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DECLARACIÓN INSTITUCIONAL

La información generada en esta tesis es propiedad intelectual del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD). Se permiten y agradecen las citas breves del material contenido en esta tesis sin permiso especial del autor, siempre y cuando se dé crédito correspondiente. Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos, se deberá contar con la autorización escrita del Director General del CIAD. La publicación en comunicaciones científicas o de divulgación popular de los datos contenidos en esta tesis, deberá dar los créditos al CIAD, previa autorización escrita del manuscrito en cuestión del director de tesis.

iv

AGRADECIMIENTOS

A CONACYT, por el apoyo económico brindado al proyecto No. 80511 que hizo posible la realización de este trabajo y además por la beca mixta otorgada para la realización de una estancia en el extranjero.

A CIAD, por darme la oportunidad de alcanzar una meta profesional más al abrirme sus puertas y mostrarme el mundo de la investigación.

A mi asesora, la Dra. María Auxiliadora Islas Osuna por todo su apoyo brindado durante mi maestría. Siempre estaré muy agradecida por todos sus consejos y su forma de alentarme a seguir siempre adelante.

A la Dra. Carmen Contreras, por haber sido una pieza fundamental en la realización de este trabajo al darme todo su apoyo día con día tanto en el laboratorio como de manera personal.

Al Dr. Miguel Ángel Martínez, por todos sus conocimientos transmitidos y por abrirme las puertas de su laboratorio de Fisiología Vegetal como si fuera una más de su equipo de trabajo. Así como a Emmanuel Aispuro, Marisol Ochoa y Francisco Soto por su apoyo técnico.

A la Dra. Adriana Muhlia, por su asesoría en los experimentos de expresión en tiempo real y a Sandra Araujo por su apoyo técnico en la utilización del equipo.

A la Dra. Marisela Rivera, por su aportación como parte de mi comité de tesis y por facilitarme la utilización de reactivos.

Al Dr. Rogerio Sotelo por su apoyo brindado durante la realización de este trabajo.

A todos mis compañeros y amigos de maestría, especialmente a Azucena Gándara, Isabel Cristina Guzmán, Lorena Ferreyra, Manuel Díaz, Tania Elisa González, Nina Heredia y Rocío León, por ser parte de esta historia que construimos juntos y por hacer más llevaderos los momentos de estrés.

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A mis papás, por ser las personas que más me apoyan y me alientan a cumplir siempre mis metas, ellos son y serán siempre mi inspiración.

A mi hermana, por estar siempre a mi lado, por demostrarme su cariño a cada momento y creer en mí. Simplemente, es ella definición de la palabra hermana.

A mi familia, especialmente a mi tío Baldo y mi tía Mónica por ser unas de las personas que más han creído en mí y de quienes siempre siento su apoyo y cariño, aun a la distancia. A mi prima y comadre Jeysil por siempre echarme porras para seguirle echando ganas y además por darme a mi ahijado, Alejandro, quien siempre me alegra cada momento cuando estoy con él. Y a mi prima Wendy por recibirnos a mi hermana y a mí en nuestra llegada a Hermosillo

A mi novio, Luis Javier Valenzuela por haber llegado a mi vida en el momento preciso, por todas sus palabras y acciones que me impulsan a seguir siempre adelante, por todo su apoyo y amor.

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DEDICATORIA

A las personas que me han enseñado que los sueños se pueden hacer

realidad. Quienes me han inculcado que siempre debo dar lo mejor de mí y a

nunca darme por vencida. Por ser las personas que más creen en mí y a

quienes yo más admiro. Éste paso es un peldaño más, que no hubiera podido

alcanzar sin apoyo. A mis padres, a quienes amo con todo mi corazón y a

quienes estaré eternamente agradecida.

Hace ya casi cuatro años me hice una promesa: todos mis logros llevarían una

dedicatoria especial. Y aquí estoy de nuevo reviviendo mis palabras para

dedicar éste trabajo a la persona que desde el momento en que nací me llenó

de cuidados y protección, pero sobre todo de mucho amor. Porque siempre

creyó en mí. Sé que desde el cielo me envía una sonrisa, un abrazo y su

bendición. Te amo abuela.

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CONTENIDO

Página

Lista de Figuras........................................................................................... ix Lista de Tablas............................................................................................. xi Resumen...................................................................................................... xii Abstract........................................................................................................ xiv Introducción............................................................................................... 1 Antecedentes y Justificación................................................................... 4 Frutos de Mango Variedad “Kent” Como un Modelo de Estudio en el Proceso de Cambios de Firmeza Durante la Maduración...........................

4

Desarrollo y Maduración.............................................................................. 5 Cambios en la Estructura y Composición Celular Durante la Maduración..................................................................................................

6

Actividad Respiratoria y Acción Hormonal................................................... 7 La Pared Celular Vegetal: Un Organelo Esencial en los Cambios de Firmeza Durante la Maduración de Frutos de Mango.................................

9

Componentes Principales de la Pared Celular............................................ 10 Metabolismo de la Pared Celular Durante la Maduración de Frutos........... 11 Principales Proteínas Con o Sin Actividad Enzimática que Modifican la Pared Celular...............................................................................................

12

Poligalacturonasas (PG) Como Enzimas Clave en los Cambios de Firmeza en Frutos de Mango.......................................................................

15

Familia de Genes de Poligalacturonasa...................................................... 16 Poligalacturonasas y Maduración en Frutos................................................ 17 Actividad Enzimática y Expresión Génica de PG en Frutos de Mango..........................................................................................................

20

Hipótesis..................................................................................................... 23

Objetivos.....................................................................................................

23 Objetivo General.......................................................................................... 23 Objetivos Específicos................................................................................... 23

Materiales y Métodos................................................................................. 24 Obtención de Mangos Variedad “Kent” y Evaluación de Sus Parámetros Fisiológicos.................................................................................................

24

Producción de CO2 y Etileno....................................................................... 24 Pérdida de Firmeza...................................................................................... 25 Cambios en el Color.................................................................................... 25

viii

Amplificación y Clonación de los Genes de PG........................................... 26

CONTENIDO (continuación)

Página

Extracción de RNA Total.............................................................................. 26 Evaluación de la Integridad del RNA total................................................... 27 Eliminación del DNA Genómico Residual.................................................... 28 Síntesis del DNA Complementario (cDNA) Por Transcripción Reversa........................................................................................................

29

Amplificación de Fragmentos del cDNA que codifica para PG.................... 29 Clonación de los Productos Amplificados.................................................... 31 Evaluación y Análisis de la Expresión Génica de cDNAs PG por PCR Cuantitativa..................................................................................................

31

Análisis estadísticos..................................................................................... 33

Resultados y Discusión............................................................................ 34 Evaluación de los Parámetros Fisiológicos................................................. 34 Producción de CO2 y Etileno....................................................................... 34 Pérdida de Firmeza...................................................................................... 36 Cambios en el Color.................................................................................... 38 Amplificación y Clonación de cDNAs PG..................................................... 40 Extracción del RNA Total y Evaluación de su Integridad............................ 40 Eliminación del DNA Genómico................................................................... 41 Síntesis del DNA Complementario (cDNA).................................................. 43 Amplificación de Fragmentos de los cDNA de PG...................................... 43 Clonación y Secuenciación de los cDNAs de PG ....................................... 45 Evaluación y Análisis de la Expresión Génica de PG por PCR Cuantitativa..................................................................................................

52

Conclusiones............................................................................................. 60 Perspectivas................................................................................................ 61 Bibliografía................................................................................................... 62

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Representación esquemática que indica los mecanismos moleculares que controlan la maduración en frutos climatéricos........

8

2 Producción de CO2 de los frutos de mango variedad "Kent"............... 35

3 Producción de etileno de los frutos de mango variedad "Kent"...........

36

4 Pérdida de firmeza de los frutos de mango variedad "Kent"............... 38

5 Cambios en el color de los frutos de mango variedad "Kent"..............

39

6 Esfera del color.................................................................................... 40

7 Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en condiciones desnaturalizantes del RNA total extraído del mesocarpio del mango..................................................................................................

41

8 Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en condiciones desnaturalizantes del RNA total de mesocarpio de mango tratado con DNasa I.........................................................................................

42

9 Electroforesis en gel de agarosa al 1%, de las reacciones de PCR utilizando como molde los RNA libres de DNA genómico..................

42

10 Electroforesis en gel de agarosa al 1%, de GAPDH a partir de los cDNA sintetizados................................................................................

43

11 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los fragmentos de cDNA de PG amplificados...........................................................................

44

12 Placa de medio LB con ampicilina, cultivada con células transformadas con uno de los insertos de PG de interés....................

45

13 Secuencia nucleotídica parcial MiPG1 de cDNA de mesocarpio de mango (Mangifera indica) variedad "Kent" y secuencia aminoacídica deducida..............................................................................................

46

x

LISTA DE FIGURAS (continuación)

Figura Página

14

Secuencia nucleotídica parcial MiPG2 de cDNA de mesocarpio de mango (Mangifera indica) variedad "Kent" y secuencia aminoacídica deducida............................................................................................

47

15 Secuencia nucleotídica parcial MiPG3 de cDNA de mesocarpio de mango (Mangifera indica) variedad "Kent" y secuencia aminoacídica deducida..............................................................................................

48

16 Ubicación y tamaño de las secuencias aminoacídicas deducidas de las clonas parciales de cDNA de MiPG1, MiPG2 y MiPG3, localizadas en secuencias aminoacídicas de PG papaya y naranja...

49

17 Alineamiento de las tres secuencias aminoacídicas parciales de PG encontradas en el mango variedad "Kent" con las secuencias aminoacídicas de las PG a las que fueron similares...........................

50

18 Expresión relativa del gen que codifica para MiPG1, durante el proceso de maduración en mangos variedad "Kent"...........................

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xi

LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1 Oligonucleótidos específicos utilizados para la amplificación de los cDNAs de PG........................................................................................

30

2 Oligonucleótidos diseñados para la evaluación de la expresión génica de PG........................................................................................

33

xii

RESUMEN

Las enzimas poligalacturonasas (PG), degradan los enlaces pectídicos de la pared celular durante la maduración de los frutos y por lo que su actividad se ha evaluado y sus diferentes isoformas se han identificado en varios frutos. Sin embargo, el conocimiento que se tiene sobre los genes que codifican para dichas enzimas y su expresión, es escasa. En frutos de mango, variedad “Kent”, se han reportado dos clonas parciales de cDNA PG, pero se desconoce su patrón de expresión génica durante el proceso de maduración. Es por ello, que esta investigación tiene como objetivo clonar y evaluar la expresión de al menos dos genes de poligalacturonasa (PG) durante el proceso de maduración en mangos variedad “Kent”. Para lo cual se recolectaron los frutos y se evaluaron sus parámetros fisiológicos. También se llevaron a cabo extracciones de RNA de mangos en post-cosecha (días 1,4,7,10 y 16 de almacenamiento), a partir del cuál se sintetizaron cDNAs, clonaron PGs mediante PCRs y se evaluó su expresión génica. Los mangos presentaron un comportamiento típico de un fruto climatérico. Se obtuvieron cambios drásticos en la pérdida de firmeza al día 10 de almacenamiento, lo cual coincidió con el aumento en la producción de etileno; mientras que el ángulo de color disminuyó a través del tiempo. Se lograron obtener tres cDNAs parciales correspondientes a PG (MiPG1, MiPG2 y MiPG3) y se dedujeron sus secuencias aminoacídicas. Las PGs de mango son similares a otras PGs depositadas en la base de datos NCBI y contienen los cuatro motivos funcionales característicos en las poligalacturonasas. La expresión génica de MiPG1, MiPG2 y MiPG3 fue diferencial a través del proceso de maduración de los frutos de mango. Los máximos niveles de expresión observados, se presentaron después de la máxima producción de etileno y coincidieron con el día de almacenamiento post-cosecha donde se

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observó la mayor pérdida de firmeza en los frutos. Estos resultados sugieren que hemos descubierto a tres genes PG asociados al proceso de maduración de los frutos de mango variedad "Kent".

Palabras clave: Poligalacturonasas, Maduración, Mango (Mangifera indica L.), Firmeza

}

xiv

ABSTRACT

Polygalacturonase (PG) enzymes degrade pectic links of the cell wall during fruit ripening. PG activity has been evaluated and various isoforms have been identified in several fruits. However, the knowledge we have about the genes encoding these enzymes and their expression is limited. In mango fruits, variety "Kent" two partial PG cDNA clones have been reported, but their pattern of gene expression during the ripening process is unknown. Therefore, this research aims to clone and evaluate the expression of at least two genes coding for polygalacturonase (PG) during the ripening process in mango variety "Kent". The fruits were collected and evaluated for their physiological parameters. Also RNA extractions were carried out from mango at post-harvest (days 1,4,7,10 and 16 of storage), and cDNAs were synthesized. PG cDNA partial clones were obtained by PCR and their gene expression was evaluated. Mangos showed the typical behavior of a climacteric fruit. Drastic changes in the loss of firmness were observed at 10 days after storage, when the increase in the production of ethylene occurred, whereas the color angle decreased over time. Three partial cDNAs corresponding to PG (MiPG1, MiPG2 and MiPG3) were obtained and their amino acid sequences were deduced. Mango PGs are similar to other PGs deposited in the NCBI database and they contain the four functional motifs characteristic of polygalacturonases. Gene expression of MiPG1, MiPG2 and MiPG3 was differential throughout the ripening process of mango fruit. The highest expression levels of the three PGs were presented after the maximum production of ethylene occurred and coincided with the day of post-harvest storage where there was the greatest loss of firmness in fruits. These results suggest that we have found three PG genes associated to ripening of the fruits of mango variety "Kent".

Keywords: Polygalacturonase, Ripening, Mango (Mangifera indica L.), Firmness

1

INTRODUCCIÓN

La maduración de frutos es un proceso bioquímico programado genéticamente (Li et al., 2010). Que se caracteriza por cambios reológicos y de textura, ablandamiento de la pared celular, desmantelamiento del aparato fotosintético y la degradación de almidón, entre otros (White, 2002). La maduración es un proceso altamente coordinado que conduce al desarrollo deseable de la calidad de la fruta. Los parámetros deseables de calidad incluyen textura aceptable, color atractivo, sabor y aroma placenteros, así como la acumulación de varios fitoquímicos buenos para la salud. Dentro de éstos cambios, la textura de las frutas es esencial en términos de su relación con la preferencia del consumidor, almacenamiento, transportación, vida de anaquel y resistencia a patógenos (Li et al., 2010). Sin embargo, el proceso de maduración puede presentar diferencias dependiendo del tipo de frutos.

Las frutas se clasifican en climatéricas y no-climatéricas, dependiendo el tipo de maduración. Las primeras se distinguen de las segundas por un aumento en la respiración y la biosíntesis de etileno durante la maduración (Lelièvre et al., 1997). En frutas como el tomate, aguacate, mango y plátano se han observado este tipo de cambios, por lo que han sido clasificadas como frutas climatéricas. El incremento en la producción de etileno, asociado al incremento respiratorio es autocatalítico en varias frutas, existiendo evidencia clara de que el etileno causa el climaterio (Lin et al., 2009). Dentro de las consecuencias que trae el aumento en el climaterio, se encuentran los cambios asociados a la pared celular de frutos.

2

La pared celular de las frutas es la estructura que brinda rigidez y es responsable de la adhesión intercelular. Ésta está compuesta principalmente por pectinas, celulosa, hemicelulosa y proteínas estructurales (Brummell y Harpster, 2001; Brummell, 2006). Sin embargo, durante la maduración la pared celular se ve afectada por la pérdida de firmeza. La mayoría de estos cambios son resultado de la acción de varias enzimas que degradan dichos componentes (Li et al., 2010).

La poligalacturonasa (PG) forma parte del grupo de enzimas que participan en la degradación de la pared celular, su función específica es la degradación de pectinas, las cuales son polisacáridos estructurales de la pared celular primaria y de la laminilla media, compuestas mayormente por ácido D-galacturónico unidos por enlaces α-1,4 (Lang y Dörnenburg, 2000). A la fecha, se han logrado identificar y estudiar varios de los genes de PG en frutos como kiwi, tomate y plátano, así como sus respectivas enzimas (Singh y Dwivedi, 2008).

Para frutos de mango se han encontrado diferentes isoformas de enzimas PG, en tres variedades de mango: “Alphonso” (Prasanna et al., 2006), “Dasheari” (Singh y Dwivedi, 2008) y “Nam Dok Mai” (Suntornwat et al., 1999). Para el caso de los mangos “Kent” y “Ataulfo” hay evidencia de la actividad enzimática de PG en frutos sometidos a tratamiento con 1-MCP (1-Metilciclopropano), donde se observó que la actividad de la enzima se redujo (Muy-Rangel et al., 2009; Muy Rangel et al., 2009; Islas-Osuna et al., 2010). Sin embargo, no se ha investigado cuántos genes codifican para las PG, ni se ha evaluado su expresión durante la maduración. Hasta la fecha, únicamente se tiene evidencia de dos clonas parciales de genes de PG en mangos de la variedad “Kent” (Pacheco-Sánchez, 2011).

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Es por todo lo anterior que la presente investigación tiene como objetivo clonar y evaluar la expresión de al menos dos genes de poligalacturonasa (PG) durante el proceso de maduración en mangos variedad “Kent”. Obteniendo dicha información, se lograría contribuir a la generación de nuevo conocimiento en esta área de investigación, y además se podrá dilucidar el papel que desempeñan los genes de PG en la maduración de frutos de mango variedad “Kent”.

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ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

Frutos de Mango Variedad “Kent” Como un Modelo de Estudio en el Proceso de Cambios de Firmeza Durante la Maduración

Dentro de las frutas tropicales de interés comercial, el mango ocupa el segundo lugar, junto con el plátano, en cuanto a calidad y valor comercial; y además ocupa el quinto lugar en producción a nivel mundial, dentro de toda clase de frutos (Masibo y Qian, 2009). En 2010, México ocupó el quinto lugar en la producción de mango a nivel mundial, con un total de 1,632,649.34 toneladas, generando con ello una ganancia de 4,347,697.77 pesos, siendo Guerrero, Nayarit, Sinaloa, Chiapas y Oaxaca los principales estados productores en ese año (FAO, 2010; SIAP, 2010). Los cultivares de mango que se producen mayormente en el país con fines de exportación son "Kent", "Keitt", "Tommy Atkins", "Haden" y "Ataulfo", todos ellos por sus características sobresalientes de sabor, aroma y tamaño (Siller-Cepeda et al., 2009).

Las variedades de mango son muy abundantes, solo en India se conoce que existen más de mil diferentes (Hammerschlag y Litz, 1992). Algunas de las más conocidas son "Alphonso", "Dashehari", "Rani Pasand" ,"Haden", "Keitt", "Kent", "Tommy Atkins", etc. (Gómez-Lim y Litz, 2007).

El mango variedad “Kent” es originario de Florida, Estados Unidos de Norteamérica. Su origen precede de la cruza de semillas de mangos variedad “Haden” y “Brooks” (Schnell et al., 2006). Su árbol es grande y vigoroso y la fruta que produce es verdosa-amarilla, con un rubor rojo o carmesí. Sus medidas van de 11 a 13 cm de largo por 9.5 a 11 cm de ancho, pesa alrededor de 600 a 700 g y tiene una forma ovalada. La pulpa es firme, dulce y jugosa,

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contiene poca fibra y un rico sabor, placentero aroma y de excelente calidad. La cáscara es gruesa, dura y adherente; su semilla es monoembriónica y leñosa. Éste es un cultivo comercial muy importante en México, América Central, Sudamérica y el oeste de África (Litz, 2009). Sin embargo, el carácter perecedero de su fruta reduce en gran medida su vida de anaquel (Petit-Jiménez et al., 2004).

Desarrollo y Maduración

La formación de un fruto, es un proceso sumamente complejo que requiere la interacción de genes y rutas de señalización. Este proceso puede ser dividido en tres etapas: amarre, desarrollo y maduración (Bouzayen et al., 2010). Primeramente se da una intensa división celular del tejido inmaduro que forman los frutos, seguido por una fase de rápida expansión celular que genera frutas de tamaño completo o casi completo. Durante la maduración, el receptáculo de las semillas se convierte en tejido comestible y atractivo y las semillas por su parte, pasan a ser de dispersión incluyendo diferentes cambios estructurales y bioquímicos. Lo anterior resulta en características deseables de aroma, color, textura y composición de la fruta madura. Por último, la fruta madura pasa a la etapa de sobre-maduración y senescencia, caracterizadas por una mayor susceptibilidad a patógenos oportunistas (Martel y Giovannoni, 2007).

La maduración de frutas es un proceso crucial para las plantas que conlleva modificaciones bioquímicas, fisiológicas y de estructura. Durante este proceso se incluyen la conversión de almidón a azúcares, acumulación y síntesis de pigmentos, biosíntesis de compuestos volátiles y de sabor; así como cambios en la estructura y metabolismo de la pared celular, que resultan en la pérdida de firmeza de la pulpa (Goulao y Oliveira, 2008).

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La maduración del mango, por ejemplo, se caracteriza por el ablandamiento de la pulpa; este ablandamiento es causado por una serie de cambios en el metabolismo y la estructura de la pared celular, lo cual resulta en cambios en la textura (Gómez-Lim y Litz, 2007). Sin embargo, la fruta de mango tiene una temporada corta de producción y una vida de anaquel también corta, lo cual puede afectar otros aspectos tales como un elevado costo del producto. El almacenamiento del mango está limitado a 2 - 3 semanas a una temperatura de 10-15 °C (Yahia, 1998), y la variabilidad en la calidad del fruto se puede detectar con respecto al sabor, color, aroma, peso, talla y forma, los cuales son parámetros afianzados durante la maduración. Específicamente para frutos de mango variedad “Kent”, uno de los principales índices de maduración está basado en el grosor del fruto y el color de la pulpa cerca de la cáscara (Sivakumar et al., 2010).

Cambios en la Estructura y Composición Celular Durante la Maduración

La maduración induce cambios que mejoran la calidad del fruto, haciéndolo comercialmente comestible (Teixeira y Ferreira, 2003). Dentro de estos cambios se encuentran: a) cambios de color de la pulpa de verdoso-amarillo a anaranjado; b) cambios de color de la cáscara de verde a amarillo; c) decremento en el contenido de clorofila y aumento en el contenido de carotenoides; d) disminución de la firmeza de la pulpa y aumento de la jugosidad; e) conversión del almidón a azúcares; f) aumento de los sólidos solubles totales; g) disminución de la acidez titulable; h) incremento de los compuestos volátiles que generan aroma; i) incremento en la producción de CO2 y j) aumento en la producción de etileno (Litz, 2009).

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La pérdida de color, firmeza, sabor y el pardeamiento de la fruta, afecta la aceptación del consumidor por la fruta de mango. La aplicación de tratamientos post-cosecha como la adición de antioxidantes (ácido cítrico y ácido ascórbico) (Robles-Sánchez et al., 2009), estabilizadores de firmeza (CaCl2), agentes anti-maduración (1-MCP) (Vilas-Boas y Kader, 2007), ceras comestibles (Sothornvit y Rodsamran, 2008) y una combinación de recubrimiento de quitosano y tratamientos térmicos (Djioua et al., 2010), han sido evaluados con el fin de mantener la calidad y alargar la vida de anaquel del fruto. Dicha calidad está influenciada por la velocidad en que se presentan lo cambios en la estructura y composición celular de los frutos de mango. Dentro de éstos tratamientos, se ha visto que la aplicación de 1-MCP retarda el ablandamiento y el pardeamiento, pero no reduce la tasa de respiración en mangos frescos cortados variedad “Kent” y “Keitt” (Sivakumar et al., 2010).

Actividad Respiratoria y Acción Hormonal

La maduración es regulada por estímulos internos y externos, incluyendo la temperatura, luz, nutrientes de la planta, la disponibilidad de agua y la producción de hormonas (Matas et al., 2009). Una de éstas hormonas es el etileno, el cual está involucrado en un amplio rango de procesos como el crecimiento, desarrollo y maduración de las plantas, además de respuestas al estrés (Abeles et al., 1992).

Muchas frutas, en particular las llamadas frutas climatéricas como el tomate, la manzana y el mango, entre otros, requieren etileno para madurar. Estas frutas se caracterizan por presentar un incremento en la respiración y una elevada síntesis de etileno (pico climatérico), para coordinar y sincronizar la maduración (Fig. 1) (Cara y Giovannoni, 2008). Aunque las frutas no-

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climatéricas carecen del pico climatérico, típicamente producen pequeñas cantidades de etileno durante la maduración y muchas de ellas han mostrado ser afectadas por el etileno exógeno durante éste proceso. Es por ello que se ha permitido tomar al etileno como una hormona control para la manipulación de la vida útil de frutas y ha sido nombrada la hormona de la maduración (Matas et al., 2009).

El mango es una fruta climatérica y puede madurar después de ser cortado durante su madurez fisiológica (verde-maduro), es decir, cuando ya ha alcanzado su tamaño final, pero antes de que el proceso de maduración haya iniciado. El pico climatérico del mango “Kent” ocurre aproximadamente a los 9 días después de ser cortado (Litz, 2009), el cual es identificado por una alta tasa de respiración. Dicho aumento coincide en mayor o menor medida con los cambios de color, olor y textura típicos del fruto durante el proceso de maduración (Pérez et al., 2004).

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Figura 1. Representación esquemática que indica los mecanismos moleculares que controlan la maduración en frutos climatéricos. El proceso de maduración de frutos es un proceso genéticamente regulado que involucra la activación de numerosas rutas de metabolitos primarios y secundarios. Dichos metabolitos contribuyen a las cualidades sensoriales y nutricionales de la fruta. Este proceso también involucra la expresión de genes relacionados a la maduración que codifican para enzimas involucradas en varias rutas de maduración. Todo el proceso se encuentra bajo el control de señales hormonales y ambientales, de los cuales el etileno juega el papel más importante. Modificado de Bouzayen (2010).

La Pared Celular Vegetal: Un Organelo Esencial en los Cambios de Firmeza Durante la Maduración de Frutos de Mango

La pared celular de las plantas es una estructura que determina la forma de las células y las mantiene unidas, provee fuerza mecánica, rigidez y es responsable de la adhesión intercelular (Brummell, 2006). Esta es además una estructura dinámica que presenta cambios durante la diferenciación y el desarrollo de los diferentes órganos de las plantas (Villarreal, 2009). Se cree que la modificación de la pared celular es la base de los cambios en la firmeza y textura de las frutas, pero el tipo y la magnitud de las modificaciones llevadas a cabo durante la maduración pueden variar considerablemente (Brummell et al., 2004). Estos cambios de textura conducen al ablandamiento de la fruta y están acompañados por la pérdida de azúcares neutros, la solubilización y depolimerización de los polisacáridos de la pared y rearreglos entre ellos. Estas modificaciones son el resultado de la acción de enzimas que digieren la pared celular (Goulao y Oliveira, 2008).

La textura de las frutas depende de la turgencia de las células así como de la presencia de estructuras de soporte como la pared celular y la cohesión de

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las células. Esta última propiedad es conferida por la laminilla media, la estructura intracelular que mantiene unidas a la pared primaria de las células contiguas y que está compuesta en su mayoría de material péctico (Brummell y Harpster, 2001). Estructuralmente, la pared celular de las frutas es similar a la pared primaria de otros tejidos de la planta cuyos componentes son polisacáridos, celulosa, hemicelulosa y pectinas (Teixeira y Ferreira, 2003).

Componentes Principales de la Pared Celular

La pared celular de la frutas consiste en un complejo de polisacáridos y proteínas. La pared celular primaria contiene en promedio, cerca de 35% de pectinas, 25% de celulosa, 20% de hemicelulosa y 10% de proteína estructural, dependiendo de la fruta y la etapa de desarrollo (Brownleader et al., 1999). En general, la modificación de la pared celular y la depolimerización durante la maduración de la fruta es variable entre las diferentes frutas (Li et al., 2010).

Según lo reportado por Brummel y Harpster (2001), los principales componentes de la pared celular, son los que se describen a continuación: a) Celulosa, la cual está compuesta por cadenas de (14) β-D-glucanos, alineados juntos por enlaces de puentes de hidrógeno en microfibrillas muy largas. b) Xiloglucanos, los cuales poseen enlaces (14) β-D-glucanos como las celulosas, pero son sustituidos por α-D-xilosa de manera regular cada tres o cuatro residuos de glucosas consecutivas. c) La xilosa, que ocasionalmente es extendida con β-D-galactosil-α-L-fucosa. d) Pectina, formada por un complejo heterólogo de polisacáridos, formados en su mayoría por ácido D-galacturónico unidos por enlaces α-1,4 que forman cadenas de homogalacturonanos.

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e) Los galacto-glucomananos están compuestos por regiones de (14) β-D-glucanos y (14) β-D-mananos, en porciones equivalentes, aproximadamente, con cadenas de unidades simples de α-D-galactosa, ocasionalmente. f) Los glucoronarabinoxilanos están compuestos por enlaces (14) β-D-xilanos, con cadenas unidades de α-L-arabinosa y α-D-ácido glucorónico. g) Los ramnogalacturonanos I (RGI) están formados por α-D-ramnosa y por residuos de α-D-ácido galacturónico, con largas cadenas unidas a residuos de ramnosa. h) Los ramnogalacturonanos II (RGII) están formados por enlaces (14) α-ácido D-galacturónico, junto con un complejo de cadenas de varios tipos de azúcares neutros. Son los componentes menos abundantes en la pared celular, pero pueden dimerizar, lo cual puede afectar la porosidad de la pared. h) Las proteínas estructurales, son de cuatro tipos diferentes y algunas están altamente glicosiladas.

Metabolismo de la Pared Celular Durante la Maduración de Frutos

Las modificaciones en la textura de las frutas son una combinación de los efectos de la deshidratación no fisiológica del tejido de la fruta (pérdida de la turgencia celular), degradación de almidón y modificaciones de las propiedades mismas de la pared. Estos cambios en la pared celular son los factores primarios que afectan el ablandamiento y textura de muchas especies (Martel y Giovannoni, 2007). Se ha propuesto que la degradación de xiloglucanos iniciaría el proceso de ablandamiento de los frutos, mientras que la degradación de las pectinas contribuiría principalmente al ablandamiento hacia el final de la maduración y en los estadios sobremaduros (Wakabayashi, 2000).

Los xiloglucanos, otras matrices de glucanos y la celulosa conforman la red estructural más importante de la pared celular de frutos. La maduración

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relacionada con la depolimerización de éstos polisacáridos aparece comúnmente en la mayoría de las especies (Brummell et al., 2004). Otros cambios en la pared celular durante la maduración frecuentemente incluyen la pérdida de azúcares neutros de numerosos polisacáridos, así como la solubilización, depolimerización y metilesterificación de ácidos pécticos (Brummell y Harpster, 2001).

Se ha visto que la solubilización de polímeros pécticos durante la maduración del mango cv. Alphonso es mucho más amplia que en frutos de tomate y kiwi (Redgwell et al., 1992). Sin embargo, la degradación de pectinas en relación con el ablandamiento y cambios en la textura difiere de fruta a fruta. La contribución de polisacáridos de hemicelulosa en relación al ablandamiento ha sido observada en tomate, melón y otras frutas (Maclachlan y Brady, 1994).

En la maduración de mango variedad "Alphonso", se ha observado una caída notable en la abundancia del peso molecular de las fracciones IV y V de hemicelulosas álcali-solubles, hasta de cuatro veces de frutas inmaduras (0.795 g% FW) a maduras (0.185 g% FW). Estos resultados muestran evidencia de las modificaciones en la composición y estructura de los polímeros durante la maduración en mango variedad "Alphonso" (Yashoda et al., 2005).

Principales Proteínas Con o Sin Actividad Enzimática que Modifican la Pared Celular

En frutas maduras, la pared celular y la laminilla media se encuentran parcialmente disueltas como resultado de la acción de numerosas enzimas que rompen los componentes de dichas estructuras (Teixeira y Ferreira, 2003). La modificación genética como la deleción o sobre-expresión de los genes que codifican para dichas enzimas, ha proporcionado información acerca de cuál es

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y cómo llevan a cabo su función éstas enzimas, así como de las diferentes isoformas que participan en la maduración de los frutos (Goulao y Oliveira, 2008).

La función y regulación de enzimas hidrolíticas de la pared celular ha sido muy estudiada en los últimos años. Estas enzimas rompen los enlaces entre los polímeros que conforman a la pared de las células de las frutas. Dentro de éste grupo se encuentran la poligalacturonasa (PG), las β-1,4-endoglucanasas, pectato-liasas, pectinmetilesterasas (PME) y xiloglucanos endo-transglicosilasas (Buchanan et al., 2000). De las anteriores, la PG, la PME y las celulasas son las más estudiadas y sus actividades son frecuentemente correlacionadas con la velocidad que se produce el ablandamiento durante la maduración (Teixeira y Ferreira, 2003).

La enzima de maduración más estudiada ha sido la PG, pues esta involucrada en la degradación de la pared celular y el fruto en el que más se ha estudiado esta enzima es el tomate (Giovannoni et al., 1989). La clonación del gen y la caracterización funcional del mismo, indican que la actividad de PG como enzima aislada no es suficiente para tener un impacto significativo en la textura. Por lo tanto, es probable que su función se dé en conjunto con otros factores o enzimas (Smith et al., 1989). La enzima PME ha mostrado actividad en todo el desarrollo de la fruta y puede aumentar la accesibilidad de PG a su pectina como sustrato (Tieman et al., 1992). Otra enzima evaluada en tomate, es la glucanasa, la cual mostró expresión diferencial de sus genes durante la maduración de frutos y su ablandamiento, así como la enzima galactosidasa (Giovannoni, 2001).

Las endo (14) β-D-glucanasas, catalizan la hidrólisis de los enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces β (14), adyacentes a residuos de D-glucosa no sustituidos (Brummell et al., 1994). Es frecuente que se haga referencia a estas enzimas como celulasas, sin embargo, la mayoría de

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las endoglucanasas de plantas superiores carecen del dominio de unión a celulosa encontrado en celulasas microbianas, y por lo tanto no pueden degradar microfibrillas cristalinas de celulosa (Villarreal, 2009).

Varios estudios realizados en algunas variedades de frutas, indican que las hidrolasas de la pared celular no pueden ser individualmente responsables del ablandamiento, sin embargo, pueden lograr cambios relacionados con este proceso, actuando en conjunto (Brummell y Harpster, 2001). Adicionalmente, existe otra proteína, la expansina que es importante para el desmontaje de la pared celular en tejidos que no se encuentran en crecimiento y puede preceder a la acción de varias hidrolasas (Brummell et al., 1999). Las expansinas son proteínas de la pared celular sin actividad hidrolítica. El mecanismo propuesto de la acción de esta enzima involucra la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las microfibrillas de celulosa y la red de glucósidos de la pared (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995; Sane et al., 2005)

Las enzimas xiloglucano endotransglucosilasas (XTH) y la β-xilosidasa, son otras enzimas que tienen funciones similares a las expansinas. Varios estudios han señalado que están involucradas en el rompimiento de la matriz de celulosa y xiloglucanos, los cuales también están asociados al proceso de ablandamiento de la fruta. Las XTH, catalizan los enlaces internos entre las uniones de β-D- glucanos y la re-ligación de moléculas de xiloglucanos (Fonseca et al., 2005).

En un estudio realizado por Ali y cols. (2004), se evaluaron diferentes proteínas relacionadas con la degradación de la pared celular durante la maduración en frutos tropicales. Se observó que la PG incrementó su actividad en un 500% en tomate, 300% en papaya, 250% en plátano, 150% para carambola y fueron guayaba y mango (variedad "Harumanis") los frutos que registraron un menor incremento con un 20% aproximadamente. En cuanto a la actividad de PME, ésta fue menor en frutas maduras de guayaba y papaya,

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mientras que en el plátano y tomate fue más elevada y en el mango se presentó la mayor actividad. La enzima β-galactosidasa presentó actividades similares en todas las frutas, presentando su mayor actividad en el plátano. La actividad de (14) β-glucanasa fue variante en todos los tipos de fruta, registrando actividades relativamente altas en papaya y guayaba, mientras que en tomate, mango y plátano fue baja (Ali et al., 2004). Con esto se demostró que el ablandamiento de los frutos es un fenómeno fisiológico que se lleva a cabo en conjunto por todas las enzimas que degradan cada uno los componentes de la pared celular de los frutos.

En el mango, el ablandamiento ha sido atribuido a la acción de hidrolasas de la pared celular. Dichas enzimas se encargan de la depolimerización y solubilización de sustancias pécticas y hemicelulosas. Las cuales se encuentran en la laminilla media y provocan cambios en el espesor de la pared celular y en su composición, tamaño, forma y turgencia (Brummell et al., 2004). Los estudios realizados en el mango sobre la actividad de este tipo de enzimas involucradas en la degradación de la pared celular, han sido muy escasos, presentándose resultados únicamente para variedades de mango relevantes en la India (principalmente en la variedad "Alphonso"), por ser éste el país más importante en la producción de éste fruto.

Poligalacturonasas (PG) Como Enzimas Clave en los Cambios de Firmeza en Frutos de Mango

Se ha observado que las enzimas PG están asociadas a un amplio rango de procesos del desarrollo de las plantas. Dentro de éstos se encuentran la germinación de semillas, la abscisión de órganos, la maduración de los granos

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del polen, la formación de las células del xilema, en respuestas de defensa por la invasión de parásitos, así como en los procesos de maduración. Demostrando con ello la importancia de estas enzimas y su diversidad de funciones (Kim et al., 2006).

Las enzimas PG, generan ruptura del enlace α-1,4-glicosídico del ácido péctico. El resultado final de esta actividad es la pérdida de la integridad de la pared celular y el incremento de la concentración de polisacáridos solubles (Rodriguez Castro et al., 2006). Por otro lado, uno o varios genes que codifican para PG han sido reportados en frutos como fresa, tomate, durazno, pera, aguacate, plátano y mango (Singh y Dwivedi, 2008).

Familia de Genes de Poligalacturonasa

La familia de genes de PG, es típica en plantas (Markovič y Janeček, 2001). Se ha observado que el número de genes PG aumenta conforme se incrementa la complejidad biológica de los organismos. Se han encontrado, por ejemplo, hasta 4 copias de PG en algas unicelulares y de 44 a 68 copias en plantas con flores. De acuerdo a un análisis filogenético con las secuencias antes mencionadas, los genes de PG fueron agrupados en seis clados (A-F), de acuerdo a la similitud de sus secuencias aminoacídicas. Los clados A y B contienen PGs de todas las plantas terrestres, los clados C, D y F contienen sólo a plantas con flores y el clado B consiste en PGs de algas y plantas con flores (Park et al., 2010).

Las PGs también se pueden clasificar con endo-PGs, las cuales cortan de manera al azar la cadena pectídica; exo-PGs, que degradan los extremos libres no reductores de la cadena y como rhamno-PGs (Markovič y Janeček, 2001). De acuerdo a ésta clasificación y la anterior, los clados A y B agrupan

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endo-PGs, los clados C y D agrupan a las exo-PGs y las rhamno-PGs se agrupan en el clado E. Por su parte, para las PGs del clado F aún no se ha definido claramente si pertenecen a endo o exo-PGs. A su vez, los seis clados han sido clasificados dentro de 20 sub-clados (Park et al., 2010).

En otro estudio realizado por Park y cols. (2008), se analizaron un total de 122 PGs, de los cuales 106 eran de plantas, 15 de Aspergillus oryzae y 1 de levadura. Se realizó un alineamiento de todas éstas secuencias a nivel de aminoácidos, separándolas por clados y se localizaron cuatro motivos funcionales correspondientes a las enzimas glicosil hidrolasas, de la familia 28 de las poligalacturonasas. De éstos, los motivos I, II y IV, son secuencias altamente conservadas, mientras que el motivo III es más variable (Park et al., 2008).

Poligalacturonasas y Maduración en Frutos

La actividad de PG ha sido reportada para un gran número de frutas; sin embargo, ha sido purificada y estudiada solo en pocas de ellas. En cuanto a los genes de PG, éstos fueron clonados por primera vez en tomate, en un estudio donde se evaluó la los cambios de la textura, mediante la transformación de los frutos con un gen antisentido de PG (Giovannoni et al., 1989). El resultado de ésta transformación genética fue una mejora en la textura de la fruta y una vida de anaquel más larga. Lo anterior aportó información clave sobre el rol de las PG durante el metabolismo de la pared celular de frutos (Hadfield y Bennett, 1998).

En un estudio realizado en dos variedades de fresa ("Fragaria chiloensis" y "Fragaria ananassa") por Figueroa y cols. (2008), se observó para la primera variedad un incremento en la expresión de PG en las etapas 2 y 3 de

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maduración. Por otra parte, se mantuvo este nivel en las etapas 3 y 4, y no se mostró expresión en la etapa 1. Para la variedad "F. ananassa" se observó una menor expresión en las etapas 2 y 3, pero una elevada expresión en la etapa 4. Para ambas especies, las etapas 1 y 2 corresponden al periodo cuando las frutas presentan elevada firmeza. Entre las etapas 2 y 3 hay una mayor reducción de firmeza; sugiriendo con esto la relación que tienen los genes PG con el ablandamiento de la pared celular (Huber, 1984; Smith et al., 1989).

Se ha demostrado que existen al menos dos genes PG en fresa. Uno de los genes, PG1 mostró expresión diferencial de la etapa verde a la etapa roja de maduración, mostrándose niveles de expresión más altos en la etapa roja. Mientras que el otro gen, PG2 mostró un incremento en sus niveles de expresión de la etapa blanca a la etapa roja (Aharoni y O’Connell, 2002). Con esto se demostró que los múltiples genes que codifican para actividades enzimáticas similares, se expresan diferencialmente durante el proceso de maduración en frutos.

En melón, una gran cantidad de depolimerización y solubilización de pectinas ocurre durante la maduración. Según lo reportado por Hadfield y cols., (1998), dos de los genes PG más abundantes que inducen la maduración en este fruto, son MPG1 y MPG2, y el menos abundante es MPG3. De éstos, MPG1 es el más abundante y fue expresado en Aspergillus oryzae, donde se observó que disminuía la viscosidad de pectinas y catalizaba la reducción de grupos lineales, sugiriendo con esto que MPG1 codifica para una endo-PG con un potencial en la depolimerización de pectinas de la pared celular de melón. Genes similares a, MPG1 y el MPG2 también están relacionados con la maduración en frutos de durazno y tomate (Hadfield et al., 1998).

Para la fruta de kiwi también se han encontrado diferentes genes PG (CkPGA, CkPGB, CkPGC), se ha observado que éstos se expresan en las diferentes etapas de maduración de la fruta (I, II y III), antes de la producción de

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etileno y en el pico climatérico. Lo anterior confirma la participación de PG en el ablandamiento de la fruta (Wang et al., 2000).

También han sido observados cambios significativos en la expresión de genes PG en frutos de papaya , estos se traducen a un incremento en la síntesis de la enzima hasta de cinco veces mayor. Esta elevada expresión ocurre cuando el fruto presenta un decremento dramático en la firmeza y dichos cambios coinciden con el pico climatérico de la respiración (do Nascimento et al., 2009).

De acuerdo a lo reportado por Wei y cols. (2010), se ha observado que en frutos de manzana variedad “Fuji” existe una correlación negativa entre la expresión de PG y la firmeza de la fruta, en presencia de etileno. Dicha expresión correlaciona con la actividad de PG, la cual se observa en etapas medias y tardías de maduración. Por otro lado en la manzana variedad “Golden delicious”, la expresión de PG es más elevada, pero puede ser inhibida en presencia del inhibidor de etileno 1-MCP (Wei et al., 2010).

Por otra parte, Asif y cols. (2005), clonaron y estudiaron varios genes PG en plátano (MAPG1, MAPG2, MAPG3 y MAPG4). De éste conjunto de genes, MAPG3 y MAPG4 están involucrados en la maduración del fruto y en la regulación de la acción del etileno, mientras que MAPG2 está asociado a la senescencia y MAPG1 muestra expresión constitutiva. Basándose en éstas observaciones, se puede concluir que el ablandamiento del plátano durante la maduración es el resultado de la expresión de los cuatro genes PG en conjunto, los cuales se expresan diferencialmente (Asif y Nath, 2005).

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Actividad Enzimática y Expresión Génica de PG en Frutos de Mango

La información que existe sobre la expresión de genes y la actividad de enzimas de maduración en los frutos de mango, aún es muy escasa. En un estudio realizado por Prassana y cols. (2008), para la variedad de mango "Alphonso", se encontraron tres diferentes isoformas de enzimas PG: PG-I, PG-II y PG-III, con abundancias de 68%, 6% y 26%, respectivamente. Para el caso de PG-I y PG-II, se encontró actividad hidrolítica hacia los arabinogalactanos, mientras que para PG-III no se encontró actividad. La actividad total de PG fue monitoreada a diferentes estados de maduración, alcanzando su máxima actividad en la fase post-climatérica, lo cual indica que existe un incremento gradual en la actividad de PG durante la maduración. Sin embargo, esta actividad total es mucho menor que la reportada para tomate, plátano y papaya, en la etapa post-climatérica (Prasanna et al., 2006).

Otra de las variedades de mango de donde también se han purificado y caracterizado éstas enzimas es en la variedad "Dashehari", en la cual se encontró que posee tres distintas isoformas de PG, las mismas que para la variedad "Alphonso" (PGI, PGII y PGIII) (Singh y Dwivedi, 2008). Sin embargo, entre las dos variedades, las isoformas de PG difieren en varias propiedades fisicoquímicas, como el peso molecular, el pH en su perfil de actividad, la temperatura óptima y el efecto que tienen sobre el sustrato en la actividad enzimática (Prasanna et al., 2006; Singh y Dwivedi, 2008).

En el mango variedad "Nam Dok Mai" se han identificado dos diferentes isoformas de la enzima de PG, las cuales son muy similares a las descritas en los frutos de kiwi, con un 51% de identidad a nivel de aminoácidos. Una de las isoformas corresponde a una endo-PG, que presenta actividades en diferentes estados de desarrollo, y otra con actividad exo-PG, la cual presenta un

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incremento en las etapas más cercanas a la maduración (Suntornwat et al., 1999).

En mangos de la variedad “Ataulfo” se evaluó la actividad de PG en mangos tratados con 1-MCP. Los resultados no mostraron diferencias significativas de la actividad de PG durante los primeros días del experimento, incrementándose al día doce de almacenamiento. Por su parte, en los mangos controles se incrementó la actividad hasta cuatro veces a los seis días. Los autores atribuyen éste incremento a su proceso natural de maduración, confirmando que la PG participa en el ablandamiento de los frutos (Muy Rangel et al., 2009). En mangos de la variedad “Kent”, también se evaluó la actividad de PG en frutos tratados con 1-MCP, donde se observó un incremento gradual de la enzima tanto en mangos tratados como no tratados durante un periodo de quince días, siendo mayor la actividad de PG en los mangos no tratados (P<0.05) (Islas-Osuna et al., 2010).

En cuanto a la expresión génica de PG, en un estudio previo con mangos de la variedad “Kent”, se tiene evidencia de cambios en la expresión genicacuando los frutos fueron sometidos a estrés por calor, en frutos de la variedad “Kent”; como resultado se observaron diferencias en la expresión del gen PG en el día doce post-tratamiento, la cual aumentó 16 veces con respecto al control (Pacheco-Sánchez, 2011). Adicionalmente, en dicha investigación se encontraron dos clonas parciales de PG (MiPGI y MiPGII) en esta variedad..

De acuerdo a lo anterior y a pesar de existir información relacionada con la actividad de PG en frutos de mango, mucho se desconoce sobre la expresión de los genes que codifican para tales enzimas. Al presentarse evidencia de que en mangos variedad “Kent” existen al menos dos genes de PG, es necesario complementar dicha información mediante la clonación y secuenciación de

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dichos genes. Además es importante conocer si existen más genes de PG para esta variedad de mango, y cuántos de ellos se expresan al inicio, durante y al final de la maduración. Obteniendo esta información, se podrá tener un panorama claro y completo sobre la influencia que presentan los genes de PG en la maduración de mangos variedad “Kent”.

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HIPOTESIS

Al menos dos genes de poligalacturonasa se expresan diferencialmente durante el proceso de maduración en mangos variedad “Kent”.

OBJETIVOS

Objetivo General

Clonar y evaluar la expresión de al menos dos genes de poligalacturonasa (PG) durante el proceso de maduración en mangos variedad “Kent” y relacionarlo con sus parámetros fisiológicos.

Objetivos Específicos

• Evaluar la producción de CO2 y etileno, la pérdida de firmeza y cambios en el color durante la maduración de mangos variedad “Kent”.

• Clonar el cDNA de al menos dos PGs de mango variedad “Kent” expresados durante su maduración

• Evaluar la expresión génica de al menos dos PG de mango variedad “Kent” durante la maduración del fruto.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de Mangos Variedad “Kent” y Evaluación de Sus Parámetros Fisiológicos

Los frutos de mango variedad “Kent” fueron recolectados del campo experimental del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), unidad Navojoa, Sonora, ubicado a una latitud norte de 27°03’49.33”, una longitud oeste de 109°30’11.42” y a 28 m sobre el nivel del mar. La selección de los frutos fue al azar y se muestrearon un total de 40 mangos, todos en el mismo día de muestreo. Los mangos se seleccionaron de acuerdo a un tamaño y apariencia uniforme, durante su etapa de madurez fisiológica. Fueron transportados al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de Plantas, donde se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio a 200 ppm, para su posterior almacenamiento a 20°C y una humedad relativa de 60-65%.

La evaluación de los parámetros fisiológicos del fruto, se realizó por quintuplicado, cada cuatro días. Las variables que se midieron se describen a continuación.

Producción de CO2 y Etileno

A cinco frutos seleccionados, se les midió su producción de CO2 y etileno cada cuatro días, utilizando un cromatógrafo de gases Varian Star 3400 (Varian-USA). Dicho cromatógrafo está equipado con detectores de ionización

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de flama (FID) y de conductividad térmica (TCD), una columna metáloda de 2 m de largo y 1/8” de diámetro interno, empacada con Hayesep N 800/100. Los frutos fueron colocados en contenedores de plástico, sellados a una temperatura de 20°C, durante 2 h. La muestra para l a determinación de los gases se tomó del espacio de cabeza del contenedor con una jeringa de inyección y posteriormente se realizó la lectura en el cromatógrafo utilizando un estándar de 5% de CO2 (Praxair). Para calcular la producción de CO2 y etileno se utilizaron las siguientes fórmulas:

mlCO2/Kgh=área de la muestraconcentración estándar(área de espacio de cabeza)

tiempo de incubaciónárea estándar(peso muestra)

µlC2H4/Kgh=área de la muestraconcentración estándar(área de espacio de cabeza)

tiempo de incubaciónárea estándar(peso muestra)

Pérdida de Firmeza

La firmeza de los frutos se determinó utilizando un penetrómetro digital Chatillon modelo TCM200, con un punzón cónico de 8 mm de diámetro. La medición se realizó en la pulpa del mango en dos diferentes puntos y se obtuvo un promedio de ambas. La firmeza se reporta como Newtons (N).

Cambios en el Color

El color de la pulpa de los mangos se midió con un colorímetro Minolta CR-300. Se obtuvieron los valores de L* (luminosidad), a* (cambio de color de

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verde a rojo) y b* (cambio de color de azul a amarillo). Con dichos valores, se llevó a cabo el cálculo del ángulo HUE (ángulo del tono) utilizando la formula:

HUE = arcTan (b*a*

El ángulo de 360° representa un color rojo, uno de 90° un color amarillo, uno de 180° un color verde y uno de 270° un color azul (Mi nolta, 2003).

Amplificación y Clonación de los Genes de PG

La evaluación de la expresión génica de PG se llevó a cabo durante el proceso de maduración del fruto. Para lo anterior fue necesario clonar los cDNAs de las posibles isoformas de PG del mango y así obtener sus secuencias, siguiendo la metodología que se describe en los siguientes apartados.

Extracción de RNA Total

Para la extracción del RNA total se utilizó pulpa de los frutos de mango, y se siguió una técnica previamente estandarizada para la extracción de RNA en dichos tejidos (Pacheco-Sánchez, 2011), la cual es una modificación de la técnica de López-Gómez y Gómez-Lim (1992). La técnica se basa en la siguiente metodología: se pesaron 0.5 g de tejido de pulpa de mango, a los cuales se agregó 1 ml de buffer de extracción. Se mezcló por vortex durante 1 min y se agregaron 200 µl de PVPP (polivinilpolipirrolidona), se agitó por vortex

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1 min y se procedió a incubar a 60°C durante 20 min . Pasado el tiempo de incubación, se agregaron 250 µl de etanol absoluto, se mezcló nuevamente por vortex y se añadieron 110 µl de acetato de potasio 5M y se mezcló por vortex 1 min. Posteriormente se agregaron 700 µl de cloroformo-alcohol isoamílico, proporción 49:1, se agitó vigorosamente con la mano y se procedió a centrifugar a 17,000 x g a 4°C durante 20 min. Se recuperó la fase acuosa y se le agregaron 500 µl de fenol-cloroformo 1:1 (V/V), se agitó vigorosamente con la mano para volver a centrifugar ahora a 12,000 x g durante 10 min a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y se agregaron 700 µl de cloroformo-alcohol isoamílico, se agitó nuevamente y se centrifugó a 12,000 x g durante 10 min a 4°C. Se recolectó el sobrenadante y se dejó precipi tando el RNA total utilizando cloruro de litio en una concentración final en la muestra de 3 M, durante toda la noche a -20°C. Pasado éste tiempo, se centrifugó a 17,000 x g por 20 min a 4°C. El RNA precipitado se lavó dos veces con etano l al 75% centrifugando la muestra y por último se resuspendió en agua libre de RNasas.

Una vez obtenido el RNA total, se procedió a su cuantificación, utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV-Vis y se midió la relación de las absorbancias 260 y 280 nm para la estimación de la pureza del RNA, las cuales indican la posible contaminación a causa de la presencia de proteínas, fenoles, sales o solventes. Evaluación de la Integridad del RNA Total

Se llevó a cabo un análisis por electroforesis en condiciones desnaturalizantes para observar si el RNA extraído se encontraba íntegro. Para ello se utilizó un gel de agarosa al 1% preparado con solución de corrida MOPS1X (MOPS 0.2 M, pH 7.0, acetato de sodio 20 mM y EDTA 10mM, pH

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8.0), al cual se le adicionaron 1.7 ml de formaldehido. Para correr el gel se cargaron 1.5 µg de RNA total utilizando una solución de carga 6X para RNA (0.75 ml de formamida deionizada, 0.15 ml de MOPS 10X, 0.24 ml de formaldehido, 0.1 ml de agua libre de RNasas, 0.1 ml de glicerol y 0.08 ml de azul bromofenol al 10%). Se adicionó bromuro de etidio a una concentración de 1mg/µl a la muestra, para teñir el RNA. Para el análisis del gel se utilizó un transiluminador UV y un equipo de fotodocumentación digital (Kodak DS DC120).

Eliminación del DNA Genómico Residual

Una vez evaluada la integridad del RNA total, se procedió a limpiar las muestras utilizando la enzima DNasa I (Roche) para asegurar que las muestras se encontraran libres de DNA genómico contaminanante. La enzima se adicionó a la muestra de RNA en una concentración de 2.5 unidades por cada µg de RNA, utilizando también 5µl del buffer de la enzima en un volumen final de 100 µl. Dicha reacción se incubó a 35°C, durante 23 min utos. Después de éste tiempo se procedió a eliminar la DNasaI, adicionando 1µl de EDTA 0.5M a pH 8.0, 2 µl de acetato de sodio 3 M a pH 5.2 y 100 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico a una proporción 25:24:1. Se mezcló mediante vortex y se centrifugó a 12000 x g durante 6 min a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y se adicionaron 300 µl de etanol absoluto frío y 10 µl de acetato de amonio 5 M para precipitar el RNA, incubando por 2 h a -20°C. Posteriormente se centrifugó a 13000 x g durante 20 min a 4°C. El precipitado se lavó dos v eces con etanol al 70% y se resuspendió en 20 µl de agua libre de RNasas (Sambrook y Russell, 2001).

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Síntesis del DNA Complementario (cDNA) Por Transcripción Reversa

Para llevar a cabo la síntesis del cDNA, se siguió el protocolo que se describe a continuación, utilizando el sistema comercial de Invitrogen. De acuerdo a las especificaciones del sistema, se hizo una mezcla de los siguientes componentes: 5µg de RNA, 1 µl de primer (oligo DT20 50 µM) y 1 µl de dNTPs 10 mM y se aforó a 10 µl con agua libre de RNasas. Se incubó la mezcla a 65°C por 5 min y después de ese tiempo se colocó en hielo por 1 min. Se preparó otra reacción utilizando los siguientes componentes: 2 µl de buffer 10X RT, 4 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de DTT 0.1M, 1 µl de RNasa OUT (40 U/µl) y 1 µl de la enzima SuperScript II RT (200 U/µl). Se agregó esta reacción a la primera y se centrifugó para obtener una mezcla homogénea. Se incubó la reacción completa a 50°C durante 50 min y se comple to la reacción incubándola a 85°C durante 5 min y posteriormente e n hielo durante 1 min. Se colectó la reacción por centrifugación y se agregó 1 µl de RNasa H, incubando 20 min a 37°C. Los cDNA sintetizados se guardaron a -20°C para su posterior uso (Sambrook y Russell, 2001).

En esta etapa se sintetizaron los cDNA utilizados para la amplificación y clonación de los fragmentos de PG, así como los que se usaron para la evaluación de la expresión génica de PG.

Amplificación de Fragmentos del cDNA que codifica para PG

Para la obtención de los cDNA parciales de PG, se diseñaron iniciadores específicos (por consenso) basándose en las secuencias nucleotídicas de PGs de otros frutos, depositados en el GenBank. De igual forma, se diseñaron iniciadores específicos tomando como referencia una secuencia parcial de PG

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de mango Dashehari (GenBank: EU805508.1). En la Tabla 1 los oligonucleótidos utilizados para la amplificación, así como el tamaño del amplicón en pares de bases de cada uno de las secuencias.

Se llevaron a cabo reacciones de PCR utilizando como templado 50 ng de cDNA. Las reacciones consistieron en la mezcla de 12.5 µl del mix Go taq, 2 µl del oligonucleótido Fw, 2µl de oligonucleótido Rv, aforándose a 25 µl con agua. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador DNAEngine® de BIO-RAD. Las condiciones de corrida utilizados fueron: 94°C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 94°C por 1 min, 52°C por 1 min y 72°C por 1:30 min, por último un paso de elongación de 72°C por 5 min. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, utilizando como solución de corrida TBE 0.5X (Tris-base 0.2 M, ácido bórico 0.4 M y EDTA 0.5 M, pH 8.0). Para ello, se cargaron 12.5 µL de la reacción de PCR en el gel. Se utilizó un marcador de peso molecular 1Kb plus DNA Ladder (Invitrogen). Dicha corrida se realizó a 60 V durante 1 h. Al término de la electroforesis, se sumergió en solución de bromuro de etidio a una concentración de 0.67 mg/mL durante 3 min para su tinción, seguido por 2 min de lavado con agua grado HPLC. Para observar los productos de amplificación se utilizó un transiluminador UV y un equipo de fotodocumentación digital (Kodak DS DC120).

Tabla 1. Oligonucleótidos específicos utilizados para la amplificación de los cDNAs de PG.

Amplicón Iniciador Forward Iniciador Reverso Tamaño

MiPG1 TGGAGCTAAAGGTGATGG CTGATTCCATGGCCTGGTC 400 MiPG2 TGGAACAGGTGATGACTG CAATCTACAGCCGGGTAAGA 500

MiPG3 AGATGGCCCAATCAATGG CTGATTCCATGGCCTGGTC 390

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Clonación de los Productos Amplificados

Para obtener la secuencia nucleotídica de los fragmentos amplificados por PCR se clonaron varios amplicones. Para ello, se ligaron los amplicones obtenidos al plásmido pCR2.1 (Invitrogen), utilizando la enzima DNA ligasa T4 y el buffer ligación 2X. Ésta mezcla se incubó a 4°C durante toda la noche. Posteriormente se transformaron células de E. coli TOP 10 con el plásmido que contenía los insertos mediante choque térmico a 42°C por 1 minuto, se agregaron 250 µl de medio SOC y se incubaron por 1h a 37°C con agitación. Enseguida se sembraron en placas de medio LB con ampicilina y se incubaron toda la noche a 37°C. Se llevó a cabo la extracción del DNA plasmídico de las células transformadas (colonias blancas) por el método de lisis alcalina. Las muestras que resultaron positivas se enviaron al laboratorio Genomic Analysis and Technology Core de la Universidad de Arizona (Tucson, AZ. USA) para determinar su secuencia nucleotídica, posteriormente fueron analizadas mediante el algoritmo BlastX , utilizando la base de datos GenBank del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Evaluación y Análisis de la Expresión Génica de los transcritos de PG por PCR Cuantitativa

Para la evaluación de cambios en la expresión génica de los diferentes transcritos de PG de la pulpa del mango durante la maduración, se realizo un análisis de expresión relativa por PCR en tiempo real. Los cDNAs utilizados como templado fueron de los mangos muestreados en los días 1, 4, 7, 10 y 16 de almacenamiento poscosecha (como se describió anteriormente).

32

De cada tiempo muestreado se utilizaron tres mangos diferentes de los cuáles se obtuvieron tres RNA totales y tres cDNAs y de cada uno de ellos se hicieron corridas de PCR por triplicado, todo esto en un termociclador de tiempo real Step-One™ Real-time PCR System (Applied Biosystem).

Para las reacciones de amplificación se utilizó la mezcla comercial iQ™ SYBR® Green Supermix (BIO-RAD) 2X. La mezcla se realizó a un volumen final de 25 µl, aforada con agua, utilizando para ello 12.5 µl de iQ™ SYBR® Green Supermix (BIO-RAD) 2X, 110 ng de templado, 1µl de los oligonucleótidos específicos Fw y 1 µl de los oligonucleótidos específicos Rv, para cada secuencia parcial (5 µM) (ver Tabla 2).

Se estandarizaron las condiciones de corrida para cada par de oligonucleótidos que amplifican cada uno de los cDNAs de PG parciales, corroborando la amplificación de un solo producto en la reacción de PCR. Las condiciones fueron: 95°C por 10 min y 40 cycles de 95°C por 15 s y 60°C por 1 min. La especificidad de los productos de PCR fue confirmada con la construcción de la curva de disociación, después de la amplificación aumentando la temperatura a 95°C por 15 seg, 60°C p or 1 min y 95°C por 15 seg. Se incluyeron además los controles negativos que no contenían templado. Se realizaron pruebas de rango dinámico para cada gen con el fin de evaluar la eficiencia de la amplificación para cada uno de los pares de oligonucleotidos utilizados. Se utilizó el valor de Ct (cycle threshold) para llevar a cabo el análisis de la expresión génica. Dicho parámetro es un valor numérico que indica el ciclo en el cual la fluorescencia generada cruza un punto umbral o punto de cruce que indica el producto amplificado generado durante la primera fase exponencial de la reacción (Nolan et al., 2006). La normalización de los datos se realizó mediante la expresión del gen constitutivo de la enzimas gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

33

La expresión relativa de los genes parciales de PG durante el almacenamiento poscosecha de los mangos se analizó mediante el método de 2--∆∆Ct de acuerdo a la fórmula:

2-∆∆Ct = (Ct gen de interés – Ct gen GAPDH)Tiempo x – (Ct gen de interés – Ct gen GAPDH)Tiempo 0

Dicha fórmula considera el cambio en la expresión génica realizando una comparación con los niveles de expresión génica en el día de madurez menos avanzado (día 1) (Livak y Schmittgen, 2001). En donde el tiempo 0 es el tiempo de referencia (Día 1) y el tiempo X son los días de almacenamiento post-cosecha de los mangos en éste estudio.

Tabla 2. Oligonucleótidos diseñados para la evaluación de la expresión génica de PG

Gen parcial Iniciador Fw Iniciador Rv

MiPG1 GGCACCATCAATGGCAATGGCAAA AACCTCAAGCTTGCCACTCTCAGAT

MiPG2 AATCGTATCACATGTGGGCCAGGT TCTTGGCAAACCCAGATCTTCCCT

MiPG3 ATGCTCCAACGGCTGTTACTTTCC AGGCGCTATCACTTTGAGTTGGGA

GAPDH GTGGCTGTTAACGATCCCTT GTGACTGGCTTCTCATCGAA

Análisis estadísticos

Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). La comparación de medias se llevó a cabo mediante la prueba de Tukey para los resultados de los parámetros fisiológicos y la prueba de Fisher para los resultados de expresión génica de PG, todo esto a un nivel de significancia del 95%. El análisis estadístico de los datos se llevo a cabo con el paquete estadístico NCSS 2007.

34

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de los Parámetros Fisiológicos de Los Frutos de Mango Durante su Maduración

Producción de CO2 y Etileno

Según la tasa de respiración observada (Fig. 2), los mangos presentaron un comportamiento típico de un fruto climatérico, alcanzando su punto máximo al día 13 de almacenamiento, con un valor de 62.29 ml CO2/Kg*h. El análisis estadístico mostro diferencias significativas a partir del día 7 y hasta el día 16, respecto al día 1 (P<0.05). No se registraron diferencias en la respiración de los mangos almacenados durante los días 7, 10, 13 y 16 a 20°C ( P>0.05). Por otra parte, los mangos del día 4 presentaron diferencias en respiración únicamente con los mangos con 13 días de almacenamiento (P<0.05).

En otro estudio realizado también con mango cv. "Kent", se reporta el pico climatérico a los 12 días de almacenamiento con una producción de 59.54 ml CO2/Kg*h (Pacheco-Sánchez, 2011), resultando ser esos datos muy similares a los encontrados en este estudio.

35

Días de almacenamiento post-cosecha

1 4 7 10 13 16

ml C

O2/

Kg*h

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

Figura 2. Producción de CO2 de los frutos de mango variedad "Kent", cosechados en su etapa de madurez fisiológica, y almacenados a 20°C durante 16 días, a una HR de 60-65%. Los valores representan las medias ± error estándar de cinco repeticiones. Los asteriscos indican diferencias estadísticas significativas (P<0.05).

La producción de etileno también mostró un incremento gradual durante los días de la maduración, alcanzando su valor máximo (0.0019 µl C2H4/Kg*h) el día 7 de almacenamiento (Fig. 3) y únicamente se encontraron diferencias significativas entre los días 1 y 7 de almacenamiento (P<0.05). Se logró detectar un incremento del 42.10% en la producción de la hormona de maduración, lo cual es típico de un fruto climatérico como el mango.

La cantidad de etileno que se produce durante el proceso de maduración en frutos de mango es muy baja, sin embargo, se sabe que éste es activo en concentraciones menores a 0.1 µl/L. En un estudio con frutos de mango cv. "Tommy Atkins", la mayor producción de etileno fue de 0.026 µl/Kg*h y se presentó al día 6 de almacenamiento (Pérez et al., 2004). Por otra parte, en mangos cv. "Kensington Pride" se presentó una producción máxima de 0.0029

* * *

*

36

µl/Kg*h al día 5 de almacenamiento (Zaharah y Singh, 2011). Éstos resultados muestran concentraciones de producción de etileno mayores a las reportadas para los mangos de la presente investigación. Esto se puede deber principalmente a las variedades de mango, ya que cada una de ellas, a pesar de tratarse del mismo fruto, puede presentar comportamientos fisiológicos distintos.


1 4 7 10 13 16

µL

C 2H

4/Kg

*h

0.0000

0.0004

0.0008

0.0012

0.0016

0.0020

0.0024

Figura 3. Producción de etileno de los frutos de mango variedad "Kent", cosechados en su etapa de madurez fisiológica, y almacenados a 20°C durante 16 días, a una HR de 60-65%. Los valores representan las medias ± error estándar de cinco repeticiones. Los asteriscos indican diferencias estadísticas significativas (P<0.05).

Pérdida de Firmeza

El parámetro de pérdida de firmeza de los mangos se representa gráficamente en la Fig. 4. Se puede observar que en los mangos que corresponden a los días 1 y 4 de almacenamiento, no se presentan diferencias

*

37

significativas (P> 0.05). Sin embargo, para el día 7, la firmeza de los mangos disminuye en un 29.52%, y para el día 10, la firmeza de los frutos se reduce de manera drástica en un 90.06% (P< 0.05). De acuerdo al análisis estadístico realizado, la firmeza de los mangos del día 1 y 4 es diferente a la firmeza de los mangos del resto de los días medidos, pero iguales entre sí. De igual manera, la firmeza de los mangos de los días 10, 13 y 16 no presentó diferencias estadísticas, pero es diferente a la firmeza de los mangos de los días 1 y 4. Además, la firmeza de los mangos correspondientes al día 7 de almacenamiento es diferente estadísticamente a la firmeza de todos los demás mangos (P<0.05).

Se ha observado que la pérdida de firmeza en frutos climatéricos es muy variable y depende de varios factores. Los niveles de carbohidratos estructurales y no estructurales, así como la cantidad y el tipo de enzimas que modifican la pared celular son dos de los principales factores que afectan este parámetro (Ali et al., 2004). Los frutos de mango cv. "Kent" son uno de los principales cultivares a nivel de comercialización, sin embargo, su ablandamiento es muy rápido lo que los hace perecederos (Petit-Jiménez et al., 2004). Es éste uno de los motivos más importantes para identificar a las enzimas relacionadas con su ablandamiento a un nivel molecular para en un futuro poder mejorar éste parámetro de calidad.

Se han reportado resultados similares a los de éste estudio sobre la pérdida de firmeza en frutos de mango de diferentes variedades. En mangos variedad "Harumanis" se observó que durante los primeros 4.5 días de almacenamiento, hubo una perdida en la firmeza de los frutos del 50% (Ali et al., 2004). Para el caso de mango cv. Ataulfo se ha encontrado una marcada disminución de la firmeza (75%) durante los primeros seis días de almacenamiento, que van desde los 200 N hasta 50 N (Muy-Rangel et al.,

38

2009). De igual manera, en mangos cv. "Tommy Atkins" se observó una caída en la firmeza de 156 N a 32 N, del día 0 al día 6 de almacenamiento, respectivamente (Contreras-Martínez et al., 2007).

Días de almacenamiento post-cosecha1 4 7 10 13 16

Firm

eza

(N)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Figura 4. Pérdida de firmeza de los frutos de mango variedad "Kent", cosechados en su etapa de madurez fisiológica, y almacenados a 20°C durante 16 días, a una HR de 60-65%. Los valores representan las medias ± error estándar de cinco repeticiones. Los asteriscos indican diferencias estadísticas significativas (P<0.05).

Cambios en el Color

Los cambios en el color de los frutos de mango se presentan mediante el parámetro del ángulo Hue, en la Fig. 5. Durante los días 1, 4 y 7 de almacenamiento no hubo diferencias significativas en el color de los mangos. Para el día 10, se presentó una disminución en el ángulo Hue de los mangos y se mantuvo constante durante los siguientes días, encontrándose así,

*

** ** **

39

diferencias en el color de los mangos de los días 1, 4 y 7 con respecto a mangos de los días 10, 13 y 16. Si se ubican dichos resultados en la esfera de color (Fig. 6) se observa una tendencia de los tonos amarillos hacia los naranja.

Al igual que en la presente investigación, existen reportes que indican que durante la maduración del mango, el ángulo Hue disminuye. En mangos cv. "Tommy Atkins" se reporta una disminución de 85.6 a 70.9 durante 21 días de almacenamiento (Filgueiras et al., 2003). En mangos cv. "Kent" también se tienen reportes de éste parámetro que van de 86.1 a 83.2, durante 20 días de almacenamiento (Osuna-García et al., 2005). Resultando estos datos muy similares a los del presente estudio.

Los cambios en la coloración del mango se encuentran asociados a la acumulación de carotenoides durante su proceso de maduración, en su mayoría a β-carotenos. Dichos resultados se han observado en otras variedades de mango como cv. Ataulfo y cv. Manila. Éstos compuestos confieren al fruto una coloración, la cual es el color característico de los frutos de mango cv. Kent en sus últimos estados de madurez (Vásquez-Caicedo et al., 2006; Ornelas-Paz et al., 2008).

Días de almacenamiento post-cosecha1 4 7 10 13 16

Áng

ulo

Hue

56

60

64

68

72

76

80

84

88

92

* * *

40

Figura 5. Cambios en el color de los frutos de mango variedad "Kent", cosechados en su etapa de madurez fisiológica, y almacenados a 20°C durante 16 días, a una HR de 60-65%. Los valores representan las medias ± error estándar de cinco repeticiones. Los asteriscos indican diferencias estadísticas significativas (P<0.05).

Figura 6. Esfera del color (Minolta, 2003)

Amplificación y Clonación de cDNAs PG

Extracción del RNA Total y Evaluación de su Integridad

El análisis electroforético del RNA total que se obtuvo del mesocarpio de mango (Fig. 7), confirma su integridad, ya que se pueden apreciar las bandas de las subunidades del RNA ribosomal (rRNA). Según Fleige (2006), la banda

41

del rRNA más grande, correspondiente a la subunidad 28S, debe ser más intensa que la del rRNA pequeño (subunidad 18S), aproximadamente al doble de intensidad (Fleige y Pfaffl, 2006). Ésta condición también se cumple para el RNA total que se obtuvo, tal como se observa en la Fig. 7. Por otra parte, las relaciones de absorbancia 260/280 nm y 260/230 nm presentaron un promedio de 2.0 para todas las muestras, indicando con ello la buena calidad del RNA obtenido.

En el gel únicamente se aprecian las bandas del rRNA, sin embargo, puede contener pequeñas cantidades de DNA genómico residual que es necesario eliminar para que éstos no interfieran en el proceso de clonación, es por ello que fue necesario un tratamiento de los RNA con DNasaI.

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en condiciones desnaturalizantes del RNA total extraído del mesocarpio del mango.

Eliminación del DNA Genómico

La Fig. 8 muestra que después del tratamiento con DNasa I, el DNA genómico fue eliminado y que el RNA total aún se encontraba íntegro. En la figura se aprecian las bandas del RNA ribosomal, y las absorbancias 260/280 nm y 260/230 nm siguieron presentando un promedio de 2.0, demostrando con

rRNA, 28S rRNA, 18S

42

MM (+) 1 2 3 4

500 pb

ello la integridad del RNA. Para comprobar que el RNA se encontraba libre de DNA genómico se realizó una reacción de PCR utilizando como templado los RNA tratados con DNasa I y como control positivo DNA genómico. Para el control se utilizaron iniciadores que amplifican un fragmento interno de una enzima de la ruta de los flavonoides, 4-coumaroil-CoA liasa (4CL) que ya han sido probados en mesocarpio de mango y amplifican un fragmento de ~530 pb (Fig.9).

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en condiciones desnaturalizantes del RNA total de mesocarpio de mango tratado con DNasa I.

Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, de las reacciones de PCR utilizando como molde los RNA libres de DNA genómico. Carriles 1-4: Muestras de RNA tratados con DNasa I. MM: Marcador de peso molecular. Carril +, control positivo utilizando DNA genómico como molde.

rRNA, 28s rRNA, 18s

43

200 pb

MM 1 2 3 4

Síntesis del DNA Complementario (cDNA)

En la Fig. 10 se muestra la amplificación de un fragmento del cDNA GAPDH, usando como molde los cDNA sintetizados del mesocarpio de mango. Se utilizaron los iniciadores para amplificar una región de 180 pb. Se pueden apreciar las bandas del tamaño correspondiente, comprobando con ello que los cDNA se sintetizaron correctamente y que estaban en condiciones para clonar los cDNAs que codifican para la poligalacturonasa.

Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1%. Productos de la amplificación por PCR de una fragmento de 180 pb de GAPDH a partir de los cDNA sintetizados del mesocarpio de mango. MM: Marcador de peso molecular.

Amplificación de Fragmentos de los cDNA de PG

En la Fig. 11 se muestra el análisis en gel de agarosa al 1% de los fragmentos de cDNA de PG amplificados.

44

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los fragmentos de cDNA de PG amplificados. MM: Marcador de peso molecular; Carril 1: MiPG1; Carril 2: MiPG2; Carril 3: MiPG3.

En los carriles 2 y 3 se observa la amplificación de más de una banda. Sin embargo, de acuerdo al análisis realizado de las secuencias nucleotídicas obtenidas posteriormente, sólo las bandas más abundantes corresponden a fragmentos de cDNA de PG.

Los tamaños mostrados en la tabla anterior, corresponden al tamaño del amplicón observado en el gel y al esperado según los pares de iniciadores utilizados para cada uno de ellos. Sin embargo, no corresponden al tamaño final de las secuencias nucleotídicas analizadas. Las razones principales de la diferencia en tamaños se debe a que durante el análisis de éstas, se eliminaron parte de los nucleótidos de los extremos, según lo sugería el análisis BlastX del National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). La razón es que éste análisis compara las secuencias nucleotídicas problema con secuencias de PGs de otros frutos y pueden existir muchas variaciones entre los tamaños de cada uno de ellas.

650 pb 500 pb 300 pb

45

Además, el análisis solo compara las regiones que son muy conservadas entre ambas secuencias, a nivel de aminoácidos y elimina las regiones que no son muy parecidas.

Clonación y Secuenciación de los cDNAs de PG

En la Fig. 12 se observa una placa de medio LB con ampicilina, donde se sembraron células de E. coli TOP 10 transformadas con el plásmido pCR2.1 al que se le ligó uno de los insertos obtenidos con los iniciadores para las diferentes PGs. Se pueden apreciar colonias blancas y azules, donde las primeras son las que contenían el inserto de interés, es decir, eran colonias recombinantes. Una vez analizadas las clonas y confirmada la presencia del inserto esperado, se determinaron sus secuencias nucleotídicas y posteriormente se hizo su traducción a aminoácidos según la tabla del código genético, como se indica en las figuras 13 a la 15.

Figura 12. Placa de medio LB con ampicilina, cultivada con células transformadas con uno de los insertos de PG de interés.

46

Figura 13. Secuencia nucleotídica parcial MiPG1 de cDNA de mesocarpio de mango (Mangifera indica L.) variedad "Kent" y secuencia aminoacídica deducida.

47


48


Después de analizar las secuencias nucleotídicas mediante un BlastX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), se encontró que (MiPG1 y MiPG2) eran muy similares a una secuencia de (GenBank: ACV85696.1), presentando un 53%, respectivamente. La clona identidad con una secuencia de Fig. 16 se puede apreciar gráficamente dónde se encuentran localizadas las secuencias aminoacídicas parciales de PG de mango cv. "Kent", ubicadas dentro de las secuencias aminoacídicas de las PG de otros frutos a las cuales son similares.

Figura 16. Ubicación y tamaño de las secuencias aminoacídicas deducidas de las clonas parciales de cDNA de secuencias aminoacídGenBank.

Después de analizar las secuencias nucleotídicas mediante un BlastX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), se encontró que dos de los clones parciales

) eran muy similares a una secuencia de (GenBank: ACV85696.1), presentando un porcentaje de identidad del 56% y53%, respectivamente. La clona MiPG3, por su parte, presentó un 74% de identidad con una secuencia de PG de naranja (GenBank: ABM67700.1). En la

se puede apreciar gráficamente dónde se encuentran localizadas las cuencias aminoacídicas parciales de PG de mango cv. "Kent", ubicadas

dentro de las secuencias aminoacídicas de las PG de otros frutos a las cuales

Ubicación y tamaño de las secuencias aminoacídicas deducidas de iales de cDNA de MiPG1, MiPG2 y MiPG3

secuencias aminoacídicas de PG papaya y naranja, depositadas en el

49

Después de analizar las secuencias nucleotídicas mediante un BlastX de los clones parciales

) eran muy similares a una secuencia de PG de papaya porcentaje de identidad del 56% y

, por su parte, presentó un 74% de aranja (GenBank: ABM67700.1). En la

se puede apreciar gráficamente dónde se encuentran localizadas las cuencias aminoacídicas parciales de PG de mango cv. "Kent", ubicadas

dentro de las secuencias aminoacídicas de las PG de otros frutos a las cuales

Ubicación y tamaño de las secuencias aminoacídicas deducidas de MiPG1, MiPG2 y MiPG3, localizadas en las

, depositadas en el

50

En las secuencias aminoacídicas deducidas de PG de mango se lograron identificar los cuatro diferentes motivos funcionales (I, II, III y IV), dentro de la estructura secundaria de las poligalacturonasas parciales obtenidas en esta investigación. Las PGs parciales de mango se alinearon con la PG de papaya y naranja, que son con las que presentan mayor similitud. Los dominios I, II y IV son secuencias aminoacídicas altamente conservadas entre las PGs y el III es el más variable, como se muestra en la Fig. 17.

I II III

IV

51

Figura 17. Alineamiento de las tres secuencias aminoacídicas parciales de PG encontradas en el mango variedad "Kent" con las secuencias aminoacídicas de las PG a las que fueron similares (papaya y naranja). Se sombrea en color negro las secuencias consenso (aminoácidos que son idénticos o conservados). En gris los reemplazos conservados (aminoácidos del mismo tipo químico) y se señalan en recuadros los motivos funcionales (I, II, III y IV) de la familia de las poligalacturonasas.

Según estudios realizados, el número de copias de genes PG en plantas es muy elevado, así como de las diferentes isoformas de la enzima (Hadfield y Bennett, 1998; Prasanna et al., 2006; Park et al., 2008; Park et al., 2010). En un estudio con plantas de arroz (Oryzaba sativa subsp. indica) y Arabidopsis se encontró que en sus genomas se localizan 59 y 66 secuencias nucleotídicas diferentes que codifican para PG, respectivamente (Kim et al., 2006). Presentando con ello evidencia que el número de genes PG en el genoma de cualquier planta o fruto, puede ser alto.

Se sabe que la función de las PGs en plantas o frutos es muy variada, ya que participa en varios procesos, como la polinización, germinación de semillas, maduración de polen, formación de xilema, respuestas de defensa y la maduración de frutos (Hadfield y Bennett, 1998). Es por ello que los genes PG abundan en el genoma de estos organismos. También se tiene evidencia de que las PGs asociadas a la maduración en frutos se encuentran en una o más copias. Se han reportado para frutos de melón (Cucumis melo) tres diferentes genes PG que participan en la degradación de pectinas durante la maduración del fruto (MPG1, MPG2, MPG3) (Hadfield et al., 1998). En frutos de Kiwi (Actinidia chinensis) también se han encontrado tres diferentes genes PG relacionados con el ablandamiento del fruto en diferentes etapas de su maduración (CkPGA, CkPGB, CkPGC) (Wang et al., 2000). Por su parte, en frutos de plátano (Musa acuminata) se han reportado cuatro diferentes cDNAs

52

de PGs (MaPG1, MaPG2, MaPG y MaPG4) en la piel del fruto, asociadas a su maduración. Y en frutos de papaya existe evidencia de al menos dos PGs que participan en la maduración del fruto (do Nascimento et al., 2009).

Por todo lo anterior, se puede inferir que los resultados obtenidos en la presente investigación, se deben a que los genes que codifican para poligalacturonasas pueden ser muy abundantes en los frutos de mango cv. "Kent", al igual que en los otros frutos reportados. Sin embargo, el número total se podrá inferir hasta que se obtenga la secuencia completa del genoma de mango.

Evaluación y Análisis de la Expresión Génica de PG por PCR Cuantitativa

La expresión relativa correspondiente a MiPG1, MiPG2 y MiPG3, evaluadas durante el proceso de maduración del mango cv. "Kent" se muestran en las figuras 18, 19 y 20, respectivamente.

53


1 2 3 4 5

Expr

esió

n re

lativ

a M

iPG

1/G

APD

H

05

1015202530354045

400050006000700080009000

1000011000

Figura 18. Expresión relativa del gen que codifica para MiPG1, durante el proceso de maduración en mangos variedad "Kent". Se presenta la media ± error estándar de tres muestras, con tres repeticiones cada una (n=9). Asterisco indica diferencias obtenidas por la prueba de Fisher (p<0.05). Los datos fueron evaluados según la fórmula descrita por Livak (2001).

1 4 7 10 16

a

*

54


1 2 3 4 5

Expr

esió

n re

lativ

a M

iPG

2/G

APD

H

0

15

30

45

60

75

90

105

120

135

150


1 4 7 10 16

*

55

Días de almacenamiento poscosecha

1 2 3 4 5

Expr

esió

n re

lativ

a M

iPG

3/G

APD

H

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12


1 4 7 10 16

*

56

Según los análisis estadísticos realizados con los datos obtenidos, se aceptó la normalidad de éstos y por lo tanto, fue posible realizar el análisis de varianza (ANOVA) por el método paramétrico. Como se muestra en las figuras 18-20, el máximo nivel de expresión para MiPG1 se observó al día 16 de almacenamiento poscosecha, mientras que para MiPG2 y MiPG3 fue al día 10. Se presentaron diferencias significativas de los días de mayor expresión de MiPG1 y MiPG2 en el mesocarpio del mango con respecto a los días 1, 4 y 7 de almacenamiento poscosecha de los frutos (P<0.05). Por su parte, el día de mayor expresión de MiPG3, fue diferente a los días 1 y 4.

Los niveles máximos de expresión entre los genes evaluados fueron muy variables pues para el gen MiPG1 el valor máximo fue hasta 6382 veces mayor que en el día 1; mientras que en el caso de MiPG2 el incremento máximo fue de 118 veces mayor. Los niveles más bajos se observaron en MiPG3, con niveles de expresión de 10. En base a dichos valores, se observa que la expresión relativa de los tres genes evaluados es muy diferente.

En los mangos del día 1 de almacenamiento post-cosecha, los tres genes presentan expresión relativa de 1, ya que éste fue considerado como el valor control o inicial. Sin embargo, en los mangos del día 4, la expresión relativa de MiPG1 fue 4 veces mayor a la de MiPG3, pero a su vez fue 1.6 veces menor que la de MiPG2. Por su parte, la expresión relativa de MiPG2 fue 7 veces mayor a la expresión de MiPG3 en los mangos del día 4.

En los mangos del día 7, la expresión relativa de MiPG1 no presentó cambios en su expresión comparada con la de los mangos del día 4 (P>0.05); sin embargo, su expresión fue 3.4 veces mayor que la expresión relativa de MiPG3, en mangos del día 7. Mientras que con respecto a MiPG2, la expresión

57

de MiPG1 fue 5 veces menor. Y la diferencia entre los niveles de expresión de MiPG2 y MiPG3 fue de 17.4 veces mayor en MiPG2.

En los mangos del día 10 de almacenamiento post-cosecha, se observa un aumento drástico y estadísticamente significativo en la expresión relativa de los tres genes, donde MiPG1 presentó el mayor incremento que resultó ser 33 y 403 veces mayor que los niveles de MiPG2 y MiPG3, respectivamente. Por su parte MiPG2 incrementó sus niveles de expresión 12 veces más que los de MiPG3.

Por último, en los mangos del día 16, MiPG1 siguió presentando los más altos niveles de expresión relativa, presentando incrementos con respecto a MiPG2 y MiPG3 de 86 y 1370 veces, respectivamente. Mientras que la expresión relativa de MiPG2 fue a su vez, 16 veces mayor con respecto a la de MiPG3.

La expresión de los genes de PG ha sido ampliamente estudiada en otros frutos. Además se ha observado que dichos genes de PG, asociados a la maduración de frutos, en muchas ocasiones son inducidos por la producción de etileno endógeno y/o la aplicación de etileno exógeno, tal como se observó en la expresión de MiPG1, MiPG2 y MiPG3, quienes presentaron su mayor incremento después de la máxima producción de etileno (día 7), lo cual es evidencia de que puede tratarse de PGs dependientes de etileno y/o asociadas a maduración. Tal como se ha observado en otros frutos como la papaya, donde se evaluó la expresión de cpPG y se encontró que la acumulación de los transcritos de PG fue mayor al día 4 de almacenamiento post-cosecha, siendo éstos resultados paralelos a la actividad de la enzima y coincidente con el climaterio del fruto. Además se encontró que éste gen era dependiente de

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etileno (do Nascimento et al., 2009). Resultando estos datos, muy similares a los encontrados en el presente estudio.

El análisis de la expresión relativa de los tres genes encontrados en ésta investigación, indica que ésta es diferencial durante el proceso de maduración de los frutos de mango cv. "Kent". Al igual que en la evaluación de expresión génica de PGs en otros frutos, como es el caso de tres diferentes variedades de fresa ("Camarosa", "Selva" y "Toyonaka"), donde se evaluó la expresión de dos diferentes genes de PG (FaPG1 y T-PG), y se encontró que la expresión de los genes inició en diferentes estados de madurez. En este estudio se presentó la mayor expresión de los genes en las primeras etapas de maduración para la variedad "Toyonaka", con mayor expresión de FaPG1; mientras que en el cultivar "Selva" se presentó al 50% de maduración de fruto y en el cultivar "Camarosa" fue en las etapas finales de maduración; con mayor expresión de T-PG en ambos casos (Villarreal et al., 2008).

Un estudio realizado con frutos de manzana con dos diferentes

variedades, de las cuales una era de rápido ablandamiento ("McIntosh") y la

otra era un cultivar que no presenta ablandamiento durante su maduración ("Honeyscript"), mostraron diferentes niveles en la expresión de MdPG1, observándose la mayor expresión del gen para la variedad "McIntosh" al día 7 después del corte, mientras que en la variedad "Honeyscript" no se detectó expresión del gen (Harb et al., 2012).

La expresión diferencial de genes de PG también ha sido observada en frutos como el plátano, donde ha sido evaluada en cuatro PGs asociadas a maduración (MaPG1, MaPG2, MaPG3, MaPG4), en el tejido de la cáscara del fruto. Donde se observaron sus expresiones máximas a los días 4, 2, 7 y 7 post-cosecha, respectivamente. Presentando los más altos niveles de expresión el

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gen MaPG4 (valores de aproximadamente 2300, 2-∆∆Ct) y los más bajos en MaPG3 (valores de aproximadamente 1.3, 2-∆∆Ct) (Mbéguié-A-Mbéguié et al., 2009).

Aunado a la expresión diferencial observada en los genes de PG, así como a su relación con la hormona etileno y al climaterio del fruto; también se ha observado una relación directa entre la pérdida de firmeza del fruto y la expresión de PG. En frutos como pera se ha demostrado que la acumulación de los transcritos de RNA mensajero de los genes de PG coinciden con el máximo ablandamiento del fruto (Hiwasa et al., 2003). De igual manera, en frutos de durazno, donde se evaluó la expresión de PaPG, en tres diferentes variedades ("Goldrich", "Currot" y "Canino"), se observó una máxima expresión del gen cuando la producción de etileno aumento y la firmeza disminuyó significativamente (Badenesa et al., 2011). Dichos resultados son consistentes a los encontrados en el presente trabajo, ya que los máximos niveles de expresión de los tres genes de PG, se presentan de igual manera asociados a una disminución significativa de firmeza en los frutos de mango cv. "Kent".

La relación que tienen los datos de expresión encontrados y analizados en el presente estudio con los parámetros fisiológicos del mango variedad "Kent", durante su proceso de maduración, muestran evidencia del rol que tienen los genes de PG asociados a dicho proceso, específicamente en el ablandamiento del fruto. Demostrando también con ello la importancia que tienen éstos genes en el proceso de maduración de los frutos.

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CONCLUSIONES

Los mangos cv. "Kent" mostraron un comportamiento típico de un fruto climatérico, donde la máxima producción de CO2 fue precedida por la máxima producción de etileno. A su vez, una significativa pérdida de firmeza fue consistente con la máxima producción de la hormona y la disminución significativa del parámetro de color (ángulo Hue).

La tres secuencias parciales encontradas de PG: MiPG1, MiPG2 y MiPG3, mostraron diferencias a nivel de nucleótidos y en su secuencia aminoacídica y a su vez fueron similares a otras PG asociadas a la maduración de frutos, como la PG3 de papaya y una PG de naranja. Además, fue posible localizar en las secuencias aminoacídicas de MiPG1, MiPG2 y MiPG3 los cuatro motivos funcionales correspondientes a la familia de las poligalacturonasas, mostrando con ello evidencia que se trata de genes de PG.

Por su parte, la expresión de los tres genes parciales de PG encontrados, mostraron una expresión diferencial a través del proceso de

maduración de los frutos de mango cv. "Kent". Así mismo, los máximos niveles de expresión coincidieron con la máxima producción de etileno y una pérdida de firmeza significativa del fruto. Estos resultados sugieren que hemos descubierto a tres genes PG asociados al proceso de maduración de los frutos de mango variedad "Kent" y además confirman el rol y la importancia que tienen los genes de PG durante el proceso de maduración del fruto.

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PERSPECTIVAS

Para tener un panorama más claro sobre las poligalacturonasas y su función en el proceso de maduración del mango, se planea clonar la secuencia completa de al menos uno de los cDNAs encontrados en la presente investigación. De esa manera, se podrá conocer y analizar la estructura completa del gen y se podrá a su vez utilizar para comparar con los resultados de otros estudios como el Southern blot para conocer el número total de genes de PG en el genoma del mango cv. "Kent".

La clonación, secuenciación y evaluación de la expresión de otros genes asociados a la maduración en frutos, como PME, β-galactosidasa, expansinas, etc., también se proponen como una alternativa para elucidar más ampliamente el proceso de maduración del mango cv. "Kent".

A su vez, se propone relacionar la expresión de los genes asociados a maduración con sus actividades enzimáticas, así como a los cambios fisiológicos que se presentan en la pared celular de los frutos durante la maduración.

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