Tinción celular

Técnicas de microscopía óptica más usadas:• Combinación de colorantes basófilos y acidófilos (por

ejemplo, Hematoxilina-Eosina, Tricrómico de Mallory)• Histoquímica (Fosfatasa ácida, PAS [ácido periódico-

Schiff])• Inmuno-histoquímica (uso de Anticuerpos contra

estructuras específicas, conjugados con moléculas fluorescentes [fluoresceína, rodamina, etc] o con enzimas)

Microscopía electrónica de transmisión y de barrido

Hematoxilina-Eosina: Técnica de coloración

•Fijación de la muestra con Formalina (solución acuosa tamponada de formaldehído). Detiene el metabolismo y conserva la estructura del tejido (proteínas pero no lípidos mal fijador de membranas).

•Lavado y deshidratación (serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta el 100%). Extracción del alcohol con Xileno, luego inclusión de la muestra con parafina fundida (miscible en Xileno). Enfriamiento y endureci-miento de la parafina Taco cortes de 5-15 de espesor con micrótomo que se montan sobre portaobjetos.

•Coloración con Hematoxilina: extracción de la parafina con Xileno, re-hidratación del corte con soluciones alcohólicas de concentración decreciente, y tinción con solución acuosa de Hematoxilina.

•Coloración con Eosina: deshidratación del corte con soluciones alcohólicas de concentración creciente, y tinción con solución alcohólica de Eosina. Lavado con Xileno, agregado de un líquido de montaje no acuoso, y cobertura con un cubre-objetos para lograr un preparado permanente.

Hematoxilina-Eosina: Fundamento de la coloración

La Eosina es un colorante ácido (predomina densidad de carga negativa), por lo cual se asocia y colorea a estructuras catiónicas del citoplasma y matriz extracelular, tales como: filamentos citoplasmáticos (como los de células musculares); membranas intracelulares; y fibras extracelulares (por sus aminoácidos básicos ionizados).

La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante básico, por lo cual se asocia y colorea estructuras aniónicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o carboxilos ionizados):

•Heterocromatina y nucléolos

•RNA ribosomal

•Matriz extracelular (por los sulfato de los GAG)

Ácido periódico-Schiff (PAS): Fundamento

El ácido periódico rompe la unión entre carbonos con hidroxilos adyacentes, y forma grupos aldehído. El reactivo de Schiff reacciona con los aldehídos para dar un color rojo púrpura intenso.

La reacción de PAS tiñe carbohidratos, y se usa para detectar:

•Gránulos de glucógeno

•Moco en diversas células

•Membrana basal de los epitelios

•Fibras reticulares del tejido conjuntivo

Microscopía electrónica: fundamentos vistos en la clase