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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y
RECURSOS NATURALES
RELACIÓN ENTRE LA FRECUENCIA DE MUTACIÓN Y
LONGEVIDAD EN Drosophila melanogaster PROVOCADAS POR
RADIACIÓN IÓNIZANTE Y ANTIOXIDANTES EXÓGENOS
TESIS
QUE PARA EL OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS
AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES
PRESENTA:
MARÍA ELENA GONZÁLEZ HERRERA
COMITÉ DE TUTORES
Dra. Martha Patricia Cruces Martínez
Dr. Adalberto Emilio Pimentel Peñaloza
Dr. Mariusz Krysztof Janczur Feret
El Cerrillo Piedras Blancas, Toluca Estado de México Marzo, 2017
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Dedicatorias
A Diego, jamás dejes de luchar por tus sueños.
A mi madre Leticia Herrera, eres mi mejor ejemplo de perseverancia, fortaleza y
valentía nunca será suficiente la recompensa por tu apoyo y amor.
A ti papá (QEPD)
A Luis Enrique, Edith, Evelin por sus consejos, su ayuda, por creer en mi
A Frida, Nadia, Karla y Omar
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RESUMEN
Dado el incremento significativo de las enfermedades relacionadas con el envejecimiento y
ante la imposibilidad de evitar la exposición de los seres humanos a los agentes que
provocan cambios en el material genético, es necesario establecer estrategias para reducir la
ocurrencia de enfermedades degenerativas. Una alternativa es utilizar sustancias de origen
natural con muy pocos o nulos efectos tóxicos para contrarrestar y proteger del daño
inducido por agentes como la radiación ionizante y otros que generan radicales libres. Entre
estas sustancias se encuentran los antioxidantes, como el ácido ascórbico (AA), la vitamina
E y su análogo el trolox. El objetivo de esta investigación fue evaluar la acción inhibidora
del AA y el trolox en el daño genético inducido por 20 Gy de rayos gama administrados a
las razones de dosis (RD) de 36 o 960 Gy/h y relacionar este efecto con la longevidad de
Drosophila melanogaster. Para este fin se trataron larvas de 48 horas de edad con: 0.5, 1.0
y 1.5 mM de trolox y 25, 50 o 100 mM de AA. Se evaluó la velocidad de desarrollo, la
toxicidad, la frecuencia de mutaciones somáticas y la longevidad de las larvas tratadas
durante 24 horas con los antioxidantes. El tratamiento con AA y en combinación con rayos
gama a la RD de 960 Gy/h disminuyó significativamente la viabilidad de los organismos
tratados. No se encontró reducción del daño genético con ninguno de los tratamientos con
trolox, por el contrario se incrementó. El AA redujo el daño radioinducido solamente
cuando la radiación se administró a la RD baja. En cuanto a la longevidad, los resultados
indicaron que el tratamiento agudo con 1.0 mM de trolox incrementó el periodo de vida
máximo (PVMa) y el tratamiento crónico con AA y en combinación con 10 Gy de
radiación incrementó el PVMa. No se encontró relación entre la frecuencia de mutación
somática y la longevidad de los organismos tratados con trolox ni su combinación con
radiación gama a la RD alta lo que podría sugerir que la prueba de mutaciones somáticas no
es lo suficientemente sensible para detectar las alteraciones que modifican la longevidad de
los organismos.
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ABSTRACT
Due to the significant increase in the aging related diseases and the impossibility of
avoiding the exposure of human beings to agents producing genetic damage, it is necessary
to establish strategies to reduce the occurrence of degenerative diseases. An alternative is
the use substances of natural origin with very low or no toxic effects in order to counteract
the damage induced by agents such as ionizing radiation and others that generate free
radicals. Among these substances are antioxidants such as ascorbic acid (AA), vitamin E
and its analogue. The objective of this research was to evaluate the inhibitory action of AA
and trolox on the genetic damage induced by 20 Gy of gamma rays administered at two
different dose rates (DR), 36 or 960 Gy/h and to relate this effect to Drosophila
melanogaster longevity. For this purpose, 48h old larvae were treated with: 0.5, 1.0 or 1.5
mM trolox or 25, 50 or 100 mM AA. Development rate, toxicity, frequency of somatic
mutation and longevity of larvae treated for 24 h with antioxidants were evaluated. AA 100
mM in combination with gamma rays at DR of 960 Gy/h significantly decreased the
viability of larvae. No reduction of genetic damage was found with any of the trolox
treatments, on the contrary, it increased. AA reduced radiation-induced damage only when
radiation was given at low DR. Regarding longevity, results indicated that acute treatment
with 1.0 mM trolox increased the maximum life span (MLS) and chronic treatment with
AA and in combination with 10 Gy also increased it. No relationship was found between
the somatic mutation frequency and the longevity of trolox-treated organisms or their
combination with gamma radiation at high DR which could suggest that the somatic
mutation test is not sensitive enough to detect alterations that modify longevity of
organisms.
6
AGRADECIMIENTOS
Al posgrado de Maestría en Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, de la
Universidad Autónoma del Estado de México
Al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, por las facilidades otorgadas para la
realización en su totalidad de esta investigación en el laboratorio de Genética de Drosophila
Esta investigación es parte del proyecto 167461 apoyado por el CONACyT Agradezco el
apoyo brindado para realizar la investigación
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca asignada.
De manera muy especial a mis asesores:
Dra. Martha Patricia Cruces Martínez por la formación profesional y humana que me
brindó, por su disposición y aporte de conocimientos, por su calidez y al Dr. A. Emilio
Pimentel Peñaloza por contagiarme el vigor científico y el entusiasmo a la investigación.
De ambos agradezco el que me hayan hecho parte de su principal virtud: su espléndida
docencia. Espero acercarme un poco a lo que ustedes son.
Mi más profundo agradecimiento a Biol. Hugo Suarez Contreras.
Al. Dr Mariusz por el apoyo y conocimientos brindados
A mis compañeros del laboratorio de Drosophila: Luz María, Regina y Yazmín.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esperanza de vida de la población mexicana de 1940 a 2030.
Figura 2. Escala de los eventos posteriores a la exposición a radiación ionizante.
Figura 3. Esquema de los diferentes efectos de la radiación ionizante.
Figura 4. Reacciones que provocan la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO).
Figura 5. Química de las especies reactivas de oxigeno (ERO).
Figura 6. Antioxidantes endógenos (enzimáticos) y exógenos (no enzimáticos) separados
en clases.
Figura 7-a. Modelo y estructura química del ácido ascórbico
Figura 7-b. Metabolismo Redox del ácido ascórbico.
Figura 8. Estructura química del trolox
Figura 9. Algunos antioxidantes utilizados como agentes antienvejecimiento
Figura 10. Mecanismos genéticos involucrados en la formación de manchas en el ensayo
de mutación y recombinación somática
Figura 11. Velocidad de desarrollo de las larvas tratadas agudamente con trolox y con
rayos gama.
Figura 12. Velocidad de desarrollo de las larvas de segundo estadio tratadas 24 h con: AA,
y rayos gama administrada a la razón de dosis de 36 Gy/h y 960 Gy/h.
Figura 13. Supervivencia para hembras y machos de D. melanogaster tratados con
diferentes concentraciones de trolox.
Figura 14. Supervivencia de machos de D. melanogaster tratados con 1.0 mM de trolox.
Figura 15. Supervivencia de hembras y machos de D. melanogaster tratados con 0.5, 1.0 y
1.5 de mM de trolox y rayos gama.
Figura 16. Supervivencia de las hembras y los machos de D. melanogaster tratados con 25
mM de AA y con 10 Gy de rayos gama.
Figura 17. Relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad en semanas
de D. melanogaster después de ser tratadas 24 h con trolox y 20 Gy de rayos gama.
b)
c)
a)
b)
c)
8
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Principales especies reactivas de oxígeno.
Tabla 2. Porcentaje de viabilidad de larvas de D. melanogaster tratadas con trolox solo y en
combinación con 20 Gy de rayos gama.
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de larvas tratadas 24h con AA solo y combinado con
rayos gama a dos diferentes razones de dosis.
Tabla 4. Número de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas en larvas mwh / flr3
pretratadas durante 24h con diferentes concentraciones de trolox solo y combinado con 20
Gy de rayos gama (Razon de dosis: 960 Gy/h)
Tabla 5. Frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas en larvas de 48 h
mwh / flr3 pretratadas con diferentes concentraciones de AA sólo y en combinación con 20
Gy de rayos gama a dos diferentes razones de dosis.
Tabla 6. Longevidad de los adultos de D. melanogaster después de ser pretratados 24 h con
trolox y después con 20 Gy de rayos gama
Tabla 7. Longevidad de adultos D. melanogaster después de ser tratados crónicamente con
AA (25 mM) y rayos gama (10 Gy)
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Evidencia del efecto del uso de antioxidantes sobre la longevidad en Drosophila
9
LISTA DE ABREVIATURAS
Ácido ascórbico AA
Anión superóxido O2-
Catalasa (enzima) CAT
Especies reactivas de azufre SRS
Especies reactivas de nitrógeno ERN
Especies reactivas de oxígeno ERO
Glutatión peroxidasa (enzima) GPx
Marcador recesivo para flare flr3
Multiple Wing Hair (gen) mwh
Periodo de vida PV
Periodo de vida máximo PVMa
Periodo de vida medio PVMe
Prueba de mutación y recombinación somáticas en el ala SMART
Radical hidroxilo OH-
Radical peroxidroxilo HO2
Radicales libres RL
Razón de dosis RD
Superóxido dismutasa (enzima) SOD
Teoría del envejecimiento mitocondrial por radicales libres TERLM
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ÍNDICE RESUMEN ......................................................................................................................................... 4
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 5
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 6
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 7
LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 8
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................................... 9
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 12
2. ANTECEDENTES ...................................................................................................................... 13
2.1. Efectos biológicos de la radiación .......................................................................................... 13
2.2 Efecto de la razón de dosis ...................................................................................................... 16
2. Radicales libres ............................................................................................................................ 17
3. Peroxidación lipídica ................................................................................................................... 20
4 Antioxidantes ................................................................................................................................ 20
4.1. Mecanismos de acción ........................................................................................................... 23
4.2 Intercepción de radicales ya formados ................................................................................... 23
5. Radioprotectores ......................................................................................................................... 23
5.1. Mecanismos de acción de los radioprotectores. ..................................................................... 24
6. Ácido ascórbico ............................................................................................................................ 24
6.1 Acción pro-oxidante del ácido ascórbico ................................................................................ 26
7. Efecto protector de la Vitamina E y su análogo soluble trolox ............................................... 26
8. Envejecimiento ............................................................................................................................ 27
8.1 Relación envejecimiento con enfermedades crónico degenerativas ....................................... 28
9. Efecto de los antioxidantes en el periodo de vida ..................................................................... 28
10. Drosophila melanogaster como sistema biológico ................................................................... 31
10.1 Drosophila melanogaster como modelo biológico para estudios de envejecimiento ...... 31
11. Prueba de mutación y recombinación somáticas en el ala (SMART) ................................... 32
12. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 34
11
13. HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 35
14. OBJETIVO ................................................................................................................................ 36
15. MATERIALES Y MÉTODO ................................................................................................... 37
15.1. Material biológico ................................................................................................................ 37
15.2. Pretramiento con AA y/o trolox: .......................................................................................... 37
15.3. Irradiación: ........................................................................................................................... 37
15.4 Prueba de genotoxicidad ....................................................................................................... 38
15.5 Evaluación de la longevidad: tratamiento agudo .................................................................. 38
15.6 Evaluación de la longevidad: tratamiento crónico ............................................................. 38
15.7. Evaluación de la relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad
provocada por trolox ..................................................................................................................... 39
16. RESULTADOS .......................................................................................................................... 40
16.1 ARTÍCULO ........................................................................................................................... 41
17. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 70
18. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 76
19. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 78
12
1. INTRODUCCIÓN
La exposición de los seres humanos a los diferentes agentes químicos y físicos tales como
la radiación ionizante, además del estilo de vida poco saludable, han provocado un
incremento de las enfermedades crónico degenerativas. Actualmente en México, las
enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte seguida por la diabetes
mellitus y los tumores malignos. De acuerdo al Programa Sectorial de Salud del Plan
Nacional de Desarrollo 2013-2018 (PND), la esperanza de vida para los mexicanos es de
77.2 años para las mujeres y 71.2 para hombres (Fig. 1). Este incremento en la esperanza de
vida ha traído como consecuencia una prevalencia alta de las enfermedades asociadas al
envejecimiento (De Flora et al., 1996).
De acuerdo con la teoría propuesta por Harman en 1956, el envejecimiento es provocado
por la acumulación del daño ocasionado por los radicales libres (RL) en las células
somáticas. Se sabe que durante el metabolismo aerobio se producen incidental e
incontrolablemente especies reactivas de oxígeno (ERO) que una vez generadas,
promueven reacciones que dañan a las macromoléculas de importancia biológica (Riley,
1994). El desequilibrio entre la producción de ERO y las defensas antioxidantes de las
células provocan una condición conocida como estrés oxidante que conduce a una variedad
de cambios fisiológicos y bioquímicos irreversibles, ocasionando deterioro y muerte celular
(Motchnik y Frei, 1994; Wei et al 1996;).
Actualmente y dada la incidencia elevada de las enfermedades relacionadas con el
envejecimiento y la imposibilidad de evitar la exposición de los seres humanos a los
agentes ambientales, es necesario establecer estrategias encaminadas a reducir la ocurrencia
de las enfermedades degenerativas.
Una alternativa es utilizar sustancias de origen natural con muy pocos o nulos efectos
tóxicos para proteger del daño inducido por agentes como la radiación ionizante y otros que
generen RL (Palomo, 2010). Entre las sustancias propuestas como quimio preventores se
encuentran los antioxidantes como la vitamina E o su análogo soluble el trolox, y el ácido
ascórbico (AA) o vitamina C.
Una estrategia eficaz para examinar directamente si estos compuestos tienen efecto en la
longevidad y en las patologías asociadas con el envejecimiento, es determinar si su
administración puede prolongar la vida útil de algunas especies de invertebrados de vida
13
corta, que representan modelos adecuados para explicar el proceso del envejecimiento en
los seres humanos (Kenyon, 2010).
Figura 1. Esperanza de vida de la población mexicana de 1940 a 2030. El Plan de Desarrollo de la
República Mexicana 2013-2018.
2. ANTECEDENTES
2.1. Efectos biológicos de la radiación
La radiación se define como la energía emitida y transferida en el espacio (Riley, 1994) Se
clasifica base en dos criterios: 1) su naturaleza y 2) la energía asociada a ella. Por la energía
asociada se clasifica en ionizante o de alta energía (partículas alfa, beta, rayos cósmicos,
neutrones rayos gamma y X) y no ionizantes (radiaciones ópticas y campos
electromagnéticos) (Leroi et al 2016).
La radiación ionizante es cualquier tipo de radiación capaz de retirar un electrón del átomo
con el que interactúa, a esta interacción de la radiación con la materia se le llama ionización
(Leroi et al 2016). La exposición a la radiación ionizante proviene de fuentes naturales
como algunos elementos radioactivos presentes en el suelo, el agua, el aire o de fuentes
14
artificiales como la medicina nuclear y la radioterapia, plantas nucleoeléctricas y los
accidentes nucleares (Kamran et al., 2016). Algunas partículas de movimiento rápido, es
decir con suficiente energía cinética, también son capaces de producir ionización como las
partículas alfa y beta. La radiación ionizante puede modificar a las moléculas de
importancia biológica de manera probabilística, ya que puede afectar a cualquier estructura
celular y sus efectos son inespecíficos. Los cambios producidos por la radiación pueden
originarse por el efecto directo o indirecto (Del Cura et al., 2009).
El efecto directo ocurre debido a la interacción entre la radiación y la materia en un lapso
de tiempo de femtosegundos 1*10-15 (la escala de estos eventos se observan en la Figura. 2)
e incluyen daño a la membrana, provocando la peroxidación lipídica, alteraciones
moleculares de los enlaces, desarreglos de las bases del ADN, rupturas sencillas o dobles y
aberraciones cromosómicas que pueden culminar en la muerte celular (Kam y Banati,
2013). La expresión a nivel celular del daño molecular que produce la radiación ionizante
puede ser muerte en la interfase, retraso mitótico, muerte diferida y transformación celular
(Del Cura, 2009).
El efecto indirecto es resultado de la acción química de los RL y las ERO generadas por la
interacción del agua y el oxígeno con la radiación ionizante (radiólisis); las ERO
contribuyen al daño celular y los cambios metabólicos y morfológicos provocados en todos
los seres vivos (Kakueva y Portagalov, 1977; Durante y Wu., 2001). Los efectos biológicos
provocados por el efecto indirecto de la radiación ionizante se observan en la Figura 3.
15
Figura 2. Escala de los eventos posteriores a la exposición a radiación ionizante. Tomado y
modificado de Becker., et al., 2005.
16
Figura 3. Esquema de los diferentes efectos de la radiación ionizante. Tomado de Anta et
al., 2002.
2.2 Efecto de la razón de dosis
Uno de los factores que modifican el efecto biológico de la radiación ionizante es la razón
de dosis (RD), que se define como el tiempo de aplicación de una dosis de radiación
determinada (Tanarro y Tanarro, 2008). Para los rayos X y gama es uno de los principales
factores determinantes sobre el efecto biológico de una dosis absorbida (Hall y Gaiccia,
2012). Se ha reportado que el daño disminuye entre los rangos de 1 a 100 centisieverts
cSv/min. Este fenómeno se denomina efecto directo de la razón de dosis y se atribuye al
incremento en la eficacia de los mecanismos de reparación del ADN. El daño radioinducido
en las células somáticas y germinales disminuye cuando la razón de dosis es menor y es
más notable en las células germinales por ser más radiosensibles (Vilenchik y Knudson,
2006).
17
En el campo clínico, la radiación se aplica por escasos minutos; si el tratamiento exige un
tiempo de exposición mayor, entonces la razón de dosis se disminuye para que distintos
procesos biológicos puedan contrarrestar los efectos de la radiación. Estos procesos son
muy importantes para la célula e incluyen: reparación celular, reordenamiento, re-
oxigenación y repoblación. El proceso de reparación celular es el más rápido y puede
ocurrir en fracciones de segundos o minutos, mientras que el reordenamiento ocurre
durante el ciclo celular en un par de horas. La repoblación requiere de más de un ciclo
celular y la velocidad de re-oxigenación en células de humanos es variable, ya que depende
del tiempo de los procesos anteriores (Whiters, 1977).
Para explicar con más detalle este fenómeno, se han realizado investigaciones que
involucran recombinación somática, translocaciones cromosómicas, letalidad celular y
leucemogénesis en los seres humanos debido a que estos procesos implican rupturas dobles
en el ADN, uno de los daños más severos en los sistemas biológicos (Vilechik y Knudson,
2006).
2. Radicales libres
Los radicales libres (RL) se definen como moléculas que tienen un electrón desapareado en
su orbital más externo, lo que los hace muy inestables y reactivos (Gilbert, 2000; Halliwell,
2006). Se derivan de tres elementos: O, N Y S, que forman las especies reactivas de
oxígeno (ERO) nitrógeno (ERN) y de azufre (SRS) (Carocho y Ferreira, 2013). La
reducción parcial del oxígeno molecular produce ERO como el anión superóxido (O2-) y el
radical hidroxilo (OH-). El primero es un radical simple, producido por los complejos uno y
tres de la cadena transportadora de electrones en la mitocondria por la adición de un
electrón al oxígeno molecular. El radical O2- puede ser protonado a pH bajo (pKa = 4.8)
para formar el radical peroxidroxilo (HO2). El H2O2 aunque no es un radical libre, es
producto de la dismutación del O2-: es estable y menos reactivo que el O2
-, sin embargo, en
presencia de metales de transición como el Fe2+, induce la formación del radical OH•, que
puede atravesar las membranas biológicas. El radical hidroperoxilo se disocia a un pH de 7
y forma O2. Este anión es altamente reactivo y puede interactuar con otras moléculas
generando otras ERO. El O2 puede dismutarse a través de la acción de la enzima
18
Superóxido Dismutasa (SOD) vía la reacción de Haber-Weiss y pasar a agua por medio de
la catalasa (CAT). En la Figura 4 se presentan las reacciones que dan lugar a las ERO.
La mayoría de los RL son de vida media corta y se combinan fácilmente entre sí pero
también existen RL derivados de sustancias orgánicas complejas que son estables y no se
combinan rápidamente (Pizzarelo, 1982).
Los RL se producen de manera normal en el metabolismo celular y son indispensables para
llevar a cabo diferentes funciones tales como la señalización celular, la traducción, la
transcripción, la regulación de las proteínas encargadas de controlar el ciclo celular (Zheng,
2000; Lander, 1997) y la activación de los fagocitos y macrófagos del sistema inmune
(McCord, 2000). Se estima que las células humanas diariamente son atacadas por un
número grande de radicales hidroxilo y otras ERO (en promedio 105 veces) (Valko et al.,
2006). El nivel normal de los RL se puede incrementar por factores externos como el
consumo del tabaco, la contaminación ambiental, la radiación ionizante, algunos
medicamentos, los plaguicidas, los solventes industriales y el ozono. Resulta paradójico
que estos elementos esenciales para la vida, en especial el O2 tengan efectos deletéreos en el
cuerpo humano (Lobo et al., 2010).
Los RL y las ERO pueden dañar a todos los componentes de los seres vivos: proteínas,
ADN, ARN, azúcares y lípidos (Lü et al., 2010). Este deterioro se traduce en el desarrollo
de enfermedades como el cáncer, padecimientos cardiovasculares, desórdenes neurológicos
(Alzheimer, Parkinson y Huntington), renales (glomérulo nefritis), artritis reumatoide,
enfermedades autoinmunes, diabetes mellitus, cataratas, autismo, vasculitis, lupus
eritematoso, ulceras gástricas y preclamsia, entre otras (Rahman, 2007; Lobo et al., 2010;
Lü et al., 2010; Singh et al., 2010).
19
Figura 4. Reacciones que provocan la formación de ERO. Las flechas verdes indican
peroxidación lipídica las flechas azules representan reacciones de Haber-Weiss y las rojas
representan la reacción de Fenton. Tomado y modificado de Carocho y Ferreira, 2013.
Figura 5. Química de las especies reactivas de oxigeno (ERO). Tomado de Desikan et al.,
2005.
20
Tabla 1. Principales ERO. Tomado y modificado de Valko et al., 2006.
Radicales libres No radicales
ROO• Radical Peróxido H2O2 Peróxido de
hidrógeno
OH• Radical Hidroxilo 1O2 Singulete de
Oxígeno
O2- Anión Superóxido
3. Peroxidación lipídica
La peroxidación lipídica es uno de los daños más importantes producidos por el radical
hidroxilo ya que altera la estructura e interfiere con las funciones de la membrana celular
(Halliwell, 2006) Las consecuencias de la peroxidación lipídica son las siguientes:
desarreglos estructurales de los componentes de la bicapa lipídica que provocan
alteraciones en la fluidez de la membrana, modificaciones en la permeabilidad, liberación
de las enzimas contenidas en los lisosomas, daño a las proteínas, rupturas en la cadena
polipeptídica e inactivación de enzimas (Girotti, 1985; Wiseman y Ridgway 1999;
Halliwell, 2006). Además, como resultado de la reacción en cadena, se producen el
malondialdehído y el 4-hidroxinolenal ambos altamente tóxicos para la célula.
4. Antioxidantes
Para hacer frente al daño producido por los RL, las células cuentan con defensas
antioxidantes, estas son de carácter enzimático: SOD, CAT y glutatión peroxidasa (GPx) y
no enzimático o exógenos (Figura 6). Los antioxidantes no enzimáticos o exógenos se
definen como cualquier sustancia cuya presencia en el organismo en concentraciones
menores a las de un sustrato oxidable, retrasa o inhibe su oxidación (Halliwell, 1995;
2006). Muchos antioxidantes se encuentran en los alimentos que ingerimos, por lo que sus
niveles en el organismo se pueden incrementar. Los antioxidantes que han sido más
ampliamente estudiados, son el ácido ascórbico AA, el α-tocoferol o vitamina E y el β-
21
caroteno. Estos compuestos presentan una estructura similar que en la mayoría de los casos
es responsable de su actividad e incluye al menos un anillo aromático y uno o más grupos
hidroxilo que pueden actuar como donadores de electrones (Simic y Jovanovic, 1988).
Diferentes estudios muestran que existe una relación inversa entre el consumo de frutas y
verduras ricas en antioxidantes y el riesgo de morbilidad y mortalidad por enfermedades
cardiovasculares (Meydani, 1999). De acuerdo con lo anterior, evitar la deficiencia de
antioxidantes en la dieta es esencial para proteger del efecto aterogénico producido por la
peroxidación lipídica. Se sabe que tanto el AA como la vitamina E previenen la
peroxidación lipídica y otros eventos oxidantes y por eso son considerados como los
mejores antioxidantes en fase acuosa y lipídica respectivamente (Esterbauer et al., 1991).
Ambos neutralizan al oxígeno, capturan radicales hidroxilo y aniones superóxidos.
Adicionalmente el AA regenera la forma oxidada de la vitamina E restituyendo su actividad
antioxidante (Packer, 1994). En la Figura 6 se muestra la clasificación de los antioxidantes
enzimáticos y no enzimáticos separados en clases.
22
Figura 6. Antioxidantes endógenos (enzimáticos) y exógenos (no enzimáticos) separados en clases. Tomado y modificado de Carocho
y Ferreira, 2013.
ANTIOXIDANTES
Enzimáticos
Enzimas primarias
-Superoxido dismutasa
-Catalasa
-Glutatation peroxidasa
Enzimas secundarias
-Glutation reductasa
-Glucosa -6 fosfato-dehydrogenasa
No enzimáticos
Co-factores
-Coenzima Q10
Minerales
-Zinc
-Selenio
Compuestos organosulfurados
-indoles
Ácidos fenólicos
Ácido hidroxicinámico
-ácido ferúlico
-ácido p- cumárico
Ácido hidroxibenzoico
-ácido gálico
-ácido elágico
Vitaminas y derivados
-retinol
-ácido ascórbico
-vitamina K
Caretenoides
-β-caroteno
-licopeno
-luteína
-zeaxantina
Compuestos nitrogenados protéicos
-ácido úrico
Flavonoides
Flavanoles
-Quercitina
Isoflavonoides
-genisteína
Flavonoles
-catequina
Flavanones
-hesperidina
Antocianinas
-cianidina
-pelargonidina
Flavones
-Crisina
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4.1. Mecanismos de acción
Los mecanismos de acción de los antioxidantes pueden clasificarse de manera general en dos
categorías: a) Prevención de la formación de RL; b) Inactivación de los RL.
Dentro de la última categoría, la intercepción de radicales ya formados es el principal mecanismo
de acción (Rose y Bode, 1993).
4.2 Intercepción de radicales ya formados
Los mejores antioxidantes desde el punto de vista biológico deben combinar dos funciones: tienen
que reaccionar con los RL pero como al donar uno de sus hidrógenos los compuestos se
transforman en RL, deben ser capaces también de interactuar con compuestos solubles en agua para
poder regenerarse y recuperar sus funciones (Rose y Bode, 1993). El mejor ejemplo de este
mecanismo está representado por la interacción de la α-tocoferol y el AA.
5. Radioprotectores
La exposición de los seres humanos a la radiación ionizante puede producir diferentes efectos
adversos tales como el Síndrome Agudo de Radiación, que se define como el conjunto de síntomas
potencialmente mortales, que resultan de una exposición aguda de todo o parte del cuerpo humano.
La inducción de este síndrome depende del tipo de radiación, la dosis absorbida y la RD. Debido a
que no se puede evitar la exposición de los individuos a la radiación ionizante, desde hace mucho
tiempo se han realizado estudios con el fin de identificar sustancias que disminuyan o eliminen el
daño de la radiación. Los radioprotectores son agentes que protegen a los sistemas biológicos antes
o durante la exposición a la radiación ionizante. Estos agentes pueden ser naturales o sintéticos,
funcionan como antioxidantes e inmuno-moduladores (Kamran et al., 2016). De manera general
protegen a los sistemas biológicos de la radiación inactivando los RL, induciendo hipoxia,
activando enzimas antioxidantes como SOD y estimulando los mecanismos de reparación.
Los radioprotectores se clasifican en:
a) Radioprotectores de origen natural: vitamina A, C, E, selenio, melanotina, flavonoides y
metilxantinas.
b) Sintéticos que contienen el grupo tiol: amofostina, prC-210.
c) Sintéticos que no contienen el grupo tiol: incluyen los nitroxidos, los bis-benzimidazoles,
los fulerenos.
24
5.1. Mecanismos de acción de los radioprotectores.
El principal mecanismo de acción de los antioxidantes como radioprotectores se basa en su
capacidad para inactivar los radicales OH° y O2-. También mediante la supresión de la formación de
especies reactivas, desintoxicación de las especies inducidas por la radiación (incremento de
enzimas antioxidantes como: SOD, CAT y GPx) y estabilización de la molécula blanco. En general
las vitaminas A, C, E y el selenio ofrecen protección frente a la radiación gama minimizando al
estrés oxidante generado por las ERO (Konopacka, 1998).
6. Ácido ascórbico
El ácido ascórbico (AA) o vitamina C es un micronutriente soluble en agua, esencial para llevar a
cabo múltiples funciones biológicas: participa como co-factor de diversas enzimas, en la
hidroxilación del colágeno, en la biosíntesis de la carnitina y en la conversión de neurotransmisores
como por ejemplo la dopamina a partir de la norepinefrina.
La mayoría de los animales como peces primitivos, anfibios y reptiles, son capaces de producir AA
a partir de la glucosa, pero en los humanos, los primates y los cobayos entre otros, el gen que
codifica la enzima gulonolactona oxidasa que sintetiza el AA no es funcional, por lo tanto dichos
organismos obtienen el AA de su dieta. En condiciones de homeostasis la concentración normal de
AA en el plasma de los seres humanos es de 40-80 mM (Frei, 1989), su deficiencia provoca el
escorbuto (Halliwell, 2001, Arrigoni y De Tullio, 2002).
25
Figura 7. a) Modelo y estructura química del AA: el color negro representa el grupo carbono, el rojo el
oxígeno y el blanco el hidrogeno, b) Metabolismo Redox del ácido ascórbico. Tomado de May, 1999.
Este antioxidante es un potente reductor e inactivador de RL en diferentes sistemas biológicos
(Buettner et al., 1996; May, 1999). En la membrana celular, el AA desempaña el papel de
antioxidante indirecto reduciendo el radical -tocoferoxil a -tocoferol. En la Figura 7b se muestra
el metabolismo del AA, cuando el L-ascórbico se oxida para convertirse en ácido dihidro ascórbico,
se forma el intermediario semidehidro-L-ascorbato que es muy reactivo. La forma oxidada puede
convertirse en ascorbato a través de una reducción. Esto permite que el AA done uno o dos
electrones en las reacciones de hidroxilación. Esta capacidad de interacción electrónica por parte
del ascorbato permite la transferencia de electrones a través de la membrana plasmática (May,
1999). Diversos autores han reportado que el efecto radioprotector del AA es debido a sus
interacciones con los RL inducidos por la radiación (Du et al., 2012) y otros agentes. Usando
Drosophila melanogaster se demostró que el AA combinado con vitamina E, puede promover o
disminuir las aberraciones cromosómicas provocadas por doxorrubicina (Antunes y Takahashi,
1998; Costa y Nepomuceno, 2006). Jagetia, (2004) observó que el AA inhibe la Peroxidación
lipídica inducida por radiación, Olvera et al., 1995 encontraron que la concentraciones de 25, 50 y
a
b
26
100 mM de AA en combinación con 20 Gy de rayos gama disminuyen la frecuencia de mutaciones
y los eventos de recombinación somática. Konopacka, 1998 reportó que el AA a concentraciones
altas incrementa el daño radioinducido. Existen investigaciones, que han demostrado el efecto
radioprotector del AA en diferentes órganos de mamíferos (Jagetia et al., 2002; Artikhov, 1992),
Mahdavi y Mozdarani 2011, evaluaron el efecto protector de la famotidina y el AA en el daño
celular provocado por radiación
6.1 Acción pro-oxidante del ácido ascórbico
A pesar de la gran cantidad de investigaciones que indican que el AA puede reducir el daño
genético provocado por diferentes agentes, existen estudios in vitro e in vivo que aportan evidencia
su efecto pro-oxidante. La combinación de AA y metales de transición como el hierro y el cobre
han sido utilizados por décadas para la inducción de daño oxidante en lípidos, proteínas y ADN
mediante la producción de radicales hidroxilo, facilitada por la reducción de dichos metales
(Halliwell y Gutteridge, 1999). La acción del AA es mediada por la reacción de Fenton, que el
cuerpo humano contrarresta a través de proteínas como la ferritina y transferrina (Halliwell, 1999;
Carr y Frei, 1999). Cabe resaltar que el efecto pro-oxidante del AA no siempre depende de la
presencia de metales de transición (Suh et al., 2003), de manera contrastante, en presencia de CoCl2
el AA aumentó los eventos de recombinación mitótica en células somáticas de Drosophila (Kaya et
al., 2002).
7. Efecto protector de la Vitamina E y su análogo soluble trolox
En 1922, Evans y Bishop descubrieron la vitamina E, posteriormente se determinó que ésta es
efectiva para la prevención de la peroxidación lipídica y otros eventos oxidantes (Esterbauer et al.,
1991). Su mecanismo de acción está relacionado con las propiedades redox de su anillo de cromano
que interrumpe la peroxidación lipídica (Halliwell, 2006).
Diferentes grupos de investigación se han interesado en demostrar la capacidad antioxidante de la
vitamina E, motivados por los estudios realizados in vitro (De Duve y Hayaishi, 1978). La
deficiencia de esta vitamina se ha vinculado con diversas patologías del sistema nervioso central y
periférico, provocando trastornos como miopatías debido al daño que causan los RL en las neuronas
sensoriales (Koholschtter et al., 1988). Aunque existen muchos estudios acerca de la vitamina E en
27
distintos sistemas de prueba, su poca biodisponibilidad, provocada por su baja solubilidad ha
generado resultados contradictorios (Burton e Ingold, 1981, Winterle et al., 1984).
Dado lo anterior se ha sugerido la utilización de un derivado soluble de la vitamina E, el trolox. El
nombre del compuesto soluble en agua es el 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-acido
carboxílico (Fig. 8). Se ha evidenciado el efecto protector del trolox, basado en un mecanismo de
acción parecido al de alfa tocoferol (Yamashita et al., 1998) así como su efecto antioxidante en
células de mamíferos con daño inducido con estrés oxidante tanto in vivo como in vitro (Casini et
al, 1985; Mickle et al.,1989; Wu et al., 1990). En Saccharomyces cerevisiae, se investigó la
actividad antioxidante y pro-oxidante del trolox así como los efectos del estrés oxidante intracelular
durante su metabolismo normal. Se encontraron diferencias significativas relacionadas con la
disminución de la formación de peróxido intracelular, la genotoxicidad en las células tratadas y el
aumento en la degradación de peróxido de hidrógeno. Cabe resaltar, que se ha reportado una
eficacia mayor del trolox comparado con el alfa tocoferol (Satoh et al., 1997). La interacción de
trolox con metales de transición puede facilitar la reducción de estos, acompañada de una sobre-
producción de peróxido de hidrógeno y de radicales hidroxilo. (Burkitt y Milne, 1996).
Figura 8. Estructura química de trolox
8. Envejecimiento
La esperanza de vida de los seres humanos, se ha incrementado considerablemente a partir del siglo
XIX, gracias a medidas como la potabilización del agua, la aplicación de vacunas que previenen
enfermedades infecciosas y el descubrimiento de los antibióticos. En México, el número de
personas mayores de 60 años está aumentando, para el 2020 una octava parte de la población, poco
más de 15 millones, serán adultos mayores y para 2050 este número se duplicará y uno de cada
cuatro mexicanos se ubicará en este grupo de edad (Góngora, 2010).
El envejecimiento es un proceso biológico que se caracteriza por la declinación de funciones, la
acumulación de daño y la reducción de la capacidad reproductiva (Quan y Kinghorn, 2013).
28
Harman, (1956) propuso que el envejecimiento es el resultado de la acumulación del daño
provocado por los RL generados durante el proceso normal del metabolismo. En 1972 planteó que
los RL se generan principalmente en la mitocondria. A partir de entonces, la teoría más aceptada
que explica el proceso del envejecimiento es la teoría del envejecimiento mitocondrial por radicales
libres (TERLM). El soporte científico de esta teoría se basa en las observaciones que han
determinado que la sobreexpresión de las enzimas antioxidantes (o la administración de agentes
antioxidantes) pueden prolongar la vida de diversos organismos (Gems y De la Guardia, 2013).
Existen también dos teorías que intentan explicar el origen biológico y evolutivo del envejecimiento
(Quan y Kinghorn, 2013): 1) Teoría de la pleiotropía antagónica, que sugiere que algunos genes
benéficos durante el desarrollo se vuelven perjudiciales en la vejez (Williams, 1957). 2) Teoría del
soma desechable, que propone que el gasto energético del organismo se deposita en la reproducción
o el mantenimiento de las células somáticas (Kirkwood, 1977). Recientemente surgió la teoría de la
hiperfunción, que argumenta que las funciones útiles durante el desarrollo continúan su curso
cuando su función ya no es necesaria, lo que favorece el envejecimiento y las enfermedades
asociadas, causando hiperplasia, cáncer, acumulación de biomasa u obesidad, dislipidemia y
ateroesclerosis o neurodegeneración por proteinopatía. De manera general esta teoría explica por
qué la disminución de las vías de señalización responsables del crecimiento tiene efectos favorables
para un envejecimiento saludable (Gems y De la Guardia et al., 2013).
8.1 Relación envejecimiento con enfermedades crónico degenerativas
Se define como enfermedad al daño producido en las células que pueden afectar su estructura y
funcióny conducir a la muerte. La explicación más aceptada que aborda la relación enfermedad-
envejecimiento se basa en la presencia anormal de reacciones que producen RL. Ese daño celular
permanece en el cuerpo conforme pasa el tiempo y es dependiente de la genética y el ambiente en
donde se desarrolla el organismo. Una evidencia de ello son los niveles anormales de SOD Zn/Cu y
los niveles altos de aniones superóxido en los vasos sanguíneos presentados en la enfermedad de
Lou Gehrig (Partridge, 2010.).
9. Efecto de los antioxidantes en el periodo de vida
Dado que los RL son los presuntos responsables de la aceleración del proceso normal de
envejecimiento, la administración de los antioxidantes como el AA y el trolox podrían ser una
29
herramienta para dilucidar si su aumento puede prolongar el periodo de vida de modelos biológicos
uni y multicelulares tanto en estudios in vivo como in vitro. En la Figura 9, se muestran los
principales antioxidantes investigados como agentes antienvejecimiento. Tanto para el alfa
tocoferol como para el AA se han realizado investigaciones para analizar si su administración afecta
el periodo de vida de modelos biológicos multicelulares (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis
elegans, Mus musculus). En el cuadro 1 se enlistan las investigaciones realizadas para evaluar el
efecto del -tocoferol el trolox y el AA, en Drosophila melanogaster. Los resultados no son
consistentes debido a variables como el protocolo utilizado y la edad entre otras (Phillips et al.,
2000). Hasta el momento no se ha demostrado con certeza si un antioxidante por si solo puede
incrementar el periodo de vida de los sistemas biológicos mantenidos en condiciones controladas
(Bayne y Sohal, 2002).
Cuadro 1. Evidencia del efecto del uso de antioxidantes sobre la longevidad en Drosophila
Modelo biológico: Drosophila melanogaster
Antioxidante
Parámetro
estudiado
Efecto reportado
Referencia
Trolox y carnosina Longevidad Incremento en los machos
(16%)
Incremento en las hembras
(36%)
Stvolinsky et
al., 2010.
Ácido ascórbico Longevidad
entre cepas
Cepa sueca
Cepa Oregón 10mM
aumento.
100 mM: disminución.
Massie et al.,
1991.
Ácido ascórbico Longevidad Concentraciones altas:
disminución en la
longevidad
Concentraciones bajas: no
hay efecto
Massie et al.,
1976.
Alfa-tocoferol Longevidad
Incremento 8–15% entre
concentraciones y 12%
respecto al control
Miquel et al.,
1976.
Alfa-tocoferol Longevidad en
machos
Solubilizado en etil acetato
3, 20, 200 µg/ml
20µg/ml: eleva la
longevidad
Driver and
Georgeos.,
2003.
30
Figura 9. Algunos antioxidantes utilizados como agentes antienvejecimiento. Tomado y editado de
Sadowska y Bartosz, 2014.
31
10. Drosophila melanogaster como sistema biológico
Drosophila melanogaster es uno de los modelos más utilizados en el estudio de procesos
relacionados con la longevidad, ya que posee ventajas como un ciclo de vida corto, un genoma
totalmente secuenciado (Adams et al., 2000), un sistema complejo de órganos que permite estudiar
el papel de los agentes en diferentes rutas metabólicas que se han conservado durante la evolución
en todos los grupos de eucariontes incluyendo al hombre, el bajo costo de mantenimiento, las
diferentes cepas con las que se cuenta y la disposición para realizar ensayos tanto en células
somáticas como en las germinales (Hui-Ying et al., 2006, Strub et al., 2008). Adicionalmente se
sabe que el 60 % de los genes que provocan enfermedades en los humanos tienen un ortólogo en
Drosophila (Adams et al., 2000).
10.1 Drosophila melanogaster como modelo biológico para estudios de envejecimiento
El envejecimiento ocurre en los organismos donde el crecimiento se detiene justo en el inicio de la
reproducción (Vaupel et al., 2002). Dentro los modelos biológicos más utilizados para estudios de
envejecimiento se encuentran: Saccharomyces cerevisae, Caenorhabditis elegans, Drosophila
melanogaster y Mus musculus.
El uso de Drosophila para realizar estudios de envejecimiento presenta diversas ventajas: 1) vive
aproximadamente dos meses a una temperatura controlada de 25°C 2) la mayoría de sus células son
post-mitóticas, a excepción de algunas células del intestino y las gónadas. Otra ventaja muy
importante en estudios de genética y biología molecular es la manipulación de la expresión de genes
relacionados con el envejecimiento durante la fase adulta, incluso existe un banco de cepas que
incluyen genes sobre expresados. Estas cepas se hallan en el Bloomington Drosophila Stock Center,
E.U Drosophila RNAi Center y The Exelisis Collection at the Harvard Medical School (Rogina,
2010).
Los mamíferos y Drosophila muestran similitud en eventos que ocurren durante el envejecimiento,
lo que indica que este es un proceso conservado evolutivamente. Ejemplos de estas similitudes son:
la disminución en capacidades de locomoción, habilidades de aprendizaje, funciones sensoriales y
las conductas relacionadas al sueño, entre otros.
Estas ventajas han permitido realizar diversas investigaciones sobre el efecto de antioxidantes
exógenos en el sistema Drosophila, que incluyen la relación entre antioxidantes exógenos y
32
endógenos (enzimas), el estrés oxidante y las patologías asociadas al proceso de envejecimiento
(Keaney y Gems, 2003).
11. Prueba de mutación y recombinación somáticas en el ala (SMART)
El ensayo de mutación y recombinación somáticas en el ala (SMART por sus siglas en inglés)
consiste en la exposición de una larva heterocigota para dos marcadores visibles en el adulto a un
mutágeno. Los marcadores que se utilizan en este ensayo son recesivos y modifican el número y la
forma de las tricomas del ala. En condición homocigota el gen mwh (multiple wing hair) produce
múltiples tricomas por célula en lugar de uno solo. Se localiza en el cromosoma 3 a 0.3 unidades en
el mapa. El marcador flr3 (flare) se ubica también en el cromosoma 3, a 38.8 unidades y produce
cerdas en forma de flama o rosetas. En condición homocigota es letal, por lo que está balanceado
con un cromosoma (TM3), al que se le indujeron inversiones múltiples que impide el
entrecruzamiento. TM3, está asociado al marcador dominante Ser que produce alas con los bordes
aserrados (Graf et al., 1984). Las larvas poseen grupos de células destinadas a dividirse un número
finito de veces, de tal manera, que una mutación inducida en alguna de las células expuestas, dará
como resultado una alteración en el fenotipo, que se expresará como una mancha reconocible en la
cutícula del ala del adulto. Esta prueba puede detectar eventos genéticos como mutaciones
puntuales, deleciones conversión génica y recombinación mitótica; esta última es de gran
importancia ya que indica rompimientos cromosómicos y se relaciona con el proceso de
carcinogénesis (Graft et al., 1984).
Como resultado de las modificaciones en el genotipo se producen grupos de células mutantes o
manchas que se clasifican de la siguiente manera:
Clasificación de las manchas:
(Graf et al., 1984)
Por su tamaño:
Tipo de mancha:
Chicas: 1 o 2 células
Grandes: Más de 3 células.
Simples: un solo tipo de células
mwh o flr.
Gemelas: dos tipo de células mwh o
flr
33
La figura 10, representa detalladamente los mecanismos genéticos involucrados en el origen de las
manchas.
Figura 10. Mecanismos genéticos involucrados en la formación de manchas en el ensayo de mutación y
recombinación somática
34
12. JUSTIFICACIÓN
Con base a las evidencias que indican que la sobreproducción de radicales libres aceleran el
envejecimiento al provocar daño celular y que el uso de antioxidantes se ha relacionado con un
incremento en la longevidad, la ingesta de antioxidantes exógenos como el ácido ascórbico y el
trolox, podría ser una alternativa para evitar o disminuir el daño provocado por los radicales libres
durante la vida útil Drosophila melanogaster.
35
13. HIPÓTESIS
Si el envejecimiento se debe al aumento de RL, la administración de antioxidantes como el trolox y
el AA podrían disminuir la frecuencia de mutaciones somáticas provocadas por los radicales libre y
prolongar el periodo de vida de Drosophila melanogaster.
36
14. OBJETIVO
Relacionar la frecuencia de mutaciones somáticas y la longevidad de los organismos tratados con
AA y trolox, solos y en combinación con radiación gama.
Objetivos particulares
1.- Evaluar la toxicidad de diferentes concentraciones de AA y trolox, solas y en combinación con
20 Gy de radiación gama.
2.- Establecer la relación entre la frecuencia de mutaciones somáticas y el periodo de vida de los
organismos tratados con antioxidantes exógenos solos y en combinación con radiación gama.
37
15. MATERIALES Y MÉTODO
15.1. Material biológico Las cepas utilizadas fueron mwh/mwh y flr³/TM3; Ser (Lindsley y Zimm,
1992). Se aislaron hembras vírgenes de 3 a 5 días de la cepa mwh/mwh y machos flr³/TM3; Ser se
dejaron madurar 2 días en medio de cultivo estándar, posteriormente, se cruzaron durante 2 horas en
frascos de 250 ml con medio de cultivo normal y se colectaron huevos durante dos horas para
homogenizar la edad de los organismos. Los huevos se incubaron durante 48 horas en el cuarto de
cultivo a 25+ 1 ºC y 60% humedad relativa para obtener larvas de segundo estadio, éstas se
separaron del medio, por gradiente de densidad en un embudo de separación con una solución de
sacarosa al 20%.
15.2. Pretramiento con AA y/o trolox: Las larvas fueron tratadas durante 24 horas con las diferentes
concentraciones de trolox (0.5, 1.0 y 1.5 Mm) o AA (25, 50 y 100 mM). Ambos se disolvieron en
una solución de sacarosa al 5% para proveer a los organismos de una fuente de energía. El
pretratamiento se administró vía oral en frascos de 250 ml de capacidad que contenían un disco de
papel filtro (Whatmann No. 2) y 3.5 ml de cada solución.
El trolox se adquirió de Sigma Chemical Company (St Louis MO) y el L(+)(-) AA de Merck
(Hillipor, Darmstadt Germany).
15.3. Irradiación:
Finalizado el pretratamiento, las larvas tratadas con cada concentración de los antioxidantes se
enjuagaron con agua corriente y se dividieron en tres alícuotas, una para control y las otras se
irradiaron con 20 Gy de rayos gama una en el irradiador Trans Elecktro LGI-01 (Hungría) con una
razón de dosis de 960 Gy/h y la otra en el irradiador Gammacell 220 Co60 Nordion, Canada con
una razón de dosis de 36 Gy/h.
La irradiación se llevó a cabo colocando las larvas en tubos homeopáticos de 2.5 cm de diámetro y
3 cm de alto, con un circulo de papel filtro (Whatmann No. 2) con 0.1 ml de agua destilada cubierto
con un tapón de poliuretano. Posteriormente las larvas irradiadas y no irradiadas se sembraron en
grupos de 50 larvas por tubos homeopáticos con 0.8 g de medio de cultivo sintético (Fórmula 4-24
Carolina Biological Supply) hidratado con 2.5 ml de agua destilada. Los organismos se introdujeron
en el cuarto de cultivo hasta completar su desarrollo. Cuando los adultos emergieron se contó
38
diariamente el número de hembras y machos por separado para realizar curvas de sobrevivencia y
determinar la velocidad de desarrollo larva-adulto. El número total individuos se consideró como el
índice de viabilidad. Las diferencias estadísticas entre grupos se determinaron mediante la prueba
de Chi cuadrada.
Cada experimento se realizó por triplicado y en condiciones de temperatura (25±1°C) y humedad
(60%) controladas.
15.4 Prueba de genotoxicidad:
Para esta prueba, las larvas se pretrataron como se describió anteriormente. Cuando los adultos
emergieron se fijaron en alcohol al 70%. Las alas de los individuos con genotipo mwh+/+flr3 se
disectaron utilizando pinzas entomológicas para hacer preparaciones fijas. Las alas se montaron con
solución de Faure (goma arábiga, glicerol, hidrato de cloral y agua de acuerdo a Graf et al., 1984) y
se analizaron al microscopio óptico para determinar el número y el tipo de manchas inducidas por
cada uno de los tratamientos. Se utilizó la prueba de Chi cuadrada para establecer diferencias entre
los grupos.
15.5 Evaluación de la longevidad: tratamiento agudo
Después del pretratamiento con trolox y el tratamiento con rayos gama, los adultos se separaron en
grupos de 25 hembras y 25 machos de 4 días de edad en tubos homeopáticos con medio de cultivo
normal. Las moscas se trasvasaban dos veces por semana y se registró el número de individuos
muertos en cada trasvase. Con los datos obtenidos se hicieron curvas de sobrevivencia y los
resultados se analizaron con el programa XL-STAT mediante el método Kaplan Meier. La prueba
emite tres resultados estadísticos: de la prueba de Wilcoxon, de Long Rank y de Tarone-Ware
(Addinsoft, 2011).
15.6 Evaluación de la longevidad: tratamiento crónico
Se propagó la cepa Canton-S (Bloomintong Drosophila Stock Center). Se obtuvieron adultos y se
separaron en grupos de 25 hembras y 25 machos en tubos homeopáticos que contenían 0.8 g de
medio de cultivo sintético hidratado con 2.5 ml de agua destilada (grupo control), una solución de
25 mM de AA en 2.5 ml de agua destilada (grupo AA solo) y otro grupo de organismos que
contenían AA, estos se irradiaron cada dos semanas en el irradiador Trans-elecktro con una dosis de
39
10 Gy. Se registró el número de individuos muertos cada trasvase. Con los datos obtenidos se
hicieron curvas de sobrevivencia y los resultados se analizaron con el programa XL-STAT
mediante el método Kaplan Meier.
15.7. Evaluación de la relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad provocada
por trolox
Para determinar la frecuencia de mutación y recombinación somáticas se sacrificaron al menos 10
organismos de cada concentración de trolox, se fijaron en alcohol al 70% y se separaron las alas,
que fueron montadas por separado en preparaciones fijas. Se analizó el número de mutaciones
somáticas inducidas para establecer una frecuencia de mutación inicial. Lo mismo se hizo con las
alas de los organismos que morían cada dos semanas, con la finalidad de establecer la relación entre
la frecuencia de mutaciones somáticas y la longevidad.
40
16. RESULTADOS
Los resultados correspondientes a la genotoxicidad del AA y su combinación con radiación gama
administrada a dos razones de dosis están incluidos en el siguiente artículo
Acuse de recibo de la editorial International Journal of Radiation Biology
Para María Elena González
41
16.1 ARTÍCULO
Evidence that radioprotector effect of ascorbic acid depends on dose rate.
1González Elena, 1Cruces Martha P*, 1Pimentel Emilio and 2Janczur Maruisz.
1Departamento de Biología. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares. Carretera México-
Toluca S/N. La Marquesa Ocoyoacac, México 52750 [email protected].
2 Universidad Autónoma del estado de México, UAEM. El Cerrillo Piedras Blancas, Toluca Estado
de México 50090. [email protected]
*Corresponding autor: [email protected]
42
Abstract
Purpose: Many studies have revealed that ascorbic acid (Aa) acts as a powerful inhibitor of genetic
damage. The main goal of the present study was to evaluate the radioprotector effect of Aa at two
diferent dose rates.
Matherial and Methods: The Somatic Mutation and Recombination Test in the wing blade of
Drosophila melanogaster was used. Larve 48 h were treated for 24 h with 25, 50 and 100 mM of
Aa. After preteratment larvae were irradiated with 20 Gy of gamma rays administred at 36 or 960
Gy/h. Toxicity, development rate and frequency of mutant spots were recorded.
Results: Results provide evidence of a radioprotective effect for all tested concentrations of Aa
when 20 Gy were delivered at a low dose rate. No differences were found in the development rate
between doses and diferent dose rate. At the highest dose rate, none of the Aa concentrations
reduced the radiation-induced damage.
Conclusion: In considering the use of Aa as radioprotector or therapeutic agent, it is necessary to
distinguish the potential applications of it under different situation to avoid an extra injury.
Keywords: Wing spot test; somatic mutation; D. melanogaster; radiation dose rate, ascorbic acid.
43
Introduction
Biological effects of radiation result from the energy transfer from radiation to the target cell. The
harmful effects of ionizing radiation in biological systems may be induced by direct action by
means of interaction between radiation and target macromolecules or indirect, due to the products
released during the interaction between radiation and water in the living systems (Azzam et al.
2012). The main free radicals produced by ionizing radiation include •OH, H•, H2, and H2O2
causing DNA strand breaks mutations, and peroxidation of membrane lipids resulting in cellular
damage leading to apoptosis, necrosis, cell dysfunction or mitotic cell death (Selim et al. 2016).
Nowadays it is well known that free radical damage of lipids, especially in low density lipoproteins
play a significant role in the development of atherosclerosis (Halliwell 1999) and DNA damage
caused by free radicals is related to degenerative diseases such as Alzheimer, Parkinson and cancer
(Jones et al. 2014; Sanz 2016).
Today, the extensive use of radiation for medical treatment, diagnosis, energy sector, industry,
nuclear accidents, the terrors for nuclear terrorism and even some human activities such as air travel
or to outer space have increased the necessity to identify, develop, and validate potential strategies
to protect normal tissues from the harmful effects ionizing radiation (Singh and Krishnan 2015).
Pharmacological intervention could be the most prudent strategy: the use of compounds, especially
those of natural origin that can act as free radical scavengers and antioxidants able to reduce or
mitigate the deleterious effects of ionizing radiation (Maurya et al. 2006).
Radioprotective agents are substances that reduce the effects of radiation in healthy tissues
(Greenberger 2009). Radioprotective compounds are important to clinical radiotherapy because
normal tissues should be protected against radiation injury while cancers are exposed to higher
doses of radiation to obtain better cancer control. A large number of compounds showed good
radioprotection in in vitro studies, but most of them failed in vivo application due to acute toxicity
and side effects (Weiss and Landauer 2003). There have been many attempts to find an ideal
radioprotector that can preferentially protect normal tissues from radiation damage without
affecting the sensitivity of tumor cells (Bump and Malaker 1997).
To prevent the damage caused by active oxygen species, eukaryotic cells possess antioxidant
systems, such as enzymes that prevent or limit the free radical production: superoxide dismutase,
catalase, and glutathione peroxidase. These enzymes provide important protection against radiation
44
exposure (Scott et al. 1989). Besides the enzymes, the cell can prevent the free radical damage by
means of dietary antioxidants (Weiss and Landauer 2003), such as vitamins A, C, and E,
polyphenols, anthocyanins, flavonoids and isothiocyanates (Meyers et al. 2008).
Vitamin C is the reduced form of Ascorbic acid (Aa) and it is an essential metabolite for a variety
of organisms, it is a water-soluble ketolactone with two ionizable hydroxyl groups that readily
undergoes two consecutive one-electron oxidations to form the poorly reactive ascorbate radical
and the dehydroascorbic acid (DHA) (Du et al. 2012). The protective effects of this compound are
due to its scavenging activity of reactive oxygen species before they attack cellular macromolecules
and represent the first line of antioxidant defense, protecting lipid membranes and proteins from
oxidative damage (Berger et al. 1997). It has been reported that Aa can prevent the adverse effects
of whole body irradiation through increasing the antioxidant defense systems in the liver and kidney
of irradiated animals (Mortavazzi et al. 2015). Pre-treatment with Aa, inhibited lipid peroxidation,
protected mice against irradiation induced sickness, mortality and improvement of the healing of
wounds after exposure to whole body gamma radiation (Prasad et al. 2002). Administration of Aa
before gamma irradiation prevents chromosomal damage in bone marrow cells, the induction of
apoptosis in peripheral blood leukocytes and radiation-induced lethality (Konopacka et al. 1993).
Different aspects of the radioprotective effects of vitamin C have been revised for Du et al. (2012).
Several studies have revealed that Aa, can also have pro-oxidant effects (Halliwell, 1996). In fact
the combination of transition metals (such as Fe and Cu) and ascorbate has long been used as an
oxidizing system and the combination of these two reagents is referred to as the “unfriend system”
and is used for the hydroxylation of alkanes, aromatics, and other oxidations (Odin 1997; Halliwell
1999).
Different factors modify the effect of Aa, the most studied are the concentration and the presence of
transition metals (Halliwell 1999), several experiments have shown that high concentrations of Aa
increased DNA damage through the production of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide by the
Fenton reaction. Du et al. (2012), found that pharmacological doses of ascorbate induce
cytotoxicity and oxidative stress in pancreatic cancer cells, and no in normal cells. Aa can also
induce free radicals in presence of transition metals (Halliwell, 1999).
The main objective of the present research was to evaluate the radioprotective effect of Aa using
two different dose rates (DR) by means of the somatic mutation and recombination test in the wing
blade of Drosophila.
45
Material and Methods
Biological material and treatment: Three days old virgin mwh/ mwh females were mated to
flr3/TM3, Ser males in 250 ml bottles with regular food. Oviposition was restricted to a 2 h period in
order to obtain more homogeneous samples. Eggs were incubated in the culture room for 72h to
obtain second instar larvae that were separated from the culture medium by means of gradient
density using a 20 % sucrose solution. Larvae were treated for 24 h in empty bottles containing a
disc of filter paper and 3.5 ml of each Aa solution: 25, 50 and 100 mM, distilled water was used as
solvent.
Treatment with radiation: After treatment finished, larvae for each concentration were divided in
three groups: one group was irradiated with 20 Gy at a DR of 36 Gy/h in the Gamma Cell 2000
irradiator, the second a high DR 960 Gy/ h in the Transelektro irradiator and the third group was
used as control. Five hundred larvae were tested for each treatment in groups of 100 by
homeopathic vial with 0.8g of synthetic medium (Formula 4-24 Carolina Biological Supply Co.)
and 2.5 ml of distilled water. All treated larvae were introduced into the culture room. After larvae
completed their development, the number of emerged adults, males and females separately, were
recorded daily.
Developmental time and larvae-viability analysis: Larvae-to-adult developmental time was
determined by counting the number of emerged flies daily, until all flies had emerged, larvae-to-
adult survival was measured as the ratio of the total number of emerged flies and toxicity was
obtained by dividing total viable adults in the numbers of treated larvae. Once that data was
obtained, survival curves were made. For the rate of development index, the slope (m) of the
exponential phase of each curve was calculated, and the day of emergence for 50% of the
individuals was determined extrapolating with the X axis. Chi square test was used to establish
differences between treatments.
Genotoxicity analysis: The wings of the subsequently emerging adults were mounted on slides
following standard procedure described by Graf et al. (1984). The wings were microscopically
scoring at 40x magnification for abnormal wing hair spots for small singles (1 or 2 cells) large
(more than 3 cells) either mwh or flr and twin spots. Single mwh spots are inferred to arise from a
separation between mwh and flr3 as from an interchange or from mutation/deletion at the mwh+
locus; single flr spots occur from mutation/deletion at the flr+ locus or following a double
exchange; and twin spots from an interchange between flr and the centromere. Since flr may behave
as a semi-lethal cell in some tissues, the possibility cannot be excluded that some fraction of large
46
mwh spots originated as twin spots, which then lost flr-bearing cells. The frequencies of each type
of mutant clones per wing (S/P) were compared with the concurrent negative control.
Results
Developmental time and larvae-viability analysis: Table 1 shows viability of second instar larvae
treated with three Aa concentrations: 25, 50 and 100 mM, none of them decreased viability,
however in combination with 20 Gy at a high dose rate (HDR), 100 mM significantly reduced the
viability (p ≤ 0.001). Figure 1, represent the development rate of the organisms treated with
different concentrations of Aa and its combination with 20 Gy gamma administered at two different
dose rates. No differences were found between the slopes of the different treatments and the control
groups.
Genotoxicity analysis: Table 2 shows the frequency of the all kinds of spots (small, large twin and
total) produced by treatment with the three Aa concentrations and in combination with 20 Gy of
gamma rays at the two DR. None dose modified the basal frequency of mutations. 20 Gy
administered at 36 Gy/h, provoked an increase of 12.8 times the total spots over the basal
frequency. The lowest concentration of Aa combined with gamma rays reduced the frequencies of
spots induced by 20 Gy: the small in 42%; the large in 18% and the total in 22%. The combined
treatment 50 mM Aa + 20 Gy reduced 72% the small; 27% the large; 62% the twin and 48% the
total spots and the combined treatment 100 mM Aa + 20 Gy reduced 37 % the small, 28% the large
and 29% the total spots.
The high DR (960 Gy/ h) increased in 31 times the basal frequency of mutations (from 0.31 to 7.13)
and only provoked a diminution of genetic damage in combination with 25 mM of Aa (p < 0.05).
No concentration relationship with Aa was found neither with the low nor with the high DR.
Discussion
Dietary antioxidants are widely used as dietary supplements; many studies suggested that these
might promote health (Rahal et al. 2014). Many compounds with ability to neutralize free radicals
or their reactions are proved to be effective radioprotectors, in this way, antioxidants could
represent the most useful modifying agents that are non-toxic to humans (Prasad et al. 2002).
Aa, has been reported to be an effective antioxidant and free radical scavenger, in vivo and in vitro
conditions, reduces oxidative and free radical-induced damage to DNA and membranes in
biological systems (Halliwell 2006). It has been demonstrated that treatment with Aa also
significantly reduced the genotoxicity of well-known mutagens (Odin 1997) and it is considered to
be a dietary radioprotective agent due to its action as a reactive oxygen scavenger (Du et al. 2012).
47
Most studies showed either a vitamin C mediated reduction in oxidative DNA damage or a null
effect, whereas some reviews showed an increase in specific base lesions.
Aa did not show any effect on the larval-adult viability and neither on the development rate of the
larvae. The first is a direct measure of toxicity and the second an indirect one. A delay in
development rate could indicate that a genetic damage was induced and cell cycle was arrest in
order to try to repair damage. However in combination with 20 Gy of gamma rays at low and high
DR did not reduce viability except with 100 mM + 20 Gy treatment at high DR. Development rate
was delayed one day when Aa (the three concentrations) was combined with 20 Gy gamma rays
administrated as low as well high DR. Several authors have showed that Aa could be anti or pro-
oxidant depending on concentrations (Du et al. 2012). Our results showed a significant reduction in
genetic damage in organisms treated with the three concentrations of Ac + 20 Gy at low DR, in
contrast Aa + 20 Gy at high DR, only the low dose of Aa reduces genetic damage mainly small
spots. These results are congruent with those reported by Olvera et al. (1995) who found a dose
related decrease in the mutagenic action of gamma rays. It is generally assume that for low-LET
radiation, (gamma and X rays), the effects are predominantly caused by free radicals produced
during the radiolysis of water. (Cai et al. 2001) in this way the reduction of the genetic damage
produced by Aa must be the result its capacity as free radical scavenger (Jagetia et al. 2003).
Dose rate is one of the physical factors that modifies the cellular response to radiation, it is defined
as the time in which a specific dose is given (Brooks et al. 2016). The DR has important
implications for genetics and radioprotection: the higher the dose rate greater the biological effect.
In the present research spot frequency provoked by 960 Gy/h, was twice the induced by the lower
dose rate. In Radiobiology is assumed that doses administered at a low dose rate produce a lesser
biological effect because the cell can start the mechanisms to repair the damage. Narra et al. (1993)
found a greater Aa radioprotective effect in mice spermatozoa when Iodine-131 was incorporated
than when acute radiation was administered. A possible explanation for our results is that at higher
DR greater the amount of free radicals that Aa is unable to inactivate even at higher concentrations.
Fujii et al. (2010) reported that in a normal human fibroblast cells Aa treatment enhanced cell
survival after X-rays, but did not after heavy ions irradiation. They concluded that Aa treatment is
not powerful enough to protect complex type of DNA damage induced by heavy ions. Unless in this
report the same type of radiation was used, some authors have suggest that higher DR caused
damage by means of direct effect, which cannot be avoided by the action of antioxidants. It is
generally accepted that DNA double strand breaks (DSBs) are the most important type of damage
48
with respect to the latent effects of radiation exposure. In the somatic mutation assay in the wing of
Drosophila, twin spots are exclusively produced by double strand breaks, the fact that 50 mM Aa
and 20 Gy at high DR enhances twin spots probably indicates a synergistic effect between ROS
induced by both agents. In this manner the Aa acts as prooxidant.
The results found in this study give evidence on the capacity of Aa to protect against radiation
damage induced at low DR probably as synergic effect with endogenous antioxidants capable of
acting and / or being induced to these levels of DRs. Therefore further experiments are required to
determine the conditions under which Aa can protect healthy cells. The results obtained in the
present study enhances the necessity to test the different situation under Aa can be use: external or
internal exposure, acute high-dose radiation vs chronic exposure etc. to avoid increase genetic
damage provoked by radiation, especially considering that the use of antioxidants to protect healthy
cells of patients receiving radiotherapy as a treatment for cancer has been suggested.
49
Table 1. Viability percentage of second instar larvae treated with Aa and 20 Gy of gamma rays at
two different dose rates
** significant to p < 0.001
Treatment
Aa (mM)
No. of Larvae Viability %
0 500 90.50
25 500 83.15
50 500 88.30
100 500 82.25
Dose rate 36 Gy/h
20 Gy 500 81.17
25+ 500 83.67
50+ 500 79.60
100+ 500 85.44
Dose rate 960 Gy/h
20 Gy 500 83.00
25+ 500 85.60
50+ 500 84.90
100+ 500 68.60 ***
50
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100 Control m = 33.86
25 m = 34.34
50 m = 34.15
100 m = 35.14
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
Sur
viva
l (
%)
20Gy m = 27.44
25 + m = 35.20
50 + m = 27.27
100 + m = 27.17
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
Time (days)
20 Gy m = 36.04
25 + m = 34.78
50 + m = 28.22
100 + m = 27.96
Figure 1. Development rate (m) of the organism treated with Aa and 20 Gy of gamma rays at two different
DR: a) Control; b) 36 Gy/h and c) 960 Gy/h.
a)
b)
c)
51
Table 2. Mutation frequency induced in 48 h mwh +/+flr3 D. melanogaster larvae pretreated with
20 Gy of gamma rays at two different DR.
The table expresses the mean of three experiments.
Spots
AA
(mM) # W
Small
Singles
Large
Singles
Twin Total
P values
SS LS TW T
# s/p # m/a # m/a # m/a
0 80 16 0.20 7 0.09 2 0.03 25 0.31
25 80 19 0.24 0 0 0 0 19 0.24
n.s.
n.s. n.s. n.s.
50 80 24 0.30 4 0.05 1 0.01 29 0.36 n.s. n.s n.s n.s
100 80 19 0.24 4 0.05 3 0.04 23 0.29 n.s n.s n.s n.s
Dose rate 36 Gy/h
20Gy 160 221 1.38 316 1.98 98 0.61 635 3.97
25 + 160 130 0.81 259 1.62 107 0.67 496 3.10 ↓<0.001 ↓ <0.05 n.s ↓<0.001
50 + 160 61 0.38 230 1.44 37 0.23 328 2.05 ↓<0.001 ↓<0.001 ↓<0.001 ↓<0.001
100 + 160 140 0.88 228 1.43 83 0.52 451 2.82 ↓<0.001 ↓<0.001 n.s ↓<0.001
Dose rate 960 Gy/h
20Gy 80 85 1.06 373 4.66 112 1.40 570 7.13
25 + 80 56 0.70 331 4.14 119 1.49 506 6.33 ↓ <0.05 n.s n.s ↓ <0.05
50 + 80 89 1.11 382 4.78 146 1.83 617 7.71 n.s n.s ↑ <0.05 n.s
100 + 80 101 1.26 362 4.53 135 1.69 598 7.48 n.s n.s n.s n.s
52
Acknowledgements
The work was supported by a grant (No. 167461) to M. P. Cruces from the Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACyT), México, and it involved in part research carried out by María
Elena González Herrera to obtain the Master’s Degree in Agricultural Sciences and Natural
Resources at the Universidad Autónoma del Estado de México (UAEM) with a fellowship (586704)
from CONACyT. The authors wish to acknowledge the technical assistance provided by Hugo
Suarez Contreras.
Disclosure statement
The authors report no conflicts of interest exist. The authors are responsible for the content and
writing of the paper.
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56
17. Resultados
Velocidad de desarrollo y viabilidad de los organismos tratados con trolox
En la Tabla 2, se muestra el porcentaje de viabilidad de las larvas de D. melanogaster del segundo
estadio tratadas con trolox solo y en combinación con 20 Gy de rayos gama administrada a una
razón de dosis (RD) de 960 Gy/h. Ninguno de los tratamientos modificó la viabilidad de los
organismos.
En la Figura 11, se muestran las curvas para la velocidad de desarrollo de las larvas tratadas
agudamente con diferentes concentraciones de trolox (a) y las del tratamiento combinado con 20
Gy (b). Sólo se encontraron diferencias en la velocidad de desarrollo cuando se compararon los
tratamientos sólo con trolox vs los tratamientos combinado (trolox + 20 Gy) estos últimos se
retrasaron aproximadamente un día.
Velocidad de desarrollo y viabilidad de los organismos tratados con AA
En la Tabla 3, se muestra el porcentaje de viabilidad de larvas de D. melanogaster del segundo
estadio tratadas con AA solo y en combinación con rayos gama a dos diferentes RD: 36 y 960 Gy/h.
el pretratamiento con AA a las concentraciones probadas no modificaron el porcentaje de
viabilidad, solamente la concentración de 100 mM combinada con 20 Gy a una RD de 960 Gy/h
disminuyó significativamente la viabilidad (p <0.001).
La Figura 12, muestra la velocidad de desarrollo de las larvas de segundo estadio tratadas por 24 h
con AA. Al comparar las pendientes de las curvas (m), no se encontraron diferencias entre los
tratamientos y el grupo control. Las curvas de la velocidad de desarrollo de los organismos tratados
con las tres concentraciones de AA en combinación con 20 Gy administrada a 36 Gy/h se presentan
en la Figura 12b y en combinación con 20 Gy a la razón de dosis de 960 Gy/h en la Figura 12c. No
se encontraron diferencias entre las pendientes de las curvas de las diferentes concentraciones y el
grupo control con ninguna de las dos razones de dosis. Los tratamientos de AA + radiación
retrasaron el desarrollo de los individuos aproximadamente un día independientemente de la razón
de dosis.
57
Genotoxicidad de trolox y rayos gama.
La Tabla 4, muestra el número de manchas chicas, grandes y gemelas provocadas por el tratamiento
por 24h con diferentes concentraciones de trolox solo y combinado con 20 Gy (RD 960 Gy/h). El
trolox no modificó la frecuencia basal de manchas. El tratamiento combinado con trolox + 20 Gy,
no redujo la frecuencia de ningún tipo de manchas, por el contrario, 0.5 y 1.5 mM aumentaron
significativamente el número de manchas grandes y totales (p <0.05, 0.001) comparados con el
tratamiento con 20 Gy.
Prueba de genotoxicidad con AA
La Tabla 5, muestra la frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas por el
tratamiento de 24 h con AA y en combinación con 20 Gy de rayos gama a una RD de 36 Gy/h o
960 Gy/h. El AA por sí mismo no modificó la frecuencia basal a ninguna de las concentraciones
utilizadas, en cuanto al tratamiento con AA + 20 Gy (RD 36 Gy/h), se puede observar que todas
las concentraciones disminuyeron significativamente la frecuencia de manchas chicas, grandes y
totales y solamente la concentración de 50 mM redujo el número de manchas gemelas (p < 0.001).
El tratamiento de AA + 20 Gy (RD - 960 Gy/h) la concentración más baja de AA redujo
significativamente la frecuencia de manchas chicas y totales (p<0.05) mientras que la concentración
de 50 mM aumentó el número de manchas gemelas (p < 0.05).
Evaluación de la longevidad: tratamiento agudo con trolox
La Tabla 6 muestra los datos de los parámetros de longevidad de los adultos de D. melanogaster
después de ser tratados por 24h con trolox y después con 20 Gy de rayos gama. El trolox por sí
mismo a las concentraciones de 0.5 y 1.0 mM provocó una reducción significativa (p < 0.001) del
PVMe tanto en las hembras como en los machos. El trolox en combinación con 20 Gy, provocó que
el PVMa y el PVMe de las hembras redujeran significativamente (p <0.001) y los tratamientos con
trolox 1.0 y 1.5 mM redujeron la longevidad de los machos.
58
Evaluación de la longevidad: tratamiento crónico con AA
La Tabla 7, muestra la longevidad de los adultos D. melanogaster después de ser tratados
crónicamente con AA (25 mM) y 10 Gy de rayos gama. El tratamiento con AA incrementó
significativamente (p <0.001), en 5.3 días el PVMe de las hembras. El tratamiento crónico con AA
y radiación prolongó significativamente (p <0.001) el PVMa tanto de las hembras como de los
machos.
Evaluación de la relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad provocada
por trolox
La Figura 17, presenta la relación entre la frecuencia de mutación somática y longevidad (semanas)
de Drosophila melanogaster después de ser tratadas 24h con trolox (0.5, 1.0 y 1.5 mM) y 20 Gy de
rayos gama. No se encontró una relación entre la frecuencia de mutaciones y el PV de los
organismos
59
Tabla 2. Porcentaje de viabilidad de larvas de D. melanogaster tratadas con trolox solo y en
combinación con 20 Gy de rayos gama
Pre-tratamiento
Trolox (mM)
No. De larvas
sembradas
% de
viabilidad 0 500 84.8
0.5 500 86.0
1.0 500 85.1
1.5 500 84.5
0+20 Gy 500 84.0
0.5 + 20 Gy 500 82.0
1.0+ 20 Gy 500 80.6
1.5+20 Gy 500 82.0
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de larvas tratadas 24h con AA solo y combinado con rayos gama a
dos diferentes razones de dosis
Tratamiento
AA
No. de larvas % de
viabilidad 0 500 90.5 25 500 83.1 50 500 88.3
100 500 82.2 Razón de dosis 36 Gy/h
20 Gy 500 81.1 25+ 500 83.6 50+ 500 79.6
100+ 500 85.4 Razón de dosis 960 Gy/h
20 Gy 500 83.0 25+ 500 85.6 50+ 500 84.9
100+ 500 68.6** ** Significativo a una p < 0.001
60
Tabla 4. Número de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas en larvas mwh / flr3 pretratadas
durante 24h con diferentes concentraciones de trolox solo y combinado con 20 Gy de rayos gama
(RD-960 Gy/h)
Manchas
Trolox
(mM) #A Chicas Grandes Gemelas Totales # m/a # m/a # m/a # m/a
0 54 10 0.19 1 0.02 0 0.00 11 0.20
0.5 56 8 0.14 3 0.05 2 0.04 13 0.23
1.0 66 9 0.14 5 0.08 0 0.00 14 0.21
1.5 44 12 0.27 0 0.00 0 0.00 12 0.27
0+20Gy 58 31 0.53 119 2.05 20 0.34 170 2.93
0.5 + 60 32 0.53 163 ↑2.72* 24 0.40 219 ↑3.65 *
1.0 + 44 26 0.59 93 2.11 20 0.45 139 3.16
1.5 + 56 25 0.45 184 ↑3.29** 22 0.39 231 ↑4.13**
No. A: Número de alas analizadas m/a: número de manchas por ala, Valor de p * <0.05, ** p <0.001. Las flechas ↑ y ↓
indican una disminución o incremento en la frecuencia de manchas respectivamente
Tabla 5. Frecuencia de manchas chicas, grandes y gemelas inducidas en larvas de 48 h mwh / flr3
pretratadas con diferentes concentraciones de AA sólo y en combinación con 20 Gy de rayos gama
a dos diferentes razones de dosis
Manchas
Aa
(mM)
No. A Chicas Grandes Gemelas Totales
# m/a # m/a # m/a # m/a 0 80 16 0.20 7 0.09 2 0.03 25 0.31 25 80 19 0.24 0 0 0 0 19 0.24 50 80 24 0.30 4 0.05 1 0.01 29 0.36
100 80 19 0.24 4 0.05 3 0.04 23 0.29 Razón de dosis 36 Gy/h
20Gy 160 221 1.38 316 1.98 98 0.61 635 3.97 25 + 160 130 ↓0.81** 259 ↓1.62* 107 0.67 496 ↓3.10** 50 + 160 61 ↓0.38** 230 ↓1.44** 37 ↓0.23** 328 ↓2.05**
100 + 160 140 ↓0.88* 228 ↓1.43** 83 0.52 451 ↓2.82** Razón de dosis 960 Gy/h
20Gy 80 85 1.06 373 4.66 112 1.40 570 7.13 25 + 80 56 ↓0.70* 331 4.14 119 1.49 506 ↓6.33**
50 + 80 89 1.11 382 4.78 146 ↑1.83* 617 7.71 100 + 80 101 1.26 362 4.53 135 1.69 598 7.48
No. A: Número de alas analizadas m/a: número de manchas por ala, Valor de p * <0.05, ** p <0.001. Las flechas ↑ y ↓
indican una disminución o incremento en la frecuencia de manchas respectivament
61
Tabla 6. Longevidad de los adultos de D. melanogaster después de ser pretratados 24 h con trolox y
después con 20 Gy de rayos gama
Tratamiento
Concentración
(mM)
Sexo
N
PVMe
PVMa
Valor de P
Control
♀ 195 91.2 ±0.26 105
♂ 175 85.5±0.29 105 n.s.
0.5 ♀ 175 89.6±0.27 101 p <0.0001
♂ 200 84.5±0.28 105 n.s.
Trolox 1.0 ♀ 175 90.7±0.27 105 n.s.
♂ 200 87.7±0.27 105 p <0.0001
1.5 ♀ 200 90.5±0.27 105 n.s.
♂ 200 85.7±0.29 105 n.s.
20Gy
♀ 175 83.5 ±0.32 104
♂ 175 70.8±0.32 87
0.5 ♀ 200 70.0±0.30 84 p <0.0001
♂ 150 71.2±0.36 87 n.s.
Trolox+20Gy 1.0 ♀ 200 74.3 ±0.30 91 p <0.0001
♂ 120 63.8±0.35 77 p <0.0001
1.5 ♀ 125 81.7±0.37 ↑94 p <0.0001
♂ 100 68.0±0.40 84 p <0.0001
N: No. de organismos; PVMe= periodo de vida medio, PVMa= periodo de vida máximo; ↑: aumento de los índices de
longevidad. Los resultados se analizaron con el método Kaplan-Meier y las diferencias son el resultado de la
comparación de los grupos tratados con sus respectivos controles.
62
Tabla 7. Longevidad de adultos D. melanogaster después de ser tratados crónicamente con AA (25
mM) y rayos gama (10 Gy)
N: No. de organismos; PVMe= periodo de vida medio, PVMa= periodo de vida máximo; ↑: aumento de los
índices de longevidad. Los resultados se analizaron con el método Kaplan-Meier y las diferencias son el
resultado de la comparación de los grupos tratados con sus respectivos controles.
Tratamiento Sexo n PVMe PVMa Valor de P
Control
♀ 510 65 ± 0.40 86
♂ 150 71.8± 0.40 96
AA
♀ 150 70.3± 0.40 86 ↑p < 0.0001
♂ 150 72.0± 0.35 86 n.s.
10 Gy
♀ 150 68.5± 0.42 96
♂ 150 62.0± 0.37 76
AA+10Gy
♀ 150 76.0± 0.40 96 ↑p < 0.0001
♂ 150 69.7± 0.39 84 ↑p < 0.0001
63
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
% d
e s
ob
rev
iven
cia
Control m = 28.67
0.5 m = 28.56
1.0 m = 27.57
1.5 m = 28.69
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
% d
e s
obre
viv
encia
Tiempo (dias)
20Gy m = 27.55
0.5 + m = 29.22
1.0 + m = 29.02
1.5 + m = 26.70
Figura 11. Velocidad de desarrollo (m) de las larvas tratadas agudamente con: a) trolox y b) combinado con
rayos gama.
a)
b)
64
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100 Control m=33.86
25 m=33.34
50 m=34.15
100 m=35.14
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
% d
e so
bre
viv
enci
a
20Gy m= 27.44
25 + m= 35.20
50 + m= 27.27
100 + m= 27.17
8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
Tiempo (dias)
20 Gy m=36.03
25 + m=34.77
50 + m=28.22
100 + m=27.96
Figura 12. Velocidad de desarrollo (m) de las larvas de segundo estadio tratadas 24 h con: a) AA, b) rayos
gama administrada a la razón de dosis de 36 Gy/h y c) a 960 Gy/h.
b)
a)
b)
a))
b)
c)
65
Figura 13. Supervivencia para: a) hembras y b) machos de D. melanogaster tratados con diferentes
concentraciones de trolox.
66
Figura 14. Supervivencia de machos de D. melanogaster tratados con 1.0 mM de trolox.
67
Figura 15. Supervivencia de: a) hembras y b) machos de D. melanogaster tratados con 0.5, 1.0 y 1.5 de mM
de trolox y rayos gama.
68
Figura 16. Supervivencia de las hembras (a, c) y los machos (b, d) de D. melanogaster tratados con
25 mM de AA y en combinación con 10 Gy de rayos gama.
69
Figura 17. Relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad en semanas de D.
melanogaster después de ser tratadas 24 h con trolox y 20 Gy de rayos gama.
70
17. DISCUSIÓN
La exposición a la radiación ionizante provoca daño a las células por acción directa o
mediante la producción de ERO, éstas deterioran de manera inespecífica a organelos
celulares y moléculas de importancia biológica, favoreciendo la patogénesis de diversas
enfermedades crónico-degenerativas (Wen et al., 2013, Kruk et al., 2015). Aunque las ERO
son indispensables para diversas funciones celulares, su exceso se relaciona con numerosas
enfermedades, entre las que destaca el cáncer, además pueden acelerar el envejecimiento
(De Flora, 1996).
La identificación de compuestos con actividad antimutagénica, sobre todo aquellos de
origen natural con pocos o nulos efectos tóxicos, como los antioxidantes, parecen ser una
de las mejores estrategias para contrarrestar el daño causado por agentes cuya exposición
en el ser humano no se puede evitar (Zeiger, 2000). Entre los antioxidantes más estudiados
en los últimos años se encuentran la vitamina E, en menor proporción su derivado soluble
el trolox y el AA (Buettner et al., 2006). El objetivo principal de esta investigación fue
evaluar la relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad de Drosophila
melanogaster provocadas por radiación ionizante y los antioxidantes trolox y AA.
Se decidió utilizar al trolox debido a que los resultados publicados en la literatura con
vitamina E son contradictorios, ya que su baja solubilidad provoca una biodisponibilidad
baja. Las dosis se eligieron con base a las curvas de sobrevivencia probando diferentes
concentraciones de los compuestos ya que en genética toxicológica se recomienda utilizar
dosis sub-letales para asegurar que el agente alcance la molécula blanco pero sin producir
una letalidad significativa, de lo contrario se obtendrían falsos negativos. Con trolox se
probaron concentraciones entre 0.5 y 10 mM, esta última produjo una toxicidad del 96%
(datos no presentados) por lo que se decidió utilizar las concentraciones de 0.5, 1 y 1.5 mM
en cuanto al AA, se probaron las concentraciones reportadas en la literatura (Olvera et al.,
1995).
71
Evaluación de la velocidad de desarrollo y viabilidad larva-adulto de diferentes
concentraciones de trolox y AA y su combinación con radiación ionizante
La viabilidad larva-adulto, se define como el número total de adultos emergidos en cada
uno de los tratamientos y la velocidad de desarrollo, como el número de organismos
emergidos por día. El primero es un índice directo de la toxicidad del agente y el segundo
es indirecto que da una idea de la capacidad del individuo para eliminar o reparar el daño
causado por el xenobiótico: un retraso en la emergencia puede producirse cuando se induce
daño al ADN y el ciclo celular se detiene para tratar de repararlo.
Ninguna de las concentraciones de trolox utilizadas redujo el porcentaje de viabilidad de
los organismos y tampoco retrasaron su velocidad de desarrollo por lo que se puede
concluir que a las concentraciones utilizadas en esta investigación no fueron citotóxicas.
Como se mencionó anteriormente, uno de los antioxidantes más estudiados ha sido el AA
(Odin, 1997, Du et al ., 2012), en la presente investigación se exploró su efecto utilizando
la misma razón de dosis que para el trolox (960 Gy/h) y en vista del efecto nulo en la
velocidad de desarrollo con el trolox, se decidió explorar el efecto del AA con una razón de
dosis más baja: 36 Gy/h, la diferencia de tiempo entre la razón de dosis baja y la alta fue
casi de 30 minutos.
Los organismos tratados con 100 mM a la RD de 960 Gy/h tuvieron una viabilidad
significativamente más baja que los organismos irradiados a esta razón de dosis, por lo que
los resultados sugieren un efecto sinérgico entre la gran cantidad de ERO producidas por la
radiación liberada en tan corto tiempo y la posible acción pro oxidante del AA a
concentraciones altas. El efecto citotóxico de las concentraciones altas de AA, ha sido
documentado por varios autores (Kurbacher et al.,1996). Aún más el AA a concentraciones
terapéuticas para el humano es capaz de matar células tumorales y se ha sugerido que el
mecanismo de acción es a través de la generación de ERO (Chen et al., 2005).
72
Nandi y Chatterjee (1987), sugieren que en concentraciones bajas la acción predominante
del AA es la inactivación de O2 y las concentraciones altas promueven citotoxicidad por sí
mismas. En la presente investigación no se observó ese efecto con la concentración más
alta (100 mM) tanto solo, como combinado con radiación a la RD baja pero si con la RD
alta.
Evaluación de la frecuencia de mutaciones somáticas de los organismos tratados con
trolox y AA solos y en combinación con radiación ionizante
La prueba de mutación y recombinación somáticas en Drosophila, se ha utilizado para
evaluar el potencial mutagénico y antimutagénico de diversos agentes (Pimentel et al.,
2000) como los antioxidantes, este ensayo ofrece la posibilidad de realizar pretratamientos,
contratamientos y postratamientos a los organismos en cualquiera de sus estadios larvarios
y detecta tanto eventos mutagénicos como de recombinación mitótica en una sola
generación.
La capacidad antioxidante el trolox ha sido evaluada principalmente utilizando estudios in
vitro. Salgo y Pryor (1996) reportaron que redujo el estrés oxidante causado por
peroxinitrito en timocitos de ratón, estos autores sugieren que a la concentración de 10 mM,
el antioxidante además de contrarrestar el efecto del estrés oxidante, inhibió la apoptosis en
células dañadas. El hecho de que en la presente investigación dos de las tres
concentraciones probadas incrementaran el daño genético provocado por radiación no sólo
contrasta con los escasos resultados reportados en la literatura sino que reafirma la
necesidad de realizar estudios in vivo antes de emitir recomendaciones para la utilización de
compuestos en los seres humanos sobre todo, tomando en consideración que no existen
evidencias de su acción utilizando radiación ionizante. Por otra parte se sugiere probar este
compuesto con agentes que al igual que la radiación ionizante produzcan daño a través de
la generación de radicales libres como el trióxido de cromo.
En los últimos años se han realizado diversos estudios para averiguar las propiedades
genotóxicas o antigenotóxicas del AA, tal como se resume en varias revisiones detalladas
73
(Hartman y Shankel, 1990; Odin, 1997; Collins, 1999, Du et al., 2012). Aunque la mayor
parte de los resultados de los estudios realizados tanto in vitro como in vivo indican que el
AA es antimutagénico y es considerado como el mejor antioxidante soluble en agua, en
algunos casos actúa como un pro oxidante (Odin, 1997, Kaya et al., 2002; Du et al, 2012).
Con el ensayo de mutación y recombinación somáticas en el ala, se encontró que el AA no
redujo la frecuencia basal de mutaciones pero combinado con radiación gama a una razón
de dosis de 36 Gy/h, todas las concentraciones disminuyeron significativamente la
frecuencia de manchas. Estos resultados coindicen con lo reportado por Olvera et al., 1995
quienes encontraron que las concentraciones de 25, 50 y 100 mM de AA en combinación
con 20 Gy de radiación ionizante disminuyeron significativamente tanto las mutaciones
como la recombinación mitótica. En el presente estudio no se encontró un efecto del AA en
combinación con 20 Gy a la razón de dosis más alta y aunque no se encontraron diferencias
estadísticamente significativas, la tendencia fue un aumento en el daño genético lo que
coincide con los resultados de la toxicidad y sugiere nuevamente un efecto sinérgico entre
la RD alta y las concentraciones altas de AA. Koyoma et al., 1998 y Barros et al., 2011
sugieren que el efecto radioprotector del AA es dependiente de la concentración, el tiempo
de administración y el tipo de radiación (trasferencia lineal de energía baja o alta), la
disminución significativa del daño radio-inducido podría explicarse además por el efecto
antioxidante del AA y por la estimulación de ciertas actividades biológicas de la razón de
dosis baja que incluyen: capacidad antioxidante (Kojima, 1998), reparación de daño al
ADN (Le et al., 1998) e incremento en la tasa de apoptosis (Cregan, 1999; Sakai et al.,
2000) estas actividades protectoras no son inducidas por la RD alta.
Los resultados obtenidos en la presente investigación, aportan evidencia del papel dual del
AA como radioprotector y pro oxidante utilizando el mismo sistema y a las mismas
concentraciones modulada por la RD.
Evaluación de la longevidad: tratamiento agudo trolox
En los últimos años los estudios para determinar el efecto de los compuestos de origen
natural en la longevidad de los organismos ha ganado importancia principalmente por la
relación que existe entre el envejecimiento y las enfermedades degenerativas (Temple,
2000).
74
En cuanto a los estudios para determinar el efecto de los antioxidantes en la longevidad, se
observó que el pretratamiento con trolox no prolongó la vida de los organismos tratados, lo
que podría explicarse por el tiempo de exposición dado que para poder evaluar en los
mismos organismos tanto la longevidad como la frecuencia de mutaciones somáticas, fue
necesario someterlos a un tratamiento agudo en estado larvario tal como se describió en la
sección de materiales y método.
El hecho que los organismos tratados con las tres concentraciones de trolox en combinación
con radiación ionizante, hayan tenido un PVMe y PVMa menor que el grupo control con
20Gy, se relaciona con los resultados obtenidos de mutación somática y sugieren que en el
sistema de prueba de Drosophila, el trolox tiene actividad pro oxidante. Estos resultados
apoyan uno de los postulados de la TERLM: el exceso de RL producidos por la radiación
provocan una disminución en el PVMa de los organismos. Como se mencionó
anteriormente aunque el trolox es considerado un buen antioxidante tanto así que su
actividad se utiliza para cuantificar la capacidad antioxidante de compuestos no existen
muchas investigaciones realizadas in vivo que respalden su efecto protector por lo que se
requiere realizar más estudios utilizando tratamientos crónicos y diferentes
concentraciones.
Evaluación de la longevidad: tratamiento crónico AA
Con base a los resultados obtenidos con anterioridad en el laboratorio de Drosophila del
ININ, utilizando el mismo protocolo que el empleado con trolox, se decidió probar un
tratamiento crónico para evaluar el papel del AA en la longevidad. En estas condiciones el
tratamiento de AA solo y en combinación con radiación, incrementó significativamente
tanto el PVMa como el PVMe de los organismos tratados. Bahadorani et al., (2008),
utilizando la cepa silvestre Rosy+5 encontró que 20 mM de AA provocó un incrementó el
PVMe, mientras que 100 mM lo redujo hasta en 30 días. Massie et al., (1976) reportaron un
incremento tanto en el PVMe como el PVMa provocado por concentraciones de 1.0, 10 y
50 mM y solamente en las hembras con la concentración de 1.0 mM. Las concentraciones
de 10 y 50 mM causaron disminución del PVMe, debido probablemente a los productos de
oxidación del AA.
75
Massie et al., (1991), reportaron el efecto del AA en dos cepas de D. melanogaster: Oregon
R y Swedish C. En la cepa Oregon, la concentración de 10 mM causó un aumento
moderado del PVMe pero la de 100 mM lo disminuyó significativamente y en la cepa
Swedish C las concentraciones de 1.0 y 10 mM incrementaron el PVMe, cuando fueron
administradas de manera aguda por 24 horas. En conjunto los resultados obtenidos en esta
investigación apoyan el papel del AA como antioxidante y radioprotector capaz de
incrementar la longevidad de Drosophila melanogaster cuando es administrado
crónicamente.
Relación entre la frecuencia de mutaciones y la longevidad
La TERLM ha sido la base para explicar que el deterioro funcional de la célula está
relacionado con la aceleración del proceso normal del envejecimiento y las patologías que
lo acompañan. Esta hipótesis supone que los RL formados durante el metabolismo
mitocondrial pueden dañar inespecíficamente a moléculas como las proteínas, los lípidos y
el ADN (Liu, 2014; Payne y Chinnery 2015; Pinto y Moraes, 2015). El papel de las
mutaciones somáticas durante el envejecimiento es un área de investigación activa sobre
todo para crear métodos que puedan cuantificar la modificación y reparación del ADN
durante el PVMa de los modelos biológicos (Koliada et al., 2015). En los estudios
comparativos de especies de animales que tienen diferentes PVMa, se ha demostrado que la
capacidad de reparación del ADN se correlaciona con su longevidad (Hart y Setlow, 1974;
Francis et al., 1981; Treton y Courtois, 1982; Hall et al., 1984). Por lo tanto, parece que las
mutaciones somáticas están involucradas en la regulación del PV.
De acuerdo a la TERLM, se esperaría una relación inversa entre la frecuencia de mutación
y la longevidad, pero los resultados obtenidos en este trabajo no apoyan esta hipótesis
puesto que no se encontraron diferencias significativas en la frecuencia de mutaciones entre
los organismos que diferían en la duración del PVMa.
Hasta donde sabemos este es el primer estudio que explora el efecto de un agente en la
relación entre la longevidad y la frecuencia de mutaciones somáticas en los mismos
individuos mediante un protocolo diseñado para este fin en el laboratorio de Drosophila del
ININ. Los resultados no respaldan la TERLM, probablemente porque la prueba de
mutación y recombinación somáticas no es lo suficientemente sensible para detectar las
76
mutaciones que puedan modular la longevidad de los organismos, esto apoya los resultados
obtenidos por Vermulst et al., 2007, quien argumenta que la acumulación de mutaciones
puntuales no reducen el PV de ratones, y sugiere que los RL producidos en la mitocondria
no están relacionados en la regulación de la longevidad, aunque no se descarta que las
deleciones en el ADN mitocondrial sí estén implicadas en las alteraciones fisiológicas que
conducen a la muerte.
La hipótesis y objetivo principal, de esta investigación, se basó en una de las predicciones
de la TERLM: la longevidad se debería incrementar si los RL fueran interceptados antes
que causen daño. Si bien la TERLM ha sido la teoría más aceptada para explicar las causas
del envejecimiento por RL, esta investigación no encontró relación entre la acumulación de
mutaciones (producido por la radiación) y la longevidad. Se sugiere realizar más estudios
que profundicen de manera específica alteraciones que evidencien el daño al ADN durante
el PVMa de D. melanogaster y si estos daños son modulados con el uso de algún
antioxidante.
18. CONCLUSIONES
El tratamiento con las diferentes concentraciones de trolox tanto solo y en combinación con
radiación ionizante no afectó la velocidad de desarrollo ni la viabilidad de los organismos
tratados, sin embargo en combinación con 20 Gy de radiación incrementó la frecuencia de
mutaciones somáticas y redujo la longevidad de los organismos tratados.
El tratamiento con 25, 50 y 100 mM de AA solo y combinado con radiación ionizante a la
razón de dosis de 36 Gy/h no afectó la velocidad de desarrollo ni la viabilidad de los
organismos tratados, y fue capaz de reducir significativamente la frecuencia de mutaciones
somáticas.
El tratamiento con 25, 50 y 100 mM de AA no afectó la velocidad de desarrollo de los
organismos. El tratamiento con 100 mM y radiación gama a una razón de dosis de 960
Gy/h, redujo significativamente la viabilidad de los adultos e incrementó la frecuencia de
mutación somática.
77
El tratamiento crónico de 25 mM de AA sólo y 10 Gy de rayos gama de los organismos
prolongó el PVMa y PVMe de hembras y machos tratados.
No se encontró relación entre la frecuencia de mutación somática y la longevidad de los
organismos tratados con trolox y radiación ionizante, lo que no apoya la TERLM.
Se sugieren estudios que cuantifiquen mutaciones más específicas ya que posiblemente el
ensayo SMART no es lo suficientemente sensible para detectar las mutaciones
relacionadas con el envejecimiento. Así mismo, se propone realizar tratamientos crónicos
con trolox.
78
19. REFERENCIAS
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