tesis que para obtener el grado de maestro en...
TRANSCRIPT
FACULTAD DE MEDICINA
MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
“LA ANGIOTENSINA II AUMENTA A UNA CORRIENTE DE K+ DEL
TIPO RECTIFICADOR TARDÍO EN NEURONAS SIMPÁTICAS”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA
Psic. Víctor Uriel Mendoza González.
ASESOR
Dr. Humberto Cruzblanca Hernández Profesor Investigador Titular B.
Colima, Colima, Octubre de 2003
AGRADECIMIENTOS
A mi asesor, Dr. Humberto Cruzblanca Hernández, por su apoyo durante mi formación como maestro en ciencias, por aceptarme para formar parte de su laboratorio y sobre todo por su asesoría en la elaboración de la presente tesis. A mis sinodales Dra. Esperanza García y al Dr. Sergio Montero, por sus sugerencias en la revisión de la presente tesis. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, por la beca número 166788 otorgada durante la maestría. Al Fondo Ramón Alvarez-Buylla de Aldama, Universidad de Colima.
DEDICATORIA A mis padres, Armando y Elisa, por su consejo y apoyo incondicional. A mis hermanos Lorena y Armando. A mis amigos incondicionales Lucía y Alma. Y sobre todo a Ti JVAM , por tu consejo y compañía durante estos tres años.
VICTOR
I N D I C E I. FIGURAS Y TABLAS
II. ABREVIATURAS
III. RESUMEN
ABSTRACT
IV. INTRODUCCIÓN
1. LA ANGIO II COMO REGULADOR FISIOLÓGICO.
1.1 Principal vía de síntesis de la Angio II.
1.2 Receptores a la Angio II
1.3 Cascadas bioquímicas de señalización estimuladas por los receptores
a la Angio II.
2. FUNCIÓN DE LA ANGIO II EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL (SNC).
2.1 Evidencia de angiotensinógeno, renina y ECA en el SNC.
2.2 Distribución de receptores a la Angio II en el SNC.
2.3 Efectos celulares de la Angio II en el SNC.
2.3.1 Efecto sobre las células del SFO.
2.3.2 Efecto sobre las neuronas del PVN.
2.3.3 Efecto sobre las neuronas de la RVLM.
2.3.4 Efecto sobre neuronas espinales.
2.3.5 Efectos sobre otras neuronas centrales.
2.3.6 Conclusiones
3. ANTECEDENTES
7
8
8
13
14
16
16
17
17
17
18
19
20
21
23
25
1
3
5
4. HIPÓTESIS
5. OBJETIVO GENERAL
5.1 Objetivos particulares
6. MATERIALES Y MÉTODOS
7. RESULTADOS
7.1 Aislamiento de la corriente de K+ tipo rectificador tardío, IKV.
7.2 Efecto de la Angio II sobre IKV.
7.3 Identificación farmacológica del receptor a la Angio II que modula a
IKV.
7.4 La toxina pertussis no altera la modulación de IKV por la Angio II.
7.5 Similitudes entre la modulación muscarínica y peptidérgica de IKV.
7.6 Posible composición molecular del canal de K+ modulado por la Angio
II: Evidencia farmacológica.
8. DISCUSIÓN.
9. CONCLUSIONES.
10. PERSPECTIVAS.
V. BIBLIOGRAFÍA
28
28
29
32
32
33
35
37
40
42
45
47
48
49
1
I. FIGURAS Y TABLAS
Figura 1: Cascada del sistema renina angiotensina.
Figura 2: El sistema renina-angiotensina incrementa la presión arterial por
diversos mecanismos.
Figura 3: Núcleos centrales que participan en el control del tono simpático.
Figura 4: Cascada de señalización disparada por la Angio II en el músculo liso
vascular.
Figura 5: La estimulación muscarínica de las neuronas simpáticas aumenta su
excitabilidad.
Figura 6: Efecto de la estimulación muscarínica en las neuronas GSC sobre la
amplitud de la IKV.
Figura 7: Aislamiento de la IKV.
Figura 8: Efecto de la Angio II sobre la amplitud de la IKV
Figura 9: Efecto del losartan sobre la modulación de ICaN.
Figura 10: Efecto del losartan sobre la modulación de IKV.
Figura 11: Efecto de la PTX sobre la modulación α2-adrenérgica de ICaN.
Figura 12: La PTX no altera la modulación de IKV por la Angio II.
Figura 13: La oxo-M ocluye la modulación de la IKV por la Angio-II.
Pág.
9
10
12
15
25
27
31
33
34
35
37
38
40
2
Figura 14: Efecto del TEA y la 4-AP sobre la IKV.
Figura 15: La Angio II modula a una corriente de K+ sensible a la 4-AP.
Tabla 1: Principales antagonistas de los receptores a la Angio II.
Tabla 2: Efectos de la Angio II en neuronas del sistema nervioso central.
Tabla 3: Biofísica y farmacología de subunidades de canales de K+.
42 43 14 24 42
3
II. ABREVIATURAS
4-AP: 4-aminopiridina
ADP: difosfato de adenosina
ANGIO I: angiotensina I
ANGIO II: angiotensina II
AVP: hormona arginina-vasopresina.
CaM: calmodulina
CaM KII: proteína cinasa dependiente de Ca2+ CaM tipo II.
DAG: diacilglicerol.
DMEM: medio Eagle modificado por Dulbecco
ECA: enzima convertidora de angiontensina
GABA: ácido gama-aminobutírico
GDP: difosfato de guanosina
GSC: ganglio superior cervical
GTP: trifosfato de guanosina
IA: corriente de potasio tipo A
ICaN: corriente de calcio tipo N
IKM: corriente de potasio tipo M
IKV: corriente de potasio tipo rectificador tardío
IML: médula intermedio lateral
IP3: trifosfato de inositol
MnPO: núcleo preóptico mediano
4
NA: noradrenalina
NTS: núcleo del tracto solitario
Oxo-M: oxotremorina-M
PIP2: fosfatidil inositol bifosfato
PKC: proteína cinasa C
PLA2: fosfolipasa A2
PLCγγ : fosfolipasa Cγ
PTX: toxina pertussis
PVN: núcleo paraventricular del hipotálamo
RS: retículo sarcoplásmico
RVLM: médula rostroventromedial
SFB: suero fetal bovino
SFO: órgano subfornical
SNC: sistema nervioso central
SON: núcleo supraóptico
SRA: sistema renina-angiotensina
TEA: tetraetilamonio
TTX: tetrodotoxina
5
III. RESUMEN
El sistema vasoconstrictor renina angiotensina (SRA) es uno de los
principales mecanismos enzimáticos responsables de mantener la homeostasis
cardiovascular. Uno de los eventos subsecuentes a la activación del SRA es el
aumento del tono simpático. En distintas áreas del sistema nervioso el efecto
celular frecuentemente inducido por la Angiotensina II (Angio II) es el aumento
de la excitabilidad celular. Por ejemplo, en las neuronas del ganglio superior
cervical (GSC) la Angio II despolariza a la membrana e induce el disparo tónico
de potenciales de acción. El propósito de la tesis de Maestría es estudiar los
mecanismos celulares y subcelulares que contribuyen al aumento de la
excitabilidad de dichas neuronas. En la presente investigación se describe la
modulación angiotensinérgica de la corriente de K+ tipo rectificador tardío, IKV.
Así entonces, se encontró que la Angio II (500nM) aumenta la densidad de la
corriente de la IKV en 12.1 ± 1.6 pA/pF (n= 12). El antagonista selectivo del
receptor AT1, losartan (2µM) disminuyó el aumento de la IKV de 12.2 ±1.4 pA/pF
(n= 15) a 3.5 ± 0.6 pA/pF (n= 12). La toxina pertussis (PTX) no bloqueó la
modulación de la IKV (control 9.8 ± 1.6 pA/pF, n= 7: PTX 8.9 ± 1.8 pA/pF, n= 6).
Finalmente, la IKV fue mas sensible a la 4-aminopiridina (4-AP) (500µM) que al
Tetraetilamonio (TEA) (500µM) y en presencia de 4-AP el efecto de la Angio II se
redujo de 12.1 ± 1.6 pA/pF a 2.7 ± 1.2 pA/pF. Estos datos sugieren que el
receptor AT1 se acopla a una proteína G insensible a la PTX para estimular a la
IKV. Debido a la correlación encontrada entre la farmacología de la subunidad
KV2.1 e IKV, es posible que esta subunidad forme parte del canal de K+ tipo
6
rectificador tardío modulado por la Angio II. Se propone que el aumento de IKV
por la Angio II contribuye a mantener la actividad tónica de potenciales de
acción.
ABSTRACT
The renin-angiotensin system (RAS) is the main enzymatic mechanism
responsible for maintaining the body arterial pressure. A secondary event upon
RAS activation is the increase of the sympathetic tone. In many areas of the
Nervous System the peptide Angiotensin II (Angio II) increases neuron
excitability by activating its G-protein coupled receptors. For instance, in superior
cervical ganglion (GSC) neurons, Angio II depolarizes the plasma membrane
thereby increasing action potential firing. The main goal of this work is to
address the cellular and molecular mechanisms underlying the enhancement of
cell excitability. Here, it is described that the delayer-rectifier K+ current, IKV, is
up-modulated by Angio II in SCG neurons. Thus, it was found that in twelve
neurons Angio II (500nM) increases current density of IKV in 12.1 ± 1.6 pA/pF.
This effect was reduced by the selective antagonist of the AT1 receptor, losartan
(2µM), from 12.2 ±1.4 pA/pF (n = 15) to 3.5 ± 0.6 pA/pF (n = 12). The
enhancement of IKV was insensitive to pertussis toxin (PTX) (control cells, 9.8 ±
1.6 pA/pF, n = 7: PTX-treated cells, 8.9 ± 1.8 pA/pF, n = 6), ruling-out the
involvement of Go/i in this type of modulation. Amplitude of IKV was quite
sensitive to 4-AP (500 µM) in a similar range as KV2.1 does. Moreover, 4-AP
reduced the Angio II-induced enhancement from 12.1 ± 1.6 pA/pF to 2.7 ± 1.2
pA/pF. Therefore, these results suggest that the AT1 receptor couples to a PTX-
insensitive G-protein to stimulate IKV. Due to the similar pharmacological
properties between KV2.1 subunit and IKV, it is quite possible that the endogenous
K+ channel underlying IKV is constituted by the KV2.1 subunit. It is proposed that
the modulated IKV contributes to maintain the high frequency firing activity upon
Angio II exposure of neurons.
7
IV. INTRODUCCIÓN.
El ambiente con el que la mayoría de las células corporales intercambian
material es el componente intersticial del líquido extracelular. Puesto que la
función celular depende de la constancia en la composición (Ej. glucosa, Na+) de
este líquido, los organismos multicelulares han desarrollado mecanismos
reguladores para conservarlo, provocando una serie de ajustes fisiológicos que
sirven para restaurar el estado normal, una vez que éste se ha modificado. Se le
conoce como homeostasis al proceso mediante el cual intervienen distintos
eventos fisiológicos con el fin de mantener las condiciones constantes en el
medio interno.
El elemento central de un proceso homeostático corporal es el sistema de
retroalimentación negativa. En él participan tanto receptores como efectores, con
el fin de asegurar que si algún parámetro fisiológico cambia fuera de ciertos
límites normales, el sistema de control inicia los ajustes necesarios para retornar
a la variable en cuestión a un valor medio predeterminado, manteniendo con ello
la homeostasis.
Así por ejemplo, como resultado de una alta oxidación celular se aumenta
la concentración de CO2 en el medio intersticial y este cambio aumenta la
ventilación pulmonar que a su vez hace retornar a este gas a su valor normal.
Otro ejemplo de sistema homeostático ampliamente descrito es el sistema
barorreceptor (Pérez, 1997; Santiago y Edelman, 1986). En las paredes de las
arterias de la bifurcación de la carótida común y el cayado aórtico existen
numerosos receptores denominados barorreceptores, los cuales continuamente
están censando la presión arterial. Cuando la presión arterial aumenta, los
baroreceptores envían un aluvión de impulsos nerviosos al bulbo raquídeo,
inhibiendo el centro vasomotor, el cual a su vez, disminuye la influencia
simpática del corazón y los vasos sanguíneos, disminuyendo así el bombeo del
corazón y produciendo dilatación de los vasos sanguíneos periféricos. Estos dos
efectos provocan que la presión arterial regrese a sus valores normales. A la
8
inversa, un descenso de la presión arterial relaja los baroreceptores, permitiendo
que el centro vasomotor se vuelva más activo de lo normal, haciendo así que la
presión arterial se eleve hasta recuperar su valor normal. En ambas respuestas
los efectos son negativos con respecto al estímulo iniciador y tienen como
finalidad la homeostasis del sistema. En lo que resta de la introducción se hace
énfasis sobre otro sistema de regulación que también participa en el control de la
presión arterial, es decir, el sistema renina-angiotensina.
1. LA ANGIO II COMO REGULADOR FISIOLÓGICO.
1.1 Principal vía de síntesis de la Angio II.
El sistema vasoconstrictor renina angiotensina (SRA) es uno de los
principales mecanismos enzimáticos responsables de mantener la homeostasis
cardiovascular. Estímulos como la hipotensión, hiponatremia o hipovolemia,
activan al SRA induciendo la liberación de la enzima renina por el aparato
yuxtaglomerular renal (Figura 1). Una vez en circulación, la renina actúa sobre el
angiotensinógeno, una alfa globulina sintetizada por el hígado, del cual corta un
decapéptido de su extremo aminoterminal. Este decapéptido es denominado
angiotensina I (Angio I) y su secuencia es, Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-
Leu. La Angio I es muy inestable y no tiene órgano blanco conocido. Sin
embargo, la Angio I sirve de substrato para la enzima convertidora de
angiotensina (ECA) dando lugar a la Angio II, al cortar los residuos His y Leu de
la Angio I. La ECA es producida principalmente por el endotelio de los capilares.
La Angio II si es un octapéptido biológicamente activo y al actuar sobre su
principal blanco, el músculo liso vascular, induce una potente vasoconstricción
que compensa la caída de la presión arterial (Figura 1).
Como en todo sistema de regulación fisiológica, el SRA no queda exento
de tener mecanismos de retroalimentación positiva y negativa. En la
9
retroalimentación positiva juega un papel relevante la estimulación del sistema
nervioso simpático, por la misma Angio II.
En la figura 2 se ilustran los dos mecanismos mediante los cuales la
Angio II aumenta la actividad simpática. En uno de ellos la Angio II excita
Angio I
ECA
Vasoconstricción
Aldosterona
Renina
Na+ túbulo distal Presión renal Actividad simpática Prostaglandinas
Angiotensinógeno
Angio II
ACTH, [K+]
+ +
+
++
+
ANP, pOsm-
Prostaglandinas Aldosterona Catecolaminas Receptores intrarrenalesNoradrenalina
-
FIGURA 1: Cascada del SRA. Estímulos como la hipotensión, hipovolemia o hiponatremiaprovocan la secreción de la enzima renina por el riñón. La renina corta al angiotensinógeno, el cual es sintetizado por el hígado, para producir Angio I. La enzima convertidora de angiotensina (ECA), producida y secretada por el tejido pulmonar, corta a la Angio I para sintetizar a la Angio II. Este péptido es un potente vasoconstrictor y un potente estimulante para la secreción de aldosterona. La aldosterona y la Angio II promueven la reabsorción de Na+ en el riñón. ACTH, hormona adenocorticotropa; ANP, péptido natriurético atrial; pOsm, osmolaridad del plasma (tomado de Zigmond y cols., Fundamental Neuroscience, Academic Press. 1999).
10
directamente a las neuronas simpáticas, induciendo la liberación de
noradrenalina (NA). Una vez liberada la NA este agonista tiene dos efectos: a)
produce vasoconstricción, la cual se suma a la producida por la Angio II; b) en el
riñón la NA estimula la secreción de renina. El otro mecanismo de
retroalimentación es indirecto y obedece a un aumento del tono simpático debido
a la participación de ciertas áreas del sistema nervioso central (SNC).
Angiotensinógeno
ANGIO II
Renina
Secreción de noradrenalina por terminales simpáticas
Receptores β
EstimulaciónSimpática
Vasoconstricción Aldosterona
Liberación de
Vasopresina
Retención de sodio y agua
FIGURA 2: El sistema renina-angiotensina incrementa la presión arterial por diversos mecanismos. Una vez sintetizada la Angio II, este péptido incrementa la presión arterial y el volumen sanguíneo mediante tres mecanismos: a nivel arteriolar produce vasoconstricción y al activar directamente en las neuronas simpáticas promueve la liberación de noradrenalina la cual tiene efectos vasoconstrictores además estimular la secreción de aldosterona. De manera paralela, a nivel cerebral, la Angio II incrementa el tono simpático (y con ello los reflejos cardiovasculares), estimula la secreción de vasopresina y estimula la sensación de consumo de agua y Na+. (Tomado de Zigmond y cols., Fundamental Neuroscience, Academic Press. 1999).
11
¿Cómo la Angio II periférica dispara la estimulación de las áreas del SNC
que regulan el tono simpático? En este efecto juega un papel relevante el órgano
subfornical (SFO), el cual se localiza en la porción dorsal del tercer ventrículo. El
SFO carece de barrera hematoencefálica y sus neuronas son sensitivas a la
Angio II, por lo que el aumento en la Angio II circulante se traduce en una señal
central que eventualmente se propaga en dirección rostro caudal hacia las
neuronas preganglionares de la columna intermedio lateral (IML) de la médula
espinal. En esta ruta descendente intervienen el núcleo paraventricular del
hipotálamo (PVN), cuyas neuronas reciben aferentes del SFO (Bains y
Ferguson, 1995; Miyakubo y cols., 2002), y la médula rostro-ventrolateral
(RVLM), esta última considerada como un área primordial del control simpático
(Figura 3). El PVN contiene tres tipos principales de neuronas: a) las neuronas
magnocelulares, las cuales son responsables de la secreción de la hormona
antidiurética arginina vasopresina (AVP), en la pituitaria posterior; b) las
neuronas parvocelulares neuroendocrinas y; c) las neuronas parvocelulares
preautonómicas. Este último grupo de neuronas regulan al sistema nervioso
autónomo debido a que sus proyecciones terminan, en orden jerárquico, en la
RVLM y en las motoneuronas preganglionares de la columna IML de la médula
espinal, pero también en el núcleo del tracto solitario (NTS) (Hardy, 2001; Pyner
y Coote, 2000). Por su parte, la RVLM contiene neuronas que proyectan
monosinápticamente a las motoneuronas preganglionares de la columna IML.
Hay evidencia que la Angio II participa como neurotransmisor en esta ruta
supraespinal. Por ejemplo, la inyección de Angio II en el PVN o en la RVLM
aumenta la presión arterial y los reflejos simpáticos cardiovasculares (Sasaki y
Dampney, 1990; Zhu y cols., 2002), siendo estos efectos bloqueados por el
antagonista del receptor AT1, losartan (Tagawa y Dampney, 1999; Zhu y cols.,
2002). En resumen, la Angio II actúa sobre el SFO como un mensajero
circulante y como neurotransmisor en el PVN y la RVLM.
Cabe hacer notar que el PVN, junto con el núcleo supraóptico (SON), son
los núcleos del hipotálamo en donde se sintetiza la AVP, la cual se libera en
respuesta al aumento de la osmolaridad de los fluidos corporales (Figura 3).
12
Dado que una de las respuestas fisiológicas a la hipovolemia es la retención de
agua, no es de sorprender que la Angio II también participe en la regulación por
el SNC del balance hídroelectrolítico, vía la inervación del PVN que recibe del
SFO (Figura 3).
En relación a la retroalimentación negativa, ésta incide sobre la
degradación de la Angio II y la liberación de renina. La vida media del
octapéptido es muy breve, alrededor de 20 segundos (Laragh and Sealey,
1975), ya que la Angio II es cortada por aminopeptidasas a péptidos cada vez de
menor peso molecular, como el heptapéptido angiotensina III, del cual se
desconoce su actividad biológica. Respecto a la liberación de renina uno de los
factores que inhiben su liberación es el propio incremento de la Angio II
circulante. Otros factores son: las prostaglandinas, la aldosterona, las
catecolaminas, los receptores intrarrenales localizados en la pared vascular y en
la mácula densa y finalmente la inervación renal que recibe la influencia del
Osmolaridad
SON
SFO
PIT
IML
Angio II
FIGURA 3: Núcleos centrales que participan en el control del tono simpático. Las neuronas del órgano subfornical (SFO) son sensibles a la Angio II circulante. Estas neuronas envían axones al hipotálamo en donde inervan a las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) y supraóptico (SON). Las neuronas parvocelulares preautonómicas del PVN envíanaxones a la médula rostro-ventrolateral (RVLM). Las neuronas C1 de la RVLM inervan a las neuronas de la columna intermedio lateral (IML) de la médula espinal, pero estas motoneuronas preganglionares también reciben inervación directa de las neuronas parvocelulares preautonómicas del PVN (linea punteada). En el SFO, PVN y RVLM la Angio II tiene acción excitatoria. (modificado de Zigmond y cols., Fundamental Neuroscience, Academic Press. 1999).
AVP
PVN
SRVLM
NTS S
s
13
sistema neuroadrenérgico por activación de los mecanorreceptores de alta y
baja presión (Figura 1).
1.2 Receptores a la Angio II
Los efectos celulares de la Angio II se deben a la estimulación de sus
respectivos receptores de membrana, los cuales pertenecen a la superfamilia de
receptores con siete dominios transmembranales. Este tipo de receptores
comúnmente se acoplan con proteínas G (proteínas que unen nucleótidos de
guanina) y subsecuentes cascadas de segundos mensajeros, para disparar
diversas respuestas celulares (Wess, 1998). Se conocen dos tipos de receptores
a la Angio II: el AT1 y el AT2. Ambos receptores son similares en tamaño (359
aminoácidos para el receptor AT1 y 363 aminoácidos para el receptor AT2). Un
análisis detallado de la secuencia del AT1 indica que este receptor tiene dos
subtipos, el AT1A y el AT1B, los cuales ostentan su mayor diferencia en el
extremo carboxilo-terminal (Chiu y cols., 1990).
Respecto a su distribución tisular, el receptor AT1A está altamente
expresado en el hígado, riñón, aorta, útero, ovario, bazo, pulmón y cerebro,
mientras que el receptor AT1B se expresa en la hipófisis, glándula adrenal, riñón,
útero e hígado y está ausente en el corazón, cerebro y bazo (Kakar y cols,
1992). Por su parte, el receptor AT2 se expresa principalmente en las glándulas
suprarrenales, cerebro, miometrio uterino y folículos ováricos atrésicos.
Aparentemente el receptor AT2 se expresa abundantemente en tejido fetal y por
lo tanto se sospecha que interviene en procesos de crecimiento y madurez. En
tejidos adultos, la expresión del AT2 se estimula en heridas cutáneas y en la
neoíntima posterior a daño vascular, existiendo evidencias de que este receptor
tiene un efecto antiproliferativo. Es posible que para efectos de proliferación y
crecimiento celular los dos tipos de receptores actúen compensando sus
efectos, siendo el AT1 proliferativo y el AT2 antiproliferativo (Pratt, 1992). Estos
novedosos efectos tróficos de la Angio II escapan al propósito de la presente
tesis y sólo se recomienda consultar revisiones al respecto (Ej. Marrero y cols.,
1996).
14
Los principales antagonistas de los receptores a la Angio II se resumen en
la tabla 1.
ANTAGONISTAS
AT1 AT2
Candersartan PD-123319
Eprosatan CGP42112A
Forasartan
Losartan
Irbersartan
Ripisartan
Tasosartan
Valsartan
1.3 Cascadas bioquímicas de señalización estimuladas por los
receptores a la Angio II.
La cascada de señalización que mejor se conoce ser activada por la Angio II es
la que subyace a su efecto vasoconstrictor. Esta ruta de señalización celular es
la de la fosfolipasa Cβ. En el tejido vascular, la unión de la Angio II al receptor
AT1 activa a la proteína Gq/11, que a su vez estimula a la enzima fosfolipasa Câ1.
Dicha enzima hidroliza el fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato (PIP2) para sintetizar los
segundos mensajeros inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol. El IP3 actúa
sobre receptores específicos de la membrana del retículo sarcoplásmico (RS) y
promueve la liberación del Ca2+ allí almacenado hacia el citosol (Figura 4).
El aumento de Ca2+ citosólico dispara la contracción del músculo liso, sin
embargo, otros mecanismos contribuyen a amplificar la señal de Ca2+. Por
ejemplo, el RS al vaciarse de Ca2+ sirve como señal para la entrada de este
catión desde el medio extracelular a través de canales de Ca2+ de tipo
TABLA 1: Principales antagonistas de los receptores a la Angio II.
15
“capacitivo”. Por su parte, el DAG activa y transloca la proteína cinasa C (PKC)
hacia la membrana celular produciendo el cierre de canales de potasio, lo que
despolariza la membrana y activa los canales de Ca2+ voltaje dependientes tipo
L (Figura 4). El resultado de todos estos efectos es un aumento de la
concentración de Ca2+ intracelular, [Ca2+]i, que produce la potente
vasoconstricción arteriovenosa (Berk y Corson, 1997; Van Bilsen, 1997; Unger,
2003).
16
2. FUNCIÓN DE LA ANGIO II EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL (SNC).
2.1 Evidencia de Angiotensinógeno, renina y ECA en el SNC.
La presencia de transmisión sináptica de tipo angiotensinérgica en áreas
del SNC involucradas en el control del tono simpático, presión arterial y/o del
balance hidroelectrolítico de los fluidos corporales, implica la presencia de
Angio II
Gq11PLCβ
AT1PIP2
Hidrólisis IP3
PKC
RS
Receptor a IP3
IP3
Ca2+
Cap
Ca2+
K+
Canales de K+
Ca2+
Ca2+L
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8) (9)
INTRACELULAR
FIGURA 4: Cascada de señalización disparada por la Angio II en el músculo liso vascular. El receptor AT1 (1) se acopla a la proteína Gq/11 para estimular a la fosfolipasa Câ(2). La enzima hidroliza al fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato (PIP2) para sintetizar al inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y al diacilglicerol (DAG) (3). El IP3 actúa sobre sus receptores del retículo sarcoplásmico (RS), liberando Ca2+ (4), el cual dispara la contracción del músculo. Al vaciarseel RS de Ca2+, esto sirve como señal (5) para la entrada de Ca2+ desde el medio externo (6), vía canales de Ca2+ “capacitivos” (Ca2+
Cap). Además, el DAG activa (7) a la proteína cinasa C(PKC), la cual inhibe a canales de K+ (8), despolariza la membrana y con ello se activan los canales de Ca2+ tipo L (9). El efecto final es mayor señal de Ca2+ y vasoconstricción.
17
angiotensinógeno y de las enzimas renina y ECA en el SNC. La siguiente
descripción se basa, en su mayoría, en datos de la rata adulta. Estudios de
hibridación in situ o inmunohistoquímica indican que el angiotensinógeno se
concentra en el SFO, PVN, SON y el núcleo preóptico medial (MnPO). El origen
celular del precursor es tanto glial (astrocitos) como neuronal (Healy y Printz,
1984; Lippoldt y cols., 1993; Sernia, 1995). Por su parte, la renina también se ha
detectado en el PVN, SON y tallo cerebral (Healy y Printz, 1984; Yu y
Nicolantonio, 1996). Finalmente, estudios de autorradiografía con el inhibidor
específico de la ECA, I-351A, indican que esta enzima se concentra en el plexo
coroideo, el SFO, el colículo superior, el NTS y la oliva inferior (Rogerson y cols.,
1995).
Como es de esperarse, la localización de Angio II no difiere
sustantivamente de la distribución de angiotensinógeno, renina y ECA. Estudios
de inmunohistoquímica revelan que la Angio II preferentemente se concentra en
las células del SFO, SON y PVN (Lind y cols., 1985a). Sin embargo, otras áreas
del SNC presentan inmunoreactividad, las cuales abarcan desde el bulbo
olfatorio hasta la columna IML de la médula espinal y que incluyen el tálamo, el
núcleo medial de la amígdala, el NTS, entre otros (Lind y cols, 1985b). Esta
amplia distribución de la Angio II sugiere que el péptido es un neuromodulador
ampliamente usado en el SNC.
2.2 Distribución de receptores a la Angio II en el SNC.
La distribución en el SNC de los dos tipos de receptores a la Angio II se
ha estudiado principalmente con la técnica de autorradiografía, cuantificando el
desplazamiento de la [125I] Sar1-Ile8-Angiotensina II, por el antagonista del
receptor AT1, DuP 753 (losartan) o del AT2, PD123177. El esquema general que
emerge de estos estudios es el siguiente: el receptor AT1 se localiza
principalmente en el SFO, órgano vasculoso de la lámina terminal, MnPO,
18
PVN, SON, RVLM, núcleo dorsal motor del vago, NTS, área postrema y núcleo
ambiguo (Aldred y cols., 1993; Gehlert y cols., 1991; Song y cols., 1992). Por su
parte, el receptor AT2 se localiza principalmente en el tálamo y núcleos
subtalámicos, oliva inferior, la amígdala, el septum lateral, el colículo superior y
el locus coeruleus (Aldred y cols., 1993; Gehlert y cols., 1991; Song y cols.,
1992). Millan y cols. (1991) reportaron una distribución similar del receptor AT2,
pero este estudio contrasta con los anteriores debido a los escasos sitios de
unión encontrados para el losartan. Esta aparente ausencia del receptor AT1 en
las áreas implicadas en el control del balance hidroelectrolítico y cardiovascular
puede deberse a un artefacto inducido por el agente antioxidante dithiothreitol, el
cual reduce de manera específica la unión al receptor AT1 y paralelamente
aumenta la unión al AT2 (Song y cols., 1992).
2.3 Efectos celulares de la Angio II en el SNC.
2.3.1 Efecto sobre las células del SFO.
La aplicación de Angio II en el SFO despolariza a las neuronas, efecto
asociado a un incremento en la conductancia de la membrana, e incrementa su
frecuencia de disparo (Ono y cols., 2001). Estudios de “patch-clamp” en
neuronas identificadas y disociadas del SFO revelan la presencia de una
corriente de Na+ sensible a la tetrodotoxina (TTX), las corrientes de Ca2+ tipos N
(ICaN) y L y las corrientes de K+, rectificador tardío e IA (Johnson y cols., 1999;
Washburn y Ferguson, 2001). De estas corrientes, la Angio II aumenta ICaN e
inhibe a la IA, pero además induce una corriente catiónica inespecífica (Ferguson
y Li, 1996; Ono y cols., 2001; Washburn y Ferguson, 2001). Estos efectos
pueden explicar la despolarización de la membrana y el aumento en la
frecuencia de disparo. Se desconoce si la corriente catiónica es dependiente de
Ca2+ y si su activación es secundaria al aumento de la ICaN. Por otra parte, los
efectos de la Angio II sobre las corrientes entrantes son bloqueados por el
19
antagonista del receptor AT1, losartan (Ono y cols., 2001; Washburn y Ferguson,
2001).
2.3.2 Efecto sobre las neuronas del PVN.
En el PVN la Angio II también tiene efectos excitatorios, sin embargo, el
mecanismo parece depender del tipo de neurona (Bains y Ferguson, 1995).
Respecto a sus corrientes iónicas las diferencias entre las neuronas
magnocelulares y parvocelulares son las siguientes (Luther y Tasker, 2000): a)
las primeras carecen de una corriente de Ca2+ tipo T;b) las neuronas
magnocelulares ostentan una corriente IA que en proporción es
significativamente mayor a la registrada en las parvocelulares. Ambos tipos de
neuronas expresan una corriente de K+ del tipo rectificador tardío y en las
neuronas magnocelulares también se ha reportado la presencia de una corriente
de K+ activada por Ca2+ (Li y Ferguson, 1996; Luther y Tasker, 2000). En las
neuronas magnocelulares la Angio II inhibe en un 31% a la IA, siendo este efecto
bloqueado por el losartan (Li y Ferguson, 1996). Como sucede en las neuronas
del SFO, en las neuronas magnocelulares del PVN la inhibición de la IA puede
contribuir al aumento en su frecuencia de disparo por la Angio II (Li y Ferguson,
1993).
Contrario al efecto postsináptico de la Angio II sobre las neuronas
magnocelulares, un mecanismo presináptico induce el aumento de la
excitabilidad de las neuronas parvocelulares preautonómicas. Dentro del PVN, el
GABA y el glutamato son los principales neurotransmisores, los cuales controlan
la excitabilidad de las neuronas parvocelulares preautonómicas. Recientemente
se ha reportado que en este tipo de neuronas la Angio II reduce la amplitud de
los potenciales sinápticos inhibitorios y la frecuencia de la actividad inhibitoria
sináptica espontánea (Li y cols., 2003). Dichos efectos de la Angio II son
selectivos sobre la transmisión GABAérgica y no se deben a cambios en la
conductancia de la membrana postsináptica. De esta manera se propone que el
aumento en la frecuencia de disparo, que induce la Angio II en las neuronas
20
parvocelulares que proyectan a la médula espinal, se debe principalmente a su
desinhibición de la influencia GABAérgica (Li y cols., 2003). Los efectos de la
Angio II sobre la transmisión GABAérgica también son bloqueados por el
losartan, sugiriendo que el receptor AT1 también se localiza presinápticamente
en el PVN.
2.3.3 Efecto sobre las neuronas de la RVLM.
Como se mencionó, la RVLM tiene un papel central en la generación del
tono simpático y los reflejos cardiovasculares. La mayoría de las neuronas
bulboespinales de la RVLM son del llamado tipo C1, las cuales contienen las
enzimas necesarias para la síntesis de adrenalina, ostentan una alta densidad
de receptores AT1 (Aldred y cols., 1993; Hu y cols., 2002; Song y cols., 1992) y
la mayoría de las neuronas C1 hacen contactos monosinápticos con las
motoneuronas preganglionares de la médula espinal. La importancia de la
inervación angiotensinérgica de la RVLM se manifiesta porque la inyección de
Angio II en esta área produce efectos presores (Sasaki y Dampney, 1990) e
incrementa la liberación de glutamato y aspartato en la columna IML de la
médula espinal (Hu y cols., 2002).
La mayoría de las neuronas C1 tienen disparo espontáneo (Ej. 2
espigas/seg). Esta actividad tónica es generada por las propiedades eléctricas
intrínsecas de las neuronas, a las que contribuyen una corriente de Na+
sostenida (Kangrga y Loewy, 1995) y otras corrientes iónicas como la IA y las
corrientes de Ca2+ tipo T, N y P/Q (Kangrga y Loewy, 1995; Li y cols., 1998).
Dado que esta actividad tónica podría ser el mecanismo celular primario
responsable de mantener un tono excitatorio sobre las motoneuronas
preganglionares, es posible que la Angio II incremente notablemente la
frecuencia de disparo de las neuronas C1. Este efecto ha sido confirmado por Li
y Guyenet (1996), quienes reportaron que la Angio II incrementa la frecuencia de
disparo de 2.2 a 6.5 espigas/seg, es decir, un aumento de ~ 200% y bloqueado
por el antagonista del receptor AT1, losartan.
21
Similar al efecto de la Angio II en el SFO, en las neuronas C1 el péptido
provoca una despolarización sostenida debida a la inducción de una corriente
entrante. Sin embargo, contrario al SFO en donde la corriente entrante se debe
a la activación de una corriente catiónica (Ono y cols., 2001), en la RVLM la
corriente entrante se debe a la inhibición de una corriente de K+ tipo “leak” (Li y
Guyenet, 1996). De esta manera, la despolarización de la membrana y el
aumento de su resistencia de entrada se traducen en aumento en la frecuencia
de disparo.
2.3.4 Efecto sobre neuronas espinales.
En las motoneuronas la Angio II también produce efectos excitatorios los
cuales se asemejan a los descritos en las neuronas C1 de la RVLM. Es decir, la
Angio II incrementa la frecuencia de disparo, provoca una lenta despolarización
asociada a un aumento en la resistencia de entrada e induce una corriente
entrante, con curso temporal similar a la despolarización, cuyo potencial de
inversión sugiere la participación de una corriente de K+ (Oz y Renaud, 2001).
Estos efectos son bloqueados por el losartan, sugiriendo la participación del
receptor AT1, y reducidos por la toxina pertussis (PTX), sugiriendo que en estas
neuronas el receptor AT1 se acopla a algún miembro de la familia Gi de las
proteínas G (Oz y Renaud, 2001).
En otro tipo de neuronas espinales los efectos excitatorios de la Angio II
parecen deberse a otros mecanismos. Por ejemplo, en células clasificadas como
interneuronas, la Angio II genera una corriente entrante catiónica que reduce la
resistencia de entrada (Oz y Renaud, 2001), simulando al mecanismo que opera
en el SFO.
2.3.5 Efectos sobre otras neuronas centrales.
Otro sitio de acción de la Angio II es el MnPO. Las neuronas de este
núcleo responden a la Angio II con una lenta despolarización que resulta en
22
disparo repetitivo prolongado (> 5 min) (Bai y Renaud, 1998). En condiciones de
fijación de voltaje la Angio II induce una corriente entrante con curso temporal
similar a la despolarización vista en fijación de corriente. Esta corriente entrante
es insensible a la TTX y su aparición es bloqueada por el losartan, sugiriendo
que en el MnPO la Angio II también activa al receptor AT1 para aumentar la
excitabilidad neuronal. La despolarización de la membrana está asociada a un
aumento en la resistencia de entrada, sugiriendo que la corriente entrante refleja
la supresión de una corriente saliente (probablemente de K+) por la Angio II.
Otros efectos se aprecian en neuronas que generan salvas de potenciales de
acción, en donde la Angio II reduce la posthiperpolarización y de esta manera
elimina la conducta denominada como adaptación a la frecuencia (Bai y Renaud,
1998).
Por otra parte, el grupo de Sumners ha caracterizado los efectos de la
Angio II sobre dos corrientes de K+, en cultivos mixtos de neuronas de
hipotálamo y tallo cerebral de ratas recién nacidas. No obstante que este
laboratorio ha realizado progresos importantes respecto a las cascadas de
señalización activadas por la Angio II, este modelo experimental tiene la
desventaja de que no permite conocer la identidad de las neuronas estudiadas.
Por ello, los resultados que a continuación se describen deben tomarse con
cierta reserva respecto a su extrapolación a una área específica del hipotálamo
o tallo cerebral, lo cual contrasta con los datos descritos en los anteriores
apartados y en donde la identificación de las neuronas se realizó con técnicas de
transporte retrogrado de moléculas fluorescentes, previo a la obtención de
rebanadas.
En los cultivos mixtos de hipotálamo y tallo cerebral bañados con una
solución conteniendo TTX y Cd2+ (el cual bloquea a las corrientes de Ca2+ y por
ende elimina a las corrientes de K+ activadas por Ca2+), la Angio II aumenta (∼
50%) la amplitud de los componentes transitorio y sostenido de la corriente
saliente generada por una despolarización de –80 mV a +10 mV y 60 mseg de
duración (Kang y cols., 1994). Al componente sostenido se le atribuye a una
corriente de K+ del tipo rectificador tardío, denominada IK y cuyo aumento fue
23
mimetizado o bloqueado por el agonista del receptor AT2, CGP-42112A. El
efecto de la Angio II sobre IK fue bloqueado por la PTX, por un anticuerpo de la
proteína G, Gi, y por el inhibidor de la fosfatasa PP2A, ácido okadaico (Kang y
cols., 1994). En un estudio posterior se encontró que la Angio II estimula la
producción de ácido araquidónico (AA), efecto también bloqueado por la PTX,
además la aplicación de este mensajero mimetiza el efecto de la Angio II sobre
IK (Zhu y cols., 1998). La participación de la vía de la fosfolipasa A2 (PLA2) fue
confirmada porque su inhibición con un bloqueador o con un anticuerpo selectivo
para esta enzima, reduce el efecto estimulante de la Angio II (Zhu y cols., 1998).
En las células el AA es metabolizado por dos grandes rutas: la de las
lipooxigenasas y las ciclooxigenasas (Siegel y cols., 1999). Hay evidencia de
que en el aumento de IK participa específicamente la ruta de la 12-lipooxigenasa
y su metabolito, el 12S-HETE (Zhu y cols., 1998; Zhu y cols., 2000). En
resumen, el aumento de IK por la Angio II parece deberse a la activación del
receptor AT2, el cual se acopla a la proteína Gi para estimular a la PLA2, con la
subsecuente síntesis de AA y 12S-HETE, siendo la activación de la PP2A un
evento posterior.
Este mismo laboratorio ha reportado que en otras neuronas la Angio II
tiene un efecto opuesto sobre IK (Sumners y cols., 1996). En este caso la
inhibición es bloqueada o reducida por el antagonista del receptor AT1, losartan,
por un anticuerpo contra la enzima fosfolipasa Cγ (PLCγ), por el buffer de Ca2+,
BAPTA y por inhibidores de la PKC y de la calmodulina (CaM). Por otra parte el
efecto es mimetizado por la diálisis del IP3, por la inyección de la proteína cinasa
dependiente de Ca2+/CaM tipo II (CaM KII) preactivada (Sumners y cols., 1996;
Zhu y cols., 1999). Estos datos sugieren que el receptor AT1 inhibe a IK por un
mecanismo de fosforilación mediado por la PKC y la CaM KII, previa
estimulación de la PLCγ. Al parecer la subunidad Kv2.2 contribuye al canal de K+
que genera a la IK (Gelband y cols., 1999). Otra acción de la Angio II mediada
por el receptor AT1 es la inhibición de la corriente de K+ IA (Wang y cols., 1997),
sin embargo, se desconoce si la vía de la PLCγ que inhibe a IK (∼ 25%) también
inhibe a la IA (∼ 31%).
24
2.3.6 Conclusiones
En resumen, los resultados descritos en esta sección permiten decir que
el efecto celular frecuentemente inducido por la Angio II en el SFO, PVN, RVLM,
MnPO y la asta ventral de la médula espina es el aumento de la excitabilidad
celular. Este efecto es principalmente mediado por el receptor AT1 y se traduce
ya sea en la inducción de disparo repetitivo o bien en aumento en la frecuencia
de disparo. Los mecanismos celulares son en su mayoría postsinápticos, a
excepción de la desinhibición de las neuronas parvocelulares preautonómicas
del PVN, e involucran la regulación de distintas conductancias iónicas. La tabla
2, resume el efecto de la Angio II sobre las corrientes iónicas de los núcleos
anteriores.
Por otra parte, en los cultivos mixtos de hipotálamo y tallo cerebral la
Angio II tiene un efecto notable sobre IK, el cual es mediado por el receptor AT2.
No obstante la detallada caracterización de las cascadas de señalización
implicadas en la modulación de IK, no se tiene evidencia suficiente de que esta
corriente efectivamente represente a un rectificador tardío porque el pulso
comando utilizado para generar a IK también activa a la IA, una corriente de K+
de rápida activación e inactivación. No se descarta la posibilidad de que estas
neuronas ostenten otros tipos de IA que se inactiven lentamente (Malin y
Nerbonne, 2000) y de esta manera contaminen las medida de la amplitud de IK
realizada al final del pulso comando (60 mseg). Otro enigma es la procedencia
específica de las neuronas cultivadas porque al menos en el PVN la Angio II no
tiene efecto sobre IK (Li y Ferguson, 1996). Además estos cultivos mixtos
contienen ∼ 70% de receptores AT2 y ∼ 30% de receptores AT1 (Wang y cols.,
1997), lo cual contrasta con la predominancia del receptor AT1 en el SFO, PVN,
RVLM, MnPO de la rata adulta (Aldred y cols., 1993; Gehlert y cols., 1991; Song
y cols., 1992), resultado confirmado por los estudios electrofisiológicos
realizados en estas mismas áreas. Esto sugiere que en los cultivos mixtos de
hipotálamo y tallo cerebral de la rata recién nacida aún es muy abundante el
25
receptor AT2 o bien las neuronas registradas tienen un origen distinto a los
núcleos neuronales citados.
Neuronas
Receptor
Efecto
Mecanismo
SFO AT1 Lenta despolarización
Frecuencia de disparo
Inducción de una corriente catiónica
inespecífica; aumento de la ICaN;
inhibición de la IA.
PVN AT1 Frecuencia de disparo
Reducción de la IA en neuronas
magnocelulares; desinhibición
presináptica de las neuronas
parvocelulares preautonómicas.
RVLM AT1 Lenta despolarización
frecuencia de disparo
Inhibición de una corriente de K+ tipo
“leak”, en neuronas C1.
Neuronas
espinales
AT1 Lenta despolarización
frecuencia de disparo
En motoneuronas es la inhibición de
una corriente de K+; en interneuronas
es la activación de una corriente
catiónica inespecífica.
MnPO AT1 Lenta despolarización
frecuencia de disparo
Inhibición de una corriente de K+;
menor adaptación a la frecuencia.
TABLA 2: Efectos de la Angio II en neuronas del SNC.
26
3. ANTECEDENTES
En la introducción se mencionó que uno de los mecanismos de
retroalimentación positiva subsecuentes a la activación del SRA es la
estimulación directa las neuronas simpáticas (Figura 2), lo cual conduce a que
estas células liberen noradrenalina.
¿Cuáles son los mecanismos celulares que subyacen a la excitación de
las neuronas simpáticas y en particular, de las neuronas del ganglio superior
cervical? Las neuronas del ganglio superior cervical (GSC) reciben inervación
colinérgica de las motoneuronas preganglionares espinales y por su parte, los
somas de las neuronas GSC dan origen a fibras posganglionares, un conjunto
de las cuales forman el nervio cardiaco cervical superior.
Las neuronas del GSC son el prototipo de neurona mejor estudiada desde
el punto de vista bioquímico y electrofisiológico. En estas neuronas se han
identificado distintas cascadas de señalización activadas por receptores
acoplados a proteínas G, que modulan a canales de Ca2+ y de K+. De estos
receptores, los muscarínicos ejercen un notable impacto sobre la excitabilidad
celular. Por ejemplo, la estimulación muscarínica de estas neuronas genera
actividad tónica de potenciales de acción (Figura 5), los cuales disparan la
liberación de NA (Koh y Hille, 1997).
FIGURA 5: La estimulación muscarínica de las neuronas simpáticas aumenta su excitabilidad. Nótese como la aplicación (línea horizontal) de muscarina transforma a la neurona de un estado eléctricamente silente a otro de disparo tónico. (de Marrion N. V. Annu. Rev. Physiol. 59, 483-504. 1997).
Muscarina (10µM)
27
Uno de los mecanismos que contribuyen al aumento de la excitabilidad
celular es la poderosa inhibición (90%) de la corriente de K+ tipo M (IKM). IKM es
una corriente dependiente del voltaje que se activa en el rango subumbral y no
presenta inactivación. Por ello, IKM domina la conductancia de la membrana,
contribuyendo así al potencial de reposo de las neuronas GSC. Por lo tanto, la
inhibición de IKM se traduce en despolarización y en un notable aumento en la
resistencia de entrada, propiciando la generación de potenciales de acción y/o
amplificando los efectos de entradas sinápticas concurrentes. En este tipo de
neuronas simpáticas se conoce con cierto detalle la cascada de señalización
que interviene en la inhibición muscarínica de IKM. En ella participa el receptor
muscarínico M1, la proteína G Gq (Haley y cols., 1998; Hamilton y cols., 1997) y
una fosfolipasa (posiblemente la fosfolipasa Cβ) que hidroliza al PIP2.
Actualmente se tiene evidencia de que el consumo de la reserva de PIP2 es el
mecanismo que inhibe a IKM (Suh y Hille, 2002), independientemente de la
activación de la PKC o la liberación de Ca2+ de depósitos sensibles al IP3
(Cruzblanca y cols., 1998; Delmas y cols., 2002).
Desde hace poco más de dos décadas se reportó que en las neuronas
GSC la Angio II mimetiza el efecto de la estimulación muscarínica, es decir,
reduce la conductancia de la membrana y favorece la generación de potenciales
de acción (Brown y cols, 1980), sugiriendo que IKM también es regulada por este
neuropéptido. En efecto, la Angio II produce una robusta inhibición de IKM
(Shapiro y cols., 1994), la cual se cree esta mediada por la misma cascada de
señalización que estimula el receptor M1 (Hamilton y cols., 1997; Hille, 1994).
Además del efecto sobre IKM, la Angio II también inhibe a la ICaN, por un
mecanismo independiente del voltaje. El efecto de la Angio II sobre la ICaN es
reducido por el losartan y el GDPβS, pero no por la PTX, sugiriendo que el
receptor AT1 se acopla a una proteína G diferente a la familia Go/i para inhibir a
ICaN. Se desconoce si la Angio II emplea la misma cascada bioquímica de
señalización para inhibir a IKM e ICaN.
28
Recientemente se ha reportado en las neuronas GSC que la estimulación
muscarínica aumenta la amplitud de una corriente de K+ del tipo rectificador
tardío, denominado IKV (Figura 6; Cruzblanca, 2002).
En esta modulación interviene un receptor del tipo M2 y una proteina G
insensible a la PTX. Dado que en las células excitables donde se expresa IKV,
esta corriente de K+ contribuye a la repolarización del potencial de acción (Hille,
2001), su aumento debe acelerar la repolarización y por ende limitar la
inactivación de una fracción importante de canales de Na+ o de Ca2+. De esta
manera, la inhibición de IKM (que tiende a despolarizar a la membrana a su valor
umbral) y la potenciación de IKV (que acelera la fase repolarizante del potencial
de acción) pueden contribuir a sostener un patrón tónico de disparo de alta
frecuencia (Figura 6), que subyace a la excitación de las neuronas GSC. Por lo
anterior, en la presente tesis se explora si la Angio II modula a IKV y de ser así,
caracterizar las propiedades globales de la cascada de señalización empleada
por el neuropéptido y se compararla con la acción muscarínica.
FIGURA 6: Efecto de la estimulación muscarínica en las neuronas GSC sobre la amplitud de la IKV. Registros de IKV obtenidos a -30, -20 y –10 mV (potencial de sujeción = -50 mV), en la condición control (izquierda) y 2 min después de la aplicación de 1µM del agonista muscarínico Oxo-M (derecha). Nótese que a todos los voltajes la Oxo-M aumenta tanto la amplitud de IKV así como su corriente de cola (de Cruzblanca, 2002)
Oxo-M
20 ms
1 nA
-10
-20
-30
Oxo-M
Control
29
4. HIPÓTESIS.
La Angio II modula a una corriente de potasio tipo rectificador tardío en
neuronas simpáticas.
5. OBJETIVO GENERAL:
Determinar si la Angio II modula a la corriente de K+ del tipo rectificador tardío,
IKV, en neuronas GSC e identificar farmacológicamente el tipo de receptor
involucrado.
5.1 Objetivos particulares:
a) Aislar a la corriente de K+ del tipo rectificador tardío, IKV.
b) Determinar si la Angio II tiene efecto sobre la amplitud de la IKV.
c) Identificar farmacológicamente el tipo de receptor a la Angio II que modula
a la IKV.
d) Identificar farmacológicamente si el receptor a la Angio II se acopla a una
proteína G sensible a la PTX.
e) Comparar la modulación muscarínica de la IKV con la modulación de la
Angio II.
f) Explorar por medios farmacológicos, la posible composición molecular de
la subunidad del canal de K+ modulado por la Angio II.
30
6. MATERIALES Y METODOS
Cultivo Celular: Los experimentos se realizaron en neuronas del GSC
mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas
fueron anestesiadas por vía respiratoria con cloroformo y posteriormente
decapitadas; se disecaron rápidamente ambos ganglios y se descapsularon.
Con el fin de facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión
enzimática se realizaron varios cortes transversales del GSC. Las enzimas
empleadas fueron papaína (20 U/ml), colagenasa (1.5 mg/ml) y dispasa (5
mg/ml), disueltas en solución de Hanks modificada (ver soluciones).
Después de su incubación durante 36 minutos con las enzimas, los
ganglios se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas
pulidas al calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una
vez logrado la disociación del tejido, las enzimas se diluyeron añadiendo medio
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Cat. No. 11995-065, GIBCO) y la
suspensión se centrifugó a 2800 rpm durante 5 min. Se resuspendieron las
neuronas en medio fresco conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFB)
y se centrifugaron por segunda ocasión a 2800 rpm durante 5 min.
Posteriormente las neuronas fueron sembradas en pedazos de vidrio (4 x
4 mm) tratados previamente con polilisina (500ng/ml) (SIGMA). Las neuronas se
incubaron en DMEM + 10% SFB + una mezcla de antibiótico y antimicótico (ver
soluciones). La incubación fue a 37oC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta
antes de su empleo para los experimentos electrofisiológicos.
Electrofisiología: Para el registro de la IKV se transfirió uno de los fragmentos
de vidrio conteniendo neuronas, a una cámara de registro de capacidad de 200
µl y se bañaron con solución Ringer Normal (ver soluciones) a una tasa de 3
ml/min. La IKV se registró mediante la técnica de “Patch-Clamp” en la
configuración de “célula entera”, utilizando pipetas de vidrio con una resistencia
de 1.4-1.8 MΩ. Los registros se realizaron con el amplificador EPC7 (HEKA
Helektronik) y un sistema de adquisición analógico-digital de 12 bits (Indec
31
Systems). La resistencia en serie fue en promedio 1.8 MΩ y se compensó al 40-
50%.
Para el registro de la IKV se bloqueó previamente las corrientes de Na+ y
Ca2+ con 500 nM de TTX y 200 µM de Cd2+ respectivamente, siendo ésta la
solución control. La IKV se generó con pulsos comando despolarizantes de 100
mseg de duración, en el rango de -40 a 0 mV (el voltaje de sujeción fue de -60 ó
-50 mV). Antes de su adquisición a 5 kHz la IKV se filtró a 1 kHz. Para medir la
amplitud de IKV primero se restó la corriente de fuga fuera de línea y luego se
obtuvo la diferencia entre el promedio de la corriente basal (5 mseg) y el
promedio del nivel de la corriente alcanzada al final del pulso comando,
promediándose los últimos 2 mseg. En algunos análisis se cuantificó la corriente
de cola de IKV. En algunos experimentos también se registró la ICaN.
Se utilizaron los siguientes fármacos y toxinas: de Merck & Co., Inc.,
losartan; de Sigma, PD 123-319, NA, oxo-M, Tetraetilamonio (TEA), y 4-
aminopiridina (4-AP); de List Biochemicals, toxina pertussis; de Calbiochem, TTX
y Angio II.
Soluciones Fisiológicas:
Reactivo Hanks
(mM)
Ringer
(mM)
Solución
control (mM)
NaCl 137 160 160
KCl 5.4 2.5 2.5
KH2PO4 0.44 - -
NaH2PO4 0.34 - -
HEPES 5 10 10
CaCl2 - 5 5
MgCl2 - 1 1
Glucosa 5 8 8
Tetrodotoxina - - 0.0005
Cd2+ - - 0.1
pH 7.4 7.4 7.4
32
Solución Antibiótico-Antimicótico (100X): Penicilina G sódica: 10.000
unidades/ml, Sulfato de Estreptomicina 10.000 µg/ml y Anfotericina B 25 µg/ml
en 0.85% de solución salina.
Solución Interna de la pipeta para el registro de la IKV (mM): KCl, 175; MgCl2,
5; HEPES, 5; Na2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; BAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4
con KOH.
33
7. RESULTADOS
7.1 Aislamiento de la corriente de K+ tipo rectificador tardío, IKV.
Cuando las neuronas se bañaron con solución Ringer, la despolarización
de la membrana de -60 a -10 mV generó una corriente entrante y luego un
componente saliente rápido y transitorio, seguido de otro sostenido (trazo
marcado con * en la figura 7A). El bloqueo de los canales de Na+ y de Ca2+
eliminó la corriente entrante y el componente saliente transitorio, dejando una
corriente saliente sostenida, aquí denominada como IKV (trazo señalado con
TTX+Cd2+ en la figura 7A). La sensibilidad a la TTX y al Cd2+ del componente
saliente rápido y transitorio sugiere que éste se debe al eflujo de K+ a través de
canales de K+ activados por Ca2+.
34
La activación de IKV puede ajustarse con una doble exponencial con
constantes de tiempo de 3.3 ± 0.2 mseg y 35.5 ± 5.7 mseg, mientras que su
desactivación tiene una constante de tiempo de 37 ± 5.5 mseg. Como se
observa en la figura 7A, IKV se mantiene estacionaria hasta el final del pulso
comando de 100 mseg, sin embargo, si se prolonga la despolarización hasta 4
seg, puede apreciarse que IKV ostenta una lenta inactivación (Figura 7B). El
umbral de activación de IKV es cercano a -30 mV y su amplitud aumenta
conforme se despolariza más la membrana (Figura 7C). La densidad de
corriente de IKV, medida a -10 mV, fue de 36.2 ± 2.4 pA/pF (n=15). Todas estas
propiedades biofísicas de IKV son similares a las corrientes del tipo rectificador
- 10 mV
- 60 mV
2 nATTX + Cd2+
*
*
A
500 pA
1 s
B
1 seg
Densidad de corriente
(pA/pF) Activación
ô1(mseg ô2(mseg)
Desactivación ô (mseg)
36 ± 2.4 3.3 ± 0.2 35.5 ± 5.7 37 ± 5.5
1 nA
50 ms
- 10
- 20
- 30
C
50 mseg
FIGURA 7: Aislamiento de la IKV. (A) Corriente de membrana generada por un pulso de -60 a -10 mV (100 mseg), antes (*) y después del bloqueo de las corrientes de Na+ y Ca2+ (TTX + Cd2+). La línea discontinua indica el nivel cero de corriente. En la condición control (*), el pulso comando genera una corriente entrante seguida de un componente saliente rápido y transitorio y otro sostenido. El bloqueo de los canales de Na+ y de Ca2+ (TTX+Cd2+) elimina la corriente entrante y el componente saliente transitorio, dejando una corriente saliente sostenida, denominada en esta tesis como IKV. La activación de IKV tiene dos constantes de tiempo (3.3 ± 0.2 mseg y 35.5 ± 5.7 mseg), mientras que su desactivación se describe con una constante de tiempo de 37 ± 5.5 mseg. (B) Registro de IKV durante una despolarización de 4 seg de duración. Nótese su lenta inactivación. (C) Registros de IKV en donde se muestra que el umbral de activación es cercano a -30 mV y su amplitud aumenta conforme más se despolariza a la membrana.
35
“tardío” descritas por McFarlane y Cooper (1992) y por Malin y Nerbonne (2000),
en este tipo de neuronas.
7.2 Efecto de la Angio II sobre IKV.
Una vez aislada IKV, se procedió a explorar el efecto de la Angio II sobre la
amplitud de este rectificador tardío. En la figura 8 se presentan registros de IKV
generados a -20 y –10 mV, obtenidos con la solución control (Figura 8A1) y 2
min después de la aplicación de 500 nM de Angio II (Figura 8A2). Nótese que a
ambos voltajes el péptido aumenta tanto la amplitud de IKV como el tamaño de
su corriente de cola. Nótese también que el aumento de IKV no está asociado a
cambios en su umbral de activación (Figura 8B).
Para determinar el curso temporal del efecto de la Angio II sobre la
amplitud de IKV, ésta se generó cada 4 seg. La figura 8C muestra un ejemplo
típico de estos experimentos. Nótese que el efecto de la Angio II tiene una
latencia de 32 seg y una vez establecido el efecto, éste alcanzó su máximo 88
segundos después. El aumento de IKV es parcialmente reversible durante los
subsecuentes 3 minutos del lavado de la Angio II.
En un total de 24 neuronas el curso temporal del aumento de IKV se pudo
describir con una función coexponencial cuya constante de tiempo fue de 40.7 ±
5.4 seg.
36
Tiempo (seg)
0 100 200 300
I KV (
nA
)
2.0
2.5
3.0
3.5
Vm (mV)
-40 -30 -20 -10
I KV (
nA
)0
1
2
3
4
Angio II (500 nM)
-10
-20
-20
-10
Control
50 mseg
1 nA
Angio II
A1
A2
B
C
FIGURA 8: Efecto de la Angio II sobre la amplitud de la IKV. Registros de IKV a -20 y –10 mV, en la condición control (A1) y 2 min después de la aplicación de 500 nM de Angio II (A2). A ambos voltajes el péptido aumenta tanto la amplitud de IKV como su corriente de cola. (B) El aumento de IKV no está asociado a cambios en su umbral de activación. En (C) se grafica el curso temporal del efecto de la Angio II sobre la amplitud de la corriente de cola de IKV. Se registró IKV cada 4 seg en solución control (círculos vacíos) o conteniendo Angio II (círculos llenos). La barra horizontal indica el tiempo de exposición al péptido.
37
7.3 Identificación farmacológica del receptor a la Angio II que modula a IKV.
Estudios de unión con agonistas muestran que las neuronas GSC
expresan solo el receptor AT1 (Stromberg y cols, 1991). Este hallazgo sugiere
que el receptor AT1 puede ser el mediador de la modulación de IKV. Para probar
esta hipótesis se evaluó el efecto del antagonista del receptor AT1, losartan,
sobre la modulación peptidérgica de IKV. Debido a que el losartan empleado en
estos experimentos fue donado por los laboratorios Merck, primero se hicieron
experimentos control positivo estudiando su efecto sobre la inhibición
angiotensinérgica de ICaN (Figura 9A) (Shapiro y cols., 1994). En ausencia del
antagonista, la inhibición de ICaN fue del 40.7 ± 5.7%, sin embargo, cuando las
neuronas se trataron previamente con 2 µM losartan, la inhibición producida por
la Angio II fue del 11.8 ± 0.9% (Figura 9B). Estos datos confirman los hallazgos
de Shapiro y cols (1994) y demuestran la actividad biológica de la muestra de
losartan empleada en los experimentos de la presente tesis.
% Inhibition of ICa by Angio II
0 10 20 30 40 50
1 nA
5 ms
500 pA NOLosartan
Losartan
C
C
5
4
% de inhibición de ICa por la Ang II
5 mseg
A
B
Proteína G (Insensible-PTX)
Sensible al BAPTA
AT1
ICaN
IKV?
FIGURA 9: Efecto del losartan sobre la modulación de ICaN. (A) En las neuronas GSC, el receptor AT1 inhibe a ICaN,. (B) Resumen del efecto inhibitorio de la Angio II en neuronas control (NO Losartan, n = 5) y tratadas con el antagonista del receptor AT1 (Losartan, n = 4). Los insertos son trazos de ICaN, antes (C) y después de la Angio II (500 nM), para cada condición. Las ICaN se generaron con pulsos comando de -80 a + 10 mV (10 mseg).
38
El efecto del losartan sobre la modulación de IKV se muestra en la figura
10. Los trazos de la figura 10A corresponden al efecto de la Angio II (500nM)
sobre IKV en una célula no tratada con el antagonista (panel izquierdo) y en otra
tratada por 2 min con losartan, antes de aplicar la Angio II (panel derecho).
Nótese que el losartan produce una notable disminución en la eficacia de la
Angio II para aumentar la densidad de corriente de IKV. En el gráfico 10B, se
presenta el resumen de los resultados de estos experimentos. En las neuronas
no tratadas con el antagonista el aumento promedio de IKV fue de 12.2 ± 1.4
pA/pF, mientras que en aquellas expuestas al losartan, la Angio II aumento a IKV
en solo 3.5 ± 0.6 pA/pF.
B
A
Au
me
nto
de
I KV(p
A/p
F)
0
5
1 0
1 5
N
O
Losa r ta n
Lo sa r ta n
(2 µ M
)
NO
PD
1 2 3 - 31 9
PD
1 2 3 - 31 9
(
2 µ M)
1 39
1 2
1 5
C o l 1 v s c o n t r o l 1
C o l 1 v s a n g i o
N O L o s a r t a n L o s a r t a n ( 2 µ M )
A n g i o I I
5 0 m s e g
2 0 p A / p F
C C
FIGURA 10: Efecto del losartan sobre la modulación de IKV. (A) Efecto de la Angio II (500 nM) sobre IKV en una célula no tratada (panel izquierdo) y en otra neurona tratada por 2 min con losartan (2µM), antes de añadir el péptido (panel derecho). En cada par de registros el trazo control esta señalado con C y el experimental con Angio II. (B) Efecto promedio (± error estándar) de la Angio II en neuronas no tratadas con antagonistas (barras llenas) y tratadas con los antagonistas (barras vacías) del receptor AT1 (losartan) y del receptor AT2 (PD123-319). El número de neuronas de cada condición experimental se indica sobre las barras.
39
No obstante que las neuronas GSC carecen de receptores del tipo AT2
(Stromberg y cols, 1991), se decidió evaluar el efecto del antagonista de este
tipo de receptor, el PD123-319. En contraste con el losartan, el antagonista del
receptor AT2, no modificó la modulación de la IKV por la Angio II (aumento control
9.9 ± 2.0 vs 9.8 ± 1.4 con PD123-319) (Figura 10B). Estos datos indican que la
Angio II estimula al receptor AT1 para aumentar la densidad de corriente de la
IKV.
7.4 La toxina pertussis no altera la modulación de IKV por la Angio II.
Wess (1998) describe que el receptor AT1 preferentemente se acopla a
miembros de la familia Gq/11 de proteínas G, sin embargo, ocasionalmente, este
receptor puede acoplarse a miembros de la familia Go/i. Por ejemplo, la Angio II
despolariza y aumenta la resistencia de entrada de las motoneuronas espinales
del asta ventral, siendo estos efectos bloqueados por el losartan y la PTX (Oz y
Renaud, 2001). La familia Go/i, con la excepción de Gz, es ADP-ribosilada por la
PTX en el residuo cisteína ubicado en la posición -4 de su extremo carboxilo
terminal, previendo así su acople con el receptor (Wess, 1998). Por lo anterior,
se decidió evaluar si la modulación angiotensinérgica de IKV es sensible a la
PTX.
Como en el apartado anterior, primero se realizó un experimento control
positivo evaluando el efecto de la PTX sobre una cascada de señalización donde
intervienen miembros de Go/i. Este control positivo es la inhibición adrenérgica
de ICaN, la cual se debe a la interacción del receptor α2-A con Go, produciendo
una inhibición que depende del voltaje (Figura 11A). Los trazos en 11B,
presentan el efecto de la NA en una célula no tratada con la toxina y en 11C el
efecto del neurotransmisor en una neurona incubada por 8 horas con PTX
(500ng/ml). En neuronas no incubadas con la PTX, la NA inhibe sustancialmente
a la ICaN, siendo este efecto parcialmente revertido por un prepulso a +125 mV,
provocando la facilitación de la ICaN, signo distintivo de este tipo de modulación
40
(Figura 11B). Por el contrario, en células tratadas con PTX, el efecto inhibitorio
de la NA fue notablemente menor, así como la facilitación de ICaN (Figura 11C).
Estos datos confirman la sensibilidad a la PTX de la inhibición dependiente de
voltaje de ICaN (Beech y cols, 1992).
Una vez probada la eficacia de la PTX, se exploró su efecto sobre la
modulación de la IKV. En la figura 12A, se muestran registros de IKV de células no
tratadas con la PTX (panel izquierdo) y de células incubadas con la toxina (panel
derecho). Nótese que en ambos grupos de neuronas la Angio II provocó un
NO PTX PTX (500 ng/ml)
10 ms
1 nA
CC
NA
NA
B C
Proteína Go Sensible a la PTX
αα 2-A
ICaN
Gβγ
A
10mseg
FIGURA 11: Efecto de la PTX sobre la modulación αα 2-adrenérgica de ICaN. (A) El receptor α2-adrenérgico se acopla a Go para producir una inhibición dependiente del voltaje de ICaN, mediada por el dimero Gβγ. Registros de ICaN generadas por dos pulsos comando de -80 a +10 mV (10 mseg), separados por una despolarización a + 125 mV (protocolo no mostrado), en una neurona no tratada con la PTX (B) y en otra incubada por 8 hrs con la toxina (C). En cada panel la línea discontinua indica el nivel cero de corriente, el registro control es [C] y con noradrenalina es [NA]. Nótese que la PTX reduce el efecto inhibitorio de la NA y la facilitación de ICaN generada por el pulso a + 125 mV y observada con la NA.
41
aumento similar en la densidad de corriente de IKV. En las neuronas control y en
aquellas incubadas con PTX el aumento promedio fue de 12.4 ± 1.8 pA/pF y
13.0 ± 1.6 pA/pF, respectivamente (12B). Estos datos sugieren que el receptor
AT1 se acopla a una proteína G distinta a Go/i para modular a la IKV.
42
7.5 Similitudes entre la modulación muscarínica y peptidérgica de
IKV.
A
B
50 mseg
20 pA/pF
C
C
20 pA/pF
Angio I IAngio I I
Au
me
nto
de
IK
V (p
A/p
F)
0
5
10
15 67
NO PTX PTX(500 ng/ml)
Angio I I (500 nM)
FIGURA 12: La PTX no altera la modulación de IKV por la Angio II. (A) Registros de IKV de una célula no tratadas con la PTX (panel izquierdo) y de otra incubada por 8 hrs con la toxina (panel derecho). Nótese que en ambas neuronas la Angio II provocó un aumento similar en la IKV respecto a los registros control [C]. (B) Incremento promedio (± error estandar) de la IKV en células no tratadas (barra negra) y tratadas (barra blanca) con la PTX. Los números sobre las barras indican el número de células.
NO PTX PTX
43
Previamente Cruzblanca (2002) reportó que un receptor del tipo M2
aumenta la densidad de corriente de IKV, efecto con características similares a la
modulación peptidérgica descrita en la presente tesis. Es decir, la modulación
muscarínica y peptidérgica son: a) independientes del voltaje, b) insensibles a la
PTX y c) lento curso temporal. Estas características sugieren que los receptores
M2 y AT1 comparten, sino toda, parte de la misma cascada bioquímica de
señalización.
Para evaluar esta posible convergencia, cada neurona se sometió primero
a la estimulación muscarínica y después a la peptidérgica o viceversa y se
determinó si hay o no aditividad u oclusión de la acción de cada tipo de receptor.
En el panel izquierdo de la figura 13A, se muestran trazos de IKV antes
(C), después del efecto máximo de 1 µM de oxo-M (O) y después de 500 nM de
Angio II (A). Nótese que la oxo-M produce un importante aumento de la IKV,
ocluyendo después el efecto de la Angio II. En el panel derecho se muestran los
resultados de otra neurona en donde ahora la Angio II ocluyó el efecto del
agonista muscarínico.
En la gráfica 13B se resumen los resultados obtenidos de este tipo de
experimentos: a) en neuronas sometidas primero a la Angio Il, el incremento
promedio de la IKV fue de 10.1 ± 2 pA/pF; b) en contraste, el efecto de la Angio II
fue prácticamente abatido en las células previamente tratadas con la oxo-M
(aumento de la IKV = 0.3 ± 0.2 pA/pF), c) la oxo-M incrementó a la IKV en 16.0 ±
1.4 pA/pF y su efecto fue reducido a 5.6 ± 1.5 pA/pF, en aquellas neuronas
previamente tratadas con la Angio II. En otras tres neuronas se observó que
cuando no hubo efecto de la oxo-M, tampoco la Angio II aumentó la IKV y
viceversa (no mostrado). Estos datos nos sugieren que ambos receptores
comparten, sino todos, algunos elementos de la cascada de señalización que
modula a la IKV.
44
FIGURA 13: La oxo-M ocluye la modulación de la IKV por la Angio-II. (A) En el panel izquierdo se muestran trazos de IKV antes [C], después del efecto máximo de 1 µM de oxo-M [O] y después de 500 nM de Angio II [A]. En el panel derecho se muestran los registros de IKV
de otra neurona en donde ahora la Angio II se aplicó primero que la oxo-M. (B) Resumen de los resultados: a) en neuronas sometidas primero a la Angio Il, el incremento promedio de la IKV fue de 10.1 ± 2 pA/pF; b) en neuronas previamente tratadas con la Oxo-M, el aumento de la IKV por la Angio II fue de solo 0.3 ± 0.2 pA/pF; c) La Oxo-M incrementó a IKV en 16.0 ± 1.4 pA/pF y su efecto fue reducido a 5.6 ± 1.5 pA/pF, en aquellas neuronas previamente tratadas con la Angio II. Los números sobre las barras indican el número de células.
Aum
ento
de
IK
V (p
A/p
F)
0
5
10
15
20
20 pA/pF
50 mseg
Oxo-M(1 µM)
Oxo-Mdespués Angio II
Angio II(500 nM)
Angio IIdespués Oxo-M
7
7
8
8
O
A
CC
O
A
20 pA/pF
A
B
45
7.6 Posible composición molecular del canal de K+ modulado por la
Angio II: Evidencia farmacológica.
En contadas ocasiones ha sido posible identificar en neuronas adultas la
composición molecular de los canales iónicos modulados por receptores
acoplados a proteínas G. Este reto ha sido mayor para los canales de K+
activados por el voltaje, debido a su gran diversidad molecular (Hille, 2001). Un
ejemplo positivo al respecto es el canal de K+ tipo M de las neuronas GSC, el
cual es un heterómero formado por las subunidades KCNQ2 y KCNQ3 (Wang y
cols, 1998). Las corrientes de K+ generadas por las subunidades KCNQ son
inhibidas ya sea por el receptor M1 endógeno de las neuronas GSC o cuando se
coexpresan las subunidades KCN2 y el receptor M1 en sistemas de expresión
heterólogos (Shapiro y cols., 2000). Por lo anterior y con el fin de tener un
conocimiento más detallado sobre la modulación peptidérgica de IKV, en la
presente tesis se inició la exploración sobre la posible identidad molecular del
canal de K+ que genera a la IKV.
Además de las subunidades KCNQ, las neuronas GSC expresan otras
subunidades de canales de K+ activados por el voltaje incluyendo, KV1.1, Kv1.2,
Kv1.3, Kv1.4, Kv2.1, Kv2.2, Kv4.1, Kv4.2 y Kv4.3 (Dixon y McKinnon, 1996). De estas
subunidades KV 2.1 y KV 2.2 generan corrientes de K+ del tipo rectificador “tardío”
(Dixon y McKinnon, 1996; Baranauskas y cols., 1999). Con el objeto de evaluar
si la subunidad KV2.1 contribuye al canal de K+ que genera a la IKV, se tomó
ventaja de su perfil farmacológico obtenido cuando esta subunidad se expresa
en sistemas heterólogos. Este perfil se ilustra en la tabla 3 en donde se puede
notar que KV2.1 es diez veces más sensible a la 4-AP que al TEA. Este perfil
farmacológico también lo tiene IKV (Figura 14). Pero además, cuando se utilizó
una concentración de 4-AP idéntica a la IC50 reportada para el bloqueo de la
subunidad KV2.1, la inhibición de IKV también fue cercana al 50% (45.5 ± 4% n =
5) (figura 14). Estas propiedades de IKV sugieren que KV2.1 puede contribuir a la
formación del canal de K+ que genera a la IKV.
46
Tiempo (seg)
0 100 200 300 400
I KV (
pA
)
200
300
400
500
600
700 TEA(500 µM)
4-AP(500 µM)
% d
e in
hib
ició
n d
e I K
V
0
10
20
30
40
50
4-AP
5
Tabla 3: Biofísica y farmacología de subunidades de canales de K+. Tomado de Chandy K. and Gutman G. In Hanbook of Receptors and Channels: Ligand- and voltage-gated ion channels (North AR Ed.) SRC Press. 1995.
Concentraciones para una inhibición al 50%
FIGURA 14: Efecto del TEA y la 4-AP sobre la IKV. Curso temporal del efecto del TEA (500µM) y la 4-AP (500µM) sobre la IKV, generada cada 4 seg en solución control (círculos vacíos) o conteniendo los bloqueadores de canales de K+ (círculos llenos). La barra horizontal indica el tiempo de exposición a cada uno de los fármacos. En 5 neuronas la 4-AP reduce ala IKV en un 45.5 ± 4% (inserto), un efecto similar a la IC50 reportada para KV 2.1 (tabla 3).
47
Con base en estos hallazgos, se decidió evaluar sí la modulación de IKV
se ve afectada por 500 µM de 4-AP. En el panel izquierdo de la figura 15A se
muestra el aumento típico de IKV por la Angio II, obtenida en una neurona
control. En el panel derecho se aplicó primero 4-AP, lo cual provocó una
disminución en la amplitud de IKV (trazo señalado con 4-AP), respecto al registro
control (trazo señalado con C). Nótese que en presencia del bloqueador de
canales de K+, la Angio II tiene un mínimo efecto sobre la corriente saliente
resistente a la 4-AP. En resumen, en células expuestas solo a la Angio II el
aumento de IKV fue de 8.8 ± 1.0 pA/pF, mientras que en presencia de la 4-AP, el
aumento fue de solo 1.3 ± 0.8 pA/pF (gráfico 15B). Estos datos sugieren que una
de las posibles subunidades de canales de K+ que generan la corriente de K+
modulada por la Angio II es KV2.1.
B
50 mseg
10 pA/pF 10 pA/pF
C
C
Angio I I
Ang io I I + 4 -AP
4 - A P
A
5
Au
me
nto
de
I KV (
pA
/pF
)
0
2
4
6
8
10
5
NO 4-AP 4-AP(500 µ M)
Angio II (500 nM)
FIGURA 15: La Angio II modula a una corriente de K+ sensible a la 4-AP. (A) Trazos de IKV en una célula no expuesta a la 4-AP (panel izquierdo) y en una célula bañada con 4-AP previo a la Angio II (panel derecho). El trazo control es [C], con el péptido es [Angio II], con4-AP es [4-AP] y con el péptido y el bloqueador [4-AP + Angio II]. (B) Efecto promedio de la Angio II en células control (barra negra) y en neuronas tratadas con 4-AP (barra vacía).
48
8. DISCUSION.
En la presente tesis se reporta que la Angio II aumenta la densidad de
corriente del rectificador tardío IKV, por un mecanismo independiente del voltaje.
En este efecto probablemente participa el receptor AT1 y una proteína G
insensible a la PTX. Este novedoso ejemplo de modulación se suma a la
inhibición, por la Angio II, de la ICaN y la IKM, previamente reportada en estas
neuronas (Shapiro y cols., 1994). La modulación de IKV e ICaN comparten las
siguientes propiedades: a) el curso temporal de la modulación es relativamente
lento (ô = 40.7 ± 5 seg), así como su recuperación; b) la modulación es
independiente del voltaje; c) insensible a la PTX; d) reducida por el antagonista
del receptor AT1, losartan. Estas propiedades sugieren que el receptor AT1
estimula cascadas de señalización similares para modular a IKV e ICaN. La
convergencia puede darse a nivel de la proteína G o del segundo mensajero. Se
desconoce si la modulación angiotensinérgica de IKM comparte las
características anteriores.
En varios tipos celulares, el receptor AT1 al acoplarse con miembros de la
familia Gq/11 comúnmente estimula la vía de la PLC y con ello la liberación de
Ca2+ de depósitos sensibles al IP3 (Wess, 1998). Dado que la modulación de IKV
es insensible a la PTX y que Gq/11 es expresada por las neuronas GSC (Haley y
cols., 1998), es probable que el receptor AT1 se acople a esta proteína G para
inducir el aumento de IKV. Sin embargo, en caso de darse esta hipotética
interacción, en la modulación de IKV no parece que participe la vía clásica de la
PLC a juzgar porque en estas neuronas la Angio II no aumenta la [Ca2+]i
(Shapiro y cols., 1994). La insensibilidad de la modulación de IKV a la PTX no
descarta la participación de la proteína Gz, el único miembro de la familia Gi que
no es ADP ribosilado por esta toxina (Wess, 1998). Gz tiene propiedades
bioquímicas que la distinguen de otras proteínas G. Por ejemplo, in vitro su tasa
de intercambio de GDP por GTP (0.02 min-1 a 30oC) es de las más lentas entre
los miembros de la familia Gi y, una vez formado el complejo Gαz-GTP, su vida
media (T½) es ~ 10 min, un tiempo 10 veces mayor a la T½ de Gαq-GTP (~ 1min)
49
y 100 mayor a la T½ de Gαo/i-GTP (10-20 seg) (Ross, 1995). Estas propiedades
bioquímicas pueden explicar el lento curso temporal del aumento de IKV (ô = 40.7
± 5 seg) y la aparente irreversibilidad del efecto de la Angio II (Figura 9C). Por lo
tanto, Gz es un serio candidato que puede explicar la insensibilidad a la PTX de
la modulación de IKV, aunque no se descarta la participación de otras proteínas
G como Gs.
Por el momento queda pendiente la identidad del mensajero que interviene
en el aumento de IKV. Un posible candidato es el ácido araquidónico, el cual
parece ser el mensajero para la inhibición muscarínica independiente del voltaje
de ICaN (Liu y Rittenhouse, 2003). De ser así, una pregunta a responder es por
qué el mismo mensajero tiene efectos opuestos sobre ICaN e IKV.
En las neuronas GSC un receptor del tipo M2 también aumenta la
densidad de corriente de IKV (Cruzblanca, 2002). El efecto anterior es similar, en
cuanto a su curso temporal e insensibilidad a la PTX, al efecto de la Angio II
sobre dicha corriente de K+. Esto sugiere que los receptores AT1 y M2,
comparten, sino todos, algunos elementos de la cascada de señalización que
modulan a la IKV. Evidencia a favor de la posible convergencia de las vías
muscarínica y peptidérgica consiste en que la estimulación del receptor M2
ocluyó la acción del receptor AT1 sobre IKV y viceversa (Figura 13A). Hasta aquí
tenemos que la modulación de IKV por el receptor AT1 y M2 comparte algunas
propiedades con la modulación de ICaN por el receptor AT1. Es necesario
profundizar los estudios sobre la identidad de las tres cascadas de señalización
con el fin de determinar en qué etapa convergen o divergen entre sí.
Son escasos los ejemplos en donde ha sido posible identificar en
neuronas adultas la composición molecular de los canales iónicos modulados
por receptores acoplados a proteínas G. En la presente tesis se inició el estudio
sobre la constitución molecular del canal de K+ que genera a IKV y que es
modulado por la Angio II. Las neuronas adultas del GSC expresan, entre otras,
las subunidades KV2.1 y KV2.2 (Dixon y McKinnon, 1996), las cuales generan
corrientes de K+ con características biofísicas de rectificador tardío
50
(Baranauskas y cols, 1999). Recientemente Malin y Neerbone (2002) reportaron
que la expresión en las neuronas GSC de mutantes dominante negativo de KV2.1
y KV 2.2, reducen la expresión funcional de una corriente de K+ cuyas
propiedades biofísicas son similares a la IKV, sugiriendo que ambas son
generadas por el mismo tipo de canal de K+. Los siguientes resultados de la
presente tesis dan sustento a la idea anterior: 1) una concentración de 4-AP que
corresponde a la IC50 para la inhibición de las corrientes de K+ generadas por
KV2.1, inhibe en ∼50% la amplitud de IKV (Figura 15); 2) en presencia de esta
concentración del bloqueador, el efecto de la Angio II sobre IKV fue
dramáticamente reducido (Figura 16). En resumen, la Angio II modula a un canal
de K+ constituido en parte por KV2.1 y esta modulación se manifiesta en
incremento de IKV.
En la introducción se describió que en distintas áreas del SNC la Angio II
aumenta la excitabilidad de las neuronas. Este efecto también ocurre en el SNP
y en particular en las neuronas del GSC. Es posible que la modulación
peptidérgica de IKM y de la IKV (resultados de la presente tesis) sea parte del
mecanismo celular mediante el cual la Angio II directamente incrementa el tono
simpático subsecuente a la estimulación del SRA.
9. CONCLUSIONES.
1) La Angio II estimula al receptor AT1 para aumentar la densidad de
corriente de la IKV.
2) En la modulación peptidérgica de IKV no participa una proteína G sensible
a la toxina pertussis.
3) Los receptores AT1 y M2 parecen compartir algunos elementos de las
cascadas bioquímicas de señalización que subyacen a la modulación de
la IKV.
4) En las neuronas GSC la Angio II modula a un canal de K+ constituido
parcialmente por la subunidad KV2.1.
51
10. PERSPECTIVAS.
Los resultados de la presente tesis sugieren que el receptor AT1 estimula
a la IKV. La primera perspectiva de este trabajo es identificar los elementos de la
cascada de señalización que median la acción del receptor AT1 sobre IKV. Es
decir, identificar el tipo de proteína G, la enzima a la cual esta proteína G
estimula y los mensajeros intracelulares que intervienen. Otra perspectiva es
identificar el mecanismo bioquímico que subyace a la modulación. Por ejemplo,
si ésta obedece a un proceso de fosforilación o desfosforilación o a la unión de
la molécula mensajero final a las proteínas que forman el canal iónico que
genera a la IKV.
En el presente trabajo se inició la identificación molecular del canal de K+
que genera a la IKV. Por ello, otra perspectiva de la presente tesis es confirmar la
participación de KV2.1, bloqueando su expresión con mutantes de KV2.1 con
propiedades de dominante negativo. De igual manera se evaluará la
participación de KV2.2.
La tesis describe que la modulación angiotensinérgica de IKV comparte
propiedades fenomenológicas con la modulación de ICaN y con la propia
modulación muscarínica de IKV. Por ello, otra perspectiva es estudiar los niveles
de convergencia y divergencia molecular de los tres tipos de modulación.
52
V. BIBLIOGRAFÍA
Aldred GP, Chai SY, Song K, Zhuo J, MacGregor DP, Mendelsohn F (1993)
Distribution of angiotensin II receptor subtypes in the rabbit brain. Regul Peptides
44:119–130.
Bai D and Renaud LP (1998) ANG II AT1 receptors induce depolarization and
inward current in rat median preoptic neurons in vitro. Am J Physiol 275: R632-
R639.
Bains JS, Ferguson AV (1995) Paraventricular nucleus neurons projecting to
the spinal cord receive excitatory input from the subfornical organ. Am J Physiol
268:R625–R633.
Baranauskas G, Tkatch T, Surmeier DJ (1999) Delayed rectifier currents in rat
globus pallidus neurons are attributable to Kv2.1 and Kv3.1/3.2 K+ channels. J
Neurosci 19: 6394-6404
Beech DJ, Bernheim L, Hille B (1992) Pertussis toxin and voltage dependence
distinguish multiple pathways modulating calcium channels of rat sympathetic
neurons. Neuron 8: 97-106.
Berk B and Corson M (1997) Angiotensin II signal transduction in vascular
smooth muscle: role of tyrosine kinases.Circ Res 80: 607-616.
Brown DA, Constantini A and Marsh S (1980) Angiotensin mimics the action of
muscarinic agonists on rat sympathetic neurons. Brain Res, 193:614-619.
Chiu AT, Herblin WF, McCall DE, Price WA, Wong PC, Carini DJ (1990)
Angiotensin II receptor subtypes and their selective nonpeptide ligands. Receptor
1:33-40.
53
Cruzblanca H, Koh DS and Hille B (1998) Bradykinin inhibits M current via
phospholipase C and Ca2+ release from IP3-sensitive Ca2+ stores in rat
sympathetic neurons. P Natl Acad Sci 95(12):7151-7156.
Cruzblanca H (2002) Modulación muscarínica de corrientes de K+ en neuronas
simpáticas. XLV Congreso Nacional de la S.M.C.F. C-07.
De Chandy K and Gutman G (1995). In Hanbook of Receptors and Channels:
Ligand- and voltage-gated ion channels (North AR Ed.) SRC Press, Pp 43-45.
Delmas P, Wanaverbecq N, Abogadie FC, Mistry M, Brown DA (2002)
Signaling microdomains define the specificity of receptor-mediated InsP(3)
pathways in neurons. Neuron 34: 209-220.
Dixon J and McKinnon D (1996) Potassium channel mRNA expression in
prevertebral and paravertebral sympathetic neurons. Eur J Neurosci 8: 183-191.
Ferguson AV and Li Z (1996) Whole cell patch recordings from forebrain slices
demonstrate angiotensin II inhibits potassium currents in subfornical organ
neurons. Regul Peptides 8;66(1-2):55-58.
Gehlert DR, Gackenheimer SL, Schober DA (1991) Autoradiographic
localization of subtypes of angiotensin II antagonist binding in the rat brain.
Neuroscience 44:501–514.
Gelband CH, Warth JD, Mason HS, Zhu M, Moore JM, Kenyon JL, Horowitz
B and Sumners C (1999) Angiotensin II type 1 receptor-mediated inhibition of K+
channel subunit KV2.2 in brain stem and hypothalamic neurons. Circ Res; 84:352-
359.
Haley JE, Abogadie FC, Delmas P, Dayrell M, Vallis Y, Milligan G, Caulfield
MP, Brown DA, Buckley (1998) The alpha subunit of Gq contributes to
muscarinic inhibition of the M-type potassium current in sympathetic neurons. J
Neurosci 18: 4521-4531.
54
Hamilton SE, Loose MD, Qi M, Levey AI, Hille B, McKnight GS, Idzerda RL,
Nathanson NM (1997). Disruption of the M1 receptor gene ablates muscarinic
receptor-dependent M current regulation and seizure activity in mice. P Natl Acad
Sci 94: 13311-13316.
Hardy SG (2001) Hypothalamic projections to cardiovascular centers of the
medulla. Brain Res 16 ; 894 (2) : 233-240.
Healy DP, Printz MP (1984) Distribution of immunoreactive angiotensin II,
angiotensin I, angiotensinogen and renin in the central nervous system of intact
and nephrectomized rats. Hypertension 6: I130–I136.
Hille B (1994) Modulation of ion-channel functions by G-protein-coupled
receptors. Trends Neurosci 17: 531-536
Hille B (2001) Ion Channels of excitable membranes, 3rd edition. Sinave Assoc
Inc.
Hu L, Zhu D, Yu Z, Wang J, Sun Z, Yao T (2002) Expression of angiotensin II
type 1 (AT1) receptor in the rostral ventrolateral medulla in rats. J Appl Physiol
92:2513-2161.
Johnson RF, Beltz TG, Jurzak M, Wachtel RE, Johnson AK (1999)
Characterization of ionic currents of cells of the subfornical organ that project to
the supraoptic nuclei. Brain Res 30; 817(1-2):226-231.
Kakar SS, Riel KK, Neill JD (1992) Differential expression of angiotensin II
receptor subtype mRNAs (AT1A and AT1B) in the brain. Biochem Bioph Res Co
185:688–692.
Kang J, Posner P and Sumners C (1994) Angiotensin II type 2 receptor
stimulation of neuronal K+ currents involves an inhibitory GTP binding protein.
Am J Physiol 267 (36): C1389-C1397.
55
Kangrga IM and Loewy AD (1995) Whole-cell recordings from visualized C1
adrenergic bulbospinal neurons: ionic mechanisms underlying vasomotor tone.
Brain Res 30;670(2):215-232.
Koh DS and Hille B (1997) Modulation by neurotransmitters of catecholamine
secretion from sympathetic ganglion neurons detected by amperometry. P Natl
Acad Sci 94(4):1506-1511.
Laragh JH and Sealey JE (1975) The renin-angiotensin-aldosterone hormonal
system and regulation of sodium, potassium and blood pressure homeostasis. In
Handbook of Physiology: Renal Physiology (Orloff J and Berliner R Eds)
American Physiological Society, Pp 831-908.
Li De-Pei, Chen SR, Pan HL (2003) Angiotensin II stimulates spinally projecting
paraventricular neurons trough presynaptic desinhibition. J Neurosci
23(12):5041-5049.
Li YW and Guyenet PG (1996) Angiotensin II decreases a resting K+
conductance in rat bulbospinal neurons of the C1 area. Circ Res 78(2):274-82.
Li YW, Guyenet PG and Bayliss DA (1998) Voltage-dependent calcium
currents in bulbospinal neurons of neonatal rat rostral ventrolateral medulla:
modulation by alpha2-adrenergic receptors. J Neurophysiol 79:583-594.
Li Z, Ferguson AV (1993) Angiotensin II responsiveness of rat paraventricular
and subfornical organ neurons in vitro. Neuroscience 55:197–207.
Li Z and Ferguson AV(1996) Electrophysiological properties of paraventricular
magnocellular neurons in rat brain slices: modulation of IA by angiotensin II.
Neuroscience 71:133–145.
Lind RW, Swanson LW, Ganten D (1985a) The distribution of angiotensin II-
immunoreactive cells and fibers in the paraventriculo-hypophysial system of the
rat. Neuroendocrinology 40:2–24.
56
Lind RW, Swanson LW, Bruhn TO, Ganten D (1985b) The distribution of
angiotensin II-immunoreactive cells and fibers in the paraventriculo-hypophysial
system of the rat. Brain Res 338:81–89.
Liu L, Rittenhouse AR (2003). Arachidonic acid mediates muscarinic inhibition
and enhancement of N-type Ca2+ current in sympathetic neurons. P Natl Acad
Sci 100: 295-300.
Lippold A, Bunnemann B, Iwai N, Metzger R, Inagami T, Fuxe K, Ganten D
(1993) Celular localization of angiotensina type 1 receptor and angiotensinógeno
mRNAs in the subfornical organ of the rat brain. Neurosci Lett 150 (2): 153-158.
Luther JA and Tasker JG (2000) Voltage-gated currents distinguish
parvocellular from magnocellular neurones in the rat hypothalamic
paraventricular nucleus. J Physiol, 523.1:193-209.
Malin S and Nerbonne J (2000) Elimination of the fast transient in superior
cervical ganglion neurons with expression of KV4.2W362F: molecular dissection of
IA. J Neurosci 20 (14) : 5191-5199.
Malin S and Nerbonne J (2002) Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by
Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J
Neurosci 22: 10094-10105.
Marrero MB, Paxton WB, Schieffer B, Ling BN and Bernstein KE (1996)
Angiotensin II signalling events mediated by tyrosine phosphorylation. Cell Signal
8,1:21-26.
Marrion N V (1997) Control of M-current. Annu Rev Physiol 59, 483-504.
McFarlane S and Cooper E (1992) Postnatal development of voltage-gated K+
currents on rat sympathetic neurons. J Neurophysiol 67:1291-1300.
57
Millan A M, Jacobowitz M D, Aguilera G and Catt J K (1991) Differential
distribution of AT1 and AT2 angiotensin II receptor subtypes in the rat brain during
development. P Natl Acad Sci 88:11440-11444.
Miyakubo H, Hayashi Y, Tanaya J (2002) Enhanced response of subfornical
organ neurons projecting to the hypothalamic paraventricular nucleus to
angiotensin II in spontaneously hypertensive rats. Auton Neurosci 95:131-136.
Ono K, Honda E and Inenaga K (2001) Angiotensin II induces inward currents
in subfornical organ neurones of rats. J Neuroendocrinol, 13(6):517-523.
Oz M and Renaud LP (2002) Angiotensin AT1 receptors depolarize neonatal
spinal motoneurons and other ventral horn neurons via two different
conductances. J Neurophysiol 88 (5) : 2857-2863.
Pérez Padilla R (1997). En Fisiología: células, órganos y sistemas. (Muñoz-
Martínez E y García X, Ed) Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas, Pp 75-
92.
Pratt R E (1992) The AT2 isoform of the angiotensin receptor mediated
myointimal hiperplasia following vascular injury. 20:432. Hypertension 20:432.
Pyner S and Coote JH (2000) Identification of branching paraventricular
neurons of the hypothalamus that project to the rostroventrolateral medulla and
spinal cord. Neuroscience; 100(3):549-556.
Rogerson FM, Schlawe I, Paxinos G, Chai SY, McKinley LJ, Mendelsohn FA
(1995) Localization of angiotensin converting enzyme by in vitro autoradiography
in the rabbit brain. J Chem Neuroanat 8:227–243.
Ross EM (1995). G protein GTPase-activating proteins: regulation of speed,
amplitude, and signaling selectivity. Recent Prog Horm Res 50:207-221.
58
Santiago T and Edelman N (1986) Brain blood flow and control of breathing. In
Handbook of Physiology. (Fishman AP Ed), American Physiological Society, Pp
163-180.
Sasaki S and Dampney RA (1990) Tonic cardiovascular effects of angiotensin II
in the ventrolateral medulla. Hypertension; 15:274-283.
Sernia C (1995) Location and secretion of brain angiotensinogen. Regul
Peptides 57(1):1-18.
Shapiro MS, Lonnie PW, Hille B (1994) Angiotensin II inhibits calcium and m
current channels in rat sympatethic neurons via G proteins. Neuron 12:1319-
1329.
Shapiro MS, Roche JP, Kaftan EJ, Cruzblanca H, Mackie K, Hille B (2000)
Reconstitution of muscarinic modulation of the KCNQ2/KCNQ3 K+ channels that
underlie the neuronal M current. J Neurosci 20(5):1710-1721.
Siegel GJ, Agrafoff Bx, Albers RW, Fisher SK, Uhler MD (1999). Basic
Neurochemistry. 6th Edition, Lippincott-Raven.
Song K, Allen AM, Paxinos G, Mendelsohn F (1992) Mapping of angiotensin II
receptor subtype heterogeneity in rat brain. J Comp Neurol 316:467–484.
Stromberg C, Tsutsumi K, Viswanathan M and Saavedra JM (1991)
Angiotensin II AT1 receptors in rat superior cervical ganglia: characterization and
stimulation of phosphoinositide hydrolysis. Eur J Pharmacol. 208,331-336.
Suh BC and Hille B (2002) Recovery from muscarinic modulation of M current
channels requires phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate synthesis. Neuron.
2002; 35(3):507-520.
59
Sumners C, Zhu M, Gelband CH and Posner P (1996) Angiotensin II type 1
receptor modulation of neuronal K+ and Ca2+ currents: intracellular mechanisms.
Am J Physiol 271(40): C154-C163.
Tagawa T and Dampney RAL (1999) AT1 receptors mediate excitatory inputs to
rostral ventrolateral medulla pressor neurons from hypothalamus. Hypertension
34(6):1301-1307.
Unger T (2003) Blood pressure lowering and renin-angiotensin system blockade.
J Hypertens; 21(6) :S3-S7.
Van Bilsen M (1997) Signal transduction revisited: recent developments in
angiotensin II signaling in the cardiovascular system. Cardiovas Res 36: 310-
322.
Wang D, Sumners C, Posner P and Gelband CH (1997) A-type K+ current in
neurons cultured from neonatal rat hypothalamus and brain stem: modulation by
angiotensin II. J Neurophysiol 78:1021-1029.
Wang HS, Pan Z, Shi W, Brown BS, Wymore RS, Cohen IS, Dixon JE,
McKinnon D (1998) KCNQ2 and KCNQ3 potassium channel subunits: molecular
correlates of the M-channel. Science 282: 1890-1893.
Washburn D and Ferguson A (2001) Selective potentiation of N-type calcium
channels by angiotensin II in rat subfornical organ neurones. J Physiol 536 (3):
667-675.
Wess J (1998) Molecular basis of receptor/G-protein-coupling selectivity.
Pharmacol Ther; 80 (3): 231-264.
Yu H, Di Nicolantonio R (1996) Altered age-dependent modulation of tissue
renin messenger RNA levels in the spontaneously hypertensive rat. J Hypertens
14 (7) : 871–880.
60
Zhu GQ, Patel KP, Zucker IH, Wang W (2002) Microinjection of ANG II into
paraventricular nucleus enhances cardiac sympathetic afferent reflex in rats. Am
J Physiol 282: H2039-H2045.
Zhu M, Gelband C, Moore JM, Posner P and Sumners C (1998) Angiotensin II
type 2 receptor stimulation of neuronal delayed-rectifier potassium current
involves phospholipase A2 and arachidonic acid. J Neurosci 18(2):679-686.
Zhu M, Gelband CH, Posner P and Sumners C (1999) Angiotensin II
decreases neuronal delayed rectifier potassium current: role of
calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurophysiol 82: 1560-1568.
Zhu M, Natarajan R, Nadler J, Moore JM Gelband CH and Sumners C (2000)
Angiotensin II increases neuronal delayed rectifier K+ current: role of 12-
lipoxygenase metabolites of arachidonic acid. J Neurophysiol 84: 2494-2501.
Zigmond M, Bloom F, Landis S, Roberts J and Squire L (1999) Fundamental
of Neuroscience. Academic Press, Pp 1600.