616091EU) y los Institutos Nacionales de Salud de los

Estados Unidos de América (National Research Council, 1996) y por la Asociación

Americana de Psicología (APA). Con respecto a la aplicación de las normas anteriormente

citadas, cabe hacer las siguientes aclaraciones: (1) Todo el personal encargado del cuidado

y manejo de los animales de experimentación cuentan con formación específica certificada.

(2) Los animales que fueron sometidos a experimentos potencialmente dolorosos recibieron

anestesia quirúrgica. (3) Al final de los procedimientos de evaluación comportamental, los

animales fueron sacrificados, previa aplicación de una sobredosis de anestésico. (4) Para

garantizar la seguridad de los investigadores, la manipulación de los residuos contaminados

producidos por este estudio se hizo utilizando batas y gorros desechables, guantes de

nitrilo, tapabocas y gafas de protección. (5) Para impedir la contaminación ambiental con

elementos potencialmente tóxicos, los residuos químicos y los materiales desechables

utilizados para la inyección fueron depositados en contenedores adecuados. (6) Los

cadáveres de los animales utilizados en esta investigación fueron incinerados en el

complejo de Ciencias de la Producción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y

Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia.

Tipo de Investigación y Diseño

La presente investigación es de tipo experimental y se llevó a cabo mediante un

diseño factorial 3 X 2. En el Cuadro 1 se encuentra ilustrado el diseño de investigación

utilizado.


30

Prueba de Aprendizaje

No PCC PCC

Protocolo de Entrenamiento

Entrenamiento N=8 N=8 Sobre-entrenamiento N=7 N=13

Sin entrenamiento N=12

Cuadro 1. Diseño experimental factorial 3 X 2. Las variables independientes utilizadas fueron el Protocolo de Entrenamiento y la Prueba de Aprendizaje (PCC).

La primera Variable Independiente fue el protocolo utilizado, en función del

número de ensayos a los que se expone al sujeto, asumiendo los valores de ausencia de

entrenamiento, ocho ensayos (entrenamiento) y dieciséis ensayos de entrenamiento (sobre-

entrenamiento). La segunda Variable Independiente fue la prueba de aprendizaje (Prueba

con caja o PCC), asumiendo los valores de presencia o ausencia de dicha prueba. Las

variables dependientes fueron el número de células Fos positivas en cada una de las

estructuras cerebrales de interés y los siguientes indicadores comportamentales de

aprendizaje:

Latencia a Meta

Entendida como el tiempo en segundos que el animal tarda en entrar a la caja de

escape emplazada en el agujero meta.

Distancia Total

Entendida como la longitud de la trayectoria entre agujeros explorados. Para esta

medición se convierte la ubicación de los agujeros en el laberinto en coordenadas polares

tomando como origen el centro de la plataforma y como radio la distancia entre este y el

centro de los agujeros. De esta forma, cada agujero corresponde a un punto con

coordenadas polares únicas.

Errores Totales

Entendidos como las exploraciones en agujeros diferentes al agujero donde se

encuentra la caja meta, para cada ensayo.

Errores Ponderados

Entendidos como el total de errores ponderados por su distancia al agujero meta. Se

obtienen a partir del conteo de las exploraciones (inflexiones de la cabeza del animal sobre


31

cualquier agujero distinto a la meta) y la multiplicación de cada exploración por su

distancia en centímetros a la meta.

Análisis Estadísticos

Los datos de las medidas comportamentales fueron analizados con un análisis de varianza

(ANOVA) de una vía de medidas repetidas o la prueba no paramétrica Friedman de

medidas repetidas y chi cuadrado, dependiendo del cumplimiento de las pruebas de

normalidad y homogeneidad de varianzas y se utilizaron como pruebas post-hoc los

métodos de comparaciones múltiples de Dunnett y Dunn, respectivamente, para las

comparaciones de la ejecución en los diferentes ensayos de adquisición. También se

llevaron a cabo pruebas t de Student para grupos independientes a fin de comparar la

ejecución en la Prueba de Recuperación en los grupos de ocho y dieciséis ensayos de

entrenamiento. El número de células Fos positivas fue analizado a través de la aplicación de

un análisis de varianza (ANOVA) de una vía o la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis

dependiendo del cumplimiento de las pruebas de normalidad y homogeneidad de varianzas

y se utilizaron como pruebas post-hoc los métodos de comparaciones múltiples de

Bonferroni y Dunn, respectivamente y pruebas t de student para grupos independientes,

para comparar el número de células marcadas en los diferentes grupos, en cada una de las

estructuras evaluadas. Para este propósito se utilizó el paquete estadístico SIGMASTAT

3.5. En todos los casos, el nivel de significancia estadística fue establecido para

probabilidades menores o iguales a 0,05.


32

RESULTADOS

Resultados Comportamentales

La Figura 5 presenta la comparación de la ejecución de los sujetos experimentales durante

la primera sesión de entrenamiento. En la primera parte de la figura (parte A) se puede

observar que los sujetos disminuyeron el tiempo de llegada al agujero meta (tiempo de

latencia) a lo largo de los ensayos (X2(7)=78,237; p<0,001), demostrándose a través de los

análisis post-hoc la existencia de diferencias estadísticamente significativas a partir del

tercer ensayo de adquisición, con respecto al primer ensayo. Al analizar la distancia

recorrida por los sujetos en cada uno de los ensayos (parte B), se observa una disminución

paulatina a lo largo de los ensayos (X2(7) = 39,890; p<0,001); En este caso, el análisis post-

hoc arroja como resultado la existencia de diferencias estadísticamente significativas, con

respecto al primer ensayo, a partir del segundo ensayo de adquisición X2(7) = 39,890;

(p<0,05). Resultados similares se hallaron al analizar la cantidad de errores cometidos y los

errores ponderados, que se redujeron significativamente a lo largo de los ensayos (X2(7) =

30,225; p<0,001) y (X2(7) = 30,810; p<0,001), en este caso, a través de las pruebas post-hoc

se demostró una disminución en el tercer ensayo y a partir del quinto, al compararlos con el

primer ensayo de adquisición (X2(7) = 30,225; p<0,05) y (X2

(7) = 30,810; p<0,001) (partes C

y D). El análisis de los indicadores previamente mencionados permite inferir que los

animales, al culminar la primera sesión de entrenamiento, habían aprendido la tarea

espacial, puesto que en todos los casos hubo una reducción estadísticamente significativa

en el último ensayo de adquisición en comparación con el primero.


33

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3 4 5 6 7 8

Late

nci

a a

me

ta (

s)

Ensayos Primera Sesión

••

•••

•

0

100

200

300

400

500

600

700

1 2 3 4 5 6 7 8

Dis

tan

cia

re

corr

ida

(cm

)


• ••

• •

•

•

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8

Err

ore

s d

e a

gu

jero

(fre

cue

nci

a)


••••

•

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1 2 3 4 5 6 7 8

Err

ore

s p

on

de

rad

os

(cm

)


••

•••

Figura 5: Ejecución de los sujetos experimentales durante el primer ensayo de adquisición. A. Latencia de llegada al agujero meta en segundos. B. Distancia recorrida en centímetros. C. Errores de agujero. D. Errores ponderados. El punto indica diferencias estadísticamente significativas con respecto al primer ensayo de entrenamiento.

A B

D C


34

A fin de establecer las posibles alteraciones en el comportamiento de los sujetos

expuestos a una segunda sesión de entrenamiento, se llevó a cabo una comparación de su

ejecución desde el noveno ensayo hasta el número dieciséis. En la Figura 6 se presentan los

mismos indicadores analizados en la primera sesión de entrenamiento, aplicados a la

segunda sesión. En la primera parte de la figura (parte A) se presenta la latencia de llegada

al agujero meta, donde hubo diferencias entre los ensayos de entrenamiento (F(19, 133) =

2,133; P = 0,044), demostrándose a través de la aplicación de la prueba post-hoc, la

existencia de un incremento estadísticamente significativo en los ensayos número doce,

trece y catorce, en comparación con el noveno ensayo de entrenamiento (primer ensayo de

la segunda sesión). En la parte B de la figura, es posible observar la distancia recorrida por

los animales en el laberinto, antes de llegar al agujero meta, en este caso no se observaron

diferencias estadísticamente significativas a través de los ensayos de entrenamiento (F(19,

133) = 0,994; P=0,438). Resultados similares fueron encontrados al analizar el número de

errores cometidos por los sujetos (F(19,133) = 1,422; P = 0,202) y los errores ponderados (F(19,

133) = 1,251; P=0,280), donde no hubo cambios en la ejecución desde el noveno ensayo

(partes C y D). El análisis de dichos resultados permite dilucidar una relativa estabilidad en

el comportamiento de los sujetos durante la segunda sesión, dado que solamente uno de los

indicadores demostró incrementos estadísticamente significativos en algunos de los ensayos

comparados con el noveno ensayo de adquisición.


35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

9 10 11 12 13 14 15 16

Late

nci

a a

me

ta (

s)

Ensayos Segunda Sesión

•••0

100

200

300

400

500

600

700

9 10 11 12 13 14 15 16

Dis

tan

cia

re

corr

ida

(cm

)


0

5

10

15

20

25

9 10 11 12 13 14 15 16

Err

ore

s d

e a

gu

jero

(fre

cue

nci

a)


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

9 10 11 12 13 14 15 16

Err

ore

s p

on

de

rad

os

(cm

)


Figura 6: Ejecución durante la segunda sesión de entrenamiento para los grupos dos (16E) y cuatro (16E+PCC). A. Latencia de llegada al agujero meta en segundos. B. Distancia recorrida en centímetros. C. Errores de agujero. D. Errores ponderados. El punto indica diferencias estadísticamente significativas con respecto al noveno ensayo de entrenamiento (primer ensayo de la segunda sesión).

A B

C D


36

Posteriormente, se realizó la comparación de la ejecución de los sujetos sometidos a

la prueba de recuperación (Prueba con caja), con sobre-entrenamiento (dieciséis ensayos) y

sin sobre-entrenamiento (ocho ensayos) (Grupos tres -8E+PCC- y cuatro -16E+PCC-). En

la Figura 7 se presenta la ejecución de los individuos, para cada uno de los indicadores. La

parte A de la figura contiene la comparación de la latencia de escape, donde se encontró

una reducción estadísticamente significativa en los sujetos sobre-entrenados con respecto a

los entrenados en una única sesión (t(19) = 2,677; P = 0,015). En la parte B, se presenta la

comparación de la distancia recorrida por los sujetos en el laberinto, donde no se

encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (t(19) = 1,675; P =

0,110). Al analizar el indicador de errores de agujero se encontró nuevamente una

disminución estadísticamente significativa en los sujetos sobre-entrenados en comparación

con los entrenados (t(19) = 2,454; P = 0,024), como se puede observar en la parte C.

Resultados similares fueron encontrados al comparar los errores ponderados de los grupos,

donde la reducción en el grupo sobre-entrenado también fue estadísticamente significativa

(t(19) = 2,113; P = 0,048), este resultado es presentado en la parte D de la figura.


37

0

50

100

150

200

250

Distancia recorrida (cm)

8E+PCC 16E+PCC

PCC

0

5

10

15

20

25

30

35

Latencia a meta (s)

8E+PCC 16E+PCC

PCC

0

50

100

150

200

250

300

Errores ponderados (cm)

Grupo

8E+PCC 16E+PCC

0

1

2

3

4

5

6

Errores de agujero (frecuencia)

Grupo

8E+PCC 16E+PCC

PCC PCC

Grupo Grupo

Figura 7. Ejecución durante la prueba de adquisición o prueba con caja (PCC) para los grupos tres (8E+PCC) y cuatro (16E+PCC). A. Latencia de llegada al agujero meta en segundos. B. Distancia recorrida en centímetros. C. Errores de agujero en frecuencia. D. Errores ponderados en centímetros. El punto indica diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos.

D

B A

C


38

Análisis Inmunohistoquímico

Posteriormente, se realizó un análisis con base en los datos obtenidos a través del

conteo de células Fos positivas en cada una de las estructuras elegidas. Previo a este

análisis, se realizó una serie de comparaciones entre el número de células Fos positivas de

los sujetos pertenecientes a los grupos cinco (CTRL1) y seis (CTRL2), en las diferentes

estructuras. Dado que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre

ellos (ver Cuadro 2), los datos pertenecientes a ambos grupos se consolidaron dentro de un

mismo grupo de comparación llamado CTRL o Grupo cinco, puesto que ninguno de ellos

tuvo entrenamiento en el laberinto circular de Barnes y la única diferencia consistió en el

número de días que estuvieron alojados en nuestro laboratorio.

Estructura Valor de t g.l. Valor de P

Hipocampo-CA1 2,494 5 0,055

Hipocampo-CA3 1,804 5 0,131

Séptum Medial -2,045 3 0,133

Séptum Lateral -0,221 4 0,843

Amígdala 0,905 5 0,407

Corteza Prefrontal 0,289 5 0,785

N. Paraventricular del Hipotálamo 0,138 3 0,899

Sustancia Gris Periacueductal -0,492 3 0,657

Caudado-putamen 0,673 7 0,523 Cuadro 2. Datos de los estadísticos correspondientes a la comparación de la cuantificación de la proteína Fos, por estructuras, entre el grupo de control cinco (CTRL1) y seis (CTRL2). La tabla contiene la estructura en la cual se realizó el conteo, el valor de t, los grados de libertad y el valor de P.


39

El análisis de las estructuras se inició con el hipocampo, áreas CA1 y CA3. En la

Figura 8 parte A, es posible observar los datos resultantes del conteo de células Fos

positivas en el área CA1 del hipocampo, donde se encontraron diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos (F(4,23)=4,590; P=0,009), al realizar pruebas t de student, se

encontró un incremento en los grupos 16E (t(9)=3,132; P=0,012), 8E+PCC (t(10)=3,164;

P=0,010) y 16E+PCC (t(7)=6,313; P=0,001) con respecto al grupo control y en el grupo

16E+PCC (t(6)=-3,663; P=0,011) en comparación con el grupo 8E. Por otra parte, en la

región CA3 se encontraron diferencias entre los grupos (F(4,24)=15,660; P<0,001),

demostrándose, a través de la aplicación de la prueba post-hoc, la existencia de un

incremento estadísticamente significativo en la marcación de los grupos 16E y 16E+PCC

(P<0,05) en comparación con el grupo control y un incremento en los grupos 16Ey

16E+PCC con respecto a 8E y en 16E y 16E+PCC con respecto a 8E+PCC (P<0,05). Estos

resultados se encuentran en la parte B de la figura.

Posteriormente, se llevó a cabo un análisis del séptum, en sus núcleos medial y

lateral. En la parte C de la Figura 8, se presentan los resultados de células Fos positivas en

el núcleo medial del séptum (SM), donde se encontró un incremento estadísticamente

significativo únicamente en el grupo 8E con respecto a 16E (t(5)=2,926; P=0,033). Por otra

parte, en el núcleo lateral del séptum (SL), se encontró un aumento en la marcación en el

grupo 8E+PCC con respecto a 16E+PCC (t(8)=2,363; P=0,046), resultado que es posible

observar en la parte D de la figura.


40

0

200

400

600

800

1000

1200

CTRL 8E 16E 8E+PCC 16E+PCC

Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osit

iva

s e

n

CA

1

Grupo

•

••

*

0

100

200

300

400

500

600

700


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osi

tiv

as

en

CA

3

Grupo

*

•

•

*

*

*

0

50

100

150

200

250


Nú

me

ro

de

Cé

lula

s F

os P

osit

iva

s e

n

SM

Grupo

*

0

50

100

150

200

250

300


Nú

me

ro

de

Cé

lula

s F

os P

osit

iva

s e

n

SL

Grupo

*

Figura 8. Número de células Fos positivas en Hipocampo y Séptum. A. Área CA1 del Hipocampo. B. Área CA3 del Hipocampo. C. Núcleo medial del Séptum (SM). D. Núcleo lateral (SL) del Séptum. Los puntos indican diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control (CTRL) y los asteriscos representan diferencias entre los grupos experimentales.

A B

C D


41

Adicionalmente, se llevó a cabo el análisis del conteo de células Fos positivas en la

amígdala (Am), donde se encontró un incremento estadísticamente significativo en el grupo

8E en comparación con el grupo Control (t(8)=2,531; P=0,035). En la Figura 9 parte A se

pueden observar estos resultados. Otras estructuras estudiadas fueron la corteza prefrontal

(PC), el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVA) y la Sustancia Gris Periacueductal

(PAG). En ninguna de estas estructuras se encontraron diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos (H(4)=1,478; P=0,831), (F(4,19)=0,799; P=0,544) y

(F(3,14)=0,797; P=0,521), respectivamente. En la Figura 9, partes B, C y D se presentan

estos resultados de manera esquemática.

Finalmente, se llevó a cabo el análisis de células Fos positivas en el Caudado-

Putamen (CPu), donde se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos (H(4)=21,915; P<0,001). Al realizar las pruebas t de student se encontró un

incremento en la marcación en los grupos 8E (t(13)=3,156; P=0,008), 16E (t(11)=7,131;

P<0,001) y 16E+PCC (t(12)=9,767; P<0,001) con respecto al grupo control.

Adicionalmente, se hallaron incrementos estadísticamente significativos en los grupos 16E

(t(8)=-4,854; P=0,001) y 16E+PCC (t(8)=-7,074; P<0,001) con respecto al grupo 8E, y en

los grupos 16E (t(7)=5,159; P=0,001) y 16E+PCC (t(8)=-7,003; P<0,001) con respecto al

grupo y 8E+PCC. Estos resultados son presentados de manera esquemática en la parte E de

la Figura 9. Finalmente, en la Figura 10 se presentan las fotografías de algunas de las

estructuras en las que se realizó la cuantificación de la proteína Fos para el presente estudio.


42

0

50

100

150

200

250

300

350

400


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osi

tiv

as

en

PC

Grupo

0

100

200

300

400

500

600

700


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osi

tiv

as

en

Am

Grupo

•

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osi

tiv

as

en

PA

G

Grupo

0

50

100

150

200

250

300

350


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fo

s P

osi

tiv

as

en

PV

A

Grupo

0

200

400

600

800

1000

1200


Nú

me

ro d

e C

élu

las

Fos

Po

siti

vas

en

CP

u

Grupo

* *

•

•

•

*

*

Figura 9. Número de células Fos positivas en diferentes estructuras cerebrales. A. Amígdala. B. Corteza prefrontal (PC). C. Núcleo Paraventricular del Hipotálamo (PVA). D. Sustancia Gris Periacueductal (PAG). E. Caudado-putamen (CPu). Los puntos indican diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control (CTRL) y los asteriscos representan diferencias entre los grupos experimentales.

A B

C D

E


43

Figura 10. Fotografías de las estructuras seleccionadas para la cuantificación de células Fos positivas en diferentes estructuras cerebrales. A. Área Ca1 del Hipocampo (CA1). B. Área Ca3 del Hipocampo (CA3). C. Caudado-putamen (CPu). D. Amígdala (Am). La barra representa 10 µm en todas las fotografías.

8E 16E 8E+PCC 16E+PCC CTRL.


44

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

A continuación se presenta un consolidado de los resultados principales obtenidos

en la presente investigación, que reflejan la eficacia de los dos protocolos utilizados para

generar aprendizaje (ocho y dieciséis ensayos de entrenamiento), las diferencias existentes

entre estos protocolos en términos de ejecución en pruebas de recuperación y las

diferencias en las estructuras activadas por cada uno de ellos.

Inicialmente, se llevó a cabo un análisis de la primera sesión de entrenamiento a fin de

establecer su efectividad en términos de aprendizaje. En este sentido se encontró que:

• Los animales entrenados con una sola sesión de adquisición presentaron una

disminución paulatina a lo largo del entrenamiento, en la latencia de llegada al

agujero meta, la distancia recorrida durante los ensayos, la cantidad de los errores

cometidos en la exploración y los errores ponderados por la cercanía o distancia del

agujero meta, lo que indica que todos los sujetos presentaron un aprendizaje exitoso.

• La reducción en los indicadores previamente citados se mantuvo a lo largo de la

primera sesión de entrenamiento, a partir del segundo y tercer ensayo en el caso de

la latencia y distancia recorrida y a partir del quinto ensayo en el caso de los errores

cometidos.

Una vez verificada la eficacia de los ocho primeros ensayos de entrenamiento (primera

sesión), se procedió a corroborar la estabilidad del comportamiento durante la segunda

sesión, encontrándose que:

• Los animales sometidos a una segunda sesión de entrenamiento (16E y 16E+PCC)

no presentaron diferencias a lo largo de los ensayos de entrenamiento, con respecto

al noveno ensayo (primero de la segunda sesión) en los indicadores de distancia

recorrida, errores de agujero y errores ponderados, lo que indica que el aprendizaje

adquirido durante la primera sesión, se mantuvo durante la segunda sesión,

demostrando estabilidad en el tiempo.

• Esta estabilidad no se observó en la latencia de llegada al agujero meta en tres de los

ocho ensayos de la segunda sesión. Este indicador mostró estabilidad a partir del

decimoquinto ensayo.


45

Tras la verificación de la estabilidad del aprendizaje, se realizó un análisis comparativo

de la eficacia de los dos protocolos de entrenamiento en la prueba de recuperación,

realizada veinticuatro horas después del último ensayo de adquisición. Los resultados son

presentados a continuación:

• Existen diferencias entre las pruebas con caja de los sujetos que fueron entrenados y

aquellos que fueron sobre-entrenados, en los indicadores de latencia de llegada al

agujero meta, errores cometidos y errores ponderados, demostrando que el

protocolo utilizado tuvo efectos sobre la ejecución de los individuos en la tarea de

aprendizaje espacial.

• La distancia recorrida durante la prueba de recuperación no tuvo diferencias en los

dos grupos evaluados.

Una vez realizado el análisis de los datos comportamentales, se procedió a revisar las

diferencias entre los grupos en la marcación de la proteína Fos en cada una de las

estructuras elegidas. La primera estructura evaluada fue el hipocampo, donde se obtuvieron

los siguientes resultados:

• En el área CA1 del hipocampo hubo diferencias entre el grupo control y todos los

grupos cuyo protocolo implicaba enfrentarse a la tarea comportamental durante más

de ocho ensayos (los dos grupos entrenados en dieciséis ensayos y el grupo

entrenado en ocho ensayos, probado veinticuatro horas después), demostrando que

un protocolo de entrenamiento más prolongado genera una mayor activación de la

región CA1 del hipocampo.

• Adicionalmente y apoyando la anterior afirmación, se encontraron diferencias en la

marcación del área CA1, entre el grupo entrenado en el más corto protocolo de

entrenamiento (8E) y el grupo entrenado en el protocolo más prolongado

(16E+PCC).

• En el área CA3, se encontraron diferencias entre el grupo control y los dos grupos

sobre-entrenados (16E y 16E+PCC), demostrando que el sobre-entrenamiento

genera una mayor activación de esta área del hipocampo.

• En la misma vía de los resultados previamente presentados, se encontró que el

sobre-entrenamiento genera una mayor activación en el área CA3 que el


46

entrenamiento en una única sesión de adquisición, con o sin prueba de recuperación,

demostrando que las diferencias entre los dos protocolos de entrenamiento

utilizados generan diferencias en la marcación de células Fos positivas en esta área

del hipocampo.

La segunda estructura cerebral analizada en el presente estudio es el Séptum, en sus

núcleos medial y lateral, encontrando los siguientes resultados:

• En el Séptum medial, no hubo diferencias entre el grupo control y los grupos

experimentales. Por otra parte, los sujetos que no fueron enfrentados a una prueba

de recuperación presentan diferencias en virtud del protocolo de aprendizaje en el

que fueron entrenados, siendo mayor la activación en el grupo entrenado en una

única sesión, con respecto al que fue entrenado en dos sesiones, demostrando que

un entrenamiento corto genera una mayor activación en este núcleo del Séptum.

• Por su parte, en el Séptum lateral no hubo diferencias entre el grupo control y los

grupos experimentales, sin embargo, se presentó una activación diferencial entre los

grupos sometidos a una prueba de recuperación (8E+PCC y 16E+PCC),

demostrando que la recuperación, tras un entrenamiento corto genera una mayor

activación en esta estructura.

Posteriormente, se realizó el análisis de la amígdala, la corteza prefrontal, el núcleo

paraventricular del hipotálamo y la sustancia gris periacueductal encontrándose que:

• La amígdala presentó una activación diferencial en el grupo que tuvo una única

sesión de entrenamiento (8E), con respecto al grupo control, lo que indica que

únicamente el más corto de los protocolos genera una mayor actividad en esta

estructura.

• No existieron diferencias entre los grupos en la activación de la corteza prefrontal,

el núcleo paraventricular del hipotálamo y la sustancia gris periacueductal, lo que

indica que su actividad no es dependiente de los protocolos implementados en la

presente investigación.

Finalmente, se llevó a cabo un análisis de la marcación de la proteína Fos en el

caudado-putámen, donde se obtuvieron los siguientes resultados:


47

• El grupo control demostró diferencias con respecto a los dos grupos sobre-

entrenados (16E y 16E+PCC) y con respecto al grupo entrenado en una sesión sin

prueba (8E). Adicionalmente, los grupos sobre-entrenados presentaron diferencias

con respecto a los grupos entrenados en una única sesión (8E y 8E+PCC), lo que

indica que el sobre-entrenamiento genera una mayor activación en ésta estructura

cerebral que un protocolo corto de entrenamiento.

Es importante mencionar que tal como se planteó en las hipótesis, se encontraron

diferencias significativas en los indicadores comportamentales de aprendizaje en función

del protocolo, medidas a través de la prueba de retención. Adicionalmente, se encontraron

diferencias en la inmunoreactividad de la proteína Fos en las estructuras analizadas, tanto

en los animales procesados después de la adquisición, como en aquellos procesados una vez

realizada la prueba de recuperación. Establecidos los resultados principales, se procederá a

analizarlos a la luz de la teoría existente, a fin de ofrecer una explicación tentativa y

ponderar sus implicaciones, desde el punto de vista psicológico y neurofisiológico.

Durante los últimos años, se ha hecho expresa la necesidad de realizar un trabajo

interdisciplinario entre las neurociencias y el Análisis Experimental del Comportamiento

(AEC), a fin de generar una comprensión más exhaustiva de los fenómenos observados en

estas dos áreas del conocimiento (Branch, 2006; Mechner, 2008). Es por esta razón que el

presente estudio incluye un análisis de los datos comportamentales a través de varios

indicadores que permiten complementar los datos obtenidos a partir del estudio histológico

realizado.

Tras la caída del modelo Estímulo-Respuesta (E-R), planteado por John B. Watson

(1913) y prevalente durante tantos años en la psicología conductual, el concepto de

aprendizaje asociativo sufrió un cambio drástico, pasando de ser un modelo mecanicista y

limitado del comportamiento, a ser amplio y flexible, dando cabida a un sinnúmero de

relaciones entre eventos, que dan la posibilidad al individuo de predecir las consecuencias

que su comportamiento producirá en el ambiente (Rescorla, 1988). Sin embargo, las

primeras teorías relacionadas con el aprendizaje espacial fueron planteadas con un énfasis

más limitado en términos conductuales, así, se asumía que los sujetos resuelven las tareas

espaciales valiéndose de la construcción de mapas cognitivos, a través del establecimiento


48

de asociaciones Estímulo-Estímulo (E-E) entre el contexto y la consecuencia (Tolman,

1948). O’Keefe y Nadel (1978) retomaron los postulados de Tolman y los abordaron desde

las neurociencias, proponiendo la existencia de dos estrategias espaciales: estrategias

táxicas y de navegación, las primeras de naturaleza asociativa e incremental y la segunda,

una estrategia de “todo o nada”, basada en la construcción de un mapa cognitivo, siendo

esta última mediada por el hipocampo. Sin embargo, los resultados no apoyan esta hipótesis

y aunque se asume que existen diferentes grados de complejidad en la resolución de tareas

espaciales, estos no se pueden atribuir a mecanismos diferentes e independientes, sino que

parecen estar mediados por procesos interdependientes de aprendizaje asociativo

(Mackintosh y Chamizo, 2002). Diversos autores asumen el aprendizaje espacial en los

laberintos de Morris y Barnes como una forma de aprendizaje asociativo, producto del

condicionamiento operante (Ziegler y cols., 2002; Lalonde, 1994; Archer y cols., 1988).

Los resultados obtenidos en la presente investigación apoyan estos postulados, dado que se

observa un aprendizaje incremental, de tipo asociativo, correspondiente a un reforzamiento

negativo, donde la probabilidad de aparición de la respuesta instrumental incrementa a lo

largo de los ensayos, con tiempos de latencia cada vez más cortos y menor cantidad de

errores en la ejecución. Este tipo de condicionamiento no solamente aumenta la

probabilidad de presentación de un comportamiento, sino que lo estabiliza en el tiempo

(Domjan, 1999), lo que explica la tendencia a la estabilidad observada en los grupos

expuestos a dos sesiones de entrenamiento en los indicadores de distancia recorrida, errores

de agujero y errores ponderados. Sin embargo, esta estabilidad durante la segunda sesión no

fue tan contundente en la latencia de llegada al agujero meta, lo que indica que aunque se

trata de un sobre-entrenamiento, la adquisición aún se encuentra en curso y este protocolo

no es tan prolongado como para lograr estabilizar la conducta en todos los indicadores

utilizados.

Las investigaciones relacionadas con el sobre-entrenamiento han arrojado

consistentemente resultados que lo sitúan como un factor protector de la memoria, contra

los efectos adversos de diferentes manipulaciones experimentales, como las lesiones en la

corteza visual (Wilcott, 1994), lesiones en la corteza prefrontal (Wilcott y Xuemei, 1990),

lesiones en la amígdala baso-lateral (Rabinak y Maren, 2008) y estrés (Troncoso y cols.,


49

2010; Torres, 2006) entre otros. Desde el punto de vista conductual, se ha encontrado que

el sobre-entrenamiento facilita la reversión del aprendizaje en tareas de discriminación

visual, un efecto llamado ORE (Overtraining Reversal Effect) (McDonald y cols., 2001) y

facilita la extinción de tareas operantes mediante un fenómeno conocido como OEE

(Overtraining Extinction Effect) (Tombaugh, 1967). Adicionalmente, el sobre-

entrenamiento favorece la estabilidad del comportamiento aún contrarrestando los efectos

de la sobreactivación producida por la deprivación de agua en ratas (Mathieu, 1973) y ha

sido utilizado como una herramienta para establecer una línea de base sólida en tareas

espaciales (Robinson y cols., 2004). Los efectos conductuales del sobre-entrenamiento,

observados en la presente investigación son contundentes, mostrando que, aunque el

entrenamiento en un protocolo de una única sesión experimental fue exitoso en la

generación de aprendizaje, el sobre-entrenamiento produjo una disminución significativa en

tres de los cuatro indicadores utilizados en la prueba de recuperación, veinticuatro horas

después del entrenamiento, demostrando estabilidad del aprendizaje aún con el paso del

tiempo. Es posible que la reducción no significativa en el indicador de distancia recorrida

por el animal en el laberinto se deba a que el sobre-entrenamiento no fue lo suficientemente

prolongado como para generar cambios en todos los indicadores, tal como se mencionó

anteriormente.

El hipocampo ha demostrado ser una estructura clave para el aprendizaje y la

memoria, (Squire, 1992), desempeñando un papel de gran importancia en diferentes tipos

de protocolos, como el condicionamiento clásico de huella (LeDoux, 2000),

condicionamiento de miedo al contexto (Trifilieff y cols., 2007), condicionamiento clásico

inhibitorio (Davidson y Jarrard, 2004) y condicionamiento instrumental (Faure y cols.,

2006). La vinculación funcional más clara de esta estructura corresponde al aprendizaje

espacial (D’Hooge y De Deyn, 2001), donde se ha demostrado una gran sensibilidad a las

lesiones en esta estructura (Morris y cols., 1982; Schenk y Morris, 1985; Moser y cols.,

1993), por lo que se ha establecido que su integridad es esencial para este tipo de

aprendizaje (D’Hooge y de Deyn, 2001), así, se ha reportado que el declive en las

habilidades relacionadas con el aprendizaje espacial se debe a cambios anatómicos y

funcionales en el hipocampo (Gallager y Nicolle, 1993; Geinisman y cols. 1995). Por esta


50

razón, no es de extrañar la gran cantidad de diferencias significativas entre los diferentes

grupos en las áreas CA1 y CA3 del hipocampo, en la presente investigación. El hipocampo

está implicado en las diferentes fases de la memoria en diversos tipos de aprendizaje,

participando en procesos de adquisición (Solomon y cols., 1986; Clark y Squire, 1998;

McEchron y cols., 1998), consolidación (Bernabeu y cols., 1997) y recuperación (Holt y

Maren, 1999). En el caso del aprendizaje espacial, se ha encontrado que la inactivación

temporal del hipocampo, aplicándose antes de la adquisición, durante la consolidación o

durante la recuperación, afecta la ejecución en el laberinto acuático de Morris, (Riedel y

cols., 1999), aunque se ha encontrado que la recuperación de memorias remotas podría

resultar menos dependiente del hipocampo (Anagnostaras y cols. 1999; Bontempi y cols.,

1999). En diversas tareas de aprendizaje que implican condicionamiento clásico y operante,

se ha encontrado expresión aumentada de IEGs durante el entrenamiento, en el área CA1,

pero no en CA3 (Faure y cols., 2006), lo que explicaría la razón por la que se observa un

incremento en la activación del área CA1 en el grupo de una sesión con prueba y la

ausencia de incremento en CA3 en los grupos de entrenamiento en la presente

investigación. Knowlton y Fanselow (1998), argumentan que el hipocampo está

permanentemente implicado en tareas cuyas memorias deben adquirirse y recuperarse

durante el desempeño (desempeño de memoria en línea), como el aprendizaje espacial en el

laberinto de Morris, lo que explicaría los altos niveles de actividad en CA1 y CA3 en los

grupos de sobre-entrenamiento.

La importancia de la vía septo-hipocampal en el aprendizaje y la memoria ha

recibido especial atención durante las últimas décadas (Flood y cols., 1998). Así, se ha

encontrado que la actividad del hipocampo depende en gran medida de la integridad del

séptum (Smythe y cols., 1992), adicionalmente, la administración de escopolamina

(antagonista del receptor muscarínico) en el séptum, afecta la función hipocampal y el

desempeño en la tarea de alternación en el laberinto en forma de T (Givens y Olton, 1990).

El séptum medial y la banda diagonal de Broca (MSDB por sus siglas en inglés) conforman

el principal input del hipocampo y son de gran importancia para el aprendizaje y la

memoria espacial (Smith y Pang, 2005). El daño de esta región afecta el aprendizaje y la

memoria y sus lesiones excitotóxicas afectan la navegación en el laberinto acuático de


51

Morris (Hagan y cols., 1988) y otras tareas de memoria espacial (Hepler y cols., 1985a, b),

de la misma forma, las lesiones electrolíticas del área septal medial afectan el aprendizaje

espacial (Winson, 1978). Adicionalmente, las conexiones entre el séptum medial y el

hipocampo sugieren que la cooperación funcional entre estas estructuras sería importante

para la adquisición y el uso de memorias de referencia espacial (Okada y Okaishi, 2010). El

séptum medial proyecta al hipocampo casi completamente ipsilateralmente a través de

fimbria-fórnix y el hipocampo proyecta a esta estructura directamente por la misma vía o

indirectamente a través del séptum lateral (Alonso y Köhler, 1984). Estas dos estructuras

del prosencéfalo que resultan morfológica y funcionalmente diferentes, desempeñan un

papel central en los procesos emocionales y cognitivos superiores (Numan, 2000). Los

estudios con lesiones revelan que estas estructuras contribuyen de manera diferencial al

desempeño en tareas de evitación activa de dos vías (Sparks y LeDoux, 2000; Torras-

Garcia y cols., 2003). El séptum medial se encarga de integrar información acerca de la

significancia biológica de episodios y eventos (Calandreau y cols., 2007). En contraste, el

séptum lateral desempeña un rol importante en la generación del comportamiento,

permitiendo al individuo incrementar las interacciones con los estímulos reforzantes

(Sheehan y cols., 2004). El séptum lateral es inervado por el hipocampo y la amígdala

extendida (Seifert y cols., 1998). Otros autores argumentan que el séptum medial

desempeña un papel crucial en la adquisición de tareas espaciales que implican la solución

de problemas y el séptum lateral podría estar relacionado con la generación del

comportamiento en algunas formas de conducta espacial, más lábiles a las manipulaciones

experimentales (Fraser y cols., 1991; Riedel y cols., 2010). Los resultados obtenidos en el

presente estudio apoyan la hipótesis de que el séptum medial y lateral participan en

procesos diferentes de la memoria espacial, así, el séptum medial presentó una mayor

activación en los sujetos expuestos a una única sesión de entrenamiento, que los sujetos

sobre-entrenados, lo que estaría de acuerdo con que la participación de esta estructura en el

aprendizaje espacial está relacionada con la adquisición de la tarea. Por su parte, el séptum

lateral demostró diferencias entre el grupo entrenado y sobre-entrenado posterior a la

prueba de recuperación, lo que supondría una participación de esta estructura en la


52

recuperación de una tarea entrenada, pero no sobre-entrenada, aunque esta participación

pueda corresponder más a aspectos procedimentales de la prueba que a aspectos cognitivos.

La amígdala es considerada la estructura cerebral moduladora por excelencia de las

emociones y especialmente, de la ansiedad. Esta estructura y sus conexiones aferentes y

eferentes, constituyen los elementos principales del circuito del miedo y del miedo

condicionado. Así, la información sensorial converge en el núcleo lateral de la amígdala y a

través de conexiones intra-amigdalinas, el output se traslada al núcleo central, que controla

una gran cantidad de sistemas efectores involucrados en la expresión de las respuestas

autonómicas y somáticas de miedo, elicitadas por estímulos aprendidos (condicionados) o

no aprendidos (incondicionados) (Rogan y LeDoux, 1996). Los procesos mediados por

NMDA al interior de la amígdala contribuyen al establecimiento de memorias emocionales

y son importantes para los cambios inducidos por estresores en la conducta de ansiedad

(Adamec y cols., 1999). Existe evidencia de que las tareas espaciales en el laberinto

circular de Barnes y el laberinto acuático de Morris producen ansiedad endógena, medida a

través del establecimiento de los niveles de corticosterona en plasma; vale la pena

mencionar que el laberinto de Morris genera niveles ansiedad significativamente superiores

a los encontrados en el laberinto de Barnes (Harrison y cols., 2009). Dado que esta tarea

genera respuestas de ansiedad en el individuo, es de esperarse que haya una activación

superior en la amígdala en al menos uno de los protocolos utilizados, lo que efectivamente

ocurrió en el presente estudio. La exposición a la novedad ha demostrado inducir respuestas

de ansiedad y se ha encontrado que la respuesta ansiosa de los animales frente a la novedad

parece ser más fuerte en espacios abiertos que en lugares encerrados (Ennaceur y cols.,

2006), lo que explica que el incremento en la activación de la amígdala en el presente

estudio se presentara en el grupo de una sola sesión de entrenamiento sin prueba de

recuperación, así, parece ser que el efecto ansiogénico generado por el protocolo utilizado

tiende a disminuir a medida que el individuo se expone repetidas veces a la tarea.

Se ha sugerido que la corteza prefrontal participa en la memoria espacial, pero su

papel específico aún se encuentra en discusión. Así, se ha encontrado que las lesiones en

esta área afectan el desempeño en tareas como el laberinto acuático de Morris y el laberinto

radial de ocho brazos (Porter y Mair, 1997; Sutherland y cols., 1982). Sin embargo,


53

investigaciones más recientes apuntan en una dirección diferente, por ejemplo, Lacroix y

cols. (2002), reportaron que lesiones en la corteza prefrontal medial en ratas generaron

efectos muy leves sobre la ejecución en el laberinto acuático de Morris y en un corredor de

tres paneles (una adquisición más lenta), apoyando la conclusión de que el daño en esta

área no produce consecuencias en el procesamiento de la información espacial. Estos

resultados sugieren que la memoria espacial no depende de la integridad de esta estructura

en los paradigmas previamente mencionados y el déficit inducido por las lesiones depende

de procesos no mnemónicos. Así, los datos reportados en el presente estudio son

congruentes con los hallazgos previamente reportados, dado que ninguno de los grupos

presentó diferencias significativas en la marcación de la proteína Fos en esta estructura, lo

que sugiere que la corteza prefrontal no tiene una activación dependiente de los protocolos

evaluados.

Uno de los correlatos funcionales más importantes del núcleo paraventricular del

hipotálamo, tiene que ver con la modulación de la respuesta neuroendocrina de estrés, a

través de su participación en la activación del eje Hipotálamo - Hipófisis – Suprarrenal

(HHS) (Isgor y cols., 2003). Estudios recientes en psicofarmacología, han sugerido la

participación de esta estructura en la tarea de aprendizaje espacial en el laberinto acuático

de Morris (Upadhya y cols., 2010), aunque esta participación podría estar relacionada con

los niveles de ansiedad endógena producidos por la tarea. Sin embargo, los resultados

arrojados por la presente investigación contradicen a los encontrados por Upadhya y cols.,

(2010) puesto que no se encontraron diferencias significativas en ninguno de los grupos, lo

que podría deberse al tipo de tarea utilizada, pues, si bien, el laberinto de Barnes genera

ansiedad, el laberinto de Morris genera niveles ansiedad superiores y el desempeño de los

animales en dicha tarea es inversamente proporcional a los niveles de corticosterona, efecto

no encontrado en la tarea espacial de Barnes (Harrison y cols., 2009).

Estudios conductuales han mostrado que la sustancia gris periacueductal es un área

integrativa importante capaz de controlar los estados motivacionales del animal al organizar

las respuestas conductuales y reacciones neurovegetativas apropiadas (Sukikara y cols.,

2006; Carobrez y cols., 2001) y es considerada una estructura clave en la modulación de la

estrategia conductual para hacer frente a los contextos aversivos (Kincheski y Carobrez,


54

2010). Adicionalmente, PAG está involucrada en actividades motoras tales como los

movimientos del cuello, la espalda y las extremidades traseras, la regulación

cardiovascular, la vocalización y las conductas de apareamiento, así como el control de la

nocicepción (Mouton y cols., 1997). En esta estructura tampoco se encontró una marcación

diferencial en ninguno de los grupos evaluados en la presente investigación.

La participación del caudado-putamen en el aprendizaje y la memoria espacial ha sido

objeto de una compleja controversia, así, algunos resultados apuntan a que esta estructura

está implicada en estos procesos de manera directa, reportando que las lesiones del

caudado-putamen afectan la adquisición en el laberinto acuático de Morris, sin que este

déficit se deba a problemas en el desempeño motor (Block y cols., 1993; Furtado y

Mazurek, 1996). Sin embargo, existe evidencia que sugiere que la participación de esta

estructura se limita a funciones no mnemónicas (McDonald y White, 1994; Packard y

Teather, 1998), donde la lesión del caudado-putamen no perjudica la adquisición, pero sí

afecta aspectos no espaciales de la tarea. La controversia continúa abierta, aunque esta

estructura parece estar involucrada en aspectos más procedimentales del aprendizaje

espacial (Setlow y McGaugh, 1999). Los resultados obtenidos en el presente estudio

muestran que existe un incremento en la marcación en esta estructura en el grupo entrenado

en una única sesión, sin prueba de recuperación, pero no en el que tuvo prueba de

recuperación, lo que sugiere que esta estructura está implicada en la adquisición, pero no en

la recuperación en la tarea implementada, sin embargo, no es claro si esta participación

tiene que ver con los aspectos cognitivos o procedimentales de la memoria espacial.

Algunos autores afirman que la relación entre la actividad del caudado-putamen y la

ejecución en tareas espaciales estaría relacionada con la estrategia de navegación utilizada.

En este sentido se ha encontrado que los animales en las tareas espaciales, inicialmente

muestran una estrategia de aprendizaje basada en el lugar (alocéntrica), pero después de un

entrenamiento más extenso, comienzan a mostrar un aprendizaje basado en la respuesta

(egocéntrica) (Chang y Gold, 2003). Estos mismos autores encontraron en una tarea

espacial en un laberinto en cruz, que la liberación de acetilcolina durante el entrenamiento y

el sobre-entrenamiento, se mantiene estable en el hipocampo, mientras que en el estriado la

liberación comienza más tarde, lo que coincide con la transición de la estrategia utilizada


55

(egocéntrica o alocéntrica). Los resultados obtenidos en el presente experimento apuntan en

el mismo sentido de los previamente reseñados, mostrando que durante el entrenamiento

existe una importante participación del hipocampo, pero no del caudado-putamen, mientras

que en el sobre-entrenamiento ambas estructuras presentan una actividad incrementada, con

respecto a los controles y a los grupos entrenados en una única sesión. A este respecto

también existe una controversia teórica, puesto que, algunos afirman que las ratas usan una

combinación de estrategias egocéntricas y alocéntricas para resolver el laberinto acuático

de Morris (Moghaddam y Bures, 1996), además, se ha sugerido que los animales

típicamente usan estrategias alocéntricas al inicio del entrenamiento, pero posteriormente

cambian a una estrategia egocéntrica como resultado del sobre-entrenamiento (Chang y

Gold, 2003). Se ha postulado que las estrategias alocéntricas dependen del hipocampo

(McDonald y White, 1994) y las egocéntricas se relacionan con la actividad del núcleo

caudado del estriado (Chang y Gold, 2003). Así, se deduce que los animales inicialmente se

basan en una estrategia declarativa basada en el hipocampo y luego del sobre-

entrenamiento cambian a un mecanismo más procedimental basado en la actividad del

estriado. Algunos autores incluso argumentan que existe un sistema jerárquico de

estrategias (Maaswinkel y Wishaw, 1999). El interés investigativo del grupo de

Neurofisiología Comportamental de la Universidad Nacional recientemente ha incluido el

estudio de las estrategias de navegación utilizadas para resolver el laberinto de Barnes

(Rodríguez, 2010) y hasta el momento se ha evaluado el efecto del estrés y la inyección de

corticosterona sobre dichas estrategias. En este sentido, se sugiere la necesidad de realizar

un estudio que evalúe los efectos del sobre-entrenamiento sobre la estrategia de navegación

en el laberinto circular de Barnes, a fin de lograr una evaluación exhaustiva y una

comprensión más detallada de los fenómenos observados. A este respecto, estudios más

recientes han postulado que, en el laberinto de Morris, las claves alocéntricas parecen ser

más dominantes que las egocéntricas y que normalmente los animales asumen un tipo de

solución para la tarea espacial y no siempre cambian la estrategia de aprendizaje como

consecuencia del sobre-entrenamiento, lo que pone en entredicho los postulados acerca de

la jerarquización de las estructuras (Kealy y cols., 2008).


56

Adcionalmente, se ha encontrado que un mayor número de sesiones de entrenamiento

puede proteger al aprendizaje de los efectos deletéreos del estrés (Torres, 2006; Troncoso y

cols., 2010), de la inactivación de estructuras (Prado-Alcalá y Cobos Zapiaín, 1979; Prado-

Alcalá y cols., 1980) y del envejecimiento (van Groen y cols., 2002). De acuerdo con estos

hallazgos, Prado-Alcalá (1995) propone un modelo explicativo del aprendizaje y el sobre-

aprendizaje. Como ya se ha mencionado, la inactivación o lesión de diversas estructuras

tienen en efectos deletéreos sobre el aprendizaje espacial, se sabe que existe un conjunto de

núcleos cerebrales indispensables para el establecimiento de la memoria y basta con que

una de ellas deje de funcionar para que se afecte la adquisición o la consolidación. Estos

hechos permiten postular que dichas estructuras se encuentran conectadas funcionalmente,

en serie y que la información debe pasar por cada una de ellas antes de llegar a un centro de

integración, de cuya activación depende la consolidación de la memoria. Así, el daño de

cualquiera de las estructuras genera un déficit general en el desempeño. Por el contrario, el

aprendizaje incrementado (por el fortalecimiento de los reforzadores o por el sobre-

entrenamiento) genera un cambio en la configuración de las estructuras, conectándolas en

paralelo, así, las alteraciones en el funcionamiento de una de las estructuras no genera un

déficit, dado que la actividad derivada de la experiencia sigue su trayecto directamente

hacia el centro integrador, permitiendo la consolidación de la memoria. Los resultados

arrojados por el presente estudio no apoyarían dicho modelo, puesto que aunque algunas

estructuras se activan tanto en los grupos entrenados como en los sobre-entrenados,

estructuras como el caudado-putamen y el área CA3 del hipocampo presentan una

activación diferencial, presente únicamente en el sobre-entrenamiento, lo que sugiere que el

aprendizaje incrementado no solamente modifica el tipo de conexión entre las estructuras

involucradas, sino que estructuras diferentes, que no están implicadas en las primeras fases

del entrenamiento, comienzan a hacerse cargo de la ejecución en la tarea.

La presente investigación representa un importante avance para el grupo de

Neurofisiología Comportamental de la Universidad Nacional, al establecer las diferencias

en el aprendizaje y la memoria producto del entrenamiento y del sobre-entrenamiento, así

como de la participación de estructuras tradicionalmente asociadas con la memoria

espacial, la ansiedad y el cambio de formas más lábiles de memoria hacia otras más


57

estables en el tiempo. El complemento de esta investigación con el análisis de otros

marcadores cerebrales de actividad, así como la continuidad de los análisis encaminados a

determinar los posibles cambios en las estrategias utilizadas por los animales en una u otra

forma de entrenamiento ofrecerán una explicación más completa sobre la forma en la cual

los animales aprenden a escapar de un ambiente potencialmente aversivo en pocos ensayos

de entrenamiento.

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73

ANEXO 1 A

Diagramas coronales del cerebro de una rata adulta, tomados del atlas de Paxinos y

Watson (2008). Representa el plano antero posterior a 3.20mm, 2.70mm, 0.70mm,

0.20mm,-1.30mm y -2.80mm con respecto a Bregma. En el diagrama, seis de los diez

cortes realizados para la cuantificación de células Fos positivas en diferentes estructuras

cerebrales.


74

ANEXO 1 B

Diagramas coronales del cerebro de una rata adulta, tomados del atlas de Paxinos y

Watson (2008). Representa el plano antero posterior a -3.14mm, -4.16mm, -5.20mm y -

6.30mm con respecto a Bregma. En el diagrama, cuatro de los diez cortes realizados para la

cuantificación de células Fos positivas en diferentes estructuras cerebrales.


75

ANEXO 2 A

RESULTADOS COMPORTAMENTALES PRIMERA SESIÓN

LATENCIA A META Multiple Comparisons versus Control Group (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 E7 vs E1 3,833 6,640 Yes E6 vs E1 3,667 6,351 Yes E8 vs E1 3,556 6,158 Yes E5 vs E1 3,417 5,918 Yes E3 vs E1 2,306 3,993 Yes E4 vs E1 2,194 3,801 Yes E2 vs E1 1,250 2,165 No Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties. DISTANCIA RECORRIDA Multiple Comparisons versus Control Group (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 E7 vs E1 2,875 4,980 Yes E6 vs E1 2,764 4,787 Yes E8 vs E1 2,667 4,619 Yes E5 vs E1 2,653 4,595 Yes E3 vs E1 2,292 3,969 Yes E2 vs E1 1,722 2,983 Yes E4 vs E1 1,694 2,935 Yes Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties.

ERRORES DE AGUJERO Multiple Comparisons versus Control Group (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 E5 vs E1 2,361 4,090 Yes E7 vs E1 2,361 4,090 Yes E6 vs E1 2,236 3,873 Yes E8 vs E1 2,153 3,729 Yes E3 vs E1 1,611 2,791 Yes E4 vs E1 1,375 2,382 No E2 vs E1 1,014 1,756 Do Not Test Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties. ERRORES PONDERADOS Multiple Comparisons versus Control Group (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 E7 vs E1 2,389 4,138 Yes E8 vs E1 2,278 3,945 Yes E6 vs E1 2,250 3,897 Yes E5 vs E1 2,194 3,801 Yes E3 vs E1 1,861 3,224 Yes E4 vs E1 1,292 2,237 No E2 vs E1 0,958 1,660 Do Not Test Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties.


76

ANEXO 2 B

RESULTADOS COMPORTAMENTALES SEGUNDA SESIÓN

LATENCIA A META Multiple Comparisons versus Control Group (Dunnett's Method) : Comparisons for factor: Comparison Diff of Means q' P P<0,050 E9 vs. E13 14,958 3,095 -- Yes E9 vs. E14 12,958 2,681 -- Yes E9 vs. E12 12,881 2,665 -- Yes E9 vs. E11 12,519 2,590 -- No E9 vs. E15 12,147 2,514 -- Do Not Test E9 vs. E16 11,192 2,316 -- Do Not Test E9 vs. E10 5,428 1,123 -- Do Not Test Note: The P values for Dunnett's and Duncan's tests are currently unavailable except for reporting that the P's are greater or less than the critical values of .05 and .01.

DISTANCIA RECORRIDA Source of Variation DF SS MS F P Between Subjects 19 230442,411 12128,548 Between Treatments 7 42435,891 6062,270 0,994 0,438 Residual 133 810995,242 6097,709 Total 159 1083873,544 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,438). ERRORES DE AGUJERO Source of Variation DF SS MS F P Between Subjects 19 661,369 34,809 Between Treatments 7 147,544 21,078 1,422 0,202 Residual 133 1972,081 14,828 Total 159 2780,994 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,202). ERRORES PONDERADOS Source of Variation DF SS MS F P Between Subjects 19 2753880,394 144941,073 Between Treatments 7 575467,082 82209,583 1,251 0,280 Residual 133 8741696,054 65727,038 Total 159 12071043,530 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,280).


77

ANEXO 2 C

RESULTADOS COMPORTAMENTALES PRUEBA DE RECUPERACIÓN

LATENCIA A META Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Latencia 8E 8 0 26,167 19,623 6,938 Latencia 16E 13 0 10,424 6,817 1,891 Difference 15,743 t = 2,677 with 19 degrees of freedom. (P = 0,015) 95 percent confidence interval for difference of means: 3,437 to 28,050 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,015).

DISTANCIA RECORRIDA Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Distancia 8E 8 0 152,689 135,491 47,903 Distancia 16E 13 0 86,333 39,950 11,080 Difference 66,355 t = 1,675 with 19 degrees of freedom. (P = 0,110) 95 percent confidence interval for difference of means: -16,557 to 149,267 The difference in the mean values of the two groups is not great enough to reject the possibility that the difference is due to random sampling variability. There is not a statistically significant difference between the input groups (P = 0,110). ERRORES DE AGUJERO Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Errores 8E 8 0 4,375 3,503 1,238 Errores 16E 13 0 1,615 1,660 0,460 Difference 2,760 t = 2,454 with 19 degrees of freedom. (P = 0,024) 95 percent confidence interval for difference of means: 0,406 to 5,113 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,024).

ERRORES PONDERADOS Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Errores Ponderados 8E 8 0 202,705 211,853 74,902 Errores Ponderados 8E 13 0 67,968 75,444 20,924 Difference 134,737 t = 2,113 with 19 degrees of freedom. (P = 0,048) 95 percent confidence interval for difference of means: 1,295 to 268,178 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,048).


78

ANEXO 2 D

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – CA1

Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 4 1138923,932 284730,983 4,590 0,009 Residual 19 1178509,307 62026,806 Total 23 2317433,240 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0,009).

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G1 6 0 354,250 129,817 52,998 G4 2 0 809,250 233,699 165,250 Difference -455,000 t = -3,663 with 6 degrees of freedom. (P = 0,011) 95 percent confidence interval for difference of means: -758,958 to -151,042 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,011).

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G2 4 0 608,250 316,434 158,217 G5 7 0 227,643 79,391 30,007 Difference 380,607 t = 3,132 with 9 degrees of freedom. (P = 0,012) 95 percent confidence interval for difference of means: 105,747 to 655,467 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,012). Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G3 5 0 731,400 418,755 187,273 G5 7 0 227,643 79,391 30,007 Difference 503,757 t = 3,164 with 10 degrees of freedom. (P = 0,010) 95 percent confidence interval for difference of means: 149,032 to 858,482 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,010). Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G4 2 0 809,250 233,699 165,250 G5 7 0 227,643 79,391 30,007 Difference 581,607 t = 6,313 with 7 degrees of freedom. (P = <0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: 363,744 to 799,470 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = <0,001).


79

ANEXO 2 E

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – CA3

ANEXO 2 F

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – SÉPTUM MEDIAL

Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 4 424253,795 106063,449 15,660 <0,001 Residual 20 135454,545 6772,727 Total 24 559708,340 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001). Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Bonferroni t-test): Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t P P<0,050 G4 vs. G5 376,643 6,632 <0,001 Yes G4 vs. G1 299,000 5,138 <0,001 Yes G4 vs. G3 264,500 4,401 0,003 Yes G4 vs. G2 84,125 1,338 1,000 No G2 vs. G5 292,518 5,671 <0,001 Yes G2 vs. G1 214,875 4,045 0,006 Yes G2 vs. G3 180,375 3,267 0,039 Yes G3 vs. G5 112,143 2,327 0,306 No G3 vs. G1 34,500 0,692 1,000 Do Not Test G1 vs. G5 77,643 1,696 1,000 Do Not Test

Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 4 25304,142 6326,036 1,891 0,158 Residual 17 56880,688 3345,923 Total 21 82184,830 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,158).

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-1 3 0 130,500 15,256 8,808 G-2 4 0 75,875 28,990 14,495 Difference 54,625 t = 2,926 with 5 degrees of freedom. (P = 0,033) 95 percent confidence interval for difference of means: 6,641 to 102,609 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,033).


80

ANEXO 2 G

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – SÉPTUM LATERAL

ANEXO 2 H

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – AMÍGDALA






81

ANEXO 2 I

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – CORTEZA PREFRONTAL

ANEXO 2 J

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – NÚCLEO PARAVENTRICULA R DEL HIPOTÁLAMO

ANEXO 2 K

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – SUSTANCIA GRIS PERIAC UEDUCTAL

Kruskal -Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks martes, diciembre 14, 2010, 09:47:11 p.m. Data source: Data 1 in Notebook 2 Group N Missing Median 25% 75% G-1 1 0 198,000 198,000 198,000 G-2 3 0 265,000 191,125 336,250 G-3 4 0 314,750 268,750 344,250 G-4 5 0 289,500 248,875 313,750 G-5 7 0 309,500 68,750 360,250 H = 1,478 with 4 degrees of freedom. (P = 0,831) The differences in the median values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,831)

ource of Variation DF SS MS F P Between Groups 4 39928,608 9982,152 0,799 0,544 Residual 15 187287,029 12485,802 Total 19 227215,638 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,544).



82

ANEXO 2 L

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – CAUDADO-PUTAMEN

All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 G-4 vs G-5 19,622 4,132 Yes G-4 vs G-3 14,800 2,748 No G-4 vs G-1 11,233 2,179 Do Not Test G-4 vs G-2 3,150 0,551 Do Not Test G-2 vs G-5 16,472 3,219 Yes G-2 vs G-3 11,650 2,040 Do Not Test G-2 vs G-1 8,083 1,471 Do Not Test G-1 vs G-5 8,389 1,869 No G-1 vs G-3 3,567 0,692 Do Not Test G-3 vs G-5 4,822 1,015 Do Not Test Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties.

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-1 6 0 315,833 51,256 20,925 G-2 4 0 628,500 148,916 74,458 Difference -312,667 t = -4,854 with 8 degrees of freedom. (P = 0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: -461,205 to -164,128 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,001).

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-1 6 0 315,833 51,256 20,925 G-4 5 0 883,100 190,201 85,060 Difference -567,267 t = -7,074 with 9 degrees of freedom. (P = <0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: -748,671 to -385,863 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = <0,001).



83

ANEXO 2 L – Continuación

ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO – CAUDADO-PUTAMEN

Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-2 4 0 628,500 148,916 74,458 G-3 5 0 270,100 46,230 20,675 Difference 358,400 t = 5,159 with 7 degrees of freedom. (P = 0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: 194,125 to 522,675 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = 0,001). Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-2 4 0 628,500 148,916 74,458 G-5 9 0 212,278 68,233 22,744 Difference 416,222 t = 7,131 with 11 degrees of freedom. (P = <0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: 287,758 to 544,687 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = <0,001). Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-3 5 0 270,100 46,230 20,675 G-4 5 0 883,100 190,201 85,060 Difference -613,000 t = -7,003 with 8 degrees of freedom. (P = <0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: -814,860 to -411,140 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = <0,001). Group Name N Missing Mean Std Dev SEM G-4 5 0 883,100 190,201 85,060 G-5 9 0 212,278 68,233 22,744 Difference 670,822 t = 9,767 with 12 degrees of freedom. (P = <0,001) 95 percent confidence interval for difference of means: 521,177 to 820,468 The difference in the mean values of the two groups is greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference between the input groups (P = <0,001).


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ANEXO 3 A

PROTOCOLO TAREA ESPACIAL DE BARNES UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

LABORATORIO DE NEUROFISIOLOGÍA COMPORTAMENTAL

Nota: Antes de empezar la aplicación de cada una de las fases del presente protocolo, asegúrese de encender únicamente las lámparas reflectoras de la cabina de experimentación, encender el quemador de DVD y el televisor, programar el cronómetro, marcar cada uno de los animales y limpiar el laberinto de Barnes y los elementos propios del laberinto como la caja de salida y caja meta con alcohol diluido 10%.

DIA 1 HABITUACIÓN DIA 2 A partir del este día todas la sesiones inician dejando al sujetos por dos minutos en la caja de consolidación. ENTRENAMIENTO

1. Realice los pasos 1 a 5, descritos en la sección anterior. 2. Deje al animal en la caja de consolidación por dos minutos. 3. Si sale de la sala experimental durante este intervalo, asegúrese de dejar la puerta

completamente cerrada. 4. Verifique que el quemador tenga un DVD con capacidad para grabar e inicie la grabación. 5. Retire al animal de la caja de consolidación y ubíquelo en la caja de salida durante 30

segundos. 6. Al finalizar los 30 segundos, encienda los reflectores y la fuente de sonido. Levante la caja

de salida y deje al animal por 240 segundos o hasta que introduzca las tres cuartas partes anteriores de su cuerpo dentro del agujero que contiene la caja meta.

7. Si luego de los 240 segundos el animal no ha ingresado a la caja meta, introdúzcalo dentro del agujero que contiene la caja meta y apague las luces y la fuente de sonido.

8. Después de cada ingreso, el animal debe permanecer en la caja meta por un minuto. 9. Retire al animal de la caja meta y déjelo en la caja de consolidación por cuatro minutos, que

es el periodo inter-ensayo. En caso de que el animal se salga de la caja, retírelo del laberinto y póngalo en la caja de reposo para dar por terminado el ensayo.

10. Durante el periodo inter-ensayo limpie bien el laberinto y cada uno de sus agujeros, al igual que la caja meta y la caja de salida con alcohol diluido al 10%.

11. Repita los pasos 5 a 10 siete veces más. NOTA

1. Si el animal se cae del laberinto, levántelo del piso, apague las luces y la fuente de sonido, déjelo en la caja de consolidación por cuatro minutos y repita el ensayo.

Un animal es excluido del análisis cuando: 2. Se cae de la plataforma dos veces seguidas.


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3. Después del ensayo sexto, incluido, siempre ha cumplido el tiempo máximo de exploración (240seg.).

DIA 3 PRUEBAS DE APRENDIZAJE: Pruebas con caja 1

Antes de iniciar revise que la caja este emplazada en el agujero meta del entrenamiento. 1. La prueba con caja se realiza de la misma manera en que se realiza un ensayo de

entrenamiento. 2. Una vez finalizada la prueba con caja, el animal es devuelto a la caja de consolidación y

permanece allí por dos minutos. EXTINCIÓN

1. Realice 8 ensayos iguales a la prueba sin caja con un intervalo interensayo de 4 minutos. DIA 4 TEST EXTINCIÓN

1. Prueba sin caja. (Como se explicó anteriormente) 2. Lleve al sujeto a la caja hogar.


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ANEXO 3 B

PROTOCOLO DE INMUNOPEROXIDASA EN SECCIONES FLOTANTE S PARA FOS

Anticuerpo Primario : Anti Fos Santa Cruz cat. SC 7202, 1:2000

Anticuerpo Secundario: IgG biotilinado Cabra @coelho, 1:400

Soluciones Características y concentraciones

PBS O,1M pH 7,4

H2O2 H2O2 3% en PBS 0.1M preparado 10 min. antes, mantenido en

refrigeración y protegido de la luz.

PBS - T PBS 0,1M, Triton X-100 0,2%

Tapón de Bloqueo PBS -T + BSA 1% (1gr de BSA en 100ml de PBS - T)

Ac. Primario 1:2000 em Tapón de Bloqueo

Ac. Secundario 1:400 em tampón de Bloqueo

Kit ABC 2 gotas de A + 2 gotas de B + 5ml de PBS

(10ulA + 10ulB + 500ul PBS)

DAB 1mg/ml de DAB en PBS (lista, congelada) + 1ul/ml de H2O2 30% una

hora da reacción


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ANEXO 3 B - Continuación

Solución Tempo

1 Lavado con PBS 5x de 3 min 15 min

2 H2O2 3% en PBS 45 min

3 Lavar PBS 2x rápidas y 3x 5 min 20 min

4 Lavar en PBS – T 4x de 5 min 20 min

5 Bloqueo PBS – T + BSA 2 h

6 Anticuerpo 1 en bloqueo 17 hs

7 Lavar en PBS 8x de 3mim 24 min

8 Anticuerpo 2 en bloqueo 1 h

9 Preparar ABC 30 min antes de usar

10 Lavar en PBS 6x de 5 min 30 min

11 ABC en PBS 60 min

12 Lavar en PBS 6x de 5 min 30 min

13 Preparar DAB

14 DAB 2-5 min

15 Parar reacción con PBS 2x rápidas e 4x5min 25 min

16 Deshidratar / Diafanizar / Montar

17 Inactivar DAB

CURRICULUM VITAE SANDRA CONSTANZA ORTEGA FERREIRA

Formación Académica

� 2007- En curso. Maestría en Psicología.Universidad Nacional de Colombia.

� 2004 - Psicóloga. Fundación Universitaria Konrad Lorenz. � 1999 - Bachiller Académico. Colegio de Nuestra Señora del Pilar

(Chapinero). Otros Estudios

�Curso: “Neurofisiología de las Funciones Ejecutivas”, Profesor Carlos Beltramino PhD. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, 2010.

� VII Encuentro Nacional de Neurociencias / VIII Seminario Internacional de Neurociencias, Universidad del Tolima. Expositora - asistente. Ibagué, Tolima, 2010.

� Curso de Neurociencia Experimental Universidad del Tolima – COLNE (Colegio Colombiano de Neurociencias) - IBRO (International Brain Research Organization). Asistente. Ibagué, Tolima, 2010.

� Curso: “Aproximación Transdisciplinaria al Estudio del Comportamiento Exploratorio: Una Visión desde la Biología y la Psicología”, Profesores Silvio Morato de Carvalho PhD. y Mara Ignez Campos PhD. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, 2009.

� IV IBRO School of Neuroscience in Brazil (ISBRA- Cognitive Neuroscience Course). Asistente. Búzios, Río de Janeiro, 2008.

� I Congresso IBRO/LARC de Neurociências da América Latina, Caribe e Península Ibérica. Asistente. Búzios, Río de Janeiro, 2008.

� Curso: “Introdução à Modelagem do Comportamento Animal por Redes Neurais”. Asistente. Búzios, Río de Janeiro, 2008.

� VI Encuentro Nacional de Neurociencias / VII Seminario Internacional de Neurociencias, Universidad Nacional de Colombia - COLNE (Colegio Colombiano de Neurociencias). Apoyo logístico, asistente. Bogotá, 2008.

� Course: “Adaptive Specializations in Learning”, Professor Michael Domjan Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, 2007.

� V Behavioural Sciences Meeting, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, 2007

� Expoacademia, Fundación Universitaria Konrad Lorenz. Participante. Bogotá 2000, 2001, 2002, 2003.

� X Congreso Colombiano de Psicología, Universidad Nacional de

Colombia. Participante. Bogotá, 2002. � II Jornada de Análisis Experimental del Comportamiento, Fundación

Universitaria Konrad Lorenz. Organizadora y Ponente. Bogotá, 2002. � I Jornada de Análisis Experimental del Comportamiento, Fundación

Universitaria Konrad Lorenz. Participante. Bogotá, 2001 Experiencia Investigativa: Tesis de Maestría en Psicología, Universidad Nacional de Colombia - 2010. Evaluación de los Cambios en la Marcación de Proteína Fos en Dos Protocolos de Aprendizaje Espacial en el Laberinto Circular de Barnes, bajo la dirección de Marisol Lamprea Rodríguez, MSc., PhD. y la co-dirección de Andrea Milena García, MSc., PhD. Trabajo Investigativo, Universidad Nacional de Colombia - 2009. Evaluación de los Cambios en los Niveles de Corticosterona Producidos por el Estrés y por el Entrenamiento en una Tarea de Aprendizaje Espacial en el Laberinto Circular de Barnes, bajo la supervisión de Marisol Lamprea Rodríguez, MSc., PhD. y Francisco Alejandro Múnera, MSc., PhD. Experiencia Docente y Profesional:

�UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – Bogotá D.C. Cargo: Asistente Docente - Asignatura de Fundamentos de Psicología, Agosto de 2010 – Diciembre de 2010.

�UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – Bogotá D.C. Cargo: Asistente Docente. Asignatura de Aprendizaje Enero de 2010 – Junio de 2010.

�ESCUELA SUPERIOR DE CIENCIAS EMPRESARIALES - Bogotá D.C. Cargo: Docente Medio Tiempo. Julio de 2009 – Diciembre de 2009.

�MONTAJES DE INGENIERÍA DE COLOMBIA -MICOL S.A.– Bogotá D.C. Cargo: Coordinadora de Recursos Humanos. Marzo de 2009 – Junio de 2009.

�UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – Bogotá D.C. Cargo: Estudiante Auxiliar con funciones Docentes. Asignatura de Fundamentos de Análisis Experimental del Comportamiento Agosto de 2008 – Diciembre de 2008.

�UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – Bogotá D.C. Cargo: Monitora. Asignatura virtual de Métodos Cuantitativos de Investigación. Marzo de 2007 – Junio de 2007.

�AGROPECUARIA CUERNAVACA S.A. - Chía Cund. Cargo: Psicóloga. Julio de 2006 – Marzo de 2007.

�INDUSTRIAS RB S.A. – CHARLIE’S ROASTBEEF - Bogotá D.C. Cargo: Jefe de Recursos Humanos. Diciembre de 2005 – Julio de 2006.

�COLEGIO NUESTRA SEÑORA DEL ROSARIO - Bogotá Cargo: Practicante en Psicología Organizacional. Julio de 2004 – Diciembre de 2004.

�COLEGIO NUESTRA SEÑORA DEL ROSARIO - Bogotá Cargo: Practicante en Psicología Clínica. Enero de 2004 – Junio de 2004.

trabajo de grado para optar por el título de magister en ... · dos protocolos de aprendizaje...

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