tesis

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SANTIAGO DEL ESTERO FACULTAD DE AGRONOMIA Y AGROINDUSTRIAS

RReeaaccttiivviiddaadd qquuíímmiiccaa ddee ffllaavvaannoonnaass

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TESIS DOCTORADO REGIONAL DE CIENCIA

Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

EVANGELINA A. GONZALEZ

Diciembre 2005. Santiago del Estero. Argentina

Este trabajo fue realizado en el Instituto de Ciencias Químicas de la Facultad de Agronomía y Agroindustrias de la Universidad Nacional de Santiago del Estero y se presenta para optar por el grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Director: Dr. Claudio D. Borsarelli (Universidad Nacional de Santiago del Estero) Co-Director Dra. Mónica A. Nazareno (Universidad Nacional de Santiago del Estero) Comisión de Supervisión de Tesis Dra. Carmen Viturro (Universidad Nacional de Jujuy) Dr. Maria Inés Isla (Universidad Nacional de Tucumán) Dr. Ferdinando Ferretti (Universidad Nacional de San Luis) Dr. Jorge Avanza (Universidad Nacional del Nordeste)

“El trabajo ayuda siempre, puesto que trabajar no es realizar lo que uno imaginaba, sino descubrir

lo que uno tiene dentro”

Boris Leonidovich Pasternak 1890-1960

AA mmii mmaaddrree

AA AAgguussttiinnaa,, GGaassttóónn yy AArriieell

AAggrraaddeecciimmiieennttooss

A todos los que de una manera u otra realizaron un aporte a este trabajo de tesis, gracias por haberme alentado, escuchado, ayudado.

- A Ariel, Agu y Gastón, por ser la alegría y el motor de mi vida. - A mi madre y mis hermanas por el amor y el apoyo que siempre me brindan. - A Juana, Héctor, Nora, Diego, Fede y Edgar que me hicieron un lugar en su casa cuando necesite un lugar tranquilo para trabajar. - Al Dr. Claudio Borsarelli por la dedicación brindada a mi formación científica. - A la Dra. Mónica Nazareno por haberme alentado y apoyado constantemente… en todos los ámbitos de la vida, por ser mi amiga por sobre todo y por su mayor logro: ¡ que me guste la Química Orgánica!! - A la Dra. Beatriz López de Mishima por su total predisposición y colaboración con esta etapa de mi vida. - A la Dra. Maria Inés Sánchez de Pinto y el Bqco Roberto Umbides, mi “equipo cátedra” por su comprensión y apoyo constante todas las veces que lo necesite. - A mis compañeros del Instituto de Ciencias Químicas y el Departamento de Ciencias Básicas de la Facultad de Agronomía y Agroindustrias: Gisela, Mariana, Verónica, Titina, Lucrecia, Valeria, Fernanda, Karina , Héctor, Manuel y Eduardo gracias por su amistad, paciencia y apoyo constante. - A la Ing. Judith Ochoa por su asesoramiento en el área de la industria citrícola. - Al Dr Paulo Bobbio por habernos cedido su Naringina Dihidrochalcona. - Al Dr Héctor Ferretti y la Dra. Sonia Blanco dos profesionales excelentes pero por sobre todo dos personas maravillosas, siempre dispuestos y amables. - A la Dra Carmen Viturro, por sus continuas palabras de aliento. - A los integrantes de la Comisión de Supervisión de este trabajo, Dra. Carmen Viturro, Dra. Maria Inés Isla, Dr. Hector Ferretti, Dr Jorge Avanza, por los aportes y el tiempo dedicado a la revisión de este trabajo. - A la Facultad de Agronomía y Agroindustrias, a la Universidad Nacional de Santiago del Estero y al CICyT por el apoyo financiero e institucional.

¡¡Gracias!! Evangelina

AA...........................................................................................................Ácido Ascórbico AAO...............................................................................................Actividad Antioxidante AAPH......................................................Hidrocloruro de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) AAR........................................................................................... Actividad Antiradicalaria AH. ........................................................................................................Radical Ascorbilo

AH-………………...…………………………………………………………….. Ion Ascorbato AO.................................................................................................................Antioxidante BiF...............................................................................................................Biflavonoides CAA................................................................................... Codigo Alimentario Argentino CEE…………………………………………….Efecto de Compensación Entalpía-Entropía Ch………………………………………………………………………………………Chalcona CoAO....................................................................................................... Coantioxidante DA …………………………………………………………………………...Dehidroascorbato DHA.............................................................................................Acido Dehidroascórbico DhCh...................................................................................................... Dihidrochalcona DPPH........................................................................................ 2,2-Difenil Picril Hidrazilo EE………………………………………………………………………….Estado estacionario F.....................................................................................................................Flavonoides Fl………………………………………………………………………………… …..Flavanona FlO.…..……………………………………………………………………......Radical Fenoxilo H……………………………………………………………………………………..Hesperidina HCh……………………………………………………………………..Hesperidina Chalcona HPLC..............................................................Cromatografía Líquida de Alta Resolución LOX.................................................................................................Enzima Lipoxigenasa N........................................................................................................................Naringina NaOAc...................................................................................................Acetato de Sodio NCh...……………………………………………………………………...Naringina Chalcona NDhCh…………...……………………………………………......Naringina Dihidrochalcona NH............................................................................................................Neohesperidina NHDhCh....................................................................... Neohesperidina Dihidrochalcona O2(1∆g)……………………………………………………………………… Oxígeno Singulete ORAC……………………………...………...Capacidad de Absorción de Radical Oxígeno REA....................................................................................Relación Estructura-Actividad RNS................................................................................. Especie Reactiva de Nitrógeno ROS...................................................................................Especie Reactiva de Oxígeno T…………............................................................................................…......Temperatura TEAC……………………………………….Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox TLC.............................................................................. Cromatografía en Placa Delgada TOH.............................................................................................. Tocoferol (Vitamina E) Vit. C............................................................................................................... Vitamina C

AAbbrreevviiaattuurraass yy SSíímmbboollooss

INTRODUCCION GENERAL i BIBLIOGRAFIA iv CAPITULO 1. FLAVONOIDES: ASPECTOS GENERALES 1 1.1- Introducción 1 1.2- Propiedades Fisicas 3 1.3- Métodos de Análisis: Espectroscopía UV-Vis de Flavonoides 3 Reactivos de reconocimiento de grupos funcionales 5

Acetato de Sodio (NaOAc) 5 Acetato de Sodio/Ácido Bórico (NaOAc/H3BO3) 5 Cloruro de Aluminio (AlCl3) 5 Cloruro de Aluminio/Acido Clorhídrico (AlCl3/HCl) 5 Metóxido de Sodio (NaOMe) 5

1.4- Biosíntesis 7 1.5- Distribución y Estado Natural 8 1.5.1- Fuentes de Flavonoides 9 1.5.2- Flavonoides en Cítricos 10 1.6- Ingesta de Flavonoides 11 1.6.1- Biodisponibilidad de los Flavonoides 12 1.7- Flavonoides cítricos con aplicaciones industriales 14 1.7.1- Situación de la Industria Citrícola Argentina 15 1.8- Flavonoides cítricos con Aplicaciones Nutracéuticas 16

Actividad antiinflamatoria, antialérgica y analgésica. 18 Efectos sobre enfermedades cardiovasculares 17 Efectos sobre enfermedades coronarias 18 Propiedades anticarcinogénicas 17

BIBLIOGRAFIA 20 CAPITULO 2. EQUILIBRIO DE ISOMERIZACION CHALCONA-FLAVANONA 23 2.1- Introducción 23 2.2- Efecto de los sustituyentes sobre la reacción de ciclización de chalconas 24 2.3- Efecto de los sustituyentes sobre la reacción de apertura de flavanonas 27

nnddiiccee

2.4- Mecanismos de reacción propuestos 28 2.5- Efecto del pH sobre la reacción de isomerización 30 2.6- Conformaciones de las chalconas 30 2.7- Hidrogenación de chalconas: dihidrochalconas 31 BIBLIOGRAFÍA 35 CAPITULO 3. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES DE LOS FLAVONOIDES 37 3.1- Introducción 37 3.2 - Oxidación de lípidos en alimentos 37 3.3- Mecanismo de la oxidación de lípidos 38

Iniciación 38 Propagación 39 Terminación 39

3.4- Factores que inducen estados prooxidantes 40 3.4.1-Oxígeno 40

Anión Superóxido 42 Peróxido de Hidrógeno 42

Radical Hidroxilo 42 3.4.2- Calor 43 3.4.3- Fotosensibilización 43 3.4.3- Lipoxigenasas 44 3.4.4- Metales: Hierro y Cobre 45 3.5- Antioxidantes 46 3.5.1 Clasificación de los antioxidantes 47

AO tipo I 47 AO tipo II 48

3.5.2. Sinergismo entre antioxidantes: co-antioxidantes (CoAO) 49 3.6- Métodos de determinación de la AAO y formas de expresarla 50

Concentración Eficiente (EC50) 51 Parámetro Antioxidante de Captura de Radicales Total (TRAP) 53 Actividad Antioxidante Equivalente de Trolox 53 Capacidad de Absorcion de Radicales Oxigeno 53

3.7- Antioxidantes en alimentos 53 3.7.1- Antioxidantes permitidos por el Código Alimentario Argentino 54 3.8- Antioxidantes naturales 54 3.9- Flavonoides como antioxidantes alimentarios naturales 54 3.9.1- Acción antioxidante in vitro 56 3.9.2- Influencia de la estructura sobre la Actividad AO de Flavonoides 57 3.9.2.1- Relación estructura-actividad de los Flavonoides 57

Grupos Hidroxilos 59 La o- metilación 61 El doble enlace C-2,3 y la función 4-oxo 61

Glicosilación 62 3.10- Interacción Flavonoides y ácido ascórbico 62 3.11- Actividad prooxidante de los Flavonoides 64 3.12- Acción Antioxidante in vivo de Flavonoides 66 BIBLIOGRAFÍA 68 CAPITULO 4. ESTUDIO CINETICO DEL EFECTO DEL SOLVENTE SOBRE EL EQUILIBRIO FLAVANONA-CHALCONA 71 4.1-Introducción 71 4.2- Espectroscopia UV-Vis de flavanonas y chalconas 72 4.3- Efecto del agregado de NaOH sobre los espectros UV-Vis de Naringina y Hesperidina. 74 4.4- Análisis cinético y termodinámico del equilibrio de isomerización flavanona-chalcona 77 4.5- Conclusiones 88 BIBLIOGRAFÍA 89 CAPITULO 5. ESTUDIO DEL EFECTO DE LA LUZ SOBRE EL EQUILIBRIO FLAVANONA-CHALCONA DE NARINGINA 91 5.1-Introducción 91 5.2- Efecto de la luz sobre soluciones ácidas y neutras 92 5.2.1- Soluciones acuosas ácidas 92 5.2.2- Soluciones etanólicas neutras 92 5.2.3- Efecto de la temperatura para las reacciones en medio ácido y neutro 93 5.2.4-.Mecanismo de cierre de NCh Fl en medio ácido y neutro 95 5.3- Efecto de la luz sobre soluciones básicas 96 5.3.1- Soluciones acuosas básicas 96 5.3.2-Soluciones etanólicas básicas 100 5.3.3- Mecanismo de reacción de NCh en medio básico con irradiación 101 5.4-Conclusiones 105 BIBLIOGRAFÍA 107 CAPITULO 6. DETERMINACION DE LAS PROPIEDADES ANTIOXIDANTES DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS 109 6.1- Introducción 109 6.2- Fundamentos de las metodologías 110 6.2.1- Determinación de la capacidad Antirradicalaria por el ensayo de decoloración del radical libre estable 2,2-Difenil-1-Picrilhidracilo. (DPPH•) 110 6.2.2- Determinación de la capacidad Antioxidante por el sistema β-caroteno- ácido linoleico 111 6.3- Resultados y Discusión 112 6.3.1- Determinación de la AAR de flavanonas y sus derivados 112 6.3.2- Determinación de la AAO de flavanonas y sus derivados 115

6.3.3- Comparación de la AAO y AAR de los Flavonoides 118 6.3.4- Determinación de la AAR de combinaciones F-AA por el método de decoloración del DPPH• 118 6.3.5- Determinación de la capacidad antirradicalaria de jugos cítricos naturales. 124 6.4- Conclusiones 126 BIBLIOGRAFIA 128 CAPITULO 7. OBTENCION DE DIHIDROCHALCONA DE NARINGINA 129 7.1- Introducción 129 7.2- Obtención de Dihidrochalcona de Naringina por hidrogenación catalítica 133 7.3- Reacción de obtención de NDhCh por hidrogenación catalítica 133 BIBLIOGRAFIA 136

CAPITULO 8. MATERIALES Y METODOS 137 MATERIALES Y METODOS 137 8.1.- REACTIVOS Y SOLVENTES 137 8.1.1- Flavonoides 137 8.1.1.1.- Obtención de Chalcona de Naringina (NCh) 137 8.1.2- Reactivos de uso general 138 8.1.3-Reactivos específicos 138 8.2- METODOLOGIA e INSTRUMENTAL 138 8.2.1- Equipamiento utilizado 138 8.2.2-METODOLOGIAS 139 CAPITULO 4: Efecto de la composición del solvente sobre el equilibrio flavanona-chalcona de Naringina 139 CAPITULO 5: Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Flavanona- Chalcona de Naringina 140 CAPITULO 6. Determinación de las propiedades AO de los Flavonoides 140

Determinación de la AAR de Flavonoides 140 Determinación de la AAO por el método del β-caroteno 140 Determinación de la AAR de combinaciones de AA con Flavonoides 141 Determinación de la AAR de jugos cítricos naturales 142

CAPITULO 7. Obtención de Dinidrochalcona de Naringina (NDhCh) 142 BIBLIOGRAFÍA 143 CAPITULO 9. CONCLUSIONES GENERALES 145

Introducción General

i

Los flavonoides son un gran grupo de compuestos polifenólicos presentes en numerosas especies del reino vegetal. Estructuralmente, consisten en dos anillos aromáticos unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono pudiendo en algunos casos formar un tercer anillo heterocíclico. Los diferentes patrones de sustitución, en general hidroxilaciones y metilaciones, originan subgrupos o familias entre las que se encuentran los flavonoles, flavanonas, flavonas, chalconas, etc.

En los últimos tiempos estos compuestos han despertado el interés de numerosos investigadores debido a que se ha comprobado que ejercen numerosos efectos benéficos para la salud, entre los que se pueden citar propiedades anticarcinogénicas y cardioprotectoras, [1], las cuales han sido atribuidas fundamentalmente a sus propiedades antioxidantes.

Por otra parte son de gran interés para la industria tanto farmacéutica como

alimentaria ya que pueden ser utilizados como principios bioactivos en medicamentos, por ejemplo, la flavanona Hesperidina se usa en tratamientos de permeabilidad vascular, Naringina se utiliza como ingrediente en preparados nutracéuticos, como antioxidante en formulaciones cosméticas, farmacéuticas y de productos alimenticios, como saborizante de bebidas, golosinas, mermeladas y productos de panadería, entre otras, mientras que su dihidrochalcona derivada presenta un sabor dulce por lo que constituyen una alternativa a los edulcorantes utilizados actualmente.

Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en casi todas las especies del reino vegetal, pero los cítricos son la principal fuente de flavanonas, especialmente glicosiladas, poco frecuentes en otras especies vegetales. Si bien la composición depende de diversos factores entre los que se pueden citar variedad cultivada,

nnttrroodduucccciióónn eenneerraall


ii

factores climáticos, características del suelo, entre otras, en general los cítricos contienen las flavanonas Naringina y su aglicona Naringenina, presentes en variedades amargas como pomelos y naranjas agrias, Hesperidina y Hesperetin, Neoericitrina, Eriodictiol, Narirutina y Neohesperidina y en menor proporción los flavonoles Kaempferol, Quercetina y Rutina [2].

La mayor concentración de flavonoides en los frutos cítricos se encuentra localizada en las cáscaras, particularmente en el flavedo, ubicado en la parte interna de las mismas. La industrialización de los cítricos genera toneladas de cáscaras como subproductos que, para el caso particular de nuestro país, son poco aprovechados ya que en algunos casos sólo se extraen los aceites esenciales y en otros, las cáscaras deshidratadas se comercializan como ingredientes para alimentos para animales.

Dada la elevada concentración de flavonoides en las cáscaras, (1.7-2.0% en peso seco en naranjas y pomelos) este subproducto representa una fuente de flavanonas tanto agliconas como glicosiladas con fines de comercialización.

Esta alternativa resulta de gran interés ya que la región del NOA, (principalmente la provincia de Tucumán) contribuye con el 40% de la producción nacional de cítricos [3].

La industria citrícola es una actividad que ha tenido un gran crecimiento en los últimos años con posibilidades de continuar en expansión, por lo que es de gran importancia la caracterización y el aprovechamiento de los subproductos que genera.

De esta manera, la obtención de flavanonas a partir de los desechos o subproductos de la industria es una alternativa viable, constituyendo un ingreso que se sumaría a los ya existentes en la actualidad.

Dado el interés en las flavanonas cítricas, ya sea desde el punto de vista alimentario o farmacológico, es de vital importancia entender los procesos químicos primarios que gobiernan la estabilidad y funcionalidad de este tipo de moléculas, sobre todo teniendo en cuenta lo interesante de su reactividad química la cual depende de diversos factores entre los que se encuentran las condiciones de pH, temperatura, luz, etc.

Sobre la base de lo expuesto los objetivos de este trabajo de tesis fueron:

Estudiar los procesos químicos

que gobiernan la estabilidad y funcionalidad de las flavanonas presentes en cítricos con relación a sus aplicaciones industriales y nutracéuticas.

Estudiar las cinéticas y

mecanismos de reacción de diversas flavanonas y sus chalconas derivadas presentes en cítricos en función de diversos factores fisicoquímicos, específicamente estudiar y entender las etapas cinéticas y mecanismos de reacción por el efecto de variables tales como: temperatura, pH, composición del medio, luz.

Estudiar la capacidad antioxidante y antirradicalaria de las flavanonas presentes en cítricos.


iii

Optimizar las condiciones para la síntesis del edulcorante Dihidrochalcona de Naringina mediante hidrogenación catalítica.

Este trabajo de tesis se presenta

en nueve capítulos. En los primeros tres capítulos se

desarrollan los antecedentes bibliográficos.

El Capítulo 1 implica el desarrollo de los aspectos generales de los flavonoides: estructuras, propiedades y distribución natural, entre otros.

El Capítulo 2 presenta una revisión acerca del equilibrio de isomerización Fl-Ch y el efecto sobre el equilibrio de los sustituyentes, el medio de reacción, etc.

En el Capítulo 3 se presentan antecedentes acerca de las propiedades antioxidantes y antirradicalarias de las flavanonas cítricas.

Los resultados de esta tesis se presentan en los capítulos 4, 5, 6 y 7.

En el Capítulo 4 se presenta el estudio de las cinéticas del equilibrio de isomerización Fl-Ch de Naringina y Hesperidina, analizándose el efecto del solvente (EtOH, H2O y sus mezclas), el pH y la temperatura.

Debido a que la luz cataliza la formación de compuestos secundarios sobre la reacción de equilibrio de N, se estudió el efecto de la misma sobre la reacción. Se determinaron los parámetros cinéticos y se caracterizó el producto de reacción, Capítulo 5.

En el Capítulo 6 se presentan los resultados obtenidos durante la determinación de la capacidad

antioxidante y antirradicalaria de las flavanonas cítricas Naringina y Hesperidina, sus agliconas y chalconas y los flavonoles Quercetina y Rutina, empleándose para ello el método de decoloración de β-caroteno por cooxidación con ácido linoleico y el método del consumo del radical libre DPPH• (2,2-difenil picril hidracilo).

En el Capítulo 7 se obtuvo la dihidrochalcona derivada de Naringina mediante hidrogenación catalítica de la forma chalcona.

El Capítulo 8 describe los diferentes materiales y métodos utilizados en el presente trabajo de tesis y en el Capítulo 9 se presentan las conclusiones generales obtenidas durante el presente trabajo.


iv

Bibliografía

[1] Skibola, C. F.; Smith, M. Potential health impacts of excessive flavonoid intake. Free Rad. Biol. Med. 29.3-4. 375-383. 2000.

[2] Benavente-García, O.; Castillo, J.; Marin, F.; Ortuño, A.; Del Río, J. Uses and Properties of Citrus Flavonoids. J. Agric. Food Chem.. 45. 12. 4505- 4515. 1997.

[3] García, M. A. Situación de la Citricultura del Noroeste Argentino. Disertación. Centro Regional Noroeste Argentino. EEA. Famailla. INTA. Tucumán. 2001

Capítulo 1 Flavonoides: Aspectos Generales

1

1.1-INTRODUCCIÓN

En 1936, Rusznyak y col [1], informaron que los extractos crudos de jugo de limón o pimienta roja eran más eficientes que el Ácido Ascórbico, AA, en aliviar lesiones capilares, mantener sanos los conductos sanguíneos y regular la permeabilidad capilar. Al principio activo de este extracto lo denominaron tentativamente “vitamina P” por “vitamina de la permeabilidad” y también vitamina C2, porque se comprobó que algunos flavonoides, F, tenían propiedades similares a la vitamina C [2]. Posteriormente se demostró que este principio, al cual también se denominó citrina, correspondía a una mezcla de los F; Hesperidina y Eriodictina.

A pesar de haberse reportado que estas sustancias pueden modificar la permeabilidad de las membranas y presentar otros efectos biológicos, no son nutrientes esenciales por lo que en el año 1950 se recomendó discontinuar con el nombre de vitamina P y se acordó

denominarlos “Flavonoides”, tal como se los conoce actualmente.

Los F comprenden varias clases de sustancias naturales de gran importancia para las plantas, ya que cumplen diversas funciones entre las que se pueden citar su acción como atrayentes de animales en la oviposición, especialmente aquellos que confieren color como las antocianinas; son agentes protectores contra la luz UV o contra la infección por organismos fitopatógenos y también son de vital importancia para la salud humana, especialmente por sus propiedades antioxidantes [3].

Estructuralmente los F consisten en dos anillos aromáticos (A y B) unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono que puede formar un tercer anillo denominado C. Generalmente se denominan como compuestos C6C3C6.

Las diferentes clases de F difieren en el nivel de oxidación y del patrón de sustitución del anillo C.

Flavonoides: Aspectos Generales


2

Para su estudio sistemático, los más de 4000 F identificados en la actualidad se han clasificado en varias clases de acuerdo a las variantes estructurales que presentan en la cadena central [4]. De acuerdo con esto, los F se dividen en varios grupos o familias: flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavanonas, dihidroflavonoles, auronas, chalconas antocianidinas, catequinas, pterocarpanos, rotenoides, etc [5].

En la Figura 1.1 se muestran las estructuras básicas de las diferentes familias de F, junto al sistema de numeración. En general, los anillos aromáticos se denominan con las letras

A y B, mientras que al heterociclo se lo denomina anillo C.

La mayoría de los F poseen nombres triviales terminados en -INA u -OL.

Estos nombres les han sido asignados por los investigadores que los han descubierto, por ejemplo, Quercetina es un flavonol identificado inicialmente en una planta del género Quercus. Naringenina es una flavanona aislada inicialmente en naranjas.

Sin embargo, dado que esta clase de nombres no es muy útil cuando se requiere información sistemática de estas sustancias se ha convenido en

O

Isoflavonas Flavanonas Dihidroflavonoles

A

B

O

O

A C9

8

7

6

510

1

2

34

1'

2'

3'

5'

6'

4'

O

O

OH

O

O

O

O

Flavonas Flavonoles

O

O

OH

O

O

2

3

4

56

α

β2'

3'

4'

5'

6'

O+

O

OH

O

O

O

O

O

Auronas Chalconas Antocianidinas

Catequinas Pterocarpanos Rotenoides

1

B

Figura 1. 1: Estructuras básicas y sistemas de numeración de las diferentes clases de F.


3

llamarlos con nombres que representen su estructura química. Así por ejemplo, Quercetina corresponde al 5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavonol y Naringenina es la 5,7,4’-trihidroxiflavanona, etc. Los F naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se encuentran generalmente combinados con azúcares en forma de glicósidos denominándose consecuentemente GLICOSIDOS, mientras que los F libres se denominan AGLICONAS.

En cuanto a la posición de los sustituyentes, para los grupos hidroxilos la mayoría de estos compuestos muestra una estructura tipo resorcinol, es decir sustitución en C-5 y C-7, en el anillo A, mientras que la glicosilación es más frecuente en C-7 para flavonas, isoflavonas y flavanonas, y en C-3 y C-7 para flavonoles y dihidroflavonoles.

1.2- PROPIEDADES FÍSICAS

Las propiedades físicas de los F dependen de la clase a la que pertenece y de la forma en que se presentan, ya sea aglicona o glicósido.

Por ejemplo, las antocianidinas, de acuerdo a su patrón de sustitución, son de colores rojo intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y dihidroflavonoles debido a la quiralidad del C-2 presentan el fenómeno de actividad óptica. Por otra parte, los glicósidos son, en general sólidos amorfos que se funden con descomposición, mientras que las agliconas y los F altamente hidroxilados son cristalinos [5]. La solubilidad depende del número y clase de sustituyentes presentes. Los glicósidos, las

antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcoholes tales como etanol, metanol y n-butanol, mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes menos polares como éter etílico, acetato de etilo y acetona.

Las agliconas altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el éter de petróleo y cloroformo.

Por otra parte, los F con hidroxilos fenólicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos altamente hidroxilados se descomponen por acción de bases fuertes, un hecho que permite reconocerlos y diferenciarlos de otros, y que desde hace años se utiliza para su elucidación estructural. En la Tabla 1.1 se muestran los F más representativos junto a algunas características sobresalientes. 1.3- METODOS DE ANALISIS: ESPECTROSCOPIA UV-VIS DE FLAVONOIDES

Si bien los F pueden ser analizados por diferentes técnicas entre las que se pueden citar: espectroscopia de resonancia magnética (RMN), Cromatografía en papel, Cromatografía en placa delgada (TLC), Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), entre otras, la espectroscopia UV-Vis es una de las principales herramientas utilizadas para el análisis de F

El espectro de la mayoría de los F consiste en dos máximos de absorción, uno en el rango de 240-285 nm (Banda II) y el otro en el rango de 300-400 nm (Banda I) [9].


4

Nombre trivial Nombre IUPAC Azúcares Propiedades Físicas

Naringina

4’,5-dihidroxiflavanona 7-neohesperidósido

Neohesperidósido(ramnosa + glucosa unión α 1→ 2)

P.F. 83ºC SOL: agua (0,001 g/ml a 40ºC), acetona, alcohol, ácido acético caliente [6].

Hesperidina

4’-metoxy -5,3’- dihidroxiflavanona 7-rutinósido

Rutinósido (ramnosa + glucosa α 1→ 6)

P.F. 258-262ºC SOL: poco soluble en agua, soluble en formamida, ácido acético, muy soluble en soluciones alcalinas [6].

Quercetina

3’,4’,5,7-tetrahidroxi flavonol (Aglicona)

P.F. 95-97ºC SOL: ácido acético glacial, soluciones alcalinas, alcohol [6].

Rutina

3’,4’,5,7-tetrahidroxiflavonol 3-rutinósido

Rutinósido (ramnosa + glucosa α 1→ 6)

P.F.:125º SOL: 0,125 g/l en agua, soluble en sol alcalinas, alcohol, acetona, acetato de etilo [6].

Neohesperidin dihidrochalcona

4’-metoxy -5,3’- dihidroxidihidrochalcona7- neohesperidósido

Neohesperidósido(ramnosa + glucosa union α 1→ 2)

P.F. 156-158ºC SOL: agua 0,5 g/l (25ºc) etanol 20,4 g/l a 25°C:; acetona, álcalis diluidos [7].

Naringina Chalcona

2’,4,6’-trihidroxichalcona-4’neohesperidósido

Neohesperidósido(ramnosa + glucosa unión α 1→ 2)

P.F.170-183ºC SOL: agua, alcoholes, ácido acético [8].

Tabla 1. 1: Nomenclatura y propiedades físicas de los F más representativos

En términos generales la Banda II

puede considerarse originada a partir del anillo A o sistema benzoílo y la Banda I se asocia al anillo B o sistema cinamoílo.

En la Figura 1.2 se muestran los espectros característicos de la flavanona N y su chalcona, NCh.

En la Tabla 1.2 se muestran las regiones características del espectro UV-Vis para las diferentes clases de F.

La utilización de la espectroscopia UV-Vis para el análisis de F se encuentra fundamentada por dos razones principales:

Se requiere muy poca cantidad de muestra.

O

OH

ROOH

O

OMe

O

OH

RO

O

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

RO

O

OH

OMe

OH

OH

RO

O

OH

300 400 500 600

0.0

0.2

0.4

Banda II Banda I

N Ch

Abs

λ (nm)

B

CAO

OBenzoíl Cinamoíl

Figura 1.2: Espectros de absorción de N y NCh

OOH

OHOR

OH

OH

O


5

Tabla 1. 2: Rangos de absorción UV-Vis para Flavonoides

La información estructural

obtenida a partir del espectro UV-Vis es considerablemente mejorada por el uso de reactivos específicos los cuales reaccionan con uno o más grupos funcionales del núcleo F [9]. La adición de cada uno de estos reactivos por separado a una solución alcohólica del F induce corrimientos en el espectro, asociados a los patrones estructurales.

Algunos de estos reactivos de reconocimiento de grupos funcionales son:

Metóxido de sodio (NaOMe): por

ser una base fuerte, ioniza todos los grupos hidroxilos del núcleo del F. A mayor número de hidroxilos, mayor corrimiento batocrómico de las bandas del espectro.

Acetato de sodio (NaOAc): al ser una base más débil que el NaOMe ioniza sólo el hidroxilo fenólico más ácido.

Acetato de sodio / ácido bórico (NaOAc/H3BO3): esta mezcla se utiliza para la detección de grupos hidroxilos en posición orto, por formación de

quelatos, tal como se puede ver en la Figura 1.3.

Cloruro de aluminio (AlCl3): este reactivo acompleja grupos funcionales tales como grupos hidroxilos en posición orto e hidroxilos en posición 5 y 3 los cuales se encuentran a ambos lados de la función ceto, con los cuales forma complejos estables en medio ácido

Cloruro de aluminio / ácido clorhídrico (AlCl3/HCl): en presencia de ácido clorhídrico acuoso, los complejos formados con los grupos en posición orto se descomponen a diferencia de los formados por los grupos hidroxilos en posición 3 y/o 5, Figura 1.4.

Banda II (nm) Banda I (nm) Tipo de Flavonoide

250 - 280 310 - 350 Flavonas 250 - 280 330 - 360 Flavonoles (3-OH sustituido) 250 - 280 350 - 385 Flavonoles (3-OH libre) 245 - 275 310 – 330 (hombro) Isoflavonas 275 - 295 300 – 330 (hombro) Flavanonas y dihidroflavonoles 230 – 270 (baja intensidad) 340 - 390 Chalconas 230 – 270 (baja intensidad) 380 - 430 Auronas 270 - 280 465 - 560 Antocianidinas y antocianinas

O

O

OO B

OH

OH-

Figura: 1.3: Complejo formado entre ácido bórico y F.


6

Reactivo Flavonas y Flavonoles Isoflavonas, Flavanonas y dihidroflavonoles Chalconas y Auronas

NaOMe

- 4’-OH: provoca +40 - 65 nm en Banda I con incremento en intensidad - 3-OH sin 4’-OH: +50-60 nm sin incremento intensidad - Glicosilación en C-7: ausencia Banda a 320-330 nm. - 3,4’ y/o 3,3’,4’-OH: Bandas que disminuyen con el tiempo

- 5,6,7 y 5,7,8 triOH: degeneración del espectro con el tiempo - 5,7-OH: +35-40 nm de Banda II con incremento de intensidad. - Corrimiento de BI a 400 nm: isomerización Fl-Ch.

- 4-OH: +60-100 nm Banda I con aumento intensidad 2 ó 4’-OH: +60-100 nm Banda I sin aumento intensidad

NaAc

-7-OH: +5-20 nm Banda II (reducido en presencia de oxigenación en C-6 u 8).

-7-OH (c/5-OH): +35 nm Banda II -7-OH (s/5-OH): +60 nm Banda II -Grupos sensibles a los álcalis ( 6,7 o 7,8 diOH): disminución de la intensidad con el tiempo.

- 4’ y/o 4-OH: corrimiento de Banda I con aparición de hombro

NaAc/ H3BO3

- o-diOH anillo B: +12-36 nm Banda I - o-diOH anillo A: pequeño corrimiento batocrómico. Banda I

- o-diOH anillo A (6,7 ó 7,8): +10-15 nm. Banda II

Ídem a flavonas y flavonoles.

AlCl3 y AlCl3/ HCl

-5-OH: +35-55 nm Banda I -5-OH con 6-oxigenación: +17-20 nm. Banda I -3-OH: +50 -60 nm Banda I -o-diOH anillo B : +30-40 nm Banda I -o-diOH anillo A (aditivo a o-diOH anillo B): +20-25 nm Banda I

- 5-OH (isoflavonas): +10-14 nm Banda II - 5-OH (flavanonas, dihidroflavonoles): +20-26 nm Banda II

-2’-OH: +48-64 nm Banda I - 2’-OH (con oxigenación en C-3’): +40 nm Banda I - o-diOH anillo B: +40-70 nm. Banda I - Pequeño incremento Banda I: posiblemente o-diOH anillo A

Tabla 1. 3: Interpretación de los cambios espectrales observados frente a la adición de reactivos de reconocimiento [9].

O

OH O

OH

OHOH

AlCl3

O

O

OH

OO

Al

OAl

HCl(ac)

2+

O

O

OH

OHOH

OAl 2+

+

Figura 1.4: Reacciones involucradas con AlCl3/HCl


7

Fenilalanina

4-Cumaril-CoA 3x MalonilCoA

CHS

OH

OR1

OH

OH

Chalcona

CHI

2

Flavonol Flavanona Isoflavona

FSI

OH

R1

OH O

OFlavona

IFS

2-HIS, 2HID

OH

OR1

OH O

FSII

OHOH

O

OH

O

Retrochalcona OH

R1

OH O

OFlavona

OH

OH

OH O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

Dihidroflavonol

F3β-H

F3'-5'H

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

3'4'

5'

F3'H

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

(R2)Reductasa

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

DFR

O

OH

(R2)OH

OH

OH

OHOH

Epicatequina Leucocianidina (R2=H)

Reductasa

O

OH

OH

OH

OH

OH

Reductasa

Polimerizacion

Taninos condensados

ANS3GT

(R2)OH

OH

OH

OGlc

OH

O

+

Cianidin 3-glucósido (R2=H) (Antocianina)

IOMT4'

Formononetina (R1=H)

I2'H

IFR

2'-hidroxi isoflavanona

OH O

R1 OOH

OH O

R1 OOMe

OH O

R1 OOMeOH

OH O

R1 OOMeOH

VRDMID

OH O

R1OMe

O

Medicarpina(Pterocarpano)

La interpretación de los espectros obtenidos adicionando cada uno de los reactivos descriptos anteriormente ofrece una información muy completa acerca de la estructura de los F.

En la Tabla 1.3 se muestran los corrimientos espectrales frente a los reactivos de reconocimiento para algunas familias de F.

1.4- BIOSÍNTESIS

La Figura 1.5 muestra las reacciones de biosíntesis de los F. Los F se sintetizan en las plantas y participan en la fase dependiente de luz de la fotosíntesis, durante la cual catalizan el transporte de electrones.[2]

Figura 1. 5: biosíntesis de las principales clases de F. Las enzimas son: CHS, CHR ,CHI chalcona sintetasa, reductasa, isomerasa respectivamente. FSI, FSII: flavona sintetasa I y II respectivamente. FLS: flavonol sintetasa, IFS: isoflavona sintetasa, F3β-H: flavanona 3-β hidroxilasa, F39H, F3959 flavonoide 39 y 39-59-hidroxilasa respectivamente, DFR: dihidroflavonol reductasa, ANS, 3GT: antocianidina sintetasa y 3-glucosiltransferasa respectivamente, IOMT, IFR: isoflavona o-metil transferasa y reductasa respectivamente, entre otras [10]


8

CH2OH

OHOH

O

OH O

O

OH

O

CH2OH

OH

OH

OH

O

OH O

OH

OH

Los F se forman por la combinación de derivados sintetizados a partir de fenilalanina (vía ácido shikímico) y ácido acético, Figura 1.5. El primer paso implica la formación de fenilalanina a partir de fenilpiruvato. La fenilalanina se transforma a ácido trans-cinámico, el cual es hidrolizado a ácido p-cumárico.

El ácido p-cumárico se condensa con tres unidades de malonilCoA para formar chalcona de 15 átomos de C.

Subsecuentemente el cierre del anillo y la hidratación originan compuestos tales como catequinas y flavonoles [10].

Los F comúnmente se acumulan en las células epidérmicas de los órganos de las plantas tales como flores, hojas, tallos, raíces, semillas y frutos.

Los F glicosilados se encuentran comúnmente en regiones hidrofílicas, tales como vacuolas y apoplastos, algunos también han sido encontrados en cloroplastos y etioplastos. Las agliconas por su parte se localizan en regiones hidrófobicas tales como las glándulas lipofílicas [11].

1.5-DISTRIBUCIÓN Y ESTADO NATURAL. La estructura base de los F puede sufrir varias modificaciones entre las cuales se puede citar: sustitución por grupos hidroxilos, metilación de dichos grupos, dimerización (biF), formación de bisulfatos y glicosilación. Los glicósidos suelen ser de dos tipos: los unidos a través de átomos de oxígeno (enlace hemiacetal), es decir o -glicósidos o con los azúcares ligados a través de enlaces C-C, o c-glicósidos. (Figura 1.6) La glicosilación en general implica una disminución de la reactividad y un aumento en la solubilidad acuosa. Aunque todos los grupos hidroxilos del esqueleto flavonólico pueden glicosilarse, la hidrólisis en algunas posiciones es más probable que en otras; ejemplo de ésto es el grupo 7-OH en flavonas y los grupos 3-OH y 7-OH en flavonoles y dihidroflavonoles.

El azúcar que generalmente está presente en los N es la glucosa, aunque también se puede encontrar galactosa, ramnosa, xilosa y el disacárido rutinosa.

Figura 1.6: Ejemplos de Flavonoides O- y C-glicosilados. Izq: Apigenina 7-O- β-D-glicopiranosa. Der: Apigenina 8-C- β-D-glicopiranosa


9

1.5.1- FUENTES DE FLAVONOIDES Los F están ampliamente

distribuidos en el reino vegetal, existiendo en todas las familias de plantas y se encuentran en considerables cantidades en frutas, vegetales, granos, bebidas cola, té, café, cacao, cerveza, vino tinto.

Son consumidos en la dieta humana en forma natural y también en forma de suplementos nutricionales, junto con ciertas vitaminas y minerales como así también en extractos de ciertas plantas como arándano, gingko biloba y cardo, entre otros que se expenden comercialmente. El vino tiene un alto contenido de compuestos polifenólicos, estimados en unos 500, los cuales provienen de las uvas y del proceso fermentativo. En la uva estas moléculas se localizan en la piel, especialmente en las células epidérmicas, y en las pepitas.

Su cantidad y tipo dependen de la variedad del clima, de las características del suelo y las prácticas del cultivo [12]. En cuanto a la ingesta, los F son los polifenoles más abundantes en nuestra dieta. La principal fuente de isoflavonas es la soja, la cual contiene mayoritariamente genisteina. Esta familia de F ha recibido una considerable atención debido a sus propiedades estrogénicas y su posible rol en la prevención de ciertos tipos de cáncer y osteoporosis.

Los frutos cítricos son la principal fuente de flavanonas, entre las que se destaca Hesperidina, una de las mayoritarias en la dieta debido al alto consumo de naranjas dulces, (125-250 mg/l de jugo). Otros tipos de F son comunes en varias fuentes alimentarías. Quercetina, el principal F de nuestra dieta, está presente en muchas frutas y vegetales y en ciertas bebidas.

Flavonoides Fuentes CATEQUINAS Epicatequinas Catequizas Epigalocatequinas Galatos de Epicatequinas Galato de Epigalocatequinas

Té verde y negro Vino tinto

FLAVANONAS Naringina Hesperidina Taxifolin

Piel de cítricos Frutos cítricos

FLAVONOLES Kaempferol

Endivias, brócoli, pomelos, té negro

Quercetina Cebollas, lechuga, brócoli, manzanas con piel, aceitunas, té, vino tinto.

Miricetina Vino tinto, uvas. FLAVONAS Crisina

Piel de frutos

Apigenina apio, perejil, ANTOCIANINAS Malvinidina

Uvas negras, vino tinto

Cianidina Cerezas. Frambuesas, uvas.

Tabla 1.4: Fuentes Naturales de F.


10

O

O5

6

7

8

2

2'3'

4'

5'

6'3

Es particularmente abundante en cebollas (0.3 mg/g peso fresco) y té (10-25 mg/L), el cual representa la principal fuente de flavonoles.

Las flavonas son menos comunes y se han encontrado en pimienta roja por ejemplo luteolina. Las catequinas son abundantes en el té. Una infusión de té verde contiene 1g/l de catequina. En té negro, su contenido se reduce a la mitad de su valor debido a la oxidación junto con polifenoles más complejos durante la fermentación.

Otras fuentes de F, específicamente antocianinas, son el vino tinto (270 mg/l) y chocolate.

En la Tabla 1.4 se describen las principales fuentes de F en alimentos.

1.5.2- FLAVONOIDES EN CÍTRICOS

En términos de la composición de F, los cítricos son excepcionales ya que se han detectado en ellos, algunos F que no existen en ninguna otra especie, por ejemplo flavonas polimetoxiladas (nobiletina y tangeretina) de gran interés por sus propiedades farmacológicas [15] y flavanonas, sustancias minoritarias en otras especies del reino vegetal.

Dentro de las flavanonas, otro hecho interesante es que, a diferencia de

lo informado para otras plantas, las flavanonas cítricas existen usualmente como glicósidos. La glicosilación generalmente ocurre en posición C-7 por rutinosa o neohesperidosa, disacáridos formados por una unidad de glucosa y una de ramnosa, que difieren solamente en el tipo de unión: 1→6 o 1→2 respectivamente. El punto de unión de ramnosa y glucosa en el disacárido es determinante para el sabor del compuesto [13].

En general, las flavanonas rutinósidos carecen de sabor mientras que flavanonas neohesperidósido presentan sabor amargo. Para el caso particular de N, Horowitz y Gentili [13], plantean que su sabor es alrededor de 1/5 del sabor amargo de quinina.

El perfil de las flavanonas en los cítricos ha formado la base para la clasificación quimiotaxonómica de los mismos. El cultivo cítrico más comercial, naranjas dulces, contiene solamente los F rutinósidos sin sabor mientras que las naranjas amargas contienen solamente flavanonas neohesperidósido.

El pomelo es considerado un híbrido debido a que contiene flavanonas rutinósidos y neohesperidósidos.

Tres flavanonas agliconas son comunes en cítricos: Naringenina,

Flavanonas 5 7 3’ 4’ Eriocitrina -OH -O-Rut -OH -OH Erodictiol -OH -OH -OH -OH Hesperidina -OH -O-Rut -OH -OCH3 Hesperetina -OH -OH -OH -OCH3 Naringina -OH -O-Neo - -OH Naringenina -OH -OH - -OH Narirutina -OH -O-Rut - -OH Neohesperidina -OH -O-Neo -OH -OCH3 Neoeriocitrina -OH -O-Neo -OH -OH

Tabla 1. 5: Nombres y estructura química de flavanonas cítricas. (-O-Rut, rutinósido);

O-Neo, neohesperidósido)


11

Erodictiol y Hesperetina. Dentro de las flavanonas glicosiladas entre las más comunes se encuentran Eriocitrina, Neoerioctrina Hesperidina, Naringina, Narirutina, Neohesperidina, Tabla 1.5.

La presencia de N en variedades dulces está muy cuestionada. En general se acepta su ausencia en variedades dulces pero existen en la bibliografía datos acerca de su existencia en dichas variedades [14].

La resolución de esta controversia es muy importante dado que N se utiliza como marcador quimiotaxonómico para distinguir naranjas dulces de otros cultivos de cítricos [13,14], además de determinar el sabor amargo de los frutos.

Dentro de los cítricos, la mayor concentración de F existe en la cáscara, especialmente en el epicarpio o flavedo, aproximadamente en un 1.7-2.0% en peso seco de cáscaras de naranjas y pomelos.

Dado que el procesamiento de naranjas para la elaboración de jugos genera aproximadamente unas 20 tn de cáscara por cada 45 tn de fruta [15], este subproducto de la industria citrícola representa un rica fuente de F.

La Tabla 1.6 muestra la composición de F de diferentes tipos de cítricos.

1.6- INGESTA DE FLAVONOIDES

Si bien los F no son vitaminas, tanto por los efectos benéficos para la salud que otorga su consumo, como por la imposibilidad del organismo humano de producirlos es que merecen ser incorporados al grupo de los nutrientes esenciales.

Aunque los hábitos alimenticios son muy diversos en el mundo, el valor medio de ingesta de F se estima como 23 mg/ día, siendo predominantes los flavonoles, especialmente la Quercetina.

De los alimentos, el té es una de las fuentes principales de Quercetina, especialmente en Japón y en los países bajos, el vino tinto lo es en Italia y las cebollas en Estados Unidos y Grecia. La ingesta promedio de flavonoles y flavonas varía entre los 20 y 26 mg/ día. Excede por lo tanto, a la de otras sustancias en la dieta, tales como β-caroteno (2-3 mg/día) y la vitamina E (7-10 mg/día) y es aproximadamente un tercio de la vitamina C (70-100 mg/día) [18, 34].

Los F representan por lo tanto una contribución importante de la dieta humana.

Desde el punto de vista de la salud, es más importante el consumo de ciertas clases de F que la ingesta total de los mismos.

Tabla 1. 6: Composición de Flavanonas glicósidos en: Limones (C. limonia), Pomelos (C. paradisi white) y naranjas dulces (C. sinesis. Navel). ERI: eriocitrina, NER, neoeriocitrina, NAT: narirutina, H: Hesperidina, N: Naringina, NH, Neohesperidina.[16]

Flavanonas Glicósidos (mg/L) Frutos ERI NER NAT H N NH Limón 87.7±18.4 4.1±1.7 6.8± 3.3 154.4± 54.0 - - Pomelo 3.1±1.8 - 105.7± 70.8 5.3±4.0 331.3± 185.5 7.8± 6.5 Naranja dulce 3.6±0.8 - 85.1± 12.8 379.3±79.7 - -


12

Los hábitos culturales dictaminan la clase de F que se ingieren.

Por ejemplo, la soja y los alimentos elaborados a partir de ésta son altamente consumidos en Japón, lo que implica una ingesta considerable de isoflavonas.

Por otra parte, debido a la costumbre de beber té, las catequinas son consumidas por una gran parte de la población de Holanda. 1.6.1 BIODISPONIBILIDAD DE LOS FLAVONOIDES Las propiedades benéficas para la salud de los F dependen de su biodisponibilidad. La absorción de F por parte del organismo depende de muchos factores tales como el tipo de alimento, la heterogeneidad de la matriz alimentaria, el tipo de azúcar, los grupos funcionales del núcleo F, la forma de administración, el sexo, la población microbiana del colon, entre otros. Es por estos muchos factores, que el mecanismo preciso por el cual los F ejercen sus propiedades benéficas o tóxicas aun no está del todo claro [17]. De acuerdo a lo descrito anteriormente, la estructura química de los F determina la velocidad y extensión de la absorción intestinal y la naturaleza de los metabolitos que circulan en el plasma. La glicosilación influye en las propiedades químicas, físicas y biológicas de los mismos, entre las que se pueden mencionar la afinidad relativa por una fase acuosa o lipofílica lo cual determina si el compuesto difundirá a través de las membranas biológicas y la

forma en que ocurre la partición en las células. Esto sugiere que la remoción del glicósido es necesaria para que ocurra la difusión a través de las paredes del intestino delgado, por lo tanto, una vez ingeridos, el primer paso es la separación de los azúcares, transformando los F glicosilados en agliconas. Este proceso se lleva a cabo por enzimas conocidas como glucosidasas entre las que se encuentran la β-glucosidasa citosólica (CBG). Es importante destacar que a pesar de las condiciones ácidas del estómago la deglicosilación no enzimática no ocurre en el organismo humano. La absorción de F es por lo tanto controlada únicamente por enzimas específicas. Otro aspecto interesante lo constituye la ramnosa, ya que por no ser un sustrato para las glucosidasas humanas, la hidrólisis de F que la contengan ocurre únicamente por acción de la microflora del colon. Luego de la hidrólisis los grupos hidroxilos de las agliconas experimentan reacciones de metilación, sulfatación y glucuronidación. En cada una de estas reacciones actúan enzimas específicas por ejemplo para la metilación están involucradas catecol-O-metil transferasas (COMT), para la sulfatación, la fenol sulfotransferasas (SULT) y, finalmente, para la glucuronidación la UDP glucuronosil transferasa, (UDPGT). Estas reacciones pueden alterar drásticamente las propiedades biológicas de los metabolitos. Además de las reacciones descritas, los F en forma de glucurónidos, Figura 1.7, penetran en el


13

colon el cual contiene ≈ 1012

microorganismos/cm3 y un enorme potencial catalítico e hidrolítico. Es aquí donde la microflora cataliza la ruptura de

los F a compuestos más simples derivados del ácido fenilacético y fenilpropiónico y otros productos inertes [18].

O

OHOH

OHOH

OH

Epicatequina Epicatequina-7-β-D-glucurónido

UDPGT

O

OOH

OH

OHOH

OH

OHCOOH

Acido 3,4-dihidroxifenilacético

Dehidroxilación

OHCOOH

Fisión del anilloEliminación de aguadehidroxilación

OH

COOH

Acido 3-hidroxifenil acético Acido 3-(3-hidroxifenil)propiónico

A

B

OOH

OH

OHOH

OH

MetilaciónOxidación

CortesGlucuronidaciónSulfatación

OCOO

HOH H

HOHH

OH

O O

OHOH

OHOH

O-rutinósido

Figura 1. 7: A) Formación de glucurónidos para Epicatequina. B) Degradación de F por acción de microorganismos


14

A pesar de que la absorción intestinal de los F es alta, la concentración en plasma de algunos F individuales raramente excede 1µM después del consumo de 10-100 mg de compuesto simple. Las medidas de la capacidad antioxidante del plasma sugieren que los compuestos con varios sustituyentes fenólicos están presentes principalmente en forma de metabolitos aún desconocidos, producidos ya sea en tejidos o por la microflora colónica.

Los metabolitos que circulan por el plasma, comparado con las agliconas originales, tienen una capacidad reducida para donar hidrógeno y son menos efectivos para desactivar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, ROS y RNS, respectivamente.

Por otra parte, la concentración de los F y sus metabolitos en plasma es muy baja comparada por ejemplo con AA y α-TOH. Consecuentemente es improbable que los F ejerzan acciones como AO, sin embargo, las evidencias sugieren que los efectos benéficos de los F pueden estar mediados por sus interacciones con proteínas específicas actuando como moléculas “señales”, es decir presentan actividad farmacológica en receptores, enzimas y factores de transcripción [17 ].

1.7- FLAVONOIDES CITRICOS CON APLICACIONES INDUSTRIALES

La industrialización de los cítricos

debe estar relacionada con el aprovechamiento de los subproductos que genera. En la actualidad no se admite una industria que tenga como objetivo simplemente la obtención de jugo, sino que los subproductos constituyen un valor agregado del proceso en sí y es también una forma de disposición de los residuos. Dentro de dichos subproductos, las cáscaras son la principal fuente de F, especialmente flavanonas glicosiladas como se describió anteriormente

El interés comercial por las flavanonas cítricas es considerable dado las numerosas propiedades que presentan. H, por ejemplo, al afectar la permeabilidad vascular es de gran interés para la farmacología, N, ha sido adicionada a aceite de palma mostrando un efecto protector hacia la autooxidación térmica, además de ser antimutagénica por lo cual se utiliza en la formulación de cosméticos [19, 20] y, debido a su sabor característico, se utiliza también como saborizante de bebidas y golosinas.

Además, tanto N como NH tienen una importante aplicación industrial dado que pueden ser convertidas, previa transformación a sus formas isoméricas

OH

OH O

ROR'

R''

DhCh R R’ R’’

Poder edulcorante

Relativo/ Sacarina

1 β-D-glucosilo -H -OH 0.4 2 β-Neohesperidosilo -H -OH 1.0 3 β-Neohesperidosilo -OH -OCH3 20.0

Tabla 1.7: Estructura química de DhCh [22].


15

chalconas, en las correspondientes dihidrochalconas, (DhCh) que poseen una fuerte capacidad endulzante. Horowitz y Gentili [21,22] reportan que las DhCh derivadas de Prurina (1), N (2) y NH (3), (Tabla 1.6), presentan un sabor intensamente dulce siendo 0.4; 1 y 20 veces más dulce que la sacarina en base molar.

La obtención de un edulcorante a partir de fuentes naturales, tales como cáscaras de cítricos en el caso de NDhCh, constituye una alternativa interesante tanto para la industria como para la población con necesidades de dietas restringidas en azúcares o de menor poder calórico ya que serían potencialmente menos tóxicas que las sustancias empleadas actualmente [23].

Al respecto, en Diciembre de 1994 se publicó en el Diario Oficial de las Comunidad Europea la directiva 94/35/CE autorizando el empleo de NHDhCh en una amplia gama de productos alimenticios entre ellos, yogurt bajas calorías. Se ha demostrado [24] que esta DhCh es inocua en dosis de hasta 500 mg/kg de peso corporal y por día, estable bajo las condiciones normales de uso y 1800 veces más dulce que el azúcar a concentraciones umbrales [25]. Además de las

propiedades edulcorantes presenta actividad como modulador y modificador del sabor, por lo que también se incluyó como aditivo alimentario. En nuestro país el Código Alimentario Argentino (CAA) la incluye, dentro de los edulcorantes permitidos para su uso en alimentos. (Cáp. XVIII. Res 1545, 12.09.90) 1.7.1- SITUACION DE LA INDUSTRIA CITRICOLA ARGENTINA

Argentina se ubica en el octavo

lugar como productor mundial de frutas cítricas con aproximadamente 2.000.000 tn, lo que representa un 2% de la producción mundial [26]. Estos valores nos dan una idea acerca de la importancia de la citricultura tanto desde el punto de vista económico como social para nuestro país.

La actividad citrícola argentina se encuentra localizada principalmente en las provincias del NEA (Entre Ríos, Corrientes, Misiones) y el NOA (Jujuy, Salta, Tucumán y en menor producción Santiago del Estero y Catamarca). El resto corresponde a la provincia de Buenos Aires y sur de Santa Fe. (Figura 1.8)

En el NOA la Citricultura tiene una gran importancia sobre el producto

SUPERFICIE CITRICOLA ARGENTINA - Año 2001

Misiones5%

Catamarca+Santiago del Estero

1%

Jujuy5%

Salta10%

Tucumán24%

Buenos Aires6%

Entre Rios30%

Corrientes19%

Figura 1.8: Situación de la citricultura del Noroeste Argentino. (INTA. Famaillá. Tucumán. 2002)


16

bruto interno. Dentro de las actividades, tanto la exportación de fruta fresca como la industrialización en forma de jugos y el aprovechamiento de los subproductos como por ejemplo, aceites esenciales, cáscaras junto a parte de la pulpa y eventualmente semillas, indican un firme crecimiento anual.

En este marco, la provincia de Santiago del Estero, presenta características climáticas benignas, tales como fuertes insolaciones y grandes amplitudes térmicas, que permite a la fruta cítrica madurar casi 20 días antes que la principal zona de frutas tempranas, Calileua, provincia de Jujuy. Sin embargo, a pesar de esta ventaja, la actividad citrícola provincial se encuentra en un franco descenso causado por la influencia de importantes factores limitantes tales como salinidad, heladas y la falta de una tecnología apropiada para el manejo de los montes frutales [27]. La industrialización de frutas cítricas es una actividad que ha tenido en los últimos años una llamativa dinámica exportadora y con interesantes posibilidades de continuar en expansión.

El procesamiento industrial de los cítricos permite obtener una serie de productos y subproductos que se destinan a diversos usos:

Para el consumo humano en Argentina, los jugos son la meta prioritaria de la industrialización, para naranjas el 80% se destina a concentrados y 20% a cremogenados y son el principal producto de exportación.

Para el consumo animal, como subproducto del proceso de obtención de jugos cítricos se aprovecha la corteza, membranas, parte de la pulpa y

eventualmente las semillas. Estos se emplean como forraje, destinándose en un 100% al mercado externo, principalmente Dinamarca y Holanda.

Para la industria farmacéutica de cosméticos y perfumes ya que los aceites esenciales se usan como aromatizantes y saborizantes y de las cáscaras deshidratadas se obtienen pectinas.

Sin embargo, es una

preocupación de las empresas citrícolas de nuestro país lograr un mejor aprovechamiento de los desechos de la industria, entre los que se puede citar la obtención de F cuyas utilidades se describieron anteriormente.

Esto ha generado la necesidad de caracterizar estos subproductos y plantear nuevas estrategias para su obtención, purificación y utilización.

En conclusión la obtención de flavanonas particularmente, a partir de los desechos de esta industria es una alternativa viable de buena rentabilidad económica y constituiría otra fuente de ingreso para la industria de procesamiento de los cítricos [28].

1.8- FLAVONOIDES CITRICOS CON APLICACIONES NUTRACEUTICAS

En los últimos años, la evidencia científica ha demostrado que los alimentos contienen sustancias fisiológicamente activas que, al igual que los nutrientes esenciales tales como las vitaminas, son necesarias para una vida saludable.

Por su parte, los consumidores, cada vez más concientes de la


17

importancia de llevar una vida saludable, han impulsado una nueva área de desarrollo en las ciencias de los alimentos y la nutrición: la de los alimentos funcionales y nutracéuticos.

Los nutracéuticos también llamados compuestos bioactivos o ingredientes funcionales se definen como “aquellos suplementos dietéticos que proporcionan una forma concentrada de un agente presumiblemente bioactivo de un alimento, presentado en una matriz no alimenticia y utilizado para incrementar la salud en dosis que exceden aquellas que pudieran ser obtenidas del alimento normal”[29].

En Japón, país pionero en el campo de alimentos funcionales y nutracéuticos, se habla de la función “terciaria de los alimentos” (la primaria corresponde a la función organoléptica y la secundaria a la nutricional) y está asociada al mantenimiento de una salud óptima y la prevención de enfermedades.

Los nutracéuticos se han dado a conocer como suplementos alimenticios ya sea en forma de comprimidos o jarabes, y contienen sustancias naturales y/o sintéticas.

Algunos de estos suplementos están constituidos directamente por extractos de plantas (hierbas) los cuales se derivan de tradiciones asiáticas, como el ginseng, el ginkgo biloba o los extractos de semillas de uva, mientras que otros contienen mezclas de vitaminas y otras sustancias benéficas para la salud. Este mercado, valuado en aproximadamente 70 millones de dólares anuales atrajo el interés tanto de la industria de alimentos como de la farmacéutica, las cuales han apoyado el desarrollo de investigaciones, así como

también la búsqueda y comercialización de nuevos productos destinados a varios segmentos de la población [30].

Dentro de las sustancias utilizadas en las formulaciones de los nutracéuticos se encuentran los F. Estos compuestos son activos en grado variable contra radicales libres, los cuales a su vez están asociados a un mayor riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares, cáncer, y otros padecimientos.

Particularmente en el caso de los F cítricos, se ha demostrado que exhiben diferentes efectos benéficos para la salud entre los que se pueden citar:

Propiedades anticarcinogénicas: recientemente los F han atraído la atención al ser considerados como agentes potencialmente importantes contra el cáncer. Los resultados de las investigaciones indican que los F pueden actuar en todos los estadios del proceso carcinogénico: daño al ADN (paso de iniciación) atribuida a su capacidad de absorber luz UV actuando como filtros contra la radiación dañina, particularmente importante para el caso de cáncer de piel, crecimiento del tumor (o paso de promoción) e invasión (paso proliferativo) [31].

Efectos sobre enfermedades cardiovasculares: Szent-György y col en el año 1938 descubrieron que ciertos F presentan efectos sobre la fragilidad capilar, debido a esto los consideraron inicialmente como vitaminas denominándolos vitamina P por su efecto sobre la fragilidad capilar.


18

Enfermedad Dosis Bronquitis Aguda: 1 mg vit. C y 500 mg F dos veces al día.

Crónica: 1 mg vit. C y 500 mg F una vez al día Prevención Cáncer 1 mg vit. C y 500 mg F dos veces al día. Dolores por úlceras 500–1 mg vit. C y 250-500 mg F 3 veces por día hasta cicatrización,

más complemento vitamínico Herpes labial 1 mg vit. C y 500 mg F 3 veces al día Infección en oídos 1 mg vit. C y 500 mg F 3 veces por dia hasta que la infección

desaparezca. Hemorroides 1 mg vit C y 500 mg F 3 veces por día Rosácea 1 mg vit. C y 500–650 mg F 2 veces por día Sinusitis 1mg vit. C y 500 mg F 3 veces por día más complejo vitamínico

Tabla 1.8: Recomendaciones de la firma comercial Whole Foods Market Health acerca de la ingesta de suplementos conteniendo F. Fuente: www.wholefoods.com.

El daño capilar provoca pérdida

de sangre y plasma junto con tejido seguido por una reacción inflamatoria. Este proceso puede tratarse con muchas drogas las cuales se basan en F, principalmente derivados de H y Rutina las cuales actúan reduciendo la hiperpermeabilidad y el edema.

Efectos sobre enfermedades coronarias: Estudios in vitro han demostrado que los F inhiben la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y reduce las tendencias trombóticas. Es por esto que la ingesta de F ha sido asociada con la disminución del riesgo de muerte por enfermedades coronarias como así también con la incidencia de infarto de miocardio. Los F cítricos ejercen una acción de regulación sobre la agregación de eritrocitos y la concentración (hematocrito), los dos principales factores que afectan la viscosidad de la sangre y el flujo.

Actividad antiinflamatoria, antialérgica y analgésica: La acción antiinflamatoria se ha asociado con la capacidad de actuar contra las histaminas y otros mediadores de los

procesos inflamatorios como son las prostaglandinas y los leucotrienos [31]. La actividad antialérgica está relacionada con la capacidad de afectar enzimas involucradas en la producción de sustancias antiinflamatorias, lo que significa que son útiles para el tratamiento de asma, alergias, artritis, etc.

Debido a estos efectos benéficos para la salud es que los F han sido incluidos dentro de los suplementos dietarios. La forma general en que se presentan para el consumo es combinado con la vitamina C ya que ha sido demostrado que mejoran la absorción de la misma [32]. En la Tabla 1.7 se da un ejemplo de recomendaciones de la firma comercial Whole Foods Market Health, para suplementos en cápsulas de vitamina C y F.

El uso de suplementos debe ser tomado con precaución. Si bien la ingesta de F en niveles normales presenta los efectos benéficos antes mencionados, ingestas elevadas puede evidenciar un rol dual sobre la mutagénesis y carcinogénesis.


19

Los F pueden actuar como antimutagénicos/promutagénicos y antioxidantes/prooxidantes dependiendo de los niveles consumidos y de las condiciones del organismo que los ingiere. La exposición a altos niveles de F, ya sea a través de la dieta y por suplementación, pueden originar especies reactivas de oxígeno, tales como oxígeno singulete, O2(1∆g) que daña el ADN. Al respecto existen estudios sobre la generación de O2(1∆g) de las formas Fl y Ch de N cuyos rendimientos cuánticos Φ∆ de 0.04 y 0.03 respectivamente [33].

Estos efectos se potencian durante el desarrollo fetal, donde hay un rápido crecimiento de células con una marcada sensibilidad a la exposición de fitoquímicos.

Todo esto sugiere que la comercialización indiscriminada de suplementos ricos en F pueden afectar de modo adverso la salud humana[34], además de la urgente necesidad de una reglamentación en esta área a fin de que las evidencias científicas sean trasladadas correctamente al conocimiento público y de esta manera sean útiles para los consumidores.


20

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Capítulo 2 Equilibrio de isomerización Chalcona-Flavanona

23

2.1-INTRODUCCION

Las chalconas constituyen un

importante grupo de sustancias comprendida dentro de los flavonoides.

La estructura química y el sistema de numeración utilizado se ilustran en la Figura 2.1, donde se aprecia que el núcleo fundamental de estas sustancias comprende dos anillos aromáticos unidos entre sí por un grupo carbonilo α,β-insaturado.

Las Ch experimentan reacciones químicas de gran interés, por ejemplo, sirven como materiales de partida para la síntesis de otras clases de sustancias, como flavonas [1]. Otro aspecto interesante, especialmente desde el punto de vista de la industria de los alimentos, es que las chalconas, por

medio de una reacción de hidrogenación, originan dihidrochalconas algunas de las cuales presentan sabor intensamente dulce, como es el caso de las DhCh derivadas de N y de NH, por lo que constituyen una alternativa a los edulcorantes sintéticos actualmente en uso [2].

Dentro de las chalconas, aquellas que presentan sustituyentes hidroxilos en posición 2’ o 6’, exhiben la particularidad de experimentar una reacción de cierre originando la estructura isomérica flavanona, Fl. Esta reacción es reversible por lo cual ambas especies están involucradas en un equilibrio que depende de los sustituyentes, el pH, la composición del solvente, entre otros.

Las primeras evidencias experimentales de la existencia del equilibrio de isomerización Ch-Fl fueron publicadas en el año 1956 por Shimokoriyama, [3] el cual analizando los F (chalconas, flavanonas y auronas) de Coreopsis tinctoria, observó que, si bien la forma chalcona era fácilmente oxidada a aurona, al mismo tiempo

Equilibrio de Isomerización Flavanona-Chalcona

O

23

4

5

6αβ

2'3'

4'

5'6'

AB

Figura 2. 1 Estructura química de Ch.


24

había una gran tendencia de Ch a convertirse a la forma Fl. Esta conducta “inusual” para Shimokoriyama sugirió en aquella época la existencia de un equilibrio de isomerización entre las formas Fl y Ch, Figura 2.2.

La reacción de ciclización de Ch a Fl constituye una etapa importante de la biosíntesis de flavonoides y está catalizada por la enzima Ch isomerasa (CHI). Ambos isómeros son precursores del resto de los flavonoides, Figura 1.7.

Existen datos en la bibliografía que indican que la reacción de ciclización de Ch a Fl ocurre en presencia de ácidos y está favorecida por un grupo hidroxilo en posición 6’ de Ch junto a una estructura tipo floroglucinol en el anillo A, (2’,4’,6’-triOH) [4].

También se ha informado la ciclización fotoinducida de chalconas en solventes tales como benceno, acetato de etilo y etanol [5].

Por otra parte, las Fl pueden también experimentar la apertura del anillo heterocíclico bajo condiciones alcalinas, por acción de ciertos microorganismos tales como Gibberella fukikuroi o por irradiación UV dando como productos 2’-OH Ch (20%), 4-fenildihidrocumarina (13%) y ácido salicílico (4%) [1]

El mecanismo de la reacción Fl-Ch ha recibido una gran atención por

diversos grupos de investigadores [6-11] encontrándose algunos resultados aparentemente contradictorios. Sin embargo, esta controversia se debe a la complejidad intrínseca de los flavonoides, ya que dependiendo de las condiciones de pH y de los grupos sustituyentes pueden generarse diferentes especies con reactividades modificadas, produciendo cambios en los mecanismos de formación de las Fl y/o Ch, tales como por ejemplo mediante un equilibrio de enolización o la formación de un carbanión intermediario dependiendo de la concentración de base presente [6, 8-12]. 2.2- EFECTO DE LOS SUSTITUYENTES SOBRE LA REACCIÓN DE CICLIZACIÓN DE CHALCONAS. El efecto de los sustituyentes sobre la velocidad de ciclización de Ch ha recibido una gran atención [6,8,9,12]. Los grupos sustituyentes estudiados generalmente son los grupos metoxilo e hidroxilo, muy frecuentes en los compuestos naturales.

La Tabla 2.1 resume las constantes de velocidad obtenidas para

Figura 2. 2 Equilibrio de isomerización Ch-Fl.

O

OH O

OChalcona Flavanona

R

R R

R


25

Tabla 2.1: Efecto de los sustituyentes sobre la velocidad de reacción de ciclización de Ch en soluciones acuosas

Ch con diferentes patrones de sustitución.

En la Tabla 2.1 puede observarse que la mayor velocidad de cierre a la forma Fl corresponde a la 2’-OHCh (I), mientras que la 2’,4,6’-triOHCh, también denominada NCh, es la que cicliza a menor velocidad.

Old y Main [7], establecieron los coeficientes de velocidad de ciclización de 2’-OH Ch con sustitución por un grupo metoxílo en posición C-4’ y C-6’. (Tabla 2.1, compuestos II y III) y observaron que, a pesar de que la disminución del pK de III con respecto a II (desde 9.55 a 8.95), la velocidad de ciclización de III es menor que la observada para II, esto es, considerando que la ciclización ocurre en forma apreciable cuando se ioniza el grupo hidroxilo en posición C-2’, la Ch III debería ciclizar a mayor velocidad que II ocurriendo lo contrario.

Por esta razón, argumentan que una correlación entre la velocidad y el pK es poco realista al igual que la correlación entre la basicidad y la nucleofilicidad del grupo 2’-O- y si bien indican que las diferencias en cuanto a la velocidad son de pequeño significado,

existiría un cierto impedimento para la ciclización de ciertas Ch 6’-sustituidas.

Por otra parte Furlong y Nudelman [9], estudiaron la ciclización de las Ch IV, V y VI en soluciones alcalinas acuosas indicando que no existe efecto de los sustituyentes analizados sobre la velocidad de reacción, excepto para la Ch VI la cual presenta una elevada energía de activación debiéndose esto al efecto donor de electrones del grupo 4-OH (el oxianión) que complica el ataque del fenolato de C-2’ sobre el Cβ. Miles y Main [8], analizando la reacción de ciclización de la Ch VII, indican que un grupo hidroxilo en posición C-6’, produce un efecto de catálisis ácida intramolecular de adición conjugada, no disponible para el caso de 2’-OHCh simples, Figura 2.3.

Dicha catálisis está fundamentada por el incremento en la velocidad observado con respecto a otras Ch sin ese patrón de sustitución

Este efecto lógicamente desaparece cuando se supera el valor de pK del grupo involucrado, es decir cuando se forma la Ch dianión

Ch pH T (ºC) k (s-1) Referencia

(I) 2’-OH 11.0 23.3 3.7 x10-3 [9] (I) 2’-OH 9.55 (pK) 30.0 7.5 x10-3 [7] (II) 2’-OH-4’-OMe 9.55 (pK) 30.0 2.7 x10-3 [7] (III) 2’-OH-6’-OMe 8.95 (pK) 30.0 0.5 x10-3 [7] (IV) 2’-3-diOH 11.4 24.4 3.0 x10-3 [9] (V) 2’,4’-diOH 12.5 22.7 1.8 x10-3 [9] (VI) 2’-4-diOH 11.2 24.0 0.3 x10-3 [9] (VII) 2’,6’-diOH-4,4’-diOMe 8.00 30.0 4.0 x10-3 [8] (VIII) 2’,6’,4-triOH (NCh) 8.00 30.0 0.2 x10-3 [6]


26

(pK=12.30) la cual es tres veces menos reactiva que la especie monoaniónica.

El efecto de la presencia de un grupo hidroxilo en posición C-4 fue estudiado para la Ch VIII (NCh) [6]. En el caso de VIII, la ionización del grupo 4-OH (pK=12.0) provoca una disminución de la velocidad de reacción con respecto a la forma monoaniónica. Este efecto es pequeño desde el punto de vista electrostático dado que el grado de deslocalización de la carga negativa junto al sistema enona, donde atacará el grupo 2’-O-, haría esperar un efecto mayor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que tal deslocalización incrementa la densidad de carga negativa sobre el Cα mucho más que sobre el Cβ.

En general, para Ch polihidroxiladas, la máxima velocidad corresponde a la forma monoaniónica ya que la ionización del resto de los grupos incrementa la deslocalización de la carga negativa y obstaculiza el ataque del fenóxido en C-2’ necesario para el cierre del anillo.

Furlong y Nudelman [11] estudiaron la reacción de ciclización de una serie de Ch sustituidas por grupos -OH, -OMe, -NO2 en las posiciones C-4, C-4’ y C-3. En su trabajo proponen un mecanismo concertado en medio básico en el cual el agua ataca el Cα seguido de un desplazamiento nucleofílico del hidroxianión (B) para formar el producto final.

Sus resultados indican que las variaciones de las constantes de velocidad son pequeñas para las diferentes sustituciones, excepto para la 2’,4-diOH Ch, la cual presenta un coeficiente de velocidad mucho menor.

Los resultados sugieren que un oxianión en posición para del anillo B tiene el mismo efecto que un grupo nitro en la misma posición. Esta pérdida de sensibilidad con respecto a la sustitución es consistente con el mecanismo concertado de catálisis ácida general y está sustentado por el hecho de que un sustituyente donor de electrones (como

O

O

MeO

HO

OMe

O

O OH

MeO

OMe

O

OH O

MeO

OMe

Figura 2. 3: Catálisis ácida general intramolecular por 6’-OH.[8]


27

O

O O

OChalcona Enolato Flavanona

O

O

H2O

OH-

R

R

R

R R

R

Figura 2. 4: Esquema propuesto para la reacción de isomerización Ch-Fl [7].

un oxianión) favorece el ataque de H+ sobre el Cα mientras que un aceptor de electrones como el grupo nitro facilita la adición del fenóxido sobre el Cβ.

En general la sustitución por un grupo -OH o -NO2 en posición C-4 disminuye la velocidad de reacción con respecto a la 2’-OH Ch. De ambas sustituciones, la presencia de un hidroxilo en posición C-4 provoca la mayor disminución en la velocidad de ciclización, por lo que postulan que el paso lento corresponde al desplazamiento nucleofílico del hidroxianión B.

2.3- EFECTO DE LOS SUSTITUYENTES SOBRE LA REACCIÓN DE APERTURA DE FLAVANONAS.

Old y Main [7] estudiaron el

efecto de la sustitución de grupos -OMe en posición C-4’ (II) y C-6’ (III) sobre la velocidad de ciclización y apertura del anillo.

Plantean que la apertura del anillo para formar la correspondiente Ch depende, tanto de la concentración del ion enolato en equilibrio con la Fl como de su velocidad de apertura, Figura 2.4. De acuerdo a esto, para la Ch III, la máxima estabilización del ion enolato requiere coplanaridad entre el oxígeno carbonílico y el grupo metoxilo. Esto haría que la concentración en equilibrio

del enolato de III sea menor que el correspondiente de II en las mismas condiciones. Sin embargo, el grupo metoxilo presente en III puede colaborar, por interacciones no enlazantes, a la apertura del anillo, resultando en una disminución de la energía libre de activación. Por lo expuesto anteriormente, se postula que existe un efecto compensatorio asociado al sustituyente en posición C-6’, es decir, si bien la concentración del ion enolato en equilibrio es menor para III que para II, esto es compensado por una velocidad mayor en la apertura del anillo, lo cual les permite predecir una velocidad de apertura del anillo similar para Ch II y III.

Miles y Main [6] por su parte compararon la velocidad de apertura, en medio básico, de N, (4’,5,7-trihidroxiflavanona) con la 5-OH-4’,7-dimetoxiflavanona las que difieren en la presencia de un grupo hidroxilo en posición C-4 del anillo B. Los resultados indican que la reacción de apertura del anillo de N dianión, es aproximadamente dos veces más rápida que la Fl de VII al mismo pH. Esto es interesante dado que, sobre la base del mecanismo propuesto que implica el ataque de un hidroxilo, proveniente de una base, sobre el Cα, la repulsión de las cargas entre dicho grupo y el sistema deslocalizado de la Fl que va desde el grupo 4-O- hasta el carbonilo, haría esperar que la reacción


28

de HO- con la Fl dianiónica sea más lenta que con la correspondiente de VII.

Este resultado indica la importancia de la presencia de un sustituyente hidroxilo en posición C-4 ya que dada esta alta reactividad, se postula la posibilidad de que la donación de electrones desde el grupo 4’-O-, ausente en VII, sea suficiente para ayudar a la partida del fenolato (2’-O-) en un estado de transición, como lo indica la Figura 2.5, predominando por sobre el efecto de repulsión entre HO- y 4-O-.

2.4- MECANISMOS DE REACCIÓN PROPUESTOS.

Los mecanismos de reacción

propuestos para la reacción de isomerización son variados. Implican tanto, reacciones catalizadas por bases, enolizaciones y mecanismos carbaniónicos.

Furlong y Nudelman [9], proponen un mecanismo donde el primer paso implica la ruptura del enlace puente hidrógeno catalizada por una base la cual se protona y ataca el Cα, Figura 2.6.

Old y Main en su trabajo [6] plantean tanto para la apertura como para el cierre la formación de un enolato en equilibrio con la Ch y la Fl, Figura 2.4.

Cisak y Mielczarek [12], en su estudio sobre los aspectos teóricos y prácticos de la isomerización de Ch - Fl postulan que la transferencia de protón es la fuerza conductora para la reacción de ciclización y apertura del anillo con un mecanismo carbaniónico operando entre pH 10 a 12.

O

OO

RO

O

H

-

-OH

Figura 2. 5: Estado de transición para la reacción de apertura del anillo de NCh [6].

+ B- + BH

O

O

O

H

OH

H

O

O

HB

O

Oδ−

δ−

+ B-

Figura 2.6: Mecanismo de isomerización Ch-Fl [9].


29

En soluciones menos alcalinas la enolización es el mecanismo principal.

En su trabajo plantean que con el incremento del pH la concentración del enol, originado por la deslocalización de la carga negativa del carbanión, disminuye exponencialmente aumentando la concentración del carbanión

De acuerdo con su hipótesis el mecanismo vía carbanión intermediario (Fl-), Figura 2.7, interviene a pH >10, prevaleciendo entre pH 12 ó 13 cuando la base fuerte (tal como HO-) deprotona

eficientemente el C-3 del anillo C y se produce la apertura del anillo antes de la formación del enolato. En otras palabras el par de electrones del carbanión puede directamente formar el doble enlace C2-C3 como parte de una estructura resonante extensamente conjugada. En una etapa posterior, el enlace oxígeno-C2 se disocia, el anillo pirona se abre y se forma el doble enlace. El oxígeno fenólico puede atacar el doble enlace olefínico para formar la correspondiente Fl, de esta manera la reversibilidad de la reacción de isomerización está

O

O

HH

HO

OH

H

+ HO- + H2O

-O

O

αβ

O

O

H

H

-

Figura 2.7: Mecanismo carbaniónico para la isomerización Ch-Fl [12].

O

O

OMe

+ HO- + H2O

O

OMe

O

O

OMe

O

OMe

OO

OMe

OOH

+ H2O HO- +

Figura 2.8: Mecanismo de isomerización vía enolato [13].


30

asegurada por una simple adición nucleofílica a un doble enlace conjugado con un carbonilo.

Andújar y col.[13] en su trabajo acerca de la 4’-OMe flavanona proponen un mecanismo de formación de enolato intermediario similar al planteado en la Figura 2.4. La diferencia radica en que una vez abierta la Fl, plantean que se produce una rotación de 180º alrededor del eje C-4’-C1’. El mecanismo se detalla en la Figura 2.8. 2.5- EFECTO DEL pH SOBRE LA REACCIÓN DE ISOMERIZACION

La reacción de isomerización depende, en forma marcada, del pH del medio. A pH ácidos y neutros predomina la forma Fl mientras que en pH alcalinos la reacción se desplaza hacia la forma chalcona.

Sin embargo la región de pH en la cual son estables ambas formas depende de los sustituyentes, especialmente en el caso de grupos hidroxilos ya que la ionización de los

mismos, en general, afecta la velocidad de ciclización de la chalcona, como se detalló en la sección 2.2.

La Figura 2.9 muestra la composición relativa de las especies Fl y Ch para el sistema 2’-hidroxiCh.[12] La gráfica muestra, de acuerdo a lo planteado anteriormente que la forma Fl es estable en un rango de pH de 0 a 10 mientras que en la región alcalina prevalece la forma aniónica de Ch.

2.6- CONFORMACIONES DE LAS CHALCONAS

Furlong y Nudelman [11] determinaron los cambios conformacionales de las Ch en medio básico aplicando 1H NMR. Aromatic-solvent-induced shifts (ASIS) indicando que las Ch existen en la conformación trans- s-cis, Figura 2.10.

Utilizando cloroformo deuterado analizaron las señales del grupo 2’-OH indicando la existencia de una interacción intramolecular con el grupo carbonilo.

Cuando adicionan hidróxido de sodio deuterado, comprueban que el anillo A rota 180º sobre el eje C-4’-C1’ existiendo una fuerte interacción entre el oxianión de C-2’ y el Hα, Figura 2.11.

Miles y Main [8] plantean el efecto de la ionización sobre la posición del equilibrio entre la poco reactiva trans-

10 11 12 13

0

20

40

60

80

100

Flavanona Chalcona

% C

halc

ona

pH

0

20

40

60

80

100

% F

lava

nona

Figura 2.9: Composición relativa del sistema

Fl / 2’-OH Ch [12].

OH

H

HO

trans s-cis

Figura 2.10: Conformación trans-s-cis de Ch.


31

s-cis y la reactiva trans-s-trans para la Ch VII, Figura 2.12. En su trabajo plantean que la barrera energética de rotación alrededor del enlace Cα-CO se espera que sea menor para la especie dianiónica que para la monoaniónica, de acuerdo con la disminución del orden de enlace. Dado que, desde el punto de vista cinético, la especie Ch monoaniónica es más rápida que la dianión, argumentan que la pérdida del enlace hidrógeno en la forma dianiónica y la consecuente repulsión electrostática entre los oxígenos fenólicos con el carbonilo favorecen la conformación s-cis donde el Cβ se encontraría muy alejado del 2’-O- dificultando la reacción de cierre. 2.7- HIDROGENACION DE CHALCONAS: DIHIDROCHALCONAS

En el año 1960, Horowitz y Gentilli, obtuvieron NHDhCh, a partir de la Fl Neohesperidina (NH).

Sorprendentemente, el nuevo compuesto no era amargo como su precursor, sino que al contrario, presentaba un sabor intensamente dulce, 1800 veces mayor que la sacarosa.

Este resultado los impulsó a convertir otras Fl cítricas a su correspondiente DhCh. En este trabajo [14] determinaron que dentro de las Fl con sustituyente neohesperidosa sólo N y NH presentan DhCh intensamente dulces. Todas las Fl rutinósido generan compuestos sin sabor, sin embargo la presencia de la sustitución por neohesperidósido es necesaria pero no suficiente. La presencia de otros disacáridos e incluso algunos monosacáridos mostraron compatibilidad con el sabor dulce de DHCh.

En la naturaleza, se conocen muy pocas DhCh entre las que se pueden destacar, floretina y floridzina, presentes en manzanas, cerezas y peras, Figura. 2.13.

CH3OD

O

OO

O

O O

CH3O-

Figura 2.11: Cambios conformacionales de Ch ante la adición de base [9].

O

O

MeO OMe

O

O

OO

MeO

OMe

trans-s-cis trans-s-trans

Figura 2.12: Equilibrio conformacional para Ch VII [8].


32

Químicamente, las DhCh pueden prepararse a partir de las Fl previa apertura del anillo heterocíclico bajo condiciones alcalinas y posterior hidrogenación.

Un ejemplo de esto lo constituye NHDhCh que se obtiene por medio de una reacción en un solo paso a partir de NH.[15], Figura 2.14. El material de partida para la producción comercial de NHDhCh es su correspondiente Fl, NH, la cual se extrae de la piel de naranjas inmaduras, o bien a partir de N siendo esta síntesis más compleja y costosa.

Este último proceso se basa en la conversión de N a floroacetofenona, la que se condensa con isovainillina de

donde se obtiene NH la que origina NHDhCh por posterior hidrogenación.

Por su parte, N constituye también una alternativa para la producción de su DhDCh, Figura 2.15, la cual se ha reportado como equivalente a la sacarina en base molar [14].

Los procedimientos para la obtención de dihidrochalconas son variados pero comúnmente se realizan por hidrogenación catalítica.

Se han publicado trabajos donde se sintetiza, a través de una reacción de condensación de Claidsen-Schmidt [16], la chalcona correspondiente la cual es posteriormente reducida.

Esta reducción también puede realizarse a partir de la correspondiente flavanona en medio básico [16,17], Figura 2.15.

Por otra parte Adams, Kern y col. [18] proponen la síntesis de bencilacetofenona (DhCh) a partir de una solución de la correspondiente Ch en acetato de etilo a la cual se le adiciona oxido de platino (PtO2) como catalizador. La mezcla se agita bajo corriente de hidrógeno de 15 a 25 min. El catalizador se separa por filtración y el disolvente se elimina destilándolo.

O

O

CH2OHO

OOH

OH

OMe

O

OH

OH

O

CH3

OH

OH OH

Hidrogenación catalítica(1) H2; Pd/C; KOH(2) HCl

O

O

CH2OHOH

OOH

OH

OMe

O

OH

OH

O

CH3

OH

OH OH

Figura 2.14: Reacción de síntesis de NHDhCh [15].

OHOH

O

OH

GlucO

OHOH

OOH

OHFloretina

Floridzina

Figura 2.13: Estructura química de DhCh.


33

OH- H2

H+ catalizador

O

OH

RO

OH

O

OH

OH

RO

OH

O

OH

OH

RO

OH

O

OOH

RO OH

+

O

XY

z

OH-

OH

OH

RO

YX

O

z

H2 / Pd calor

OH

OH

RO

YX

O

z

O

OH

RO

YX

O

z

OH-

H2/Pd

Figura 2.16: Esquema general para la síntesis de DhCh a través de la reacción de arilación catalizada por Paladio [16].

Figura 2. 15: Reacción de obtención de NDhCh

Figura 2.17: Esquema general para la síntesis de DhCh a través de la reacción de arilación catalizada por Paladio [19].

R+

OOH

R [Pd]

OHX

OH

RR


34

La bencilacetofenona se recristaliza en EtOH con un rendimiento de aproximadamente 81 a 95%.

Briot y col [19], desarrollaron un método alternativo a partir de un o-halofenol y 1-aril-2-propen-1-ol, catalizada por Paladio, Figura 2.16.

Periasamy y Thirumalaikumar informan la obtención de DhCh por reducción de Ch con NiCl2–NaBH4.[20]

Otros procedimientos para obtener DhCh implican la utilización de microorganismos los cuales actúan sobre las correspondientes Fl glicosiladas.[21]

Dado el interés de la industria en estos compuestos, la extracción de flavonoides a partir de residuos cítricos y su conversión a DhCh ha sido, desde hace tiempo, motivo de numerosas patentes.[2, 22].


35

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[11] Furlong, J.J.P.; Sbarbati Nudelman,

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[20] Periasamy, M.; Thirumalaikumar, M. Methods of enhancement of reactivity and selectivity of sodium borohydride for applications in organic


36

synthesis..J Organomet. Chem. 609. Issue 1-2. 137-151. 2000.

[21] Linke, A.H.B.; Natarajan, S.; Eveleigh, D.E. A new screening agent to detect the formation of dihydrochalcone sweeteners by microorganisms. Abstracts of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology, 171. Abstracts Nº 184. 1973.

[22] Baier, W.E. U.S. Patent. 2.421.063. 1974.

37

3.1- INTRODUCCIÓN

Tanto los aceites, las grasas,

como los alimentos que los contienen, están sujetos, durante su procesamiento y almacenamiento, a reacciones químicas que pueden alterar de modo indeseable las características del producto final. Hidrólisis y oxidaciones de ácidos grasos insaturados pueden ser responsables de estos procesos.

La oxidación es una reacción compleja catalizada por diversos factores extrínsecos que se inicia con la formación de radicales libres y tiene como productos primarios hidroperóxidos que afectan profundamente las características sensoriales y nutricionales de los alimentos reduciendo su tiempo de vida útil y tornándolos inaceptables para el consumidor. 3.2 - OXIDACIÓN DE LÍPIDOS EN ALIMENTOS

Los lípidos constituyen uno de los

principales componentes de los

alimentos y de otros sistemas biológicos. Este grupo de biomoléculas

orgánicas pueden clasificarse en dos clases principales: lípidos simples y lípidos compuestos.

Los lípidos simples son aquellos que no se separan en porciones menores por hidrólisis. Dentro de este grupo se encuentran esteroides, prostaglandinas y terpenos.

Los lípidos compuestos son aquellos que se hidrolizan con facilidad para formar los lípidos simples. La mayor parte de estos compuestos son ésteres de ácidos carboxílicos de cadena larga, llamados ácidos grasos. Los dos grupos principales de ésteres son las ceras y los glicéridos.

Los lípidos existen tanto en animales como en plantas constituyendo una fuente potencial de energía por beta oxidación o, como lípidos constituyentes de membrana. En el almacenaje, los lípidos existen como triglicéridos, mientras que en las membranas se encuentran como fosfolípidos, esteroles,

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Capítulo 3 Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

38

esfingolípidos y glicolípidos. Muchos alimentos de origen vegetal contienen lípidos altamente insaturados. Los lípidos de origen animal presentan bajos contenidos de lípidos insaturados pero contienen ciertas cantidades de ácidos grados altamente insaturados.

La presencia de dobles enlaces en la molécula de los ácidos grasos los hace susceptibles del ataque por el oxígeno provocando cambios químicos complejos que, eventualmente se manifiestan por el desarrollo de olores y sabores indeseables. Este proceso, denominado autooxidación es un proceso de radicales libres. La extensión del período de inducción de la autooxidación es sensible a la presencia de componentes minoritarios que pueden extender dicho período, conocidos como AO, o aquellos que lo acorten, denominados prooxidantes.

Los productos de oxidación lipídica pueden, si son ingeridos a través de los alimentos, desencadenar la peroxidación in vivo, ocasionando problemas para la salud. [1]

El uso de sustancias que retarden o inhiban la velocidad de la reacción de oxidación en alimentos que contienen lípidos minimiza la rancidez y consecuentemente retardan la formación de productos de oxidación tóxicos para quienes los consumen permitiendo mantener la calidad nutricional y los caracteres organolépticos del mismo. 3.3- MECANISMO DE LA OXIDACIÓN DE LÍPIDOS

La oxidación de los lípidos es una

reacción compleja catalizada por factores extrínsecos tales como metales u

oxígeno, que puede suceder por ejemplo durante el procesamiento de un alimento a altas temperaturas. Dicha reacción se inicia por la formación de radicales libres, teniendo como productos resultantes peróxidos, hidroperóxidos, aldehídos, cetonas, ácidos y polímeros que generan modificaciones de las características organolépticas del alimento, trastornos gastrointestinales por su ingestión, destrucción de las vitaminas liposolubles: A, D, E, carotenoides y ácidos grasos esenciales originando una disminución de la calidad nutricional del alimento.[1]

El mecanismo básico de la peroxidación lipídica consta de tres etapas: iniciación, propagación y terminación.

INICIACIÓN La oxidación de un lípido comienza con la formación de radicales libres. La reacción de iniciación se refiere al ataque de alguna especie lo suficientemente reactiva, denominada iniciador L., capaz de abstraer un átomo de hidrógeno del grupo metileno alilíco de un ácido graso insaturado o por adición de un radical a un doble enlace:

••• +→ HR RH L 3.1

•• +→ HORO ROOH 3.2

OHROORO 2ROOH 2++→ •• 3.3 Donde RH, R., ROOH, RO., ROO. y L. corresponden al lípido, radical lipídico, hidroperóxido, radical alcoxilo, radical peroxilo e iniciador respectivamente.


39

La formación del radical lipídico R.., es usualmente mediada por trazas de metales, irradiación o calor. También, los hidroperóxidos lipídicos, los cuales existen en cantidades de trazas aún antes de la oxidación, pueden romperse dando radicales como se indican en las ecuaciones 3.2 y 3.3. Esto es, los hidroperóxidos, bajo ruptura homolítica o bajo descomposición bimolecular pueden formar el radical alcoxilo (RO..). Los hidroperóxidos pueden formarse de varias maneras que incluyen, reacción de lípidos insaturados con oxígeno singulete o por oxidación de ácidos grasos poliinsaturados catalizada por la enzima lipoxigenasa.

PROPAGACIÓN Una característica de los radicales libres es su tendencia a proceder en reacciones en cadena. La formación inicial de un radical es responsable de la subsecuente transformación química de innumerables moléculas a través de una cadena de eventos. De hecho, la propagación de la oxidación de los lípidos es una reacción en cadena que consume oxígeno y genera una nueva especie radicalaria denominada radical peroxílo, ROO., el cual puede abstraer otro átomo de hidrógeno de un ácido graso vecino produciendo hidroperóxidos y radicales lipídicos que retroalimentan la reacción, ecuaciones 3.4 y 3.5. De esta forma, la degradación oxidativa de lípidos, frecuentemente es descripta como un proceso autocatalítico o autooxidativo.

•• →+ ROO O R 2 3.4

•• +→+ RROOHRHROO 3.5

Una vez formado el radical lipídico, R., éste tiende a estabilizarse mediante un arreglo por deslocalizacion formando dienos conjugados, Figura 3.1 los cuales pueden reaccionar de diferentes maneras, sin embargo, en condiciones aeróbicas, se combinan principalmente con oxígeno molecular originando radicales peroxilos tal como se describe en la ecuación 3.4. El oxígeno molecular es particularmente susceptible al ataque del radical, como lo indica el valor de la constante de velocidad (k≈ 3 x 108 M-1s-1) de la reacción 3.4 [2], además presenta una energía de activación cercana a cero y por lo tanto es prácticamente controlada por difusión. Es por esto que en muchos sistemas conteniendo oxígeno la reacción (3.4) conduce a una acumulación de radicales peroxilo (ROO.) los que, de acuerdo a lo descrito anteriormente y tal como se indica en la ecuación 3.5, son los principales responsables de la propagación de la oxidación. El paso de propagación también puede ser inducido por una reacción de adición de radicales a compuestos con cadenas insaturadas generando radicales centrados en carbono.

TERMINACIÓN Un radical libre se define como una entidad que posee electrones desapareados y es estructuralmente inestable lo cual significa que es altamente reactivo.


40

A medida que transcurre la reacción, los radicales libres que se acumulan en el sistema, pueden reaccionar unos con otros apareando los electrones y formando especies no radicalarias estables. De esta manera, las reacciones de terminación conducen a una interrupción de la etapa de propagación de la reacción en cadena. Aunque el acoplamiento de los radicales está asociado con una muy baja entalpía de activación, las reacciones de terminación están controladas por la concentración del radical, la cual es responsable de la frecuencia de encuentros efectivos, por la orientación correcta, y por la difusión a través del medio de reacción. En las ecuaciones 3.6, 3.7 y 3.8 se enumeran las reacciones de terminación:

3.6

3.7

3.8 Los productos finales de la oxidación lipídica son derivados de descomposición de hidroperóxidos tales como alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y productos de elevado peso molecular resultantes de reacciones de dimerización y polimerización. La formación de aldehídos y otros compuestos volátiles confieren sabor y olor desagradables al alimento, afectando las propiedades organolépticas del producto.

En la Figura 3.1 se muestra, a modo de ejemplo, la peroxidación lipídica del ácido araquidónico. 3.4- FACTORES QUE INDUCEN ESTADOS PROOXIDANTES 3.4.1-Oxígeno El oxígeno en su estado fundamental no es reactivo y puede coexistir perfectamente con la materia orgánica. Este hecho se explica en función de la denominada “restricción por spin”. Es un hecho conocido que las transiciones permitidas son aquellas que ocurren entre moléculas con estados de igual multiplicidad de spin, tal como lo indican las ecuaciones 3.9, 3.10 y 3.11.

3.9

3.10

3.11 Donde S y T

representan los estados singulete y triplete respectivamente La molécula de oxígeno en su estado fundamental posee dos electrones desapareados con spin paralelos correspondiendo esto a un estado de multiplicidad triplete, mientras que las moléculas orgánicas presentan estado fundamental singulete. De esta manera la interacción entre ambas está prohibida por spin. Sin embargo, las especies más reactivas en los procesos de oxidación son las formas activas de oxígeno. Estas formas reactivas pueden obtenerse mediante la activación física o química de oxígeno, tal como se indica en la Tabla 3.1.

ROORROOR →+ ••

RRRR −→+ ••

2OROORROOROO +→+ ••

permitidoSS →+

permitidoTT →+

prohibidoTS →+


41

La activación física sucede principalmente por transferencia de energía de excitación desde un pigmento o sustancia fotoactivada (fotosensibilizador) hacia el oxígeno. Esta energía es suficiente para invertir el spin de uno de sus dos electrones, originando el estado excitado singulete de oxígeno, 1O2, el cual presenta una alta difusibilidad y reactividad hacia moléculas orgánicas (cuyos electrones están generalmente

apareados) y como consecuencia se observan daños, por ejemplo en las membranas fotosintéticas. La activación química ocurre por reducción del oxígeno molecular en su estado basal. Para la reducción de oxígeno a agua se requiere un total de cuatro electrones y cuatro protones. La ganancia de cada electrón por parte del oxígeno genera una especie activa del mismo, Tabla 3.1.

COOH

Acido Araquidónico

- H.

COOH

14 11 8 5

.13

COOH.11

Dieno Conjugado

O2

COOHOO

Radical PeroxiloRH

R.

COOHOOH

Peróxido Cíclico Hidroperóxido

O O

COOH

11

9

.O

O

COOH

Endoperóxido Cíclico Malonaldehído (MDA)

O2

Hidrolisis ó calor O O

.

Figura 3.1: Mecanismo para la peroxidación lipídica del ácido araquidónico. Se indica la abstracción de H del C-13. El H también puede ser abstraído del C-10 o C-7, originando otros peróxidos como productos finales [11].


42

22222 OOH2HOO +→++ +−•−•

OOHHOHO 2 2222 +→++ +−••

Tabla 3. 1: Formación de las principales especies reactivas de oxígeno. Algunas de las características de las principales formas activas de oxígeno son:

Anión Superóxido: O2.-, es una

especie que en solución acuosa puede actuar como una base aceptando un protón para formar el radical hidroperoxilo (HO2

.), en un equilibrio como se indica en la ecuación 3.12:

3.12

La ecuación 3.12 es la reacción ácido-base del anión superóxido cuyo pK es aproximadamente igual a 4.8, lo cual indica que en soluciones ácidas predomina el radical hidroperoxilo, mientras que a pH por encima del pK prevalece el anión superóxido.

Por su parte, el anión superóxido en solución acuosa puede dismutar espontánea o enzimáticamente originando H2O2, según se indica en las ecuaciones 3.13a, b, c,

3.13a

3.13b

3.13c

Peróxido de Hidrógeno: si bien el H2O2, no es un radical libre, participa

como un oxidante o reductor en muchas reacciones celulares. A diferencia del anión superóxido, el peróxido de hidrógeno es altamente difusible a través de las membranas y compartimentos acuosos y puede inactivar enzimas a bajas concentraciones. Al ser más estable que las otras especies, es menos tóxico, sin embargo es peligroso dada su capacidad de generar el altamente reactivo radical hidroxilo por reacción con metales tales como Fe2+ y posiblemente con iones Cu+, como se explicará más adelante, o bien por ruptura homolítica por radiación UV-Vis

Radical Hidroxilo: HO., es el más poderoso agente oxidante en sistemas biológicos.

Es altamente reactivo frente a cualquier molécula biológica y la velocidad con la que reacciona está controlada por difusión.

Las diferentes especies reactivas pueden causar, en diferentes medida, inhibición de enzimas específicas, degradación o blanqueamiento de clorofilas, peroxidación lipídica, como por ejemplo el peróxido de hidrógeno y el oxígeno singulete pueden atacar ácidos grasos insaturados formando hidroperóxidos,

Especie Reactiva Reacción

Activación Física Oxígeno Singulete Clorofila* + O2 → Clorofila + 1O2

Activación Química Radical Anión Superóxido O2 + e- → O2

.- Peróxido de Hidrógeno O2

.- + e- + 2H+ → H2O2

Radical Hidroxilo H2O2 + e- + H+→ HO. + H2O

22222 OOHHOHO +→+ ••

−•• + 22 OH HO


43

Especie Nombre Común Tiempo Vida (37ºC)

HO. Radical Hidroxilo 1x10-9 seg O2

.- Radical Anión Superóxido 1x10-6 seg 1O2 Oxígeno singulete 1x10-6 seg RO. Radical alcoxilo 1x10-6 seg ROO. Radical peroxilo 7 seg NO. Radical óxido nítrico 1-10 seg H2O2 Peróxido de Hidrógeno Estable HOCl Ácido Hipocloroso Estable

Tabla 3. 2: Especies reactivas de oxígeno [3].

La toxicidad de las diferentes

especies activas de oxígeno está relacionada con su corto tiempo de vida antes de reaccionar con componentes celulares. En la Tabla 3.2 se muestran los tiempos de vida de las principales especies reactivas de oxígeno. La estructura electrónica de estas formas activadas de oxígeno determina su reactividad. El radical HO. y 1O2 son las formas más reactivas seguida por el radical anión superóxido y el peróxido de hidrógeno. Algunas formas activas pueden interconvertirse en presencia de catalizadores específicos. 3.4.2- Calor La velocidad de oxidación de un lípido se incrementa con el aumento de la temperatura, esto es, con el tratamiento por calor al cual se somete un alimento. Durante el calentamiento del producto se producen numerosos cambios químicos, algunos de los cuales son importantes para el flavor, la apariencia, el valor nutritivo y la toxicidad. La química de la peroxidación lipídica a altas temperaturas es complicada dado que ocurren reacciones termolíticas y oxidativas

simultáneamente. Si bien los ácidos grasos saturados son relativamente estables a las temperaturas usadas en la industria de los alimentos, los ácidos insaturados se deterioran en presencia de oxígeno y calor formando compuestos volátiles de olor desagradable [4]. Es importante recalcar que la extensión de la oxidación de un alimento presenta una gran variabilidad muy difícil de prever y se encuentra influenciada por algunos factores tales como la presencia de sustancias prooxidantes y AO presentes en la matriz alimentaría. 3.4.3- Fotosensibilización Parecería imposible que la reacción directa de una molécula de lípido (R-H) con una molécula de oxígeno conduzca a la formación de hidroperóxidos con facilidad. De hecho, sobre la base del concepto de conservación del momento angular de spin, es improbable que una molécula de lípido, la cual posee un estado electrónico singulete, reaccione con la molécula de oxígeno con un estado fundamental triplete. Aunque los hidroperóxidos se producen durante la etapa de propagación, el rol de un


44

iniciador, tal como la enzima lipoxigenasa o fotosensibilizadores, es muy importante desde el punto de vista de la formación de hidroperóxido inicial. Es bien conocido que sensibilizadores naturales y artificiales tales como clorofilas, hematoporfirinas o flavinas (incluyendo riboflavina, vitamina B2) son capaces de convertir oxígeno triplete a singulete. El mecanismo de formación de 1O2 por fotosensibilización o activación física, Tabla 3.1, implica una transferencia de energía, desde una molécula denominada sensibilizador hacia una molécula de oxígeno en su estado fundamental. El proceso implica la absorción de radiación por parte del sensibilizador el cual pasa primero al estado excitado singulete y luego por cruce entre sistemas (ISC) al estado triplete, ecuación 3.1. Desde este estado es capaz de transferir ese exceso energético a una molécula de oxígeno en su estado fundamental, originando la especie singulete, ecuación 3.15.

Esta especie de oxígeno puede reaccionar con una molécula de lípido formando hidroperóxidos. La secuencia se indica a continuación:

*S*SS 31h →→ ν 3.14

S*OO*S 21

233 +→+ 3.15

ROOHRHO*2

1 →+ 3.16

Donde 1S, corresponde al estado singulete del sensibilizador, 1S* es el estado excitado singulete, 3S* es el estado excitado triplete del sensibilizador, 3O2 es el triplete normal de oxígeno, 1O2* estado excitado singulete del oxígeno y hν es la energía de la luz en fotones. El oxígeno singulete reacciona 1000 a 10000 veces más rápido que el oxígeno normal con linoleato de metilo, ya que ahora la reacción está permitida por spin.

3.4.3- Lipoxigenasas Junto a los metales, las lipoxigenasas, (LOX), son unos de los principales factores prooxidantes. Las lipoxigenasas son enzimas que existen tanto en plantas como en animales. La Tabla 3.3 muestra algunas características y fuentes vegetales de la LOX.

Especificidad a Peroxidación (%) Fuente pH óptimo 9-LOOH 13-LOOH

Soja L-1 9.0 5 95 Soja L-2 6.5 50 50 Arvejas L-2 6.5 50 50 Maní 6.0 0 100 Papa 5.5 95 5 Tomate 5.5 95 5 Trigo 6.0 90 10 Pepinos 5.5 75 25

Tabla 3. 3: Fuentes y características de lipoxigenasas de origen vegetal.


45

Estas enzimas catalizan la oxidación de algunos ácidos grasos insaturados a sus correspondientes hidroperóxidos. Estos hidroperóxidos tienen la misma estructura que los obtenidos por autooxidación, sin embargo las reacciones catalizadas por esta enzima están caracterizadas por su especificidad de sustrato, selectividad de peroxidación, rango de pH óptimo para la actividad de la enzima, susceptibilidad al calor, y una alta velocidad de reacción en el rango de 0-20ºC. Las LOX oxidan sólo ácidos grasos conteniendo un sistema 1-cis,4-cis-pentadieno. Los sustratos preferidos y su especificidad varían de acuerdo al origen, Figura 3.2. Las enzimas de origen vegetal reaccionan con los ácidos linoleico y linolénico, mientras que las de origen animal reaccionan con el ácido araquidónico. 3.4.4- Metales: Hierro y Cobre

Los metales de transición son buenos promotores de las reacciones radicalarias debido a la transferencia de un electrón durante el cambio de su estado de oxidación. Entre las posibles reacciones, la descomposición de

hidroperóxidos parece ser el principal proceso de iniciación. Una simple ruptura del enlace O-O (energía de activación de 184 kJ/mol) origina la formación de radicales libres, ecuación 3.2, los cuales son responsables de la iniciación de la reacción radicalaria. Dicha ruptura es insignificante en alimentos excepto cuando son sometidos al calor durante su cocción.

El proceso bimolecular descrito en ecuación 3. 3 es más importante para la generación de radicales libres en alimentos

En presencia de iones metálicos, tales como hierro y cobre, la descomposición catalítica de hidroperóxidos es la principal fuente de radicales libres siendo este proceso conocido como reacción de Fenton. Los iones metálicos aceleran la peroxidación por descomposición de hidroperóxidos en bajos (ecuación 3.17) y altos (ecuación 3.18) estados de oxidación.

Los radicales alcoxilos y peroxilos producidos durante estas reacciones pueden abstraer hidrógeno de una molécula de lípido vecina y continuar la cadena de reacción de la peroxidación lipídica, ecuación 3.19 a y b.

COOHO2

OOH

COOH COOHOOH

LOX-1 de soja LOX de tomate

Figura 3. 2: Especificidad de LOX frente a la oxidación de ácido linoleico.


46

•++•++ ++ →+ HO)(CuFeRO)(CuFeROOH 23rápida2

+++•++ ++ →+ H)(CuFeROO)(CuFeROOH 2lento23

ROHRRHRO +→+ ••

ROORRRHROO +→+ ••

3.17

3.18

3.19. a

3.19. b

3.20

3.21.a

3.21. b

Estos procesos pueden proceder en un ciclo de reacciones en cadena, siempre que las cantidades de iones metálicos sea adecuada para generar efectivamente radicales libres.

Agentes reductores tales como ácido ascórbico o radical anión superóxido pueden acelerar estas reacciones dependientes de iones metálicos.

Para el caso particular del hierro, el ión Fe2+ puede tomar parte de las reacciones de transferencia de electrones con el oxígeno molecular, ecuación 3.20. El anión superóxido puede dismutar para formar peróxido de hidrógeno, ecuación 3.21.a, el principal componente para la reacción de Fenton, ecuación 3.20.b, y conducir a la formación del altamente agresivo radical hidroxilo.

La adición de una sal de hierro a un lípido insaturado libre de peróxidos provoca el comienzo de la etapa de iniciación de la peroxidación lipídica (abstracción de un H por el radical HO.).

Esta reacción puede ser inhibida por enzimas que remueven peróxido de hidrógeno, tales como las enzimas

catalasas o selenio glutation peroxidasa, sustancias secuestrantes de radical hidroxilo y agentes quelantes que acomplejen hierro y prevengan su participación en la reacción radicalaria.

Sin embargo, es necesario resaltar que estos iones metálicos son esenciales para muchas funciones fisiológicas, tales como participar como constituyentes de proteínas y cofactores de diferentes enzimas, por ejemplo hierro para catalasas, cobre para ceruloplasminas y Cu, Zn para peróxido dismutasa, implicadas en el sistema de defensa antioxidante [32]. Por estas razones su presencia en alimentos es de gran importancia para cubrir de esa manera la demanda del organismo. 3.5- ANTIOXIDANTES

En sistemas biológicos existen

varios mecanismos de defensa que implican enzimas, vitaminas y otras sustancias naturales que protegen a los componentes celulares del daño oxidativo.

En los alimentos, existen naturalmente compuestos que imparten

-2

3-2

32

22

2 OFe )OFeO(Fe OFe +−↔−+ ++++

2222 OOH2H2O +→+ +−

•−++ ++→+ HOHOFeOHFe 322

2


47

RHAROOAH +→+ ••

cierta protección pero que, en muchos casos son degradados durante el procesamiento o almacenamiento de los mismos, necesitándose la adición de sustancias exógenas que detengan o inhiban el proceso oxidativo. Es por eso que, para evitar los daños de carácter tanto sanitario como económico que causa la rancidez, se recurre a la adición de sustancias capaces de proteger los lípidos, al captar el oxígeno, inactivar los radicales libres que se forman o complejar metales, etc.

Los AO son un grupo de sustancias que, estando presentes en bajas concentraciones, comparadas con el sustrato oxidable, retardan o previenen significativamente la oxidación de los mismos [5]. Por las razones expuestas anteriormente, los AO son un grupo indispensable de aditivos alimentarios que prolongan el tiempo de vida útil de un alimento sin alterar su calidad sensorial o nutricional. 3.5.1 CLASIFICACION DE LOS ANTIOXIDANTES

Existen numerosas maneras de clasificar a los AO, de acuerdo al origen se clasifican en naturales o sintéticos; teniendo en cuenta su solubilidad son AO hidrosolubles o liposolubles, etc.

La principal clasificación tiene en cuenta el modo de acción de estas sustancias durante el proceso de oxidación. De acuerdo a esta clasificación los AO se dividen principalmente en dos grupos:

AO Tipo I: actúan interrumpiendo

la cadena de reacción, ya sea a través

de la donación de electrones o de átomos de hidrógeno a los radicales libres generados en la reacción de oxidación, transformándolos en especies termodinámicamente estables y generando radicales estabilizados que no contribuyen a la reacción en cadena, ecuaciones 3.22, 3.23, 3.24.

3.22

3.23

3.24 donde; AH y A. denotan al antioxidante y su radical y R., ROO., RO. representan al radical del lípido, radical peroxilo y radical alcoxilo, respectivamente

Durante las reacciones descritas en las ecuaciones 3.22, 3.23, 3.24, los AO se transforman en especies radicalarias de baja reactividad, muy estables que pueden interferir con la etapa de propagación al reaccionar con otros intermediarios radicalarios, eliminándolos del medio y formando compuestos AO peroxilos, como se indica en las ecuaciones 3.25 y 3.26:

3.25

3.26

Los AO tipo I más empleados en

la industria de los alimentos son las sustancias polifenólicas que responden a la estructura general mostrada en la Figura 3.3.

Los AO fenólicos presentan sustituyentes alquílicos o grupos donores de electrones en posición orto y/o para en el anillo aromático.

RHARAH +→+ ••

ROHAROAH +→+ ••

ROOAROOA →+ ••

ROAROA →+ ••


48

Los grupos donores de electrones

incrementan la densidad electrónica sobre el grupo hidroxilo por un efecto inductivo y aumentan la reactividad hacia los radicales lipídicos. La Figura 3.4 muestra las estructuras de los AO sintéticos y naturales pertenecientes a esta categoría.

La reacción de estos AO con los radicales libres resulta en la formación de un radical libre fenoxilo estabilizado

por deslocalización del electrón desapareado en el anillo aromático, Figura 3.5.

El radical libre fenoxilo será tanto más estable cuando más grande sea el grupo sustituyente, o bien, será menos reactivo por impedimento estérico

AO Tipo II: también denominados

preventivos, actúan por diferentes mecanismos que incluyen complejación con metales, secuestro de oxígeno, descomposición de hidroperóxidos, absorción de radiación UV o desactivación de oxígeno.

Los más utilizados son los agentes complejantes entre los que se destacan ácido cítrico especialmente para complejar trazas de Fe en aceites vegetales [6], ácido Tartárico, Lecitina y ácido Etilendiaminotetraacetico (EDTA).

OHR2R1

R4R3

Figura 3.3: Estructura general de los AO del tipo I.

OHOHOH

COOC3H7

Galato de Propilo Butilhidroxianisol Butilhidroxitolueno (BHA) (BHT)

OHC(CH3)3

OMe CH3

C(CH3)3C(CH3)3

OCH3

CH3

OH

CH3

CH3 CH3 CH3 CH3

CH3

α−tocoferol (TOH)

O O

OHOH

CH2OH

OH

O

OHOH

OH

OHOH

OAcido Ascórbico (AA) Quercetina

Figura 3.4: Estructura de AO del tipo I frecuentemente utilizado en alimentos.


49

Secuestrantes de oxígeno, tales como ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo para matrices lipídicas y sulfitos, reaccionan con oxígeno libre y lo remueven de los sistemas cerrados. El ácido ascórbico (AA) y el palmitato de ascorbilo pueden actuar regenerando AO del tipo I, denominándose Coantioxidantes (CoAO).

Los carotenoides, especialmente β- caroteno, son efectivos para desactivar oxígeno singulete previniendo así la formación de hidroperóxidos, [7]. Su acción está limitada por la presión de oxígeno, ya que para presiones por encima de 150 mm Hg pueden actuar como prooxidantes. También pueden actuar como AO del tipo I a bajas presiones de oxígeno.

En cuanto a la descomposición de peróxidos en sustancias no radicalarias; los compuestos que ejercen este efecto incluyen principalmente aminas terciarias y ácidos fuertes y por eso no son utilizables en los alimentos [6].

La clasificación de los AO es en realidad algo limitada, algunos AO pueden actuar por diversos mecanismos y por lo tanto pertenecer a los dos tipos AO descritos anteriormente, es decir, actúan tanto como AO primarios, secundarios y CoAO

Los polifenoles, especialmente los que presentan estructura catecol, (o-

OH) pueden actuar como AO de Tipo I y también como complejante de metales. 3.5.2. SINERGISMO ENTRE AO: CO-ANTIOXIDANTES (CoAO) El sinergismo entre AO se define como el efecto de dos o más AO, los cuales son menos efectivos individualmente que combinados. La función sinérgica puede ocurrir por varios mecanismos. Algunos AO pueden actuar, por ejemplo, como donores de hidrógeno al radical fenoxilo, regenerando el AO primario, situación que permite utilizar cantidades menores de sustancias AO, si se adiciona simultáneamente un CoAO [12]. Secuestrantes de oxígeno, tales como AA, palmitato de ascorbilo reaccionan con oxígeno y lo remueven. El AA actúa también como co-AO de los AO del tipo I, especialmente con tocoferoles. Buettner y col [2], sugieren que en una mezcla de ambos compuestos el AA puede reducir a la forma oxidada del tocoferol, ecuación 3.26 y 3.27. Esto puede explicarse en función de los potenciales de reducción, (TO•, H+/ TOH, E0’= 480 mV: A-, H+/AH- E= 282 mV). El radical TO. es más oxidante que el Asc•- por lo tanto se reduce, regenerándose [2]. Este efecto sinérgico es máximo para peroxidaciones iniciadas en fase lipídica.

O

R

O

R

.O

R.

Figura 3.5: Estabilización del radical fenoxílo.


50

3.27

3.28 3.6-METODOS DE DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (AAO) Y ANTIRRADICALARIA (AAR).

Muchos modelos in vitro e in vivo

han sido desarrollados para la evaluación de la AAO. Sin embargo, la interpretación de los resultados obtenidos a partir de estos sistemas modelos deben tomarse con precaución debido a que métodos diferentes se basan en mecanismos diferentes, resultando en valores aparentemente contradictorios.

Lamentablemente no existe el sistema perfecto que permita determinar el “verdadero” poder AO de un compuesto o de una mezcla compleja de AO [8]. La elección de una metodología apropiada depende fundamentalmente de las características del compuesto o extracto a analizar. En general, la efectividad de un AO se determina monitoreando su poder

de inhibición en un proceso de oxidación, Actividad Antioxidante (AAO) o bien midiendo la capacidad de una sustancia para atrapar radicales libres, en cuyo caso se determina como Actividad Antirradicalaria (AAR).

Las estrategias para la determinación de la AAO de una sustancia consisten básicamente en comparar la extensión o velocidad de un proceso oxidativo en ausencia y presencia del AO.

Para la AAR la metodología implica el monitoreo del cambio de alguna propiedad relacionada con la captura de los radicales libres, por ejemplo la disminución de la absorbancia UV-Vis de una solución de DPPH. ante la

adición de un AO. El monitoreo de las reacciones

puede ser realizado utilizando métodos químicos, instrumentales o sensoriales.

En general, cualquier ensayo para la determinación de la capacidad AO está caracterizado por tres parámetros: el sustrato a oxidar, el iniciador de la oxidación y una técnica apropiada para medir el punto final u otro

•• +→+ TOROOHTOHROO

−•−• +→+ AscTOHAscHTO

Determinación de la AAO

1- Ensayos de inhibición

2- Medidas del tiempo de

inducción

3- Ensayos de

decoloración

a- Medidas

a tiempo fijo

b- Análisis cinéticos

Figura 3. 6: Clasificación de las distintas estrategias para la determinación de la AAO.


51

n = 1EC50 x 2

parámetro que sirva para evaluar el progreso de la oxidación. (Tabla 3.2). Debido a la gran variedad tanto de sustratos, de fuentes radicalarias y de técnicas analiticas y además de las diferentes combinaciones posibles es que han surgido en la literatura numerosas estrategias para la determinación de la capacidad AO de un compuesto, o extracto.

Robards y col, clasifican a las diferentes estrategias en tres categorías, Figura 3.6 [9].

En el sistema 1, los reactivos se mezclan y se determina el punto final a un intervalo de tiempo predeterminado, tipo a, o la velocidad de la reacción, tipo b. En ambos casos, la adición de una sustancia AO modifica tanto el parámetro punto final como la velocidad de la reacción. En los ensayos pertenecientes al grupo 2, se determina la duración del período de inducción y los cambios en el punto final. Muestras con alta actividad AO suprimen los cambios mucho más que aquellas con menor actividad. En los ensayos incluidos en el punto 3 se utiliza una sustancia coloreada. Esta sustancia presenta generalmente una absorbancia UV-Vis estable la cual desaparece ante la adición de un AO

En la Tabla 3.4 se indican algunos de los métodos más utilizados en la determinación de la AAO.

De manera similar a la gran

variedad de métodos para determinar la actividad AO las formas de expresar los resultados son numerosas y en muchos casos depende incluso de cada autor.

A modo de síntesis se detallan a continuación algunos de los parámetros más utilizados:

Concentración Eficiente (Efficient Concentration) (EC50), utilizado en el ensayo de decoloración del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH·), Figura 3.7, el cual presenta una intensa banda de absorción a 515 nm cuya absorbancia disminuye en presencia de una sustancia AO.

El valor de EC50 expresa la

concentración, o, para el caso de extractos, los µl de AO necesarios para reducir el 50% de la concentración inicial del radical. En la bibliografía se utilizan indistintamente tanto EC50, como las siglas IC50, (Inhibition Concentration), SC50, (Scavenging Concentration) [23]. Otros parámetros relacionados con la AAR son el Poder Antirradicalario (ARP), definido como la inversa del valor de EC50, [23] y el Factor Estequiométrico, (n), [21] el cual expresa el número de moles de radical consumido por mol de AO adicionado. Cuando el valor de EC50 se expresa en concentración molar es posible determinar el factor estequiométrico por medio de la ecuación 3.29:

3.29

N

NO2

NO2

O2N N.

Figura 3.7: Estructura química del radical libre estable DPPH..


52

Tabla 3. 4: Metodologías frecuentemente utilizadas para la determinación de la AAO

Método Fundamento de la Técnica Índice Tipo Ref.

Ensayo de peróxidos lipídicos

Detección de peróxidos por iodometría o colorimetría por reacción con tiocianato férrico

Valor de peróxidos (PV)

Sist. 1 9,10

Método de absorción de oxígeno

Detección de consumo de oxígeno (manómetro Warburg) o detección de incremento de masa

Absorción de Oxígeno Sist 2 11

Ensayo de dienos conjugados

Detección espectrofotométrica de dienos conjugados formados por oxidación iniciada térmica o enzimáticamente, en presencia de metales de transición (ej. lipoxigenasas, sulfato de Cobre, cloruro férrico)

% Inhibición Sist. 1, 2 12,13,14

Test del Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

Detección espectrofotométrica de aldehídos formados durante la oxidación lipídica mediante reacción con ácido tiobarbitúrico.

Sist. 1 15

Test anisidina (valor de Anisidina)

Detección espectrofotométrica de productos formados por reacción entre aldehídos, 2-alquenales y productos de descomposición volátiles con p-anisidina.

Valor de anisidina Sist. 1,2 16

Método Rancimat

Medidas de conductividad de ácidos de cadena corta producidos en condiciones de oxidación acelerada (altas T y aireación)

Sist. 2 17

Método del AAPH 2,2’-azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro

Detección espectrofotométrica de la desactivación de fluorescencia de 2,7-diclorofluoresceína o ficoeritrina por reacción con los radicales peroxilos originados por descomposición de AAPH.

TRAP, ORAC Sist. 3 18,

19

Decoloración del radical catión ABTS.+

Detección espectrofotométrica de la decoloración del radical catión preformado ABTS+ originado por oxidación de 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) ABTS con: a-metamioglobina b-MnO2 c-Persulfato de Potasio

a-TEAC I b- TEACII c- TEACIII

Sist 1,2. 20, 21, 22

Ensayo de decoloración del radical libre DPPH

Monitoreo espectrofotométrico de la decoloración del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo. (DPPH)

EC50, ARP Sist. 1,2. 23

Sistema Acido Linoleico/β-caroteno

Detección espectrofotométrica de la decoloración de una emulsión acuosa de β-caroteno durante la oxidación Ácido linoleico.

% Inhibición Sist 1,2. 24


53

Parámetro Antioxidante de

captura de radicales total: (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter) (TRAP), basado en las medidas de consumo de oxígeno durante una reacción de peroxidación lipídica inducida por descomposición térmica del hidrocloruro de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) (AAPH), [25]

El parámetro TRAP se utiliza generalmente referido a una sustancia patrón, [21] por ejemplo Trolox C, Acido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, (un análogo a la vitamina E soluble en agua) y se define como la relación entre el periodo de inducción de la muestra con respecto al tiempo de inducción de Trolox, Figura 3.8.

Actividad Antioxidante Equivalente de Trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (TEAC) [26] El TEAC refleja la capacidad de un antioxidante de donar un átomo de hidrógeno o electrón comparada con Trolox.

Capacidad de Absorción de Radical Oxígeno (Oxygen Radical Absorbance Capacity) (ORAC) donde se combinan tanto el tiempo como el grado de inhibición dentro de un mismo valor.

Los valores se reportan como µmoles equivalentes de Trolox 3.7- ANTIOXIDANTES EN ALIMENTOS

El uso de AO en alimentos data

desde antes de la década del ‘40. Sustancias naturales, como la goma guaiaca, se usaron inicialmente para preservar grasas y aceites.

En la actualidad estas sustancias fueron reemplazadas por compuestos sintéticos con AAO mejores y de mayor disponibilidad.

El uso de AO en alimentos está regulado por las leyes de cada país y por estándares internacionales. A pesar de que muchos compuestos naturales o sintéticos presentan AAO, solamente algunos de ellos son aceptados como “seguros”.

Para que una sustancia sea empleada en alimentos debe cumplir con los siguientes requisitos a) Carecer de acción tóxica o

interferente b) Ser soluble en la matriz alimenticia (distribución homogénea, con emulsionante y sinergista) c) No modificar los caracteres organolépticos del alimento d) Actuar en pequeñas cantidades (0.1 a 0.5 g/kg)

Figura 3. 8: Estructura química del azo iniciador AAPH y el equivalente hidrosoluble de la vitamina E, Trolox-C.

C C N N C C NH2Cl-

NH2

CH3

CH3CH3

-ClH2N

NH2

CH3+ +

O

CH3

H3C

HO

CH3

CH3

COOH

AAPH Trolox -C


54

e) Conservar su acción, aún a altas temperaturas [27]. 3.7.1- ANTIOXIDANTES PERMITIDOS POR EL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO

En la República Argentina, el

Código Alimentario Argentino, CAA, dentro del grupo de Aditivos Alimentarios, Capítulo XVIII, Articulo 1391, enumera las sustancias AO permitidas para su uso en alimentos, especialmente para aquellos que contengan ciertos aceites esenciales, terpenos, así como otras sustancias aromáticas.

Según el CAA para que una sustancia pueda se utilizada como AO debe cumplir con los siguientes requisitos: a) Ser inocuos por sí mismos o a través de su acción como aditivos en las condiciones de uso. b) Formar parte de la lista positiva de aditivos alimentarios del presente Código c) Ser empleados exclusivamente en los alimentos específicamente mencionados en este Código. d) Responder a las exigencias de designación, composición, identificación y pureza que este Código establece.

Según el CAA los AO son indispensables para la protección de ciertos aceites esenciales, especialmente los que contienen terpenos, así como de otras sustancias aromáticas.

En la Tabla 3.5 se indican los AO permitidos para su utilización en alimentos.

3.8- ANTIOXIDANTES NATURALES

Dada la importancia de la peroxidación lipídica en el deterioro de los alimentos, la industria, con el fin de preservarlos, ha recurrido a la adición de sustancias que de acuerdo a lo mencionado, son en su gran mayoría de origen sintético. Sin embargo en la actualidad existe una gran controversia acerca de la seguridad de su empleo, por ejemplo se han publicado trabajos sobre los efectos perjudiciales para la salud que presenta el uso de BHT y BHA [28].

Esto ha motivado a los investigadores a buscar sustancias naturales con AAO, que puedan actuar solas o sinérgicamente con otros aditivos [1].

En el reino vegetal, existen numerosas sustancias con propiedades AO, entre las que se pueden citar los tocoferoles, los ácidos ascórbico, cítrico, los carotenoides y por supuesto los F.

En la Tabla 3.6 se muestran algunas fuentes de AO naturales. A pesar de la variedad es importante tener en cuenta que su uso está limitado a productos que sean compatibles con sus texturas, color, flavor y por supuesto con su naturaleza hidro o liposoluble. 3.9- FLAVONOIDES COMO ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS NATURALES

La búsqueda de nuevos AO llevó a identificar y aislar sustancias entre las cuales se encuentran los F. Estos polifenoles ejercen propiedades AO vía varios mecanismos tales como secuestro de especies ROS y entre ellos radicales


55

Sustancia Estructura Química Usos y Dosis Máxima

Permitida α-tocoferol y mezclas de tocoferoles naturales

CH3

OH

CH3

CH3

O CH3

CH3

CH3 CH3 CH3

Se utilizan en grasas de origen animal, especialmente combinado con AA.

Ácido Ascórbico (AA), Ascorbatos de Sodio y Calcio

O

OH

OH

OH OH

O

No se especifica

Ácido Cítrico, Fosfórico

H3PO4, No se especifica

Ácido Eritórbico O

OH

OH OH

OOH

No se especifica

Galatos de propilo, octilo y dodecilo

COOR

OHOH

OH

R: C3H7 galato de propilo C8H17 galato de octilo C12H25 galato de dodecilo

Utilizados en grasas y aceites. Máximo 1g/kg

Hidroxianisol butilado(BHA); Hidroxitolueno butilado (BHT);

OH

OMe

C(CH3)3

OH

CH3

C(CH3)3(CH3)3C

Utilizados en grasas, aceites y alimentos que los contengan. Máximo 1g/kg

Palmitato y estearato de ascorbilo

O

OOC(CH2)14CH3

OH OH

OOH

Máximo 1g / kg

Ter-butil hidroquinona (TBHQ)

OH

OH

C(CH3)3

Máximo 1 g/ kg o en mezclas con BHT y BHA

Tabla 3. 5: Estructura química y características de algunos AO alimentarios permitidos por el CAA

hidroxilos, alcoxilos y peroxilos, la inhibición de enzimas implicadas en su formación, la complejación de metales y la regeneración de AO endógenos ligados a la membrana tales como α- tocoferol (vitamina E) [29]. Si bien en la actualidad no son empleados industrialmente como AO, existen estudios acerca de su utilización por

ejemplo extractos conteniendo flavonoles, flavanoles de uva en la conservación de pescado [30].

Rey y col [31] estudiaron el efecto de adicionar F puros (Q y R) y extractos de hierbas conteniendo polifenoles a carne de cerdo, indicando que los mejores resultados se lograron con Q.

OHCOOH

COOHCOOH


56

Buteína (3,4-dihidroxiCh) es un

potente AO utilizado en grasas de cerdo. A una concentración de 0.02% es dos veces más activa que Q o TOH y seis veces más reactiva que BHT [11].

Las isoflavonas de soja combinadas con tocoferoles y fosfolípidos, son efectivas para preservar pescados [11]. 3.9.1- ACCIÓN ANTIOXIDANTE IN VITRO

Los F actúan como AO

principalmente de dos maneras: 1- Inhiben enzimas responsables de la producción de anión superóxido, tales como xantina oxidasa y proteinquinasa C. Los F han mostrado también inhibición hacia ciclooxigenasa, lipoxigenasa, monooxigenasa, glutation S-transferasa, succinoxidasa mitocondrial y NADH oxidasa, todas implicadas en la generación de ROS [32,37].

Por otra parte, ciertos F complejan eficientemente trazas de metales Fe y Cu, los cuales juegan un rol importante en el metabolismo de oxígeno [32].

Los sitios propuestos de unión con metales son el núcleo catecol en el

anillo B, el grupo 3-OH, 4-oxo en el anillo heterocíclico C y el anillo B y el 4-oxo, 5- OH entre el heterociclo C y el anillo A, Figura 3.9.

2- Debido a sus bajos potenciales de reducción, (0.23 < E7 < 0.75V) [33], donde E7 representa el potencial de reducción a pH 7, los F son termodinámicamente capaces de reducir los radicales libres oxidados con potenciales redox en el rango de 2.13- 1.00 V, tales como los radicales superóxido, peroxilos, alcoxilos e hidroxilos por cesión de un átomo de hidrógeno, ecuación 3.30, Tabla 3.7:

HROSFlOROSFlOH −+→+ • 3.30

donde ROS. representa a las especies reactivas de oxígeno, anión superóxido, etc.

Fuentes Sustancia Antioxidante

Aceites y semillas Tocoferoles y Tocotrienoles; Sesamol y sustancias relacionadas; aceite de oliva; Fosfolípidos.

Avena y ciertos tipos de arroz Varios compuestos derivados de lignina.

Frutas y vegetales Acido Ascórbico, Acidos hidroxicarboxílicos, Flavonoides y Carotenoides.

Especias, hierbas, té, cacao Compuestos Fenólicos. Proteínas e hidrolizados de proteínas Aminoácidos, productos de reacción de Maillard.

Tabla 3. 6: AO naturales en algunos ingredientes alimentarios

O

O

OO

OO

MeMe

Me

Figura 3.9: Sitios de unión de F con metales.


57

Tabla 3. 7: Potenciales de reducción a pH 7 para cuplas de radicales seleccionados [32].

3.9.2- INFLUENCIA DE LA ESTRUCTURA SOBRE LA ACTIVIDAD AO DE FLAVONOIDES

La Tabla 3.8 muestra los datos de

potenciales de reducción, los potenciales de oxidación a medio pico a pH = 7 y la AAO de algunos F expresada como TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox) [34,35].

Jovanovic y col [33], sobre la base de que tanto la oxidación electroquímica como la cesión de un átomo de hidrógeno implican la ruptura del mismo enlace [32], proponen que el potencial de oxidación a medio pico, Ep/2, es un parámetro recomendable para evaluar la AAO de F.

De acuerdo con esta hipótesis, F con Ep/2 < 0.2 son definidos como fácilmente oxidables y por lo tanto buenos AO.

Por otra parte, y teniendo en cuenta que los compuestos con mayor AAO son los que presentan el mayor valor de TEAC y Ep/2 < 0.2, de la Tabla 3.8 puede observarse que la catequina Epigallocatequina, el flavonol Quercetina y la antocianidina Cianidina son los mejores AO, mientras que la flavanonas Naringina y Hesperidina se encuentran entre las sustancias de menor capacidad para actuar como AO.

De la Tabla 3.8 puede concluirse por lo tanto que la AAO de los F depende tanto de su estructura como del arreglo de los grupos funcionales que presenta.

En los últimos 15 años investigadores abocados al estudio de la Relación Estructura- Actividad (REA), han generado varias líneas consistentes que evidencian el rol específico de los componentes estructurales como requisitos para la capacidad de atrapar radicales libres, capacidad de complejar metales y AAO de los F.

La aplicación nutricional de esta información requiere una investigación exhaustiva del metabolismo de las sustancias, el análisis sistemático de los alimentos en cuánto a la composición de F y la comparación de la AAO in vivo.

3.9.2.1- RELACION ESTRUCTURA-ACTIVIDAD DE FLAVONOIDES

Los criterios estructurales para

establecer la AAO están definidos principalmente por: la presencia de un grupo catecol en el anillo B o anillo B o-hidroxilado, capaz de donar átomos de hidrógeno o electrones para estabilizar especies radicalarias [34,35,36 ], y un doble enlace en posición C-2,C-3 en conjunción con un grupo oxo en posición 4, responsables de la deslocalización electrónica

Radical E7 (V) HO., H+/ HO- 2.310 RO., H+/ ROH (alcoxilo) 1.600 ROO., H+/ ROOH (peroxilo) 1.000 PUFA., H+/PUFA-H 0.600 TO., H+/ TOH 0.480 Ión ascorbato.-, H+/ ión ascorbato- 0.282


58


59

La oxidación de un F, con este patrón de sustitución, ocurre sobre el anillo B formando o-semiquinonas, relativamente estables, Figura 3.10.

A continuación se detalla el efecto de cada uno de los parámetros estructurales:

Grupos hidroxilos: El arreglo espacial de los

sustituyentes es un factor determinante en la AAO. De acuerdo con lo observado para muchos AO fenólicos, tanto la posición como el número total de grupos hidroxilos influyen sustancialmente sobre el mecanismo de la AAO. La presencia de grupos hidroxilos en el anillo B es más efectiva que en el anillo A.

Estos grupos hidroxilos donan hidrógeno y un electrón a radicales hidroxilos, peroxilos y peroxinitritos estabilizándolos y transformándose en radicales fenoxilos relativamente estables.

En cuanto al número de hidroxilos presentes, Cao y col [37] indican, que a mayor sustitución por grupos hidroxilos, mayor AAO expresada en ORAC.

Ciertas flavonas y flavanonas estructuralmente homólogas muestran un incremento lineal y exponencial respectivamente de la capacidad de atrapar radicales peroxilos e hidroxilos, con el número total de grupos OH, por ejemplo. Kaempferol (5,7,4’-trihidroxiflavonol), Quercetina (5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavonol) y Miricetina (5,7,3’,4’,5’-pentahidroxiflavonol) tienen actividad en ORAC de 2,7; 3,3 y 4,3 respectivamente.

Una estructura 3’,4’- catecol en el anillo B mejora fuertemente la inhibición hacia la peroxidación lipídica. Este arreglo estructural es una característica importante de los más potentes AO para atrapar radicales peroxilo, superóxido, etc. Por ejemplo, la capacidad de capturar radicales peroxilo de Luteolina excede substancialmente a Kaempferol. Figura 3.11, a pesar de presentar el mismo número de grupos hidroxilos

Se ha reportado que el principal factor que controla la actividad de los F con un sistema catecol en el anillo B es la estabilización por enlace puente

OHOH

OHO

OOR. RH R. RH

Fl-OH Semiquinona Quinona

Figura 3.10: Captura de especies reactivas de oxígeno por F [32].

O

OHOH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OOH

Figura 3.11: Estructura de Luteolina y Kaempferol respectivamente.


60

hidrógeno intramolecular del radical fenoxilo formado, Figura 3.12 [38].

El efecto de otros patrones de sustitución no es claro, sin embargo las evidencias indican que el incremento del número total de grupos hidroxilos incrementa la AAO.

Al respecto, F conteniendo solamente un grupo hidroxilo en el anillo B, específicamente en posición 4’, son pobres AO. El mecanismo de acción es vía la formación de un radical fenoxilo.

Este es el caso particular de F sin la presencia del doble enlace en el anillo C, lo cual interrumpe la conjugación. Dos ejemplos típicos lo constituyen Apigenina (5,7,4’-trihidroxiflavona) y Naringenina (5,7,4’-trihidroxiflavanona) las cuales presentan la mínima reactividad posible debido a la relativamente lenta formación del radical fenoxilo [29]. Los hidroxilos en posición 3 y 5 potencian la acción antioxidante. Este patrón de sustitución también les confiere la acción complejante de metales, como se vio en la Figura 3.9.

Además del número de grupos hidroxilos, un factor determinante para la AAO es su localización con respecto a los anillos. Que el anillo C esté cerrado o no es indistinto para la efectividad, sin embargo son de fundamental importancia la presencia de un grupo hidroxilo en posición 3 y un doble enlace en posición C2-C3 que permite la conjugación entre los anillos aromáticos [39].

Burda y Oleszek [40], analizaron la AAO y AAR de diferentes F a fin de elucidar la relación entre la estructura química y su AAO informando que, comparado con BHT y α-tocoferol, los compuestos con un grupo hidroxilo libre en posición C3 muestran una capacidad antioxidante similar, indicando que dicho grupo hidroxilo es el responsable de la alta inhibición de la oxidación del β-caroteno en un sistema heterogéneo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta la capacidad de acceso a la fase lipidica, la cual se modifica al bloquearse dicho grupo [29].

La glicosilación o metilación de otros hidroxilos no produce tal efecto.

El ángulo de torsión del anillo B con respecto al resto de la molécula influencia fuertemente la capacidad de atrapar radicales. Flavonoles con 3-OH son planares, dado que se ha postulado que los grupos hidroxilos del anillo B forman enlace hidrógeno con el 3-OH alineándolo con el heterociclo C y el anillo A, mientras que flavanonas y flavonas carecen de coplanaridad y por lo tanto son débiles AO. Remover el 3-OH disminuye la coplanaridad y la conjugación, por lo tanto compromete la capacidad antioxidante [41].

Ejemplo de esto lo constituyen Quercetina (5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavonol), Figura 3.13, la cual exhibe un valor de TEAC de aproximadamente 4.7, mientras que Luteolina, sin el grupo 3-OH presenta un valor de 2.1, o sea una

OHR

OH ROO.

OHR

O

R

OH

O

Figura 3.12: Estabilización del radical fenoxilo en el anillo B de los F por enlace puente

hidrógeno intramolecular [38].


61

disminución del 50% en la AAO. La sustitución del 3-OH por un grupo metilo o por un glicósido suprime la actividad de Quercetina y Kaempferol.

La o- metilación.

Aunque la relación de los

sustituyentes metoxilo a hidroxilo no necesariamente condiciona la capacidad para atrapar radicales de los F, el anillo B es particularmente sensible a la posición de los grupos metilos. Una configuración 6’-OH/4’-OMe a una 6’-OMe/4’-OH reduce completamente la capacidad de atrapar radicales DPPH por reducir la coplanaridad [39].

La diferencia observada en cuanto a la AAO entre F polihidroxilados y polimetoxilados radica principalmente en los efectos estéricos que perturban la coplanaridad.

La obstrucción estérica de la estructura 3’,4’-catecol por un –OMe en posición 4’, compromete significativamente la capacidad AO. Por ejemplo, la sustitución del grupo hidroxilo en posición 4’ de Quercetina por un grupo metilo (Tamarixentina) disminuye la inhibición de la peroxidación inducida

por sulfato ferroso desde un 98.0% a –2.6% [42].

En conclusión la mayoría de los investigadores acepta que la sustitución de un grupo hidroxilo por un metilo compromete la AAO, sin embargo, la influencia de los grupos metilos no es clara ya que en la bibliografía existen datos aparentemente contradictorios.

Dicha controversia puede deberse a que los resultados dependen del método utilizado para su evaluación, el tipo de radical usado y las propiedades fisicoquímicas de los AO, ya que, por ejemplo en un sistema lipídico, la lipofilicidad es un factor crucial para acción antioxidante.

El doble enlace C-2,3 y la función

4-oxo: F con un doble enlace en

posición C2-C3 en conjugación con un grupo carbonilo en posición C4 presentan valores menores de EC50 (indicativo de una fuerte AAO) comparado con F cuyos heterociclos están saturados.

La mayoría de los investigadores concuerdan que aquellos F que presentan ambas características estructurales son potentes AO. La conjugación entre el anillo A y el B permite un efecto de resonancia que estabiliza al radical fenoxilo, optimizando el efecto de la estructura catecol del anillo B.

Glicosilación

En general, la glicosilación

reduce la capacidad de atrapar tanto

OHOH

OOH

OH

OHO

Figura 3. 13: Estructura del flavonol Quercetina. El sombreado indica las características estructurales importantes para la AAO de F.


62

radicales libres como de inhibir la oxidación [32].

Las agliconas son más potentes AO que sus correspondientes glicósidos. Daidzeína y Genisteína aglicona exhiben mayores valores de TEAC (1,25 y 2,9) que sus 7-glicósidos (1,15 y 1,24 respectivamente) [ 43 ]. Además de la presencia; la posición y la estructura del azúcar juegan un rol importante.

Ioku y col. evaluaron el efecto de Quercetina y varios de sus glicósidos en una suspensión fosfolipídica liposomal expuesta a ROS en medio acuoso, Luteolin y quercetina exceden significativamente sus 3-4’- y 7-O-glicósidos en la acción de retardar la acumulación de hidroperóxidos en bicapas de membranas, pero un azúcar en posición 4’ presenta mayor efecto supresor que la sustitución en posición 3 ó 7.

Cuando la C-glicosilación se da en el anillo A también disminuye la actividad y el efecto negativo puede ser una consecuencia del azúcar en sí mismo, más que por la sustitución de grupo hidroxilo original.

Rice Evans y col [34] compararon los valores obtenidos para Naringenina (TEAC 1.5 ± 0.05 mM) con Narirutina (5,4’-dihidroxi-7-rutinósido (TEAC 0.76 ± 0.05 mM mostrando que la glicosilación en posición 7 en una estructura con un heterociclo saturado y solamente un grupo OH en el anillo B reduce fuertemente la actividad antioxidante. Un efecto similar se observa con Hesperetina (TEAC 1.4 ± 0.08 mM), comparado con su glicósido Hesperidina (TEAC 1.08 ± 0.03 mM), lo cual es una evidencia de lo descrito anteriormente.

3.10-INTERACCION FLAVONOIDES Y ACIDO ASCORBICO

Existen innumerables evidencias

acerca de que el consumo de frutas y vegetales es benéfico para la salud y contribuye a la prevención de procesos degenerativos tales como cáncer y enfermedades cardiovasculares. Estas propiedades benéficas han sido atribuidas a varios fitonutrientes entre los que se destacan el ácido ascórbico (AA), y los F.

La interacción AA-F ha recibido una gran atención por parte de los investigadores reportándose resultados aparentemente contradictorios, por un lado se postula que varios F sirven como CoAO para el AA mientras que otros autores indican lo contrario, es decir que el AA protege a ciertos F.

Miller y Rice-Evans [ 44 ] determinaron la AAO, asociada fundamentalmente al AA, de jugos de naranjas, manzanas y grosellas negras comerciales y la estabilidad de Vitamina C en los mismos, concluyendo que las sustancias fenólicas presentes en los jugos (Hesperidina, Narirutina, Antocianidinas, etc) protegen a la Vitamina C, Figura 3.14.

Los F retardan la degradación de ión ascorbato a Ácido dehidroascórbico (DHA). El mecanismo para esta protección implica el complejamiento de cobre y otras trazas de metales F, resultando en una disminución de la oxidación de AA catalizada por metales.

Otro efecto implica la capacidad de los F para atrapar radicales libres. La formación de los mismos está considerada como una etapa muy


63

FlO- + AH. FlO. + AH-

importante en la oxidación del ión ascorbato.

En cuanto a lo fisiológico [45], se han considerado varias interacciones tales como:

a) Incremento de la absorción del ácido ascórbico b) Estabilización del ácido ascórbico c) Reducción de DHA a ión ascorbato

Bors y col [ 46 ] estudiaron la

interacción F-AA sobre la hipótesis de la existencia de una analogía con el sinergismo observado entre ión ascorbato y α-tocoferol, ecuaciones 3.26 y 3.27.

El trabajo consistió en determinar

los potenciales de reducción de algunos F y combinaciones con AA en un sistema radical azida/ ión ascorbato/ F a pH 8.5, empleando la técnica de radiolisis pulsada.

Las reacciones básicas planteadas para ese sistema son:

3.31.a,b

3.32

3.33.a,b

3.34

3.35

3.36

Donde FlOH, FlO-, FlO. y Fl=O

corresponden a F reducido, disociado, univalentemente oxidado (semiquinona o radical fenoxilo) y el totalmente oxidados (quinona) respectivamente, y AA, AH-

,AH• y DHA denotan, Ácido Ascórbico, ion ascorbato, radical ascorbilo, y Ácido Dehidroascórbico.

Los potenciales de reducción de la Tabla 3.7 fueron obtenidos mediante los parámetros cinéticos de las reacciones resaltadas 3.31 y 3.33. La reacción descrita por la ecuación 3.33 se plantea específicamente para aquellos F que forman o-quinonas en el anillo B.

FlO. + FlO. Fl = O + FlOH

Fl = O + AH. FlO. + DHA

FlO. + AH. FlOH + DHA

FlO. + AH. Fl = O + AA

AH. + AH. AA + DHA

Parámetros Flavonoide K1

k30a/ k30b K2

k32a/ k32b

ln K1 ln K2 ∆E10

(mV) ∆E2

0

(mV) E1

0

(mV) E2

0

(mV)

Dihidroquercetina 74.4 - 4.31 - -110 - 83 - Kaempferol 0.54 - -0.62 - 16 - 209 - Luteolina 1.6x10-2 0.10 -4.15 -2.29 106 59 299 -115 Fisetina 0.44 18.43 -0.81 2.91 21 -75 214 -249 Quercetina 3.3x10-4 10.10 -8.02 2.30 205 -59 398 -233 Rutina 4.1x10-2 4.22 -3.19 1.44 82 -37 275 -211

Tabla 3.9. Parámetros termodinámicos de cuplas flavonoides/ión ascorbato a pH 8.5 [46].

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

% R

eman

ente

de

Vit.

C

tiempo (h)

Figura 3.14: Estabilidad de Vit. C proveniente de jugos comerciales de: grosellas negras (25%); grosellas negras (17%); naranjas con adición de Vit. C; manzanas y Redoxón disuelto en agua mineral [44].


64

A partir de los parámetros termodinámicos y los potenciales de reducción obtenidos, concluyen la existencia de dos comportamientos.

Aquellos F que poseen una estructura catecol en el anillo B, presentan potenciales de reducción mayores que los de la cupla del Ascorbato, por lo que en estos casos predomina la regeneración del F, o sea la ecuación 3.30b.

Los F que no presentan las características estructurales mencionadas en el punto anterior tienen potenciales de reducción menores que ascorbato, por lo que la reacción predominante es la descrita en la ecuación 3.30a, o sea la regeneración de ascorbato a partir del radical ascorbilo. De considerable interés es el hecho de que el flavonol Quercetina, frecuentemente encontrado en alimentos, así como también su glicósido Rutina, son regenerados por ión ascorbato a partir del correspondiente radical fenoxilo. Tal interacción, análoga a la reacción de AA con α- tocoferol podría ser una evidencia de un efecto sinérgico entre un F y el ión ascorbato. Galatti y col [47] compararon la actividad prooxidante de F y su capacidad de cooxidar ión ascorbato. La reacción consistió en oxidar ión ascorbato en un sistema H2O2/peroxidasa en presencia de F. Se compararon las velocidades de cooxidación de ión ascorbato ante F conteniendo un sólo grupo hidroxilo con sus equivalentes catecoles para tres clases de F: las flavonas Apigenina versus Luteolina, las flavanonas Naringenina versus Eriodictiol y los flavonoles Kaempferol versus

Quercetina. Los resultados indican que los radicales semiquinonas de polifenoles conteniendo estructura catecol en el anillo B son los responsables de oxidar ión ascorbato más rápidamente que las o-quinonas. 3.11-ACTIVIDAD PROOXIDANTE DE FLAVONOIDES

La presencia de algunas

características estructurales que optimizan la AAO de los F, tales como la presencia de un sistema catecol en el anillo B, pueden también exacerbar su actividad prooxidante. Los radicales fenoxilos producidos durante la oxidación de los F pueden actuar como prooxidantes en sistemas conteniendo metales activos. La presencia de oxígeno y metales de transición tales como cobre y hierro, catalizan reacciones que forman ROS y otros radicales que pueden dañar ADN, lípidos y otras moléculas biológicas [48]. El radical fenoxilo interactúa con oxígeno molecular, generando quinonas y anión superóxido. Esta última reacción puede tener lugar en presencia de altos niveles de iones metálicos y es la responsable del efecto prooxidante indeseado de los F [49]. Esto es, la capacidad de actuar como AO de los F depende no sólo del potencial redox de la cupla Fl-O./ FlOH sino también de las posibles reacciones del radical fenoxilo.

La captura del radical superóxido es particularmente importante, porque si bien este radical es de reactividad intermedia, es el precursor del radical hidroxilo, altamente reactivo.


65

Fl 1Fl 3Flhν ISC

3.37

3.38

3.39

3.40

3.41 La oxidación inicial de catecoles

por Cu (II) genera semiquinonas, ecuación 3.37, que pueden reaccionar con oxígeno para formar el radical anión superóxido, ecuación 3.38. Esta reacción tiene un carácter autocatalítico dado que el anión superóxido es capaz de oxidar a un nuevo F regenerando la semiquinona y peróxido de hidrógeno el cual también se origina por desproporción del radical superóxido, ecuaciones 3.39 y 3.40. En presencia de trazas de Cu (I), el H2O2 es rápidamente convertido a radical hidroxilo .OH, en una reacción tipo Fenton, ecuación 3.41.

La actividad prooxidante es directamente proporcional al número total de grupos hidroxilos. La presencia de grupos hidroxilos múltiples, como el caso de Miricetina (5,7,3’,4’,5’-pentahidroxi flavonol) especialmente en el anillo B, la incrementan [50].

La o- metilación y probablemente otras modificaciones atenúan tanto la conducta AO como la prooxidante [37].

En presencia de RNS, F con configuración pirogallol (3 grupos

hidroxilos adyacentes) en el anillo A o B inducen daños al ADN.

Existen evidencias que el doble enlace 2,3 y la función 4-oxo, además de una estructura catecol en el anillo B, promueven la formación de ROS inducidas por la presencia de Cu(II) y oxígeno [42].

Montenegro [7] en su trabajo postula que algunos F bajo irradiación pueden presentar efectos prooxidantes por generación de O2 (1∆g) mediante un mecanismo de transferencia de energía entre el F y el oxígeno molecular, ecuación 3.39, pudiendo también actuar como AO por desactivación del O2 (1∆g) tanto por vía física como química, ecuaciones 3.44 y 3.45.

3.42

3.43

3.44

3.45

OH

OH+ Cu(II) + Cu(I) + 2 H+

O

O

+ O2 + O2-.

O

O

O

OOH

OH+ O2

-. + H2O2

O

O

2 O2-. + 2 H+ H2O2 + O2

Cu(I) + H2O2 Cu(II) + HO. + HO-

3Fl + O2(3Σg-) Fl + O2(1∆g)

Fl + O2(1∆g) 3Fl + O2(3Σg-)

Desactivación Física

Fl + O2(1∆g) FO2

Desactivación Química


66

Los resultados indican que las formas Ch y Fl de N, con rendimientos cuánticos de 0.03 y 0.04 respectivamente, son generadores débiles de oxígeno singulete.

Estos efectos prooxidantes son los responsables de la toxicidad de algunos F aislados a partir de hierbas medicinales.

Al respecto, es importante destacar que el nivel de ingesta de F requerido para inducir mutaciones y citotoxicidad en humanos no es fisiológicamente alcanzable a través de una dieta rica en vegetales, sin embargo, el uso de suplementos, particularmente fórmulas comercializadas como “Antioxidantes” y mezclas de hierbas, recomendadas en términos de gramos por día, puede resultar en niveles potencialmente tóxicos. Por ejemplo, algunos fabricantes de suplementos recomiendan dosis de Quercetina, en un rango entre 500 a 1000 mg por día, el cual es 10 a 20 veces mayor que lo que puede consumirse a partir de una típica dieta vegetariana. Esto sugiere que la comercialización no regulada de estos suplementos pueden presentar efectos adversos a la salud humana [51]. 3.12-ACCION ANTIOXIDANTE IN VIVO DE FLAVONOIDES

A pesar de las evidencias acerca de la actividad antioxidante in vitro de los F, es poca la información de su eficacia in vivo.

Es importante destacar que la función antioxidante en sistemas biológicos es mucho más complicada que un simple proceso de captura de

radicales libres. Un AO puede afectar a un sistema biológico por inhibición de especies reactivas ROS y RNS, alterando la actividad de ciertas enzimas, afectando otros AO endógenos, secuestrando metales de transición, etc.

Existen evidencias de que algunos AO actúan por uno o más mecanismos en dichos sistemas.

Los factores que influencian la eficiencia de un antioxidante in vivo son complejos y requieren consideración acerca de su biodisponibilidad, lugar de acción, tipo de especie reactiva con la cual reaccionará, su estabilidad, toxicidad y los posibles efectos sinérgicos con otros compuestos. Todo esto hace que los resultados obtenidos in vitro no puedan ser extrapolados a sistemas in vivo. La actividad antioxidante in vivo de un compuesto depende fuertemente de su biodisponibilidad. Esta depende de varios factores, entre los que se incluyen su liberación de la matriz alimentaria, su estabilidad frente a la flora intestinal, las modificaciones que experimente en el intestino, la absorción a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo, la estabilidad en el hígado y su accesibilidad. La absorción de estos polifenoles depende primariamente de factores relacionados con su estructura básica, incluyendo el grado de glicosilación, su tamaño molecular y el nivel de conjugación con otros polifenoles. Los F glicosilados son susceptibles de degradación por microorganismos presentes en el intestino.

Por esto, sólo una pequeña proporción de los F digeridos alcanza el torrente sanguíneo.


67

De acuerdo a muchos autores, flavonoles, flavonas e isoflavonas glicósidos son, en principio, hidrolizados a sus respectivas agliconas.[52,53] Sin embargo se ha demostrado, utilizando la técnica de Cromatografía Liquida acoplada con Espectrometría de Masa LC-MS, la existencia de Rutina en sangre de voluntarios después del consumo de puré de tomate. La cantidad absorbida de F normalmente no excede un pequeño porcentaje de la dosis ingerida. La composición del alimento representa un factor importante para su disponibilidad. Proteínas unidas a polifenoles reducen la biodisponibilidad, por el contrario el alcohol lo mejora, como ha sido demostrado en vino tinto, comparado con los niveles detectados luego de la ingesta de vino tinto sin alcohol. Además, datos recientes informan también que las grasas mejoran la absorción de ciertos F específicos, catequinas de té verde, proantocianidinas oligoméricas de semillas de uva y silibinina de leche de cardo son absorbidas en un porcentaje mayor cuando son administrados con fosfolípidos. Durante la absorción a través de la membrana intestinal, flavonoles, flavonas, isoflavonas y catequinas son parcialmente transformadas a sus glucurónidos y sulfatos, Figura 1.7

Subsecuentemente, una pequeña fracción de los F absorbidos son metabolizados por enzimas del hígado, resultando en conjugados polares que pueden ser excretados en la orina. Sin embargo, la mayor parte son degradados por la microflora intestinal. Las enzimas bacterianas catalizan varias reacciones,

incluyendo hidrólisis, cortes del anillo heterocíclico, dehidroxilación y descarboxilación. Durante estas reacciones se producen varios ácidos fenólicos. Estos ácidos fenólicos sí pueden reabsorberse. Este aspecto es relevante por dos razones: la primera es debido a que estos ácidos pueden representar una gran fracción de los F ingeridos (30-60%) y la segunda razón es que algunos de esos ácidos poseen una capacidad AO comparable con sus precursores. Esto sugiere que esos metabolitos pueden tomar parte en la protección AO. Se asume que los F dietarios pueden tomar parte de un sistema primario de defensa en el tracto digestivo, por limitar la formación de ROS y por capturarlos. Una vez absorbidos, tanto glicósidos y agliconas, intactos y sus ácidos fenólicos, continúan ejerciendo un efecto AO. Este efecto in vivo se evidencia por mediciones del incremento total del potencial antioxidante de plasma después de la ingesta de F contenidos en alimentos, bebidas o hierbas. Sin embargo existe una controversia acerca de esto, ya que por otra parte se ha informado que, comparado con otros AO potentes tales como AA y α-tocoferol, las concentraciones de los F en el plasma son muy bajas y sin embargo otra hipótesis planteada indica que en realidad la actividad de los F está mediada por sus interacciones con proteínas específicas, actuando como moléculas “señales”, es decir presentan actividad farmacológica en receptores, enzimas y factores de transcripción [54]


68

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Capítulo 4 Estudio cinético del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

71

4.1-INTRODUCCIÓN

La ciclización de Ch a Fl es una reacción crucial en la biosíntesis de F en las plantas y está catalizada por una enzima específica: la Ch-Fl isomerasa.

La mayoría de las Fl son estables en soluciones ácidas y neutras. Sin embargo en soluciones básicas experimentan la apertura del anillo C para dar la correspondientes Ch [1]. Esta transformación no es completa debido a la tendencia de las 2’-OHCh en volver a ciclar estableciéndose un equilibrio cuya posición depende del los sustituyentes, la composición del solvente y el pH, Figura 4.1.

Como se mencionó en el Capítulo

1, tanto las Fl como las Ch son el material de partida para el resto de los flavonoides, Figura 1.5, y es precisamente este hecho el que ha motivado a numerosos investigadores a estudiar el equilibrio y el efecto de diferentes factores que afectan la posición del mismo, tales como grupos sustituyentes en el núcleo flavonoide [2], efecto del solvente [3, 4], pH [1] y la temperatura [2],entre otros.

Para el caso particular de. Naringina (N), el estudio del equilibrio y las condiciones que lo controlan son de

Estudio cinético del efecto del solvente sobre el equilibrio

Flavanona-Chalcona

O

OH O

OChalcona Flavanona

R

R R

R

Figura 4.1: Equilibrio de isomerización Ch-Fl.


72

gran interés dado que su forma Ch, por una simple reacción de hidrogenación origina la correspondiente dihidrochalcona con propiedades edulcorantes equivalente en base molar a la sacarina.

Por otra parte, tanto Hesperidina (H) y su chalcona derivada, hesperidinmetilchalcona (HCh) son ampliamente utilizadas en el tratamiento de enfermedades tales como insuficiencia venosa crónica [5], entre otras.

En este capítulo se presenta un estudio cinético del efecto del solvente, (H2O, EtOH y mezclas de ambos) sobre el equilibrio Fl-Ch de N y H, Figura 4.2, en condiciones donde el mecanismo de isomerización es controlado por la formación de un carbanión intermediario. Se determinaron los parámetros cinéticos y termodinámicos asociados a la reacción de isomerización mediante la utilización de espectroscopía

de absorción UV-Vis y cromatografía líquida de Alta Resolución (HPLC).

4.2- ESPECTROSCOPIA UV-VIS DE FLAVANONAS Y CHALCONAS. El espectro de absorción UV- Vis de las Fl exhiben dos máximos de absorción: una banda intensa en la región de 270-295 nm, asociada al anillo A, denominada Banda II y un hombro o pico de menor intensidad en la región de 300-390 nm, denominado Banda I, originada por el anillo B.

El espectro de estos compuestos no es afectado por cambios en la oxigenación del anillo B, sin embargo el incremento de oxigenación en el anillo A provoca corrimientos batocrómicos de la Banda II.

Para las Ch, debido a la presencia del doble enlace C2-C3 que extiende la conjugación desde el anillo B, la situación es diferente ya que la banda dominante corresponde a la Banda I,

Compuesto Patrón de sustitución

Flavanonas R R’ R’’

Naringina (N) -O-neohesperidósido -H -OH Hesperidina (H) -O- rutinósido -OH -OCH3 Chalconas Naringina Chalcona (NCh) -O-neohesperidósido -H -OH Hesperidina Chalcona (HCh) -O- rutinósido -OH -OCH3

Figura 4.2: Estructura química de las flavanonas de N y H y sus correspondientes Ch.

O

OOH

RO

R''

R'OH

OOH

RO

R'

R''

Flavanona Chalcona

2

3

4 '

5

6

7

8

3 '2 '

α

β 23

4

6 '

4 '

5 '

2 '3 '

A B

C


73

localizada en la región de 340-390 nm, mientras que la Banda II de menor intensidad y se encuentra en la región 220-270 nm. La presencia de un grupo hidroxilo en posición C-2’ tiene un marcado efecto sobre el máximo de absorción, por ejemplo 4’,4-dihidroxichalcona (λ= 348 nm) y 2’,4’,4-trihidroxichalcona (λ= 370 nm).

En la Figura 4.3 se muestra el espectro de la flavanona N y su Ch en EtOH.

Para N se observa un máximo principal a 284 nm (Banda II, log ε = 4.28) y una banda minoritaria a 330 nm (Banda I). Para NCh se observa un máximo principal a 366 nm (Banda I, log ε = 4.51).

Para H el espectro UV- Vis presenta dos máximos de absorción, uno a 285 nm (Banda II, log ε= 4.27), un hombro a 330 nm (Banda I) [6], mientras que para HCh la banda principal está centrada a 371 nm (Banda I, log ε= 4.3) [7].

En la Figura 4.3 se observa que si bien tanto las Fl como las Ch de ambas sustancias presentan máximos de absorción similares, el coeficiente de

absortividad molar de las Ch con respecto a sus correspondientes flavanonas son diferentes. Para NCh el valor de ε experimenta un importante incremento, casi un 50%, con respecto a su Fl; mientras que HCh presenta un coeficiente de absortividad menor que H.

Las principales características de una banda de absorción son su posición e intensidad. Esta última depende de dos factores, el primero implica la probabilidad de la interacción entre la energía de radiación y el sistema electrónico lo que ocasiona la transición desde el estado fundamental al estado excitado, y el segundo factor depende de la polaridad del estado excitado.

Sobre la base de estos hechos las diferencias observadas pueden explicarse en función de las diferencias estructurales de ambos compuestos.

Para H, la sustitución en C-4 y C-3 modificaría la coplanaridad del anillo B, provocando una disminución en el coeficiente de extinción de H con respecto a N, este efecto sería mayor para las formas Ch.

Figura 4.3: Espectros de las formas Fl y Ch de N y H en soluciones etanólicas neutras.

300 400 500 6000

10000

20000

30000 Flavanona Chalcona

ε (M

-1 c

m-1)

λ (nm)300 400 500 600

0

7000

14000

Flavanona Chalcona

ε (M

-1 c

m-1)

λ (nm)

Naringina Hesperidina


74

4.3- EFECTO DEL AGREGADO DE NaOH SOBRE LOS ESPECTROS UV-VIS DE NARINGINA Y HESPERIDINA.

La Figura 4.4 muestra los

cambios espectrales, producidos por el agregado de NaOH 1.25 mM, en soluciones EtOH-H2O, XW = 0.03, de N y NCh.

En todos los casos el agregado de base provoca cambios espectrales instantáneos, seguido de cambios dependientes del tiempo.

Para N, la Figura 4.4.A muestra que inmediatamente después del agregado de base (t <10 s), se produce un ligero corrimiento batocrómico de la Banda II desde 284 nm a 288 nm y la aparición de una banda a 245 nm, cambios asociados con la deprotonación del grupo hidroxilo en posición C-5 del anillo A [1,6].

Simultáneamente, para la Banda I, se observa un importante desplazamiento batocrómico de 35 nm, el cual está asociado a la presencia de una especie carbaniónica intermediaria

formada, luego de la deprotonación del grupo hidroxilo en posición C-4’, por abstracción de un átomo de hidrógeno en posición Cα, cuyo mecanismo de formación se detallará más adelante.

Esto fue corroborado utilizando el ensayo del NaOAc, descrito en la sección 1.3, el cual al ser una base débil deprotona el grupo hidroxilo más ácido de la molécula. Los espectros de la Figura 4.5 muestran que la adición de dicha sal no provoca cambios en la Banda II, sin embargo, la Banda I muestra un corrimiento batocrómico de 8 nm, indicado en el inserto de la Figura 4.5, el cual corresponde a la deprotonación del grupo fenólico en posición C-4’ del anillo B.

De esta manera se confirma la hipótesis de que el corrimiento de 35 nm de la Banda I, observado en la Figura 4.4.A, no corresponde a la deprotonación de los grupos fenólicos de la molécula sino a la formación de la especie carbaniónica de N.

300 400 5000.0

0.5

1.0

1.5

t = 10 s

Abs

λ (nm)

0 30 60 90

0.4

0.8 288 nm 430 nm

Abs

tiempo (min)

300 400 5000.0

0.5

1.0

t =10 s

Abs

λ (nm)

0 40 80

0.1

0.2

0.3

0.4

288 nm 430 nm

Abs

tiempo (min)

Figura 4. 4: cambios espectrales de A) N y B) NCh producidos por el agregado de NaOH 1.25 mM en soluciones EtOH-H2O (XW = 0.03).


75

Luego de los cambios instantáneos

se observa el crecimiento de una banda centrada a 430 nm, y la disminución simultánea de las bandas formadas a 245 nm y a 288 nm, tornando a la solución de incolora a amarilla. A medida que transcurrió la reacción, (10 s < t < 2500 s), se observó la aparición de puntos isosbésticos a 256, 267 y 304 nm los cuales indican la existencia de un equilibrio o de la transformación directa

al producto final, por ej., R→P. Por otra parte, los perfiles cinéticos

para los cambios de absorción observados a la desaparición de la banda de 288 nm y la formación de la banda a 430 nm presentan las mismas constantes de velocidad de primer orden, indicando que la especie formada instantáneamente por el agregado de HO- se transforma más lentamente en la especie de color amarillo.

La comprobación de dicho equilibrio se produce cuando se realiza el mismo experimento partiendo de una solución de NCh, Fig. 4.4B. En este caso el agregado de base provoca de manera instantánea el corrimiento de la Banda I desde 367 nm a 430 nm, asociado a la deprotonación de los grupos 2’-OH y 4-OH principalmente, dado que se ha informado que los valores de pKa son 6.9 y 8.5, respectivamente, mientras que el grupo 6’-OH tiene un pKa= 12 [1]. Así es claro que la banda visible a 430 nm corresponde a la forma deprotonada de la chalcona de N, NCh.

Figura 4. 5: Cambios espectrales de soluciones metanólicas de N ante el agregado de NaOAc

315 330 345

1.12

1.16

1.20 8 nm

Abs

(x1x

10-1)

λ (nm)

250 300 350 400 450

0.0

0.2

0.4

0.6

N N +NaOAc (30 min)

Abs

λ (nm)

0 4 8 12 16

0.00

0.06

0.12

0.18

0.24NCh

N

t = 0 min t = 90 min

tiempo (min)

Figura 4. 6: Cromatogramas inicial (negro) y final (trazos) obtenidos para la reacción N en medio etanólico básico [NaOH] =1.25 mM. Condiciones: columna ODS-2 (250x46 mm i.d., 5 µm), T: 25

ºC. Fase móvil H2O-ACN-HAc (79.5: 20: 0.5). Flujo 1.2 ml/min. Detección 330 nm.


79

XW = fracción molar de H2O Tabla 4. 1: Constantes de primer-orden observadas, kobs, y constantes de equilibrio K para isomerización Fl- Ch en mezclas EtOH-H2O en presencia de NaOH a 25 °C, usando tanto la Fl como Ch como reactivo inicial.

Naringina Hesperidina kobs /103

(s-1) kobs /103

(s-1) Xw NaOH

(mM) Fl + HO- Ch + HO-

KFl→Ch (ka/kc) Fl + HO-

KFl→Ch (ka/kc)

0.03 1.25 1.4 ± 0.5 1.3 ± 0.2 1.7 ± 0.2 0.80 ± 0.04 0.37 ± 0.04 0.15 1.25 1.9 ± 0.5 1.8 ± 0.3 2.4 ± 0.2 0.24 1.25 1.25 ± 0.01 0.48 ± 0.03 0.36 1.25 2.3 ± 0.5 3.0 ± 0.2 0.52 0.13 2.6 ± 0.5 2.5 ± 0.5 0.07 ± 0.02 0.52 0.25 2.5 ± 0.1 0.09 ± 0.02 0.52 0.40 2.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.52 1.25 2.2 ± 0.2 2.3 ± 0.1 3.4 ± 0.3 1.57 ± 0.03 0.31 ± 0.02 0.52 4.00 2.2 ± 0.2 3.3 ± 0.2 0.64 1.25 1.8 ± 0.2 2.7 ± 0.3 0.76 1.25 1.5 ± 0.1 1.5 ± 0.2 1.5 ± 0.2 1.90 ± 0.05 0.33 ± 0.03 0.76 3.72 2.03 ± 0.05 0.45 ± 0.05 0.76 9.80 2.24 ± 0.05 0.37 ± 0.02 0.91 1.25 0.8 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.57 ± 0.05 1.70 ± 0.09 0.18 ± 0.01 0.97 1.25 0.5 ± 0.1 0.29 ± 0.08 1.00 0.32 1.3 ± 0.1 0.04 ± 0.01 1.00 0.89 0.56 ± 0.04 0.18 ± 0.02 1.00 1.25 0.49 ± 0.02 0.48 ± 0.01 0.23 ± 0.04 1.48 ± 0.08 0.19 ± 0.02 1.00 3.16 0.49 ± 0.05 0.24 ± 0.10

-4.0 -3.5 -3.0 -2.5-4.5

-4.0

-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

A

log

k

log [NaOH]-6 -4 -2 0

0.04

0.08

0.12B

Abs

(358

nm

)

- log [NaOH]-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

-4.30

-4.25

-4.20

-4.15

-4.10

-4.05

-4.00

-4.3

-4.2

-4.1

-4.0

log ka

Figura 4.8.A) Efecto de la concentración de NaOH sobre ka (círculos) y kc (cuadrados) en mezclas EtOH-H2O (XW = 0.52) (símbolos negros) y en H2O (símbolos grises) de N. B) símbolos llenos: Curva de titulación para N en buffer Na2HPO4- NaH2PO4, símbolos abiertos: variación de ka con la concentración de base.


80

Las reacciones que operan bajo

este mecanismo implican primero la abstracción de un átomo de hidrógeno por parte de una base, originando un carbanión o base conjugada del sustrato a partir de la cual, en una segunda etapa, parte el grupo saliente.

Existen algunas evidencias que apoyan la hipótesis de que el equilibrio Fl-Ch opera bajo el mecanismo E1cB, Figura 4.9.

Este mecanismo se presenta particularmente en sustratos conteniendo hidrógenos ácidos y pobres grupos salientes, tal como fenoxilos, presentes en las flavanonas. Por otra parte, se ha sugerido también que, todas las eliminaciones iniciadas por bases, donde el átomo de hidrógeno está activado por un grupo tomador de electrones, tal como el grupo carbonilo en las flavanonas, operan bajo el mecanismo E1cB [9]

De acuerdo con este mecanismo, la reacción de apertura sucede vía un pre-equilibrio rápido en el cual, por abstracción del átomo de hidrógeno en posición C-3, el más ácido de la molécula de la flavanona ionizada, se forma el carbanión Fl3-. Este carbanión puede retornar al compuesto de partida Fl2-, o bien continuar hasta la chalcona ionizada Ch2-, siendo éste el paso

determinante de la reacción con una constante de velocidad ka.

Este preequilibrio explica la variación de las constantes de velocidad con la concentración de la base. A medida que aumenta la concentración de la base, la reacción se desplaza hacia la formación de Fl3-. Cuando log [NaOH] > -3 la formación del carbanión es prácticamente completa, y la velocidad de la reacción se torna independiente de la concentración de la base. De acuerdo con lo anterior, la gráfica sigmoidal de la Figura 4.8.A puede considerarse como la curva de titulación para el pre-equilibrio ácido de formación del carbanión, con un valor de protonación media (50% de carbanión), (log[NaOH])1/2 ≈ -3.4 (±0.3), considerando los datos en H2O y al 25% v/v H2O en EtOH.

Estos resultados son comparables a lo informado en la bibliografía para el equilibrio entre la flavanona base, y su 2’-OHCh, (log[NaOH]1/2) ≈ -2.2 medidos en H2O [10].

La Figura 4.10 muestra el efecto de la composición del solvente sobre los valores de las constantes de velocidad de reacción para N y H. Se observa que para N, ka alcanza un máximo en mezclas con XW ≈ 0.5, mientras que para la constante de cierre kc prácticamente no se observan mayores cambios con la composición de la

ORO

O

H

HO -OH

-

Fl2- Fl3- Ch2-

ka

kc

O

OH

RO

Olento

ORO

OOH

O O O

rápido

Carbanión

Figura 4.9: Mecanismo de reacción propuesto para el equilibrio Fl ! Ch


82

∆H‡ = [ kJ mol-1]; ∆S‡ = [J K-1 mol-1] Tabla 4. 2: parámetros de activación para las reacciones de apertura (a) y cierre (c) de N y H en función de la composición de la mezcla EtOH-H2O. ([NaOH] = 1.25 mM).

Naringina Hesperidina Xw

∆Ha‡ ∆Sa

‡ ∆Hc‡ ∆Sc

‡ ∆Ha‡ ∆Sa

‡ ∆Hc‡ ∆Sc

‡

0.03 60± 3 -100± 7 72± 5 -65± 1 75± 2 -65± 7 68± 6 -76±20 0.52 54± 3 -116± 5 89± 3 -10± 3 79± 3 -45± 11 72± 1 -59±4 0.76 66± 3 -86± 5 72± 4 -69± 1 65± 2 -93± 6 62± 3 -89±11 0.91 77± 2 -56± 5 74± 1 -59± 2 73± 3 -70± 9 72± 2 -56 ± 7 1.00 85± 2 -36± 5 72± 3 -69± 5 62± 9 -108± 30 59±10 -103± 34

Flavanona Carbanión Chalcona Anión ChalconaHO - H+

rápido lento rápido

OROO

O

OMe

O

OROO

O

OMe

O

- OROO

O

OMe

O

-ORO

O

O

OMe

O

-

HESPERIDINA

ORO

O

O

O

ORO

O

O

O

-

ORO

O

O

O

- ORO

O

O

O

-

NARINGINA

- - -

- - -

HO -

HO -

Figura 4. 12: Estructura de resonancia de los carbaniones de N y H


85

las especies moleculares son derivadas de los componentes formales tales como isómeros, dímeros, etc, los cuales se encuentran en un equilibrio dinámico.

Este equilibrio dinámico es sensible a la adición de cualquier componente, ya sea soluto o solvente ya que por ejemplo, la adición de solutos polares favorece la formación de subespecies polares del solvente como así también la adición de solutos no polares favorece la formación de especies no polares.

De la misma manera si al sistema se adicionan solutos capaces de formar puente hidrógeno, éstos interferirán en el equilibrio existente entre las especies de solvente.

El modelo postula que cualquier cambio finito en una variable de estado puede ser representado como la suma de cambios infinitesimales, de tal manera que el sistema está inicial y finalmente en un equilibrio molar.

Bajo este mecanismo cada paso infinitesimal puede ser dividido en un

paso isomolar o isodélfico , en el cual el sistema parte de un equilibrio molar seguido de un segundo paso denominado de variación, cambio molar, o componente liodélfica en el cual el sistema resultante retorna al equilibrio bajo las nuevas condiciones, Figura 4.14

Cualquier cambio finito en una variable de estado, en principio, incluye una contribución con una compensación entalpía-entropía exacta.

El CEE postula que todas las subespecies de una misma especie que están en un equilibrio antes de cualquier cambio se reorganizan o redistribuyen de manera tal que la energía libre de este proceso es cero.

Dentro de esta teoría, el CEE para soluciones líquidas puede explicarse mediante un mecanismo termodinámico denominado mecanismo de solvatación.

En fases líquidas se pueden generar diferentes isómeros “ambientales”. En la Figura 4.15 se muestra un ejemplo de solución diluida

Componente 1 A (1-α); B (α) T’; α’=αeq (T) No equilibrio

Componente 1 A (1-α); B (α) T; α=αeq (T) Equilibrio

Componente 1 A (1-α’); B (α’) T’; α’=αeq (T’)

Equilibrio

Proceso Isodélfico Proceso Liodélfico Cambio de T Isotérmico δH0

1 ≠ TδS01 δH0

1 = TδS01

δG01= 0

Figura 4. 14: Descripción de las etapas isodélfica y liodélfica para una perturbación de un sistema en equilibrio.


86

formada por moléculas de solvente (A) y moléculas de soluto (U).

En este sistema la especie molecular del solvente consiste en dos subespecies A/a y A/u definidas en la Figura 4.15, mientras que el soluto, por ser una solución diluida, sólo contiene la subespecie U/a.

De manera general, la expresiones matemáticas para los parámetros termodinámicos de una solución implican;

4.24

Donde n1, n2 corresponden al

peso fórmula del solvente y soluto respectivamente y α es la fracción molar de las subespecies e indica el progreso de la reacción.

Durante la perturbación del equilibrio, α se ajusta a sí mismo cuando se adiciona el soluto manteniéndose la energía libre en un mínimo, siendo

0)/( 2,1 =∂∂ nnG α . Para ser capaz de especificar esta restricción se introduce una nueva variable, ( ) 21,/ nnGy α∂∂= . Por definición, y=0 cuando α=αeq.

La transformación matemática de G(n2, α) a G(n2, y) es decir cuando el sistema es perturbado, se describe en la ecuación 4.25.

4.25

Donde la primera diferencial

corresponde al proceso isodélfico y la segunda al liodélfico-

En el equilibrio, por definición y = 0 , por lo tanto la ecuación se reduce a:

4.26

En la ecuacion 4.23 la variación de energía libre corresponde a la suma de los términos asociados a los procesos isomolar y al de variación molar. El término isomolar α)/( 2nG ∂∂ expresa el cambio de energía libre molar parcial cuando se introduce el soluto sin variación en α. El término de variación o corrimiento molar expresa el efecto de la variación en α: yn )/( 2∂∂α por mol de soluto adicionado y ( )α∂∂= /Gy expresa la respuesta de G al corrimiento de α. La ecuación 4.24 indica que la energía parcial molar del soluto no es afectada por la perturbación del solvente.

De manera similar, la entropía y entalpía molar parcial se expresan de acuerdo a las ecuaciones 4.27 y 4.28

4.27

( ) ααα

dGdnnGdG

nnnn

121

1

,

2

,2

∂∂

+

∂∂

=

∂∂

+

∂∂

=

∂∂

21,21,2 ny

nG

nG

nny

α

α

1,1,022

2 neqny nG

nGG

α

∂∂

=

∂∂

==

( )eqTeqnnT nT

GSS,2,22,2

222

∂∂

∂∂

∂∂

+=αα

αα

A/a A

A A

A

A A

A/uU/a

A/uA

A

A A/u

Figura 4. 15: Ejemplo de isómeros ambientales en soluciones diluidas. A= moléculas de solvente. U = moléculas de soluto. Ambientes: /a: adyacente únicamente a moléculas de solvente, /u: adyacentes a una molécula de soluto.


87

4.28

Donde Si y Hi representan la

entropía y entalpía molar parcial del iésimo componente bajo condiciones de equilibrio químico a T y P constante, (Si)α representa a la entropía y entalpía del iésimo componente adicionado, a T y P constantes, bajo condiciones de no equilibrio es decir bajo el proceso isodélfico.

Como se muestran en las ecuaciones 4.26, 4.27 y 4.28, para G la contribución liodélfica es cero dado que G2 es rigurosamente una propiedad isomolar, pero para H y S la dicha contribución es diferente de cero. La ley de compensación puede derivarse entonces como un caso especial donde la contribución liodélfica es mayor que la isodélfica:

4.27

4.28

4.29

4.30

De las ecuaciones 4.29 y 4.30 se

observa que el término isodélfico compensa exactamente, por lo cual el CEE emerge cuando la componente liodéfica de la entalpía es mucho mayor que la contribución isodélfica.

Este modelo, aplicado a nuestro caso implicaría que la adición del segundo solvente, EtOH o H2O, perturba

al equilibrio existente entre el soluto, o sea el carbanión, y el solvente. A medida que se adiciona el segundo solvente el equilibrio es pertubado y con ello por ejemplo, la capacidad donora de puente hidrógeno del solvente en su conjunto.

De acuerdo a esta teoria, la reorganización del sistema involucra las dos etapas antes mencionadas, el corrimiento isodélfico, sin compensación, y el paso de liodelfico, donde el sistema retorna al equilibrio. De esta manera las propiedades termodinámicas del sistema se modifican de manera tal de alcanzar el equilibrio bajo las nuevas condiciones.

Particularmente para la reacción de isomerización de las flavanonas, el efecto de compensación implica el desplazamiento del equilibrio dinámico de interacciones unión hidrógeno entre el carbanión Fl3- y su esfera de solvatación, compuesta por moléculas de EtOH y H2O. Puesto que tanto las moléculas de H2O como de EtOH presentan una gran tendencia a participar como donoras y aceptoras de puentes hidrógeno, la formación de los mismos entre ambos solventes se ve favorecida y la entalpía disminuye. Como estos enlaces requieren de la participación de moléculas en posiciones relativamente fijas también disminuye la entropía [13].

Por otro lado hay que tener en cuenta que las mezclas EtOH-H2O no se comportan idealmente, y que las interacciones unión hidrógeno solvente-solvente son máximas a Xw ≈ 0.6, como se concluye a partir de la disminución observada en el valor de volumen molar de exceso para la mezcla a dicha composición, Figura 4.16 [14]. Esto implica que a dicha composición las

STGH ∆∂+∆∂=∆∂

ααα STGH ∆∂+∆∂=∆∂

( )eqTeqnnT nT

GHH,2,22,2

222

∂∂

∂∂

∂∂

+=αα

αα

Isodélfico Isodélfico

liodélfica liodélfica

S T S T G H H

∆ ∂ +∆ ∂ + ∆ ∂ = ∆ ∂ + ∆ ∂

α α α

liodélfico liodélfico ST H ∆ ∂ = ∆ ∂


88

interacciones soluto-solvente son altamente reducidas.

Por otra parte, para caracterizar la polaridad de un solvente, Taft y col. [1] idearon y determinaron el conocido parámetro empírico α. Este parámetro es sumamente útil para cuantificar la capacidad donora de unión hidrógeno (HBD) de un solvente. En la Figura 4.16 se muestra que dicho factor es mínimo a Xw ≈ 0.8 indicando que a esa composición la capacidad de interacción soluto solvente es mínima.

4.5- CONCLUSIONES

Tanto para N como para H existe

un equilibrio entre sus formas flavanonas y chalconas. En medio básico, pH aproximado de 11, N se encuentra desplazada hacia su forma Ch ocurriendo lo contrario para H, como lo indican los valores de K, Tabla 4.2.

La existencia de un CEE para los parámetros termodinámicos es una evidencia de que ambas flavanonas

reaccionan bajo el mismo mecanismo E1cB o mecanismo carbaniónico.

En cuanto al comportamiento cinético, las diferencias observadas en las velocidades de apertura y cierre entre N y H pueden explicarse sobre la base del efecto de los sustituyentes en el anillo B de ambas flavanonas.

En cuanto a la optimización de las condiciones para la obtención de Ch, los valores de Keq, Tabla 4.2, indican que la reacción se encuentra desplazada hacia la forma Ch a Xw =0.52 para N y Xw=0.24 para H ambas a pHap= 11, coincidentes con los parámetros cinéticos de la Figura 4.11.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

alfa

parametro alfa

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0 Volumen exceso

Vol

umen

exc

eso

XwFigura 4. 16: Parámetros α (capacidad donora de puente hidrógeno) y volumen de exceso en

función de la composición del solvente para mezclas EtOH: H2O [12,13,14].


89

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and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerization of naringin and the 4’-rhamnoglucoside of 2’,4,4’,6’-tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 195 – 198. 1988.

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Capítulo 5 Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

91

5.1-INTRODUCCIÓN

Como se mencionó en el Capítulo 2, las chalconas son un importante grupo de sustancias precursoras biosintéticas del resto de la familia de los flavonoides.

La relación entre estos compuestos y la luz ha sido motivo de numerosas investigaciones. La utilización de chalconas como fotoestabilizadores de polímeros, en lociones de protección solar y en fotografía [ 1 ], indican lo interesante de su fotoquímica.

El efecto de la luz sobre las reacciones de los F se ve reflejado desde la biosíntesis, ya que ha sido demostrado que la irradiación directa de 2’OH-Ch contenida en cultivos celulares de Petrollinum hortense [2], incrementa la producción de F.

Las reacciones que experimentan las Ch en presencia de luz son muy diversas e implican fotociclización a flavanonas [3,4], síntesis de flavonas [5],

fotodimerización [1], fotoisomerización cis-trans [6], entre otras.

Por otra parte, se ha informado también acerca de la irradiación de flavanonas la cuales conducen a la formación de 2’-OH-Ch, 4-fenildihidrocumarina y ácido salicílico [7].

Sobre la base de estos antecedentes se presenta un estudio acerca del efecto que produce la luz tanto sobre las velocidades de reacción del equilibrio Fl-Ch, como las posibles reacciones secundarias que pudieran tener lugar en presencia de irradiación.

Es importante aclarar que nuestros estudios preliminares indicaron que no existe efecto de la luz sobre Hesperidina, H, ni sobre su chalcona; por lo que el presente trabajo se refiere exclusivamente al efecto de la luz sobre el equilibrio Naringina, N, Naringina Chalcona, NCh.

Estudio del efecto de la luzsobre el equilibrio

Flavanona- Chalcona deNaringina


92

5.2- EFECTO DE LA LUZ SOBRE SOLUCIONES ACIDAS Y NEUTRAS. 5.2.1- SOLUCIONES ACUOSAS ÁCIDAS.

La Figura 5.1 muestra los

cambios espectrales que se producen en soluciones de NCh en buffer de citrato-fosfato (1 mM) de pH 3.6 irradiada con luz de 360 ± 5 nm, correspondiente a la región de máxima absorción de NCh en medio ácido y neutro.

La reacción fue estudiada a diferentes T entre 16 y 45 oC, tanto en presencia de radiación UV como en ausencia de la misma. En todas las condiciones se observaron cambios espectrales similares: disminución de la banda característica de NCh a 366 nm y crecimiento simultáneo de la banda a 285 nm asociada con la formación de la flavanona N. Las constantes de velocidad observadas de primer orden, kobs, monitoreadas en ambas longitudes de onda, fueron similares. Este resultado sumado a la presencia de un claro punto

isosbéstico a 300 nm y a los cromatogramas obtenidos por HPLC, muestran que la reacción se encuentra desplazada hacia N, concluyéndose que la reacción en cuestión se trata simplemente de la reacción de isomerización Ch F en medio ácido, la cual debe ser considerada irreversible ya que en estas condiciones de pH la forma flavanona es estable. Por lo tanto los valores de kobs son directamente los correspondientes a la constante de velocidad unimolecular para el cierre de la chalcona, kc. 5.2.2- SOLUCIONES ETANÓLICAS NEUTRAS Las Figura 5.2 muestra los cambios espectrales producidos en soluciones etanólicas de NCh en ausencia (A) y presencia (B) de irradiación UV (360 nm).

Al igual a lo observado en soluciones acuosas a pH 3.6, en ambas reacciones se observa la disminución con el tiempo de la banda de la chalcona a 366 nm y la aparición simultánea de la banda a 285 nm correspondiente a la forma flavanona de N.

En general se observa que, tanto para las reacciones en medio acuoso, como para las soluciones etanólicas las velocidades de las reacciones sin irradiar son menores que las irradiadas al máximo de absorción de NCh.

Las reacciones también fueron simultáneamente monitoreadas por HPLC confirmándose la existencia sólo de la forma flavanona y chalcona de N, Figura 5.3.

300 400 500 6000.0

0.3

0.6

0.9

Abs

λ / nm

0 2 4 6 80.0

0.3

0.6

0.9

365 nm, τ = 4.2 ± 0.1 h

285 nm, τ = 4.5 ± 0.2 h

Abs

tiempo (horas)

Figura 5.1: Cambios espectrales y perfilescinéticos (insertos) de NCh en buffer citrato-fosfato a pH 3.6 y T=42.6 ºC en solucionesirradiadas a 360 nm


93

5.2.3- EFECTO DE LA TEMPERATURA PARA LAS REACCIONES EN MEDIO ÁCIDO Y NEUTRO

La Tabla 5.1 muestra las

constantes de primer orden observadas, kobs, en función de la temperatura para soluciones acuosas de chalcona a pH 3.6 y etanólicas neutras, tanto en condiciones de oscuridad como irradiadas con luz de 360 nm. La Figura 5.4 muestra el efecto de la temperatura sobre los valores de la Tabla 5.1,

analizados según la Teoría del Estado de Transición, ecuación 4.16.

En la Figura 5.4 se observa que la luz UV no ejerce efecto catalítico sobre la reacción de ciclización N→NCh en cada solvente, pero sí existe una diferencia entre los parámetros termodinámicos de activación de las soluciones acuosas ácidas y las etanólicas.

Los valores de ∆H‡ obtenidos son entre 10 y 40 kJ/mol mayores que los observados para el cierre de NCh en

300 400 500 6000.0

0.5

1.0

1.5

Abs

B

λ (nm)

0 2 4 6 80.0

0.5

1.0

τ = 4.2 ± 0.2 h

285 nm365 nm

Abs

tiempo (horas)

400 6000.0

0.3

0.6

0.9

Abs

λ (nm)

0 4 80.0

0.5

τ = 7.7 ± 0.5 h

A 368 nm284 nm

Abs

tiempo (horas)

Figura 5.2: Cambios espectrales y perfiles cinéticos (insertos) de chalcona en EtOH. T: 25 ºC. A) sin fotolizar. B) fotolizada con luz de 360 nm.

5 10

0.000

0.003

0.006

N Ch Ch fotolizada

tiempo (min)

Figura 5.3: Cromatograma para la reacción de NCh en EtOH neutro, irradiada con luz de 360 nm.

Detección 298 nm.


94

condiciones básicas al oscuro en agua y etanol respectivamente, Tabla 4.2.

Solución acuosa pH 3.6

Oscuro Irradiado (360 nm) T

(ºC) kc/105 (s-1)

T (ºC)

kc/105

(s-1)

16.2 0.27 20.6 0.68 25.4 1.24 29.2 1.66 35.7 2.51 34.7 2.71 44.7 8.34 42.6 6.57

Soluciones etanólicas neutras Oscuro Irradiado (360 nm)

T (ºC)

kc/105 (s-1)

T (ºC)

kc/105 (s-1)

16.8 3.58 20.6 4.53 25.9 4.29 29.2 6.68 34.8 54.1 34.7 78.1 43.7 208 42.6 204

Tabla 5. 1: Constantes de velocidad para la reacción de chalcona a flavanona en soluciones acuosas a pH 3.6 y etanólicas en función de la temperatura

Este resultado concuerda con los

mecanismos previstos para el cierre de NCh. En medio básico, la reacción involucra un nucleófilo fuerte, el grupo C2’-O-, el cual se adiciona al Cβ del doble enlace, condiciones óptimas para

que se produzca la reacción de Michael [9].

Sin embargo en medio ácido el nucleófilo es débil, C2’-OH y, aunque el sistema se encuentra activado para la adición ya que el Cβ es altamente electrofílico debido a que, por resonancia, comparte la carga positiva parcial del carbono carbonílico, los valores de entalpía indican que bajo estas condiciones la reacción es menos favorable que en medio básico.

Por otra parte, es interesante notar que si bien la ∆H‡

c, EtOH > ∆H‡c,H2O

las kobs en EtOH son mayores que en H2O ácida. Este comportamiento puede entenderse en función del cambio entrópico que se produce en cada solvente, ya que ∆S‡

c,EtOH = 58 J/K.mol mientras que ∆S‡

c,H2O = -66 J/K.mol. En EtOH el aumento entrópico compensa el aumento de entalpía de activación, mientras que el segundo caso no favorece la espontaneidad de la reacción por incrementar el valor de la energía libre, Figura 5.5.

3.2 3.4

-20

-18

-16

-14

∆S‡ = 58 ± 5 J/K.mol∆H‡ = 113 ± 7 kJ/mol

Etanol Oscuro Luz

∆S‡ = -66 ± 7 J/K.mol∆H‡ = 82 ± 5 kJ/mol

ln(k

obs/T

)

10-3/T (K-1)

pH 3.6 Oscuro Luz

3.2 3.4

-18

-16

-14

-12

Figura 5.4: Gráficas de Eyring para NCh en soluciones acuosas ácidas y etanólicas neutras.


95

Teniendo en cuenta que las coordenadas nucleares internas para la formación del enlace C2’–O–Cβ son las mismas en ambos solventes, la marcada diferencia de entropía de activación debe

asociarse a los cambios de organización de las esferas de solvatación en cada solvente. 5.2.4-. MECANISMO DE CIERRE PARA NCh Fl EN MEDIO ACIDO Y NEUTRO

Los resultados obtenidos tanto

para las soluciones acuosas pH= 3, como para las soluciones etanólicas neutras, con o sin irradiación, indican que la reacción implica únicamente el cierre de la forma NCh a N. Estos resultados están de acuerdo con los datos existentes en la bibliografía en los cuales se informa acerca de reacciones de ciclización de chalconas en medio ácido [ 8 ]. Para soluciones en medio ácido puede explicarse en función del mecanismo que se describe en la Figura 5.6, el cual implica en un primer paso la

280 300 320 340 36090

100

110

∆G‡c = ∆H‡

c- ∆S‡cT

∆G‡ c (

kJ/m

ol)

T (K)

Agua pH 3 Etanol

Figura 5.5: Simulación de la variación de laenergía libre de activación ∆G‡

c con latemperatura para la reacción de cierre de NCh → N en medio acuoso pH 3 y en EtOH.

OH

OH OH

OH

OH

+

+OH

OH OH

OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

+

+

OH

OH O

OH

OH

+H+

O

OH OH

OH

OHH

O

OH O

OH

OH

-H+

Figura 5.6: Mecanismo propuesto para la reacción de ciclización de NCh en medio acuoso ácido.


96

protonación del grupo carbonilo [9]. Esto provoca, por el efecto de

conjugación con el doble enlace, un aumento en la electrofilicidad del Cβ activándolo para el ataque de nucleófilos débiles, tales como el grupo hidroxilo ubicado en posición C-2’ originando la flavanona. Este mecanismo implica por lo tanto una enolización catalizada por ácido.

En cuanto a la reacción en EtOH neutro, existen datos en la bibliografía [3] en los que se informa que en solventes polares, tales como alcoholes, el grupo hidroxilo en posición C-2’ y el solvente interactúan, ya sea por solvatación o algún efecto similar, que debilita o rompe el enlace hidrógeno del dicho grupo hidroxilo, transformándolo en fenolato, un nucleófilo fuerte capaz de atacar el doble enlace con la consecuentemente formación de Fl. Esta hipótesis concuerda con los datos de entropía de activación obtenidos en cada medio.

En el caso de EtOH, el ataque del ion fenolato del C-2’ sobre el Cβ libera

moléculas de solvatación aumentando la entropía total del sistema. 5.3-EFECTO DE LA LUZ SOBRE SOLUCIONES BASICAS 5.3.1-SOLUCIONES ACUOSAS BÁSICAS La Figura 5.7 muestra los cambios espectrales observados para la reacción de NCh en soluciones acuosas pH 11, sin irradiar e irradiada con luz de 420 ± 5 nm a 25.1 ºC.

En ambos casos los espectros muestran la desaparición de la Banda I de NCh deprotonada, centrada a 430 nm, y la aparición de la banda a 285 nm asociada a la forma N deprotonada. Sin embargo, a diferencia de lo observado en soluciones no irradiadas y en soluciones ácidas, la iluminación de la banda I de NCh produce la aparición de dos nuevas bandas centradas a 310 nm y a 400 nm, respectivamente.

300 400 5000.0

0.3

0.6

0.9

Abs

BHCl exceso

λ (nm)300 400 500

0.0

0.3

0.6

0.9 A

Abs

λ (nm)

Figura 5.7: Cambios espectrales de soluciones acuosas de NCh en medio básico. A) Sin irradiar, B) irradiado con luz de 420 nm. En líneas de puntos se indica el espectro obtenido por agregado de HCl.


97

Estas bandas no están asociadas con la forma N, ya que el agregado de H+ en exceso produce un corrimiento hipsocrómico de 25 nm de la Banda a 401 nm y el espectro obtenido es totalmente diferente al de N, Figura 5.7.B.

Por lo tanto, en soluciones irradiadas la reacción de cierre para la formación de flavanona es acompañada por la formación de un nuevo producto P. Es importante destacar que independientemente del reactivo inicial se obtuvieron resultados similares, es decir partiendo tanto de NCh como de N, en un rango de pH comprendido entre 10 y 12.

La Figura 5.8.A y B muestra el análisis por HPLC de las distintas fracciones irradiadas, las cuales confirman la formación progresiva de un nuevo producto con tiempos de retención menor (tR = 4.10 min) que los picos para N (tR= 5.7 min) y NCh (tR= 12.0 min).

Aunque el análisis espectral de las soluciones a oscuras no permite la detección de un producto diferente a la flavanona, el análisis por HPLC, luego de más de 5 horas de reacción, confirma la

existencia de trazas de un producto con el mismo tiempo de retención que el producto observado en soluciones irradiadas. Mediante la utilización de curvas de calibración de N y Ch, bajo las mismas condiciones del análisis, se determinó la composición del sistema al final de cada experimento. A las 5 h de reacción a oscuras se obtiene un 4.4% de P, expresado en función de la concentración inicial de NCh, mientras que para la reacción irradiada ese porcentaje aumenta a 88.40%.

En principio, puede establecerse que la formación de P en oscuridad posee una barrera de activación bastante elevada y por lo tanto, este proceso puede descartarse a temperatura ambiente.

Con el objeto de identificar el producto P, se procedió a aislarlo mediante la técnica de HPLC. La Figura 5.9.A muestra el espectro UV-Vis de P en solución acuosa ácida (pH:4) junto con los espectros N y NCh al mismo pH.

El producto P presenta dos bandas de absorción bien definidas a 309 nm y a 363 nm, respectivamente.

0 4 8 12

0.000

0.004

0.008

0.012 A

ChN

P

t=0 t=5h

tiempo (min)0 5 10 15

0.000

0.004

0.008

0.012 B

t = 0 h t = 5 h

tiempo (min)

Figura 5.8: Cromatogramas para soluciones acuosas de chalcona en medio básico. A) sin irradiación, B) irradiado con luz de 420 nm. Detección 330 nm. Condiciones experimentales descritas en el Capítulo 8.

N

P

NCh NCh


98

Es interesante notar que en medio ácido, el espectro de absorción UV-Vis del producto P se modifica muy lentamente, en términos de días, con una clara aparición de la banda a 285 nm característica de la forma N, Figura 5.9.B.

Para confirmar si la aparición de esta banda corresponde a la formación

de N a partir de P, se realizó el análisis por HPLC de una solución de P en medio ácido dejada reaccionar por 3 días y se la coinyectó con una solución de N, Figura 5.10.

El aumento del área del pico de mayor tiempo de retención confirma que el producto P se transforma lentamente en N.

Figura 5. 9: A) Espectro del producto P (normalizado) en solución ácida (pH 4). B) Evolución espectral del producto P en solución acuosa ácida, pH 4.

250 300 350 400 4500.0

0.5

1.0

A

P Fl Ch

Abs

λ (nm)250 300 350 400 450

0.0

0.3

0.6

B

0 días 2 días 8 días

Abs

λ (nm)

Figura 5.9: A) Espectro del producto P (normalizado) en solución ácida (pH 4). B) Evolución espectral del producto P en solución acuosa ácida, pH 4.

0 5 10 150.00

0.01

0.02

0.03

NP

Coinyección P + N P (3 días) P

tiempo (min)

Figura 5.10: Cromatograma de la evolución de P en medio acuoso ácido. Detección 330 nm.


99

La Figura 5.9.A muestra que el espectro del producto P presenta un corrimiento hipsocrómico con respecto al espectro de NCh, indicando la pérdida del cromóforo característico que involucra la conjugación extendida de los anillos aromáticos a través del sistema del doble enlace conjugado con el grupo carbonilo.

El análisis del comportamiento cromatográfico sugiere que P es una molécula más polar y de menor tamaño que N y NCh.

Por otra parte, la transformación de P hacia N es un indicio de que la molécula carece del heterociclo C, es decir se encuentra en forma abierta con una tendencia a cerrar en medio ácido.

Finalmente, y dado que las chalconas son susceptibles a la hidrogenación catalítica del doble enlace en posición C2-C3 originando las correspondientes dihidrochalconas [10],

se utilizó esta reacción para comprobar la existencia de un doble enlace en el anillo C de P. El procedimiento básicamente consistió en comparar los resultados de la hidrogenación de NCh y P en soluciones metanólicas ácidas y neutras utilizando como catalizador PtO (IV) y bajo una presión de hidrógeno de 2-3 atm. A diferencia de NCh, la reacción fue negativa para P, sugiriendo esto la ausencia del doble enlace en la molécula.

Los resultados experimentales sugieren que P corresponde a la familia de compuestos denominados β-hidroxidihidrochalconas [11], Figura 5.11, denominandose β-hidroxi-4,2`,4`-trihidroxi dihidrochalcona.

OH

OH

RO

O

OH

OH

Figura 5.11: Estructura del producto P.

OH

OH

OH

O OH

OH

H+

OH

OH

OH

O OH2

OH

-H2O

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

OH

O

OHH

-H+

O

OH

OH

O

OH

+

+

+

Figura 5.12: Mecanismo para la reacción de cierre del producto P en medio ácido.


100

Basado en esta estructura para P,

la reacción de cierre a N en medio ácido puede explicarse mediante una reacción de sustitución nucleofílica unimolecular, SN1 que implica simplemente la protonación del hidroxilo en posición C-β (hidroxilo bencílico) facilitando su salida como H2O y cerrando a la forma flavanona, Figura 5.12.

5.3.2-SOLUCIONES ETANÓLICAS BÁSICAS.

La Figura 5.13 muestra los cambios espectrales observados para soluciones etanólicas básicas de NCh ([NaOH] = 1.25 mM), tanto en condiciones de oscuridad como de irradiación de la banda visible de la chalcona deprotonada a 420 nm. Los cambios espectrales para la reacción

300 400 500 6000

1

2

3Oscuridad

0 h 6 h días

A

Abs

λ (nm)300 400 500 600

0

1

2

3

Luz (420 nm) 0 h 6 h días

Bλ (nm)

Figura 5.13: Espectros de absorción de soluciones etanólicas básicas de NCh ([NaOH] 1.25 mM). A)

Reacción a oscuras. B) Reacción irradiada con luz de 420 nm.

0 3 6 9 12 15 18-0.02

0.00

0.02

0.04

0.06

t = 6 h

NCh

N

P

Sin irradiación Irradiado con luz λ= 420 nm

tiempo (min)

Figura 5.14: Cromatogramas para soluciones etanólicas de NCh en medio básico ([NaOH] 1.25 mM).

Detección 330 nm.


101

irradiada son similares a los observados en medio acuoso básico, según lo indica la forma del espectro final luego que se dejó a las soluciones durante un período de 2 días.

A fin de corroborar si en soluciones etanólicas básicas también tenía lugar la reacción de formación de P observada en soluciones acuosas, se realizó también el análisis por HPLC de las soluciones irradiadas y no irradiadas, Figura 5.14.

Tanto los experimentos de absorción UV-Vis como los realizados por HPLC demuestran que la irradiación de soluciones etanólicas básicas de NCh originan el producto P. Además, este producto formado regenera N luego de dos días de almacenado en oscuridad en medio ácido.

En cambio en ausencia de luz después de 6 horas aproximadamente, solo se observa una mezcla de N y Ch.

Estos resultados sugieren la formación del mismo producto P que en medio acuoso, Figura 5.11.

5.3.3- MECANISMO DE REACCIÓN DE NCh EN MEDIO BÁSICO CON IRRADIACIÓN

Según la estructura propuesta, el producto P se formaría mediante la adición nucleofílica intermolecular del anión HO- al C-β [9]. Bajo las condiciones experimentales estudiadas puede considerarse que P sólo se forma en presencia de luz. Esto sugiere que el proceso de adición nucleofílica intermolecular está activado fotoquímicamente, involucrando al estado excitado del cromóforo asociado con la banda de absorción visible de la chalcona deprotonada, *NCh2-, Figura 5.15.

La mayoría de la reacciones fotoquímicas orgánicas ocurren mediante procesos diabáticos, en donde la superficie potencial del estado excitado del reactivo se aproxima a la superficie potencial del estado fundamental en alguna geometría molecular intermedia entre el reactivo y el producto, Figura 5.16.

O

RO

O

O

O

hν

*

OH

RO O O

OHON 2- NCh 2- P

ADICION NUCLEOFILICA INTRAMOLECULAR

ADICION NUCLEOFILICA INTERMOLECULAR

- OH

* NCh2-

ka

kc

kc* kP

O

OH

RO

O

O

O

OH

RO

O

O

O

OH

RO

O

O

*

+-+

-

Figura 5.15: Mecanismo para la reacción de NCh en medio básico a oscuras e irradiada.


102

La diferencia de estos procesos con los denominados adiabáticos radica en el hecho que para los últimos la transformación del reactivo en producto ocurre en la misma superficie de energía potencial del estado excitado [12].

En la Figura 5.16, R* representa el estado singulete excitado de NCh2- cuya configuración geométrica en el mínimo de energía es óptima para el acoplamiento de las superficies de energía potencial entre el estado excitado y el fundamental. En el caso de sistemas de dobles enlaces es conocido que los estados singuletes excitados poseen carácter zwitteriónico [12], Figura 5.17.

Es importante notar que el estado excitado con estructura zwitteriónica posee un momento dipolar mayor que el estado fundamental, favoreciendo el ataque nucleofílico. En esta situación, en principio, el estado excitado zwitteriónico también favorecería la competencia con la adición nucleofílica intramolecular del grupo fenolato en posición C-2’ al mismo C-β originando la flavanona.

El mecanismo de reacción en medio básico que se describe en la Figura 5.15 implica básicamente una reacción a través de la cual la especie NCh anión puede, tanto en el estado fundamental como en el estado excitado, ciclizar a la forma N en un ataque intramolecular del grupo fenolato en posición C-2’ de acuerdo al mecanismo planteado en el Capítulo 4, Figura 4.10, y simultáneamente en el estado excitado puede adicionar HO- originando el producto P.

La Figura 5.18 muestra los perfiles cinéticos obtenidos por análisis de HPLC de la reacción de NCh2- en ausencia y presencia de irradiación a 430 nm.

1.35 A 1.44 A

S0 ( π,π) planar S1 ( π,π*) torsionado

Estado Fundamental Estado excitado singulete

Figura 5. 17: Formación de un zwitterión por absorción de energía.

hν

R

Estado excitado

Estado fundamental

R*

P

Transición radiativa

Transición no radiativa

Movimiento en la superficie

R Phν

hν

R

Estado excitado

Estado fundamental

R*

P







R Phν

R Phν

Figura 5. 16: Representación de reacciones fotoquímicas diabáticas en términos de superficies de energía.


103

[ ][ ] [ ]−−

−

−+=− 2

2

NCh*NCh )(dt

NCh deac

kkk

Efectivamente, puede observarse que en ausencia de luz tanto los perfiles cinéticos para el consumo de NCh2- como la formación de N2- son idénticos, con una constante de velocidad de primer orden kobs = 4.9x10-4 s-1.

Además es claro que tanto Ch2- y N2- alcanzan un valor de equilibrio. Tal como se discutiera en el Capítulo 4, kobs = ka + kc para el equilibrio de isomerización flavanona-chalcona en el estado fundamental. A pH 11 la constante de equilibrio para la formación de flavanona es 4.35 (Tabla 4.1).

Teniendo en cuenta la ecuación. 4.9 se obtiene que kc = 4.07x10-4 s-1 y ka = 9.04x10-5 s-1.

En presencia de radiación, el decaimiento de primer orden de NCh2- es más rápido (kobs = 1.23x10-3 s-1) mientras que su consumo es prácticamente total luego de 150 min de reacción. A su vez, se observa la formación eficiente tanto de P como de N2- con la misma velocidad que el decaimiento de NCh2- (kobs = 1.23x10-3 s-1). Para el caso de N2,- y luego del crecimiento mencionado, se

observa un consumo más lento con una kobs = 9.75x10-5 s-1. Este valor coincide con la constante de velocidad para la reacción de apertura de N2- en oscuridad (ka = 9.04x10-5 s-1), indicando que en estas condiciones el equilibrio de isomerización chalcona-flavanona es desplazado hacia el consumo total de chalcona ya que la formación fotoinducida de P es un proceso irreversible en medio básico.

Bajo condiciones de iluminación continua, y sólo considerando la formación de N2- y P, las velocidades de consumo y formación de las distintas especies están descriptas por las siguientes ecuaciones diferenciales:

5.1

5.2

5.3

0 100 200 3000

2

4

6

tiempo (min)

HPL

C A

rea/

105

tiempo (min)

Reacción en oscuro NCh2-; τ = 33 min N2-; τ = 34 min

0 100 200 3000

2

4

6

Reacción con luz (430 nm)NCh2-; τ = 13.5 min P; τ = 14.0 min N2-; τ

1 = 13.8 min

τ2 = 171 min

Figura 5.18: Perfiles cinéticos obtenidos por HPLC, detección 298 nm, para la reacción de NCh2- en

soluciones acuosas pH 11, en ausencia y presencia de radiación visible a 430 nm

[ ][ ]−= 2*

PNCh*

dt

P dk

[ ][ ] [ ]−− += 2*

c2

c

-2

NCh* NCh dt

N dkk


104

En condiciones de iluminación continua, la formación de los estados excitados de NCh2- pueden considerarse en régimen de estado estacionario [13], y por tanto la concentración de los mismos en esas condiciones está dado por:

5.4

Donde ke y k-e corresponden a la

velocidad de formación y desactivación de los estados excitados *NCh2-, mientras que kc*, y kP*, son las constantes de velocidad de formación de N2- y P desde el estado excitado. El cociente de estas constantes se denomina constante de velocidad observada de estado estacionario kee.

En estas condiciones y teniendo en cuenta la [*NCh2-]ee las ecuaciones anteriores pueden reescribirse como:

5.5

5.6

5.7 La forma integrada de estas

ecuaciones son:

5.8

5.9

5.10

Estas ecuaciones explican por qué la constante de velocidad observada, kobs, para el consumo de NCh2- es coincidente con los valores para la formación de N2- y de P, validando el mecanismo propuesto.

Los valores de kP’ y kc’ pueden obtenerse considerando las ecuaciones 5.9 y 5.10 en condiciones de tiempo infinito.

5.11

5.12 Donde [P]∞ representa la

concentración final de producto formado, mientras que la [N2-]∞ representa la concentración máxima de Naringina formada bajo iluminación (aproximadamente a 30 min de iniciada la reacción), es decir sin considerar su consumo lento por el desplazamiento del equilibrio de isomerización Ch→F a causa de la formación irreversible de P.

Ambas cantidades fueron obtenidas por HPLC mediante la realización de curvas de calibración.

Los valores obtenidos fueron [P]∞= 5.2x10-5 M, [N2-]∞ = 1.8x10-5 M y [NCh2-]0 = 5.9x10-5 M. Teniendo en cuenta que kobs = 1.23x10-3 s-1, se obtiene kP’ = 1.1x10-3 s-1 y (kc + kc’) = 3.8x10-4 s-1. Sin embargo, el valor de la constante de cierre en la oscuridad a pH 11 es kc = 4x10-4 M (ver arriba), por lo tanto este resultado implica que no se produce la formación de flavanona desde el estado excitado *NCh2- y que la única reacción que ocurre desde dicho estado en forma eficiente es la formación de P.

02

obsP

]NCh [

] P ['

−

∞

=kk

]Ch [)(

]Ch[]Ch[* 2

ee

e*

P*

c

2e

ee2 −

−

−

− =++

= kkkk

k

[ ][ ]

[ ]−−

−

−

=

−+=−

2obs

2eeeec

2

NCh

NCh (dt

NCh d

k

kkkk

[ ][ ] [ ]−− =+= 22 NCh 'NCh )(

dt

P dPee

*

Pkkk

[ ][ ]

[ ]−−

−

+=

+=

2

2

2

NCh )'(

NCh )(dt

N d

cc

ee

*

cc

kk

kkk

[ ] [ ] [ ])texp(1 NCh )'

N obs02

t2 k

k

k(k

obs

cc−−

+= −−

[ ] [ ] [ ])texp(1 NCh'

P obs02

t kk

k

obs

P−−= −

[ ] [ ] )texp(NCh NCh obs02

t2 k−= −−

02

2

obscc

]NCh [

]N [)'(

−

∞

−

=+ kkk


105

En el estado fundamental la conformación de NCh2- es trans-s-cis respecto al doble enlace, Figura 2.9 [4, 5, 6, 14,15]. Esta conformación geométrica no es la apropiada para la adición nucleofílica intramolecular y por tanto la molécula debe rotar sobre el enlace Cα–CO para alcanzar la conformación reactiva trans-s-trans [8].

Sobre la base de los hechos observados, es posible plantear que la rotación hacia la forma trans-s-trans originaría N, mientras que la conformación trans-s-cis favorecería la formación de P. La rotación alrededor del enlace simple tiene una barrera energética baja, tal como lo indica el hecho de que la reacción de ciclización ocurra en el estado fundamental, por lo tanto, que en el estado excitado el proceso predominante sea la formación de P implica que cuando la molécula de NCh2- absorbe radiación, se forma el estado excitado zwitteriónico con un exceso de carga positiva sobre el Cβ y, antes de rotar hacia la forma reactiva para el cierre, ocurre la reacción de adición nucleofílica intermolecular del anión hidróxido, HO-.

Esto resulta lógico si se tiene en cuenta que la [HO-]>>[NCh2-]. Dicho proceso bimolecular se comporta como de pseudoprimer orden, tal como se observa en Figura 5.18.

Finalmente, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos se plantea, en la Figura 5.19, el esquema de reacción para las soluciones básicas de NCh2-

. 5.4-CONCLUSIONES

Los experimentos realizados indican que tanto en medio ácido como

en soluciones etanólicas neutras, el equilibrio se encuentra desplazado hacia la forma N, no existiendo efecto de la luz sobre las velocidades de reacción ni en los parámetros termodinámicos. El mecanismo involucrado en la reacción de ciclización de NCh es vía enolización catalizada por ácido. Los parámetros cinéticos indican que la reacción de ciclización es más rápida en EtOH que en las soluciones ácidas, a pesar que los valores de entalpía de activación son mayores en EtOH que en medio acuoso.

Como consecuencia se observa que en EtOH la reacción está controlada por entropía debido al relajamiento de moléculas de solvente en el estado de transición, el cual sería menos polar que NCh2-.

En medio básico (10 < pH < 12), los resultados indican que en presencia de radiación visible además de la reacción de ciclización existe la formación de un producto P, el cual se origina prácticamente desde el estado excitado de la NCh2- por una reacción de adición nucleofílica intermolecular del anión hidróxido HO-.

Sobre la base de estos resultados se concluye que si bien es posible obtener chalcona a partir de flavanona en medio alcalino, deben tenerse en cuenta las posibles reacciones secundarias como las descritas en este

hν

N 2- NCh 2- Pka

kc

ke k-e kP

NCh 2-

Figura 5.19: esquema para la reacción de NCh

en medio básico


106

capítulo, las que disminuirían el rendimiento de la reacción, teniendo especial precaución en el efecto de la luz. Por lo expuesto, el manejo de condiciones experimentales como pH,

luz, composición del solvente, son de fundamental importancia para desplazar este equilibrio a una u otra forma isomérica de Naringina.


107

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Capítulo6 Determinación de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

109

6.1-INTRODUCCIÓN

En los últimos tiempos los avances científicos han demostrado que los alimentos contienen, además de los nutrientes esenciales, sustancias fisiológicamente activas que son necesarias para una vida saludable. Dentro de estos alimentos benéficos se ha demostrado la importancia del consumo de frutas y vegetales en la prevención de enfermedades crónicas.

Las propiedades benéficas para la salud relacionadas con los cítricos son atribuidas, además de la presencia de AA, a la actividad antioxidante de los polifenoles que contienen [1].

Entre las frutas, los cítricos se destacan como principal fuente de flavanonas dentro de las cuales se encuentran Naringina, en naranjas agrias y pomelos principalmente; Hesperidina

en naranjas dulces y sus agliconas Naringenina y Hesperetina respectivamente.

En este capítulo se presentan los resultados obtenidos en la determinación de las actividades antioxidantes (AAO) y antirradicalarias (AAR) de Naringina, N, Hesperidina, H, sus agliconas como así también la especie Naringinchalcona, NCh, su correspondiente dihidrochalcona, NDhCh y los flavonoles Rutina, R y Quercetina, Q utilizadas como sustancias de comparación por su alto poder antioxidante, Figura 6.1. En una segunda etapa y teniendo en cuenta que en los jugos cítricos coexisten tanto F como ácido ascórbico (AA), Figura 6.2, se analizaron las combinaciones de AA y F en diferentes concentraciones con el objeto de simular las condiciones existentes en los jugos cítricos

Determinación de las propiedades

antioxidantes de flavanonas y sus derivados


110

Flavonoles R1 R2 R3 R4 R5 Quercetina (Q) -OH -OH -OH -OH -OH Rutina (R) -OH -OH -OH -OH -O-rutinos.

Figura 6. 1: Estructura de los compuestos estudiados.

Finalmente, se determinaron las AAR de jugos naturales de naranjas, pomelos y limones.

Para la determinación de las AAR y AAO se utilizaron dos metodologías: el ensayo de decoloración del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo. (DPPH•) y el método de blanqueamiento

de β-caroteno por cooxidación con Ácido Linoleico, cuyas fundamentos se describen a continuación. 6.2-FUNDAMENTOS DE LAS METODOLOGIAS 6.2.1-Determinación de la capacidad Antirradicalaria por el ensayo de decoloración del radical libre estable 2,2-Difenil-1-Picrilhidracilo. (DPPH•).

En esta técnica se utiliza el

radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, DPPH•, Figura 6.3, el cual presenta una intensa banda de absorción a 515 nm que desaparece en presencia

Compuesto Patrón de sustitución Flavanonas R1 R2 R3 R4 Naringina (N) -O-neohesp. -OH -H -OH Naringenina (Ng) -OH -OH -H -OH Hesperidina (H) -O- rutinos. -OH -OH -OCH3 Hesperetina (Ht) -OH -OH -OH -OCH3 Chalconas R1 R2 R3 R4 Naringin Chalcona (NCh) -O-neohesp -OH -H -OH Naringina Dihidrochalcona (NDhCh) -O-neohesp -OH -H -OH

O

R2

R1

R4

R3

O

OH

R2

R1

R4

R3

OFlavanonas Chalconas

OH

R2

R1

R4

R3

O R2

R1

R4

R3

O

O

R5

Dihidrochalconas Flavonoles

O O

OH OH

CH2OH

OH

Figura 6.2: Estructura química de Ácido Ascórbico (AA).

Capítulo 6 Determinación de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

111

N N

NO2

NO2

O2N.

de una especie capaz de donar un hidrógeno. Debido a que los F estudiados no absorben a 515 nm, las cinéticas de desaparición de DPPH• en función de la concentración de los F pueden ser estudiadas espectrofotométricamente al máximo de absorción del radical.

La reacción de consumo del radical por la especie donora de hidrógeno, AH se muestra en la ecuación 6.1:

•• +−→+ AHDPPHAHDPPH 6.1

Este tipo de metodología brinda

información acerca de la reactividad de los compuestos adicionados y es función de su concentración. Es un método rápido, sensible y sencillo que requiere poca cantidad de muestra y puede aplicarse tanto para sustancias lipofílicas e hidrofílicas [2], mientras sean solubles en el medio; sin embargo presenta el inconveniente de que la cinética del proceso es usualmente compleja, especialmente para aquellas sustancias que reaccionan muy lentamente [3 ] lo que se atribuye a mecanismos complejos de reacción que implican etapas secundarias. Específicamente en el caso de fenoles la reacción es compleja e

involucra varias reacciones reversibles de difícil interpretación en términos de la velocidad de reacción [4]. Los resultados obtenidos pueden expresarse en términos del factor estequiométrico (n) definido como el número de moléculas de radicales libres consumidos por molécula de sustancia adicionada durante el tiempo necesario para alcanzar un estado estacionario, EE [ 4 ]. A mayor valor de n, mayor capacidad antirradicalaria. Otro parámetro utilizado es el valor EC50, el cual representa la cantidad de antioxidante adicionado necesario para reducir al 50% la concentración inicial del radical DPPH•. El valor de EC50 puede expresarse en moles de AO adicionado, concentraciones o, para el caso de extractos EC50 frecuentemente se expresa en µl de extracto adicionado [5].

6.2.2- Determinación de la capacidad Antioxidante por el sistema β-caroteno- ácido linoleico

Este método se basa en el

monitoreo de la desaparición de β- caroteno durante la co-oxidación de una emulsión acuosa formada por el carotenoide y ácido linoleico contenidas en micelas de Tween 20, Figura 6.4.

Durante la oxidación del ácido linoleico, un átomo de hidrógeno es abstraído desde un grupo metilénico bis-alilíco formando el radical libre pentadienilo el cual, para readquirir un átomo de hidrógeno ataca el altamente insaturado β-caroteno reduciendo su sistema de dobles enlaces conjugados y produciendo consecuentemente su decoloración.

Figura 6. 3: Estructura química del radical DPPH


112

El proceso se monitorea por

espectroscopía UV-Vis al máximo de absorción del carotenoide. La AAO es evaluada como la capacidad de un compuesto de minimizar la pérdida de color del carotenoide.

Este método es rápido y sensible, ampliamente utilizado en la determinación de la AAO de diferentes sustancias, sin embargo ha sido criticado por su baja especificidad, por estar sujeto a interferencias y por no ser, el ácido linoleico, un lípido representativo de los típicos presentes en alimentos [6].

Sin embargo, al ser un método aplicable especialmente a sustancias lipofílicas, considera la “habilidad” real de atravesar las membranas y de actuar en medios más similares a los biológicos [2]. 6.3- RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.3.1- DETERMINACIÓN DE LA AAR DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS.

En la Figura 6.5 se muestran los perfiles típicos de desaparición del

radical DPPH• en función del tiempo para los diferentes F estudiados.

Desde el punto de vista de la velocidad de reacción y de la efectividad, se observan diferentes comportamientos, las flavanonas N y Ng presentan un comportamiento cinético muy lento, en períodos de horas y con requerimientos de altas concentraciones para consumir más del 50% del radical (100 moles de N/mol DPPH•); en el otro extremo de reactividad se encuentra el flavonol Q, con un decaimiento rápido y altos consumos del radical a bajas concentraciones, indicando su alta eficiencia y reactividad. El resto de los F analizados muestra un comportamiento intermedio entre los dos casos descritos.

Para la determinación de los factores estequiométricos se realizaron experimentos a partir de los cuales se obtuvieron los consumos porcentuales del radical en el estado estacionario, para diferentes concentraciones de F, como se ejemplifica en la Figura 6.5.A.

Acido Linoleico + β - ca roteno

Tween 20 Flavonoides

Figura 6. 4: Esquema representativo del sistema β-caroteno- ácido linoleico


113

Estos valores se graficaron en

función de la concentración de cada F, Figura 6.5.B, y a partir de allí se determinaron los valores de EC50.

Finalmente se calculan los factores utilizando la ecuación 6.2:

6.2

Una forma alternativa de

determinar el factor n consistió en realizar gráficas como la que se muestra en la Figura 6.6, donde se representan

los moles de radical consumido por mol de AO agregado.

Como se muestra en la Figura 6.7, la relación es lineal hasta una cierta concentración de AO a partir de la cual el consumo de radical se torna independiente de la concentración del AO adicionado.

El valor de la pendiente para el sector lineal de este gráfico, representa el factor estequiométrico.

n = 1EC50 x 2

Figura 6. 5: Perfiles de disminución de la concentración del radical libre por adición de: A) 0,0; 7,0; 10,00 y 200 moles de N / mol DPPH•. B) 0,00; 0,07; 0,14; 0,29 moles de Q / mol DPPH•.

0 9 18

0.2

0.4

0.6

0.8

A

Abs

. (51

5 nm

)

tiempo (min)0 7 14

0.3

0.6

Btiempo (min)

Abs

. (51

5 nm

)

0.0 0.4 0.8

25

50

75

100

B

% D

PP

H re

man

ente

E. E

stac

iona

rio

mol Rutina/ mol DPPH0 1000 2000

0

25

50

75

100

A

% D

PP

H re

man

ente

tiempo (s)

Figura 6. 6.A: Perfil cinético; 0,07; ⌧ 0,15; 0,22; 0,37; 0,73 1,08 mol R/ mol DPPH•. B: % DPPH remanente en el E.E en función de la concentración para el flavonol Rutina.


114

Compuesto n* n ARP

Q 3.57 3.11 7.14 R 4.91 3.90 9.81 Ht 0.31 0.31 0.62 H 0.42 0.38 0.80

NCh 1.03 1.06 2.08 NDhCh 0.57 0.78 1.14

Ng 0.11 0.13 0.22 N 0.09 0.02 0.18

Tabla 6. 1: Factores estequiométricos y valor de ARP para los F estudiados

En la Tabla 6.1 muestra los

valores obtenidos para los diferentes F estudiados y se comparan los valores determinados mediante gráficos como el de la Figura 6.7 (n*) con los calculados a partir del valor EC50 (n) según la ecuación 6.2 [5].

De acuerdo a los valores obtenidos se estableció el siguiente orden de eficiencia, expresado como factores estequiométricos, R > Q > NCh > NDhCh > H > Ht > Ng > N.

Los resultados pueden explicarse en función de las características estructurales de los compuestos.

La eficiencia para atrapar radicales libres está modulada por la aptitud de transferir átomos de H a

DPPH•, esto es por la estabilidad de la forma radicalaria del F.

Flavanonas con solo un grupo hidroxilo en el anillo B y un enlace simple entre C2-C3 tienen baja reactividad debido, entre otras razones, a la lenta formación del radical fenoxílo [ 7 ]. El aumento de la reactividad observado para H y Ht es una evidencia del efecto de un grupo metoxilo en posición C-4’ del anillo B junto al hidroxilo en C-3’, o sea la disustitución en el anillo B. La adición del grupo metoxilo mejora las propiedades donoras de H de la posición C-3’. En cuanto a la forma NCh, el isómero estructural de N, el aumento de la reactividad se asocia fundamentalmente a la presencia del doble enlace C2-C3 que favorece la conjugación entre los anillos aromáticos, además de la presencia de un nuevo grupo hidroxilo en posición C-2’, susceptible de donar átomos de hidrógeno. La disminución observada para NDhCh es consecuencia de la eliminación de dicho doble enlace.

La máxima efectividad para capturar radicales corresponde al flavonol Q cuya estructuras reúne las características óptimas para la captura de radicales libres; esto es un sistema o-dihidroxi en el anillo B, el cual estabiliza al radical fenoxilo por enlace puente hidrógeno intramolecular (Figura 3.9), un doble enlace C2-C3 que permite la

0 7 14

0

6

12

DPP

H c

onsu

mid

o (1

x 1

0-8m

ol)

Quercetina (1 x 10-8moles)

Figura 6.7: Relación mol DPPH• consumido vs. mol Q adicionado.


115

conjugación entre el anillo B y el carbonilo, y un grupo hidroxilo en posición C-3 el cual aumenta la coplanaridad de la molécula por disminución del ángulo de torsión del anillo B con respecto al resto de la molécula.

La disminución observada para NDhCh es consecuencia de la eliminación de dicho doble enlace. 6.3.2- DETERMINACIÓN DE LA AAO DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS.

La Figura 6.8.A muestra el

consumo de β-caroteno durante la co-oxidación térmica (50ºC) de ácido linoleico. En el gráfico 6.8.B se comparan los perfiles cinéticos para la muestra blanco la cual contiene solo el carotenoide y es una referencia de su descomposición térmica, el control que incluye el carotenoide más el ácido linoleico y representa el proceso de co-oxidación y la muestras en donde se adiciona la sustancia a analizar, en el caso de la Figura 6.8, corresponde a Q.

Bajo esta metodología, la AAO puede expresarse de diferentes maneras entre las que se incluyen medidas de la absorbancia UV-Vis del control y la muestra al comienzo y final de la reacción [ 8 ], relación entre las velocidades de blanqueamiento del carotenoide [9], etc.

En nuestro caso consideramos conveniente monitorear el consumo del carotenoide a lo largo del tiempo del experimento, utilizando las pendientes de las gráficas absorbancia vs. tiempo del control y la muestra como lo indica la ecuación 6.3:

6.3

Dado que esta metodología

involucra un sistema microheterogéneo, el conocimiento de la forma en la que las sustancias se distribuyen en las diferentes microfases es de gran importancia. Es por ello que se determinaron los coeficientes de partición utilizando n-octanol como fase orgánica debido a que este solvente

400 5000.0

0.5

1.0

A

0- 90 minA

bs

λ (nm) 0 20 40 60 80 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B Blanco Control Adición Quercetina

Abs

460

nm

tiempo (min)

Figura 6. 8: A) Cambios espectrales de β-caroteno durante la cooxidación con ácido linoleico. B) Perfil cinético para el agregado de Q. (1 mol Q/mol β-caroteno) calculado en base a la solución micelar en

Tween 20. T: 50ºC. Procedimiento descrito en el Capítulo 8.

CtrolMCtrol

PendientePendientePendienteAAO −=%


116

F Relación molar F/β-C

% Act. AO

KO/W

fO

Q 0.97 62.50 18.20 0.95 R 0.94 -1.56 1.62 0.62 Ht 0.81 25.15 8.93 0.90 H 0.99 7.12 2.09 0.68

NCh 0.95 17.61 2.75 0.73 NDhCh 0.92 27.31 3.30 0.77

Ng 0.98 0.10 39.81 0.98 N 0.95 1.25 1.29 0.56

Tabla 6. 2: Actividad Antioxidante de los F estudiados.

presenta un valor de constante dieléctrica similar al reportado para Tween 20 [10].

En la Tabla 6.2 se indican los valores de AAO junto a las constantes de partición de F entre n-octanol y agua, KO/W, y la fracción de F en la fase orgánica, fO. de los F analizados, calculados como:

6.4

De los F analizados, el flavonol Q

presenta la mayor AAO, mientras que su correspondiente glicósido, R es el menos eficiente en la protección del carotenoide.

Este resultado está de acuerdo con lo publicado por Burda y col [11] quienes, comparando la AAO de flavonoles agliconas con sus glicósidos sugieren que el bloqueo del grupo hidroxilo en C-3 resulta en una pérdida total de la AAO [11,12]. Por otra parte Heim y col [ 13 ] indican que la superioridad de Q para inhibir daños oxidativos está adscripta a la presencia de un sustituyente hidroxilo en posición C-3 que incrementa la estabilidad del radical fenoxilo formado.

Además de los factores estructurales, el sistema heterogéneo utilizado en esta metodología juega un rol importante ya que se trata de un sistema micelar donde los sustratos oxidables están en el interior de la micela. Es por esto que la capacidad de atravesar la interfase para actuar en el medio lipofílico puede ser estimado considerando una partición agua-octanol. De este modo K modela la capacidad de llegar al interior de la micela.

Para R, el coeficiente de partición indica que se encuentra en un 60% dentro de la micela.

Sobre la base de estos hechos la baja AAO o la actividad prooxidante de R se explica en función de los factores estructurales antes mencionados.

Dentro del grupo de las flavanonas, tanto N como Ng son prácticamente inactivas, a pesar de que los coeficientes de partición de la última indican una alta solubilidad en la micela, esto es un 98% de la concentración inicial se encuentra en la fase orgánica. Tanto N como Ng poseen un enlace simple C2-C3 y sólo un grupo hidroxilo en posición C-4’ del anillo B, característica poco favorable para atrapar radicales libres [12]. La ausencia

WO

WO

T

OO

W

OWO K

KFFf

FFK

/

// 1][

][;][][

+===


117

de un doble enlace C2-C3 impide la conjugación entre los anillos A y B y consecuentemente los radicales fenoxilos formados son menos estables.

Por otra parte se ha informado que compuestos con grupos 4’ monohidroxilados son menos potentes, debido a la relativamente lenta formación del radical fenoxilo comparado por ejemplo, con “fenoles impedidos” es decir, estructura con grupos metoxilos en posición orto. En forma general, las flavanonas, son AO débiles, debido a la pérdida de la conjugación entre los anillos A y B.

En la Figura 6.9, se comparan las estructuras de la forma flavanona y chalcona de N. En ella se observa que, para la forma flavanona, el anillo B, principal responsable de la AAO, se encuentra fuera del plano con respecto al resto de la molécula, mientras que para la forma chalcona existe coplanaridad entre el anillo B y el grupo carbonilo.

Las flavanonas H y especialmente su aglicona Ht, presentan un aumento de la AAO con respecto a N y Ng. Esto concuerda con lo informado por Burda y Oleszek [11] quienes asocian este aumento en la eficiencia a

la presencia del grupo metoxilo el cual incrementaría la estabilidad del radical fenoxilo traduciéndose como un aumento de la actividad AO.

En cuanto al efecto de la glicosilación, en general las agliconas son más potentes que sus respectivos glicósidos, hecho que se observa puntualmente en H y Ht donde la glicosilación reduce la AAO en un 65% aproximadamente.

Dentro de los F más efectivos se encuentran NCh y NDhCh, siendo la primera un isómero estructural de N.

Para NCh la efectividad se debe fundamentalmente a la presencia del doble enlace C2-C3 que, como se ve en la Figura 6.9 aumenta la coplanaridad entre el anillo B y el resto de la molécula.

De manera contraria a lo esperado, NDhCh, con un enlace simple en posición C2-C3 interrumpiendo la conjugación entre el anillo B y el resto de la molécula, es más efectiva que su correspondiente chalcona.

Este resultado inesperado podría justificarse teniendo en cuenta la estabilidad de NDhCh comparada con NCh la cual se encuentra en equilibrio con la forma flavanona, siendo esta

Anillos A y C

Anillo B

Anillo B

Anillo A

Flavanona Chalcona

Figura 6.9: Estructuras de las formas flavanona y chalcona de N.


118

última la forma predominante en agua. Con el objeto de constatar esta

hipótesis se realizaron experimentos que consistieron en disolver NCh en la micela de Tween 20 monitoreándose los cambios espectrales en función del tiempo. Los resultados indicaron que NCh se encuentra en el interior la micela, y está fuertemente estabilizada por ésta ya que no se observaron cambios en el espectro de absorción.

Este mismo resultado se obtuvo en n-octanol, el solvente utilizado para modelar el medio, por lo que la hipótesis se rechazó.

Tanto para NCh como para NDhCh los valores del coeficiente de partición y de fO son similares, por lo tanto, la diferencias en cuanto a la AAO pueden atribuirse a algún tipo de interacción específica (probablemente tipo puente hidrógeno) de NCh con el surfactante, la cual bloquea el sitio accesible para la reacción con los radicales, disminuyendo la AAO.

Finalmente puede concluirse que la AAO está sujeta principalmente a los factores estructurales de las moléculas.

6.3.3- COMPARACION DE LA AAO Y AAR DE LOS FLAVONOIDES

La Figura 6.10 compara los

valores obtenidos para la AAO y AAR de los F bajo estudio. La principal diferencia entre las dos metodologías se observa para el caso de R la cual presenta una elevada AAR y AAO casi nula, lo cual puede adscribirse a dos efectos, por una parte el bloqueo del grupo hidroxilo en posición C-3, presente en Q el cual es responsable de la AAO de ésta con respecto al resto de los F que no lo

poseen y por otra parte, dado que se trata de un sistema microheterogéneo, las diferencias en el coeficiente de partición determinado en n-octanol, solvente de características similares a Tween 20.

Sin embargo, observando la situación para Ng, la cual presenta el mayor coeficiente de partición y AAO muy baja, se puede concluir que las diferencias observadas se deben fundamentalmente a los factores estructurales. 6.3.4-DETERMINACION DE LA AAR DE COMBINACIONES F-AA POR EL MÉTODO DE DECOLORACIÓN DEL DPPH•.

De acuerdo con lo descrito en el

Capítulo 3, en los cítricos coexisten tanto AA como F. Sobre la base de los antecedentes bibliográficos mencionados en el Capítulo 3 y, con el objeto de explorar la posibilidad de un sinergismo similar al observado entre ión ascorbato

Figura 6. 10: A) Fracción de F en la fase orgánica (f0)., B) % AAO, C) factor

estequiométrico (AAR) de los F estudiados

Q R Ht H Ch NDhCh Ng N0

2

4

6

Fact

or e

steq

.

Q R Ht H Ch NDhCh Ng N

0

20

40

60

C%

AAO

Q R Ht H Ch NDhCh Ng N0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

B

A

f o


119

y el α-tocoferol, ecuaciones 3.24 y 3.25, se investigó el efecto sobre la AAR de combinar los F estudiados anteriormente con AA frente al radical libre DPPH. .

Los experimentos se realizaron determinando primero los consumos de radical de cada compuesto por separado, luego se prepararon mezclas in situ a las cuales se les adicionó solución stock del radical y finalmente, con el objeto de determinar la posibilidad de regeneración entre las diferentes especies oxidadas y reducidas, la reacción se llevó a cabo en etapas, esto es adicionando primero el F, y luego de alcanzar el EE se adicionó el AA. El procedimiento también se llevó a cabo de manera inversa, se permitió reaccionar primero AA y luego del EE se agregó el F.

El AA presenta una gran reactividad frente a los radicales libres, para el caso particular de DPPH• la reacción procede de manera instantánea, alcanzándose el EE en menos de 30 s con un factor estequiométrico de 1.76, determinado experimentalmente.

Como consecuencia de su reacción con los radicales libres AA se transforma en Ácido Dehidroascórbico (DHA), la forma completamente oxidada de AA., Figura 6.11.

En la Figura 6.12 se muestran los perfiles cinéticos obtenidos para N, Q, y AA con diferentes secuencia de agregado.

Las líneas de puntos representan el consumo “teórico” del radical, obtenido

Acido Ascórbico Radical Semidehidroascorbilo Acido Dehidroascórbico (AA) (HA.) DHA

O O

OH OH

CH2OH

OH O O

OH O

CH2OH

OH

DPPH. DPPH-H DPPH. DPPH-H

O O

O O

CH2OH

OH

Figura 6.11: Mecanismo para la reacción de AA con DPPH•.

0 40 80 120 360 380 40070

80

90

100 A

(N+AA)+DPPHvalor experimental

(AA+DPPH)+N

valor teórico

(N+DPPH)+AA

(N+AA)+DPPH

% D

PP

H re

man

ente

tiempo (min)0 50 100 150 330 360 390 420

20

40

60

80

100

B

valor experimental(Q+AA)+DPPH

(Q+DPPH)+AA

(AA+DPPH)+Q

valor teórico

tiempo (min)

% D

PP

H re

man

ente

Figura 6.12: Perfiles cinéticos para A) N, AA y mezclas. B) Q, AA y mezclas frente a DPPH..


120

sumando los consumos de cada compuesto por separado.

Los círculos de la Figura corresponden al comportamiento de la mezcla de los F con AA, preparada in situ mientras que los cuadrados corresponden a la reacción en etapas donde se adiciona en primer lugar el F y los triángulos a la reacción primera con AA.

La Figura 6.12.A muestra que para la mezcla, (N+AA)+DPPH., se observa primero un decaimiento instantáneo cuyo consumo es coincidente con la suma de los perfiles para los compuestos individuales, designado como “valor teórico” Luego de este decaimiento rápido el perfil de la mezcla muestra una lenta disminución que no puede asociarse con N ni AA, dado que de acuerdo a los perfiles individuales de ambas sustancias la reacción con el radical ya alcanzó el EE.

Este consumo “extra” de radical, de aproximadamente 6% sugiere que la interacción de ambas sustancias origina

alguna especie susceptible de continuar atrapando radicales libres.

Cuando se hace reaccionar N en primer lugar, símbolos cuadrados, se observa un decaimiento rápido con un consumo de aproximadamente un 10% del radical. Una vez que se alcanzó el EE, se adicionó una alícuota de AA observándose una segunda disminución rápida coincidente con el consumo de AA seguida de una tercera componente lenta similar a la observada para la mezcla.

Por último, cuando se utiliza AA como reactivo inicial el perfil muestra, luego del consumo característico del radical por parte de AA, un disminución asociada a la adición de N para posteriormente continuar disminuyendo lentamente con una pendiente similar a la observada en el perfil de la mezcla.

Estos resultados sugieren que durante la interacción F-AA se formaría o regeneraría alguna especie susceptible de continuar capturando radicales libres.

Las velocidades con las que ambas sustancias reaccionan con el

DPPH . DPPH-H DPPH . DPPH-H

AscH- Asc.- DHAinstantáneo instantáneo

lento

N N .

DPPH. DPPH-Hmuy lento

kobs < 0.5 s-1

kobs = 3 x10-3 s-1

kobs = 3 x10-4 s-1

Figura 6.13: Mecanismo para mezclas de N y AA con DPPH..


121

radical son muy diferentes, AA reacciona instantáneamente: kobs AA+DPPH > 0.5 s -

1mientras que N presenta una velocidad de reacción de aproximadamente kobs

N+DPPH = 3x10-3 s-1. Esto sugiere que DHA se forma aproximadamente 30 veces más rápido que el correspondiente radical fenoxilo de N.

Sobre la base de estas observaciones, se puede postular que la reacción entre ambos compuestos ocurre, en este caso, principalmente entre la forma DHA y N.

De esta manera, el posterior decaimiento en los perfiles puede atribuirse principalmente a la regeneración del radical ascorbilo, AH• por reacción con N, de acuerdo con lo postulado por Bors y col [14] durante su estudio de la interacción de ascorbato con F.

Las reacciones posibles para N son las descritas en la Figura 6.13, donde: AscH-, Asc.-.y DHA corresponden a ascorbato, radical ascorbilo y dehidroascorbato; N y N. representan a Naringina y radical libre fenoxilo de Naringina.

Para la reacción con Q, AA y mezclas con DPPH•, Figura 6.12.B se observa que tanto para la reacción en etapas con AA en primer lugar como para la reacción donde ambas sustancias están juntas, los consumos del radical y las pendientes de los perfiles cinéticos son idénticos, sugiriendo esto que las reacciones involucradas son las mismas para ambos casos.

Sobre la base de estas observaciones se sugiere que, en estas condiciones experimentales, no existe interacción entre el DHA formado y Q en

ninguno de sus diferentes estados de oxidación y los consumos observados tanto para la reacción en etapas como para la mezclas (AA+DPPH•)+Q y (AA+Q)+DPPH• corresponden simplemente a la suma de los compuestos por separado. Sin embargo, para el agregado de AA a la mezcla Q+DPPH• la situación es diferente, cuadrados en la Figura 6.12.B, ya que una vez adicionado AA ocurre un consumo del radical mayor al esperado, aproximadamente un 10% extra.. Esto sugiere que existe alguna interacción entre las formas oxidadas de Q y AA, formando o regenerando alguna especie susceptible de donar átomos de H al radical.

Dado que la pendiente del decaimiento es similar en los tres casos es posible plantear que se trata de una regeneración de alguna especie ya presente en la reacción o con la misma reactividad.

La reacción de Q con DPPH• ha sido ampliamente estudiada [ 15 , 16 ], reportándose que bajo estas condiciones experimentales, la absorbancia UV- Vis. decae rápidamente, en el orden de 1-2 min como resultado de la transferencia del átomo de Hidrógeno más lábil (paso rápido( el cual es seguido por una caída lenta asociada a la capacidad de donar átomos de Hidrógeno residuales.

El mecanismo de reacción de Q con DPPH• ha sido postulado por Dangles [15], Figura 6.14 e implica:

Abstracción de un átomo de

Hidrógeno en posición 3′ y/o 3 formando los respectivos radicales aroxilos, etapa muy rápida (k= 41.9 x 102 mol-1 s-1) [15].


122

Desproporción de los radicales aroxilos regenerando Q y formando quinonas, etapa rápida. (k= 13.0 x 102 l mol-1s-1)[15].

Adición rápida del solvente (por ej. MeOH) a las quinonas originando un aducto susceptible de donar otro átomo de hidrógeno en un paso posterior.

Por lo expuesto anteriormente y

para la reacción en discusión, (Q+DPPH•)+AA, las cinéticas rápidas observadas para Q corresponden a la primera abstracción de un átomo de hidrógeno y la formación de quinonas con regeneración de Q. En cuanto al AA, y dado que en la reacción donde AA se hace reaccionar primero con DPPH• no se observa este aumento en el consumo,

se descarta que la reacción suceda con la especie DHA.

Además de esto y puesto que las velocidades de reacción de AA y Q en su primera etapa son comparables las reacciones posibles son las indicadas en la Figura 6.15, donde Q• representa el radical aroxilo formado por la primera abstracción de un átomo de hidrógeno, Q=O la forma quinona de Quercetina, Figura 6.16.

En ambas reacciones se plantea la posibilidad de regeneración de Q, desde su primer estado de oxidación o desde su forma quinoidea, susceptible de formar un aducto con el solvente y continuar reaccionando con el radical.

Esto estaría de acuerdo con la similitud del perfil cinético observado

DPPH . DPPH-H DPPH . DPPH-H

instantáneo instantáneoAscH- Asc.- DHA

DPPH . DPPH-H DPPH . DPPH-H DPPH . DPPH-H

Q Q(-H). Q=O Aducto Aducto=O 2 ROH(solvente)

rápido

Figura 6.15: Mecanismo de reacción para mezclas de Q y AA frente a DPPH..

2 DPPH . 2 DPPH-H

Q Q(-H) . DPPH . DPPH-H

Q(-H). Q=O Aducto* Aducto=Orápido

2 ROH(solvente)

rápido

kobs> 9.07 x 10-2 s-1

Figura 6 14: Mecanismo de reacción de Q frente a DPPH.


123

O

OO

O

OH

OHOH

O

OHO

O

OH

OHO

Figura 6.16: Estructuras de Resonancia para la forma quinoidea de Q.

para Q sola con el obtenido después de la adición de AA.

Las reacciones indicadas en la Figura 6.15 fueron planteadas por Bors y col.[14], quienes reportan que la reacción de regeneración de Q tiene una considerable contribución al proceso total mientras que la reacción donde se regenera Q. a partir de la forma quinoidea de Q se encuentra favorecida termodinámicamente por los potenciales redox de las cuplas implicadas, Capítulo 3, Tabla 3.7.

En la Tabla 6.3 se muestran los valores obtenidos para el resto de los F.

Los valores denominados teóricos se determinaron sumando los consumos individuales del radical para cada F y para el AA. Los valores designados como experimentales corresponden al consumo de las mezclas de los diferentes F con AA. Los valores designados como (F+ DPPH•)+AA corresponden a

experimentos en donde se hizo reaccionar en primer lugar el F adicionándose luego el AA y (AA+ DPPH•)+F a las reacciones en las cuales se oxidó al AA y posteriormente se adicionó el F.

Los valores de la Tabla 6.3, indican que sólo Q y N presentan reacción positiva frente al radical.

Para la reacciones en etapas, la mayoría de los F presentaron efecto positivo sólo cuando la reacción se llevó a cabo en primer lugar con los F y adicionando luego AA, indicando que la interacción es favorable entre las especies oxidadas de F con AA..

Sobre la base de los resultados obtenidos surge la posibilidad de continuar las investigaciones en este tema utilizando otras metodologías que permitan evaluar la AAO, por ejemplo un sistema heterogéneo donde cada uno de los compuestos se ubiquen en fases diferentes de acuerdo con su solubilidad

% Consumo DPPH• Flavonoide (F) (F+AA)+DPPH•

teórico (F+AA)+DPPH•

experimental (F+DPPH•)+AA (AA+DPPH•)+F

Q 40.3 ± 0.3 47.4 ± 0.5 53.0 ± 0.3 43.0 ± 0.1 R 22.8 ± 0.2 20.1 ± 0.4 25.2 ± 0.6 21.0 ± 0.2 Ht 84.2 ± 0.6 82.2 ± 0.9 100± 0.8 80.0 ± 0.5 H 96.1 ± 0.3 81.3 ± 0.7 77.9 ± 0.7 78.4 ± 0.9 Ch 70.3 ± 0.3 61.5 ± 0.5 79.1 ± 0.3 58.9 ± 0.2 DhCh 52.4 ± 0.5 42.2 ± 0.3 48.7 ± 0.1 43.4 ± 0.2 Ng 56.7 ± 0.1 47.8 ± 0.1 50.5 ± 0.3 47.3 ± 0.5 N 18.0 ± 0.1 23.9 ± 0.1 24.2 ± 0.3 20.9 ± 0.4

Tabla 6. 3: Consumos porcentuales en el EE para las mezclas F-AA. Concentraciones

(mol F/mol DPPH• ): Q: 0,07; R:0,05; Ht: 5,24; H: 10,16; NCh: 0,50; NDhCh; 0,43; Ng:11,24; N:10,09.


124

(método de decoloración de β-caroteno iniciado enzimáticamente, utilizar otro tipo de fuente de radicales libres para la cual la reacción de AA y los F sean a velocidades similares, lo que permitiría determinaciones más precisas o emplear técnicas cinéticas más rápidas por ejemplo, stop- flow, etc.

6.3.5- DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIRRADICALARIA DE JUGOS CÍTRICOS NATURALES.

La Figura 6.17 muestra el efecto del agregado de jugo de naranja natural frente al radical DPPH•. En los perfiles se observa un rápido decaimiento de la absorbancia, alcanzándose el EE en menos de 30s, comportamiento similar al

observado para la reacción de AA, principal componente AO de los jugos cítricos [17].

Al respecto, Rapisarda y col [18] indican que el perfil de sustancias AO de los jugos de naranjas frescos están constituidos en un 65%, por AA, un 28% de F (principalmente Hesperidina y Narirutina) mientras que el resto incluye a Acidos Hidroxicinámicos tales como Acido ferúlico, sinápico y p-cumárico

La Tabla 6.4 muestra los valores de EC50 expresados como µl de jugo necesario para reducir al 50% la concentración de DPPH•, la concentración de AA en los jugos determinada por HPLC y la concentración calculada a partir de los moles de DPPH• consumidos utilizando los parámetros de la curva 6.18.A , cuyos detalles se describen más adelante.

En nuestra provincia se cultivan dos variedades de naranjas, una de cosecha temprana y una tardía todas injertadas sobre limón. En cuanto al pomelo la variedad más común corresponde a la denominada Marsh Sedlees.

Los valores de EC50 obtenidos para los jugos de naranjas, considerando las dos especies antes mencionadas, Washington navel y Valencia son menores que los informados en la literatura para jugos de naranjas [18].

Jugos EC50

(µl jugo) [AA]

(µg / ml jugo)[AA]*

(µg / ml jugo) Naranjas 15.5± 0.3 477 ± 5 568 ± 23 Pomelos 18.6± 0.3 468 ± 4 501 ± 22 Limones 28.8± 0.3 250 ± 9 341± 27

* Calculado a partir del consumo del radical DPPH• Tabla 6.4: Valores de EC50 y concentración de AA determinada por HPLC para jugos naturales

0 3 60

30

60

90

20 µl jugo fresco 15 µl jugo fresco 10 µl jugo fresco 5 µl jugo fresco

% D

PP

H re

man

ente

tiempo (min)

Figura 6. 17: Perfiles obtenidos para jugos fresco de naranjas.


125

Estas diferencias pueden explicarse teniendo en cuenta que tanto la composición como la concentración de las sustancias presentes en un fruto están sujetas a la influencia de factores tales como variedad de cultivo, condiciones ambientales del crecimiento, estado de madurez, entre otros ocasionando una gran variabilidad en los resultados.

De los jugos analizados con esta técnica, el jugo de naranja es el que presenta la mayor AAR, mientras que el jugo de limón es el menos eficiente.

Los valores obtenidos muestran que existe una relación entre la eficiencia para atrapar los radicales libres de cada jugo con la concentración de AA presente.

Durante los experimentos con soluciones patrones de AA se observó una excelente correlación lineal entre los moles de AA presentes y los moles de radical consumido, Figura. 6.18.A, con una pendiente igual a 1.76, correspondiente al factor estequiométrico del AA.

A partir la Figura 6.18.A es posible determinar, conocidos los moles de radicales consumidos, los moles de AA presentes en una muestra o viceversa, esto es conocidos los moles de AA de la muestra, estimar cual será el consumo de radicales. De esta manera la gráfica puede considerarse como una curva de calibración para AA frente a DPPH•.

A partir de los moles de radical consumido por cada jugo y utilizando los parámetros de la curva de la Figura 6.18.A, se calcularon los moles de AA correspondientes, tal como se indica en la Tabla 6.4.

Los resultados indican que los valores de concentración de AA determinados a partir de los moles de radical consumidos son siempre mayores que los determinados por HPLC.

En la Figura 6.18.B se comparan los consumos de radical de cada alícuota de jugo de naranja adicionados a soluciones metanólicas de DPPH• símbolos llenos, respecto de los consumos teóricos, símbolos abiertos,

0 3 6 9

0

6

12

A

Y = A + B * XA= (1.81±2.73) x10-9

B= 1.76 ± 0.06R= 0.99807

mol

DP

PH

con

sum

ido

(x10

-8)

mol AA (x10-8)0 3 6

0

2

4

6

8

10

12

B

jugo de Naranjas Solución Stock AA

mol

DP

PH

con

sum

ido

(x10

-8)

mol AA (x10-8)

Figura 6: 18: A) Relación de mol radical consumido por mol de AA adicionado. B) Consumo de radical de jugo de naranja comparado con solución stock de AA.


126

correspondientes a los moles de AA contenidos en la muestra. Nuevamente se observa que, el consumo de radical por parte del jugo es mayor que el esperado para la concentración de AA presente en el mismo.

Esto sugiere que si bien el AA es el principal componente en los jugos cítricos, en el caso del jugo de naranjas los cálculos indican una contribución mayor al 85% de la AAR total, existe un aporte asociado a la presencia del contenido fenólico total entre los que se encuentran por supuesto, los F, además de la posibilidad de que la interacción entre el AA con las diferentes sustancias, presenten efectos positivos en cuanto a la AAR total del sistema, tal como los observados durante los experimentos donde se combinaron soluciones patrones de AA y los F descritos en la sección anterior.. 6.4- CONCLUSIONES

En este capítulo se determinaron las AAO y AAR de las flavanonas cítricas, sus agliconas, chalconas y los flavonoles Quercetina (aglicona) y Rutina, empleando dos métodos ampliamente utilizados: el método de decoloración del radical libre DPPH• y el método del blanqueamiento de β-caroteno durante la cooxidación con ácido linoleico.

Los resultados obtenidos indican que R y Q presentan la mayor AAR y AAO respectivamente, de acuerdo con lo predicho por la relación estructura- actividad (REA) descrita en el Capítulo 3, Sección 3.9.2.1. De las flavanonas N presenta la mínima AAR, sin embargo los experimentos realizados con el objeto

de evaluar la interacción con AA indican que la combinación N-AA presenta efecto positivo expresado como consumo de radical, comparado con la suma de los consumos individuales. Este efecto puede explicarse en función de los potenciales de reducción de las cuplas, los cuales indican que F con las características estructurales de N tienen potenciales de reducción menores que los del AA, o sea que son capaces de regenerarlo, prolongando la capacidad de atrapar radicales libres, como lo demuestran los perfiles cinéticos de la Figura 6.12.A.

Además de N, sólo Q presentó efecto positivo al combinarse con AA.

Finalmente se determinaron las AAR de jugos de naranjas, pomelos y limones, encontrándose que el más eficiente en cuanto a la capacidad de atrapar radicales libres corresponde al jugo de naranja. Teniendo en cuenta que el AA es el componente mayoritario de los cítricos, se determinaron las concentraciones de este compuesto en cada jugo, encontrándose que existe una relación lineal entre la cantidad de AA y la AAR.

Una vez determinados los consumos porcentuales de DPPH• de cada jugo, se compararon estos valores con los correspondientes a los moles de AA presente en cada muestra. Los resultados indican que el consumo de radical por parte de los jugos es mayor que el esperado para una solución patrón de AA a la misma concentración.

Este hecho puede explicarse teniendo en cuenta que si bien AA es el componente mayoritario de los jugos, existen otras sustancias, entre las cuales


127

se encuentran los F, que contribuyen a la AAR total.

Además, existe la posibilidad de que las diferentes sustancias, (F, AA, Ácidos Hidroxicinámicos) puedan actuar sinérgicamente potenciando la AAR.

Por otra parte, es importante destacar la necesidad de utilizar diferentes metodologías para la determinación de la AAO y AAR de un compuesto o extracto ya que ha sido demostrado que el poder AO depende de la técnica utilizada tanto como de la concentración, naturaleza y propiedades fisicoquímicas de los compuestos estudiados.

Además de lo descrito, la gran diversidad existente en cuanto a las formas de expresar la eficiencia de una sustancia para actuar como AO es tan numerosa como la cantidad de metodologías para medirla. Esto hace difícil la comparación entre los resultados obtenidos por diferentes investigadores, aún para un mismo compuesto. Con respecto a este tema, existe un consenso generalizado entre los científicos que trabajan en esta temática acerca de la imperiosa necesidad de estandarizar tanto las metodologías como la forma de expresar los resultados con el objeto, fundamentalmente, de aportar datos confiables a los consumidores.


128

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Capítulo 7 Obtención de Dihidrochalcona de Naringina

129

SN-Na+

O

O O

NS

O

O

O-Na+

Sacarina Sódica Ciclamato de Sodio Aspartamo

HOMeO

N

O

NH2

COOHH

7.1- INTRODUCCION

El sabor dulce presente en los

alimentos que consumimos diariamente está dado por diversos compuestos, algunos naturales y otros diseñados para cubrir las expectativas de sabor de personas obligadas a ingerir dietas pobres en azúcares o con menor poder calórico, denominadas edulcorantes.

Según el Código Alimentario Argentino (CAA) los edulcorantes se definen como aquellas sustancias diferentes de los azúcares que aportan sabor dulce a los alimentos.

Para que un compuesto o mezcla de compuestos sea aceptada como edulcorante debe satisfacer algunos

requisitos básicos:

Ser inocuo Poseer un alto poder endulzante Adecuada solubilidad y estabilidad Ser aceptable al paladar, con buena

relación costo-dulzor La Figura 7.1 muestra algunos de

los edulcorantes utilizados actualmente, aprobados por el CAA.

Sin embargo, el consumo de algunos de estos edulcorantes es polémico ya que han surgido estudios que indican que algunos de ellos son nocivos para la salud.

Obtención de Dihidrochalcona de Naringina.

Figura 7.1: Estructura química de edulcorantes sintéticos comúnmente utilizados.


130

Tanto la búsqueda de

edulcorantes inocuos, como la tendencia actual de los consumidores por preferir sustancias naturales, ha motivado el interés de la industria y la ciencia de los alimentos al descubrimiento de nuevos sustancias con poder endulzante que puedan reemplazar a las existentes.

Entre estas sustancias, las dihidrochalconas, DhCh, generalmente obtenidas por hidrogenación de las chalconas, satisfacen los requisitos antes mencionados, Figura 7.2.

Sin embargo, y tal como se describió en el Capítulo 2, no todas las DhCh presentan sabor dulce. Horowitz y col [1] plantean que el sabor de estas sustancias está relacionado con factores tales como la presencia de ciertos glicósidos en la molécula.

De manera general se acepta que las DhCh rutinósidos (6-O-α-L-ramnosil-β-D-glucósido), entre las que se encuentra H y su DhCh, carecen de sabor, mientras que las DhCh neohesperidósidos (2-O-α-L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranosa), donde se incluye a Naringina dihidrochalcona, NDhCh, y Neohesperidina Dihidrochalcona (NhDhCh), presentan sabor dulce.

Estos derivados de Ch, entre los que se incluyen sus correspondiente

glicósidos han sido empleados como agentes edulcorantes de alimentos.

Dihidroxichalconas xilósidos y galactósidos son 1.5-2 veces más dulce que la sacarina [2].

En nuestro país, el CAA, incluye a Neohesperidina dihidrochalcona para su utilización como aditivo alimentario, (Cap XVIII. Res 1545, 12.09.90), Figura 7.3.

Las características de esta dihidrochalcona en cuanto a la paladabilidad indican un sabor residual mentolado, por lo que actúa apropiadamente en gomas de mascar, lavados bucales, pastas dentales y mezclas con otros productos.

Dado que el objetivo de este

capítulo es obtener sustancias con poder edulcorante, de las flavanonas cítricas estudiadas en los capítulos anteriores, sólo N constituye una alternativa no sólo

O

OCH2OH

OH

OOH

OH

OMe

O

OH

OH

O

CH3

OH

OH OH

Figura 7. 3: Estructura química de Neohesperidina dihidrochalcona

Figura 7. 2: Obtención de DhCh de N

O

OOH

RO

OH

OH

OOH

RO

OH

OH

OOH

RO

OH

OH- H2

H+


131

para la obtención de su dihidrochalcona, NDhCh, Figura 7.4, equivalente en base molar a la sacarina [3], sino también por ser precursora de la Neohesperidina dihidrochalcona a través de una conversión a Floroacetofenona-4’-β-neohesperidósido y posterior condensación con isovainillina.

Los procedimientos para la obtención de dihidrochalconas son variados pero generalmente se realizan por hidrogenación catalítica. Se han publicado trabajos en los cuales se sintetiza la chalcona correspondiente a través de una reacción de condensación

de Claisen-Schmidt [4]. Esta Ch es posteriormente reducida, o bien su correspondiente flavanona en medio básico [4,5] Figura 6.4.

También se ha reportado la obtención de DhCh por transformación microbiológica de flavanonas glicosiladas [6].

Por otra parte, Briot y col [7], desarrollaron un método alternativo a partir de un o-halofenol y 1-aril-2-propen-1-ol, catalizada por Paladio, Figura 7.5.

Periasamy y Thirumalaikumar informan la obtención de DhCh por reducción de Ch con NiCl2–NaBH4 [8].

Figura 7. 4: Reacciones de síntesis de DhCh.[4]

OOH

RO OH

+

O

XY

z

OH-

OH

OH

RO

YX

O

z

calor H2 / Pd

OH

OH

RO

YX

O

z

O

OH

RO

YX

O

z

OH-

H2/Pd


132

Contando con los resultados de

los capítulos anteriores, donde se realizó el estudio del efecto del solvente, el pH y la luz sobre el equilibrio flavanona-chalcona se eligieron las condiciones apropiadas para la reacción de hidrogenación. En primer lugar se estudió la reacción de hidrogenación en medio neutro, descartándose EtOH como solvente por la tendencia de NCh a cerrar a Fl y el H2O no sólo por la inestabilidad de NCh sino también por considerarse poco apropiada para la hidrogenación catalítica. Experimentos preliminares indicaron que NCh es estable en soluciones metanólicas por lo que se eligió este solvente como medio de reacción, tanto para medio ácido como para básico. Si bien bajo esta

última condición de pH los resultados indicaron la existencia de una mezcla de N y NCh los experimentos se realizaron bajo la hipótesis de que de ambas especies sólo se puede hidrogenar la forma NCh, además si la reacción tiene lugar el Principio de Le Chatelier predice que, el equilibrio se desplazará hacia la forma NCh.

Por otra parte, teniendo en cuenta el efecto de la luz sobre NCh (Capítulo 5) todos los experimentos se realizaron evitando la exposición de las soluciones a la luz.

En este capítulo se presenta la obtención de la DhCh derivada de N, (NDhCh), mediante hidrogenación catalítica de soluciones metanólicas de NCh, utilizando PtO2.

(IV) y negro de Pt.

Figura 7. 6: Hidrogenador Parr

R

OOH

R

OHX

OH

RR+ [Pd]

Manómetro de la

botella de reacción

Tanque de reserva

de gas

Manómetro del

tanque de gas

Conexión al

tanque de gas Botella de

reacción

Figura 7. 5: Esquema general para la síntesis de DhCh a través de la reacción de arilación catalizada por Paladio. [7].


133

Las reacciones fueron monitoreadas por espectroscopía UV-Vis y por HPLC, detalles experimentales en el Capítulo 8 7.2- OBTENCIÓN DE DIHIDROCHALCONAS POR HIDROGENACION CATALITICA

De las diferentes reacciones que

se pueden utilizar para la reducción de compuestos orgánicos, la hidrogenación catalítica tiene un gran campo de aplicación ya que ofrece grandes ventajas y simplicidad experimental.

La reacción de hidrogenación catalítica se lleva a cabo utilizando un Hidrogenador Parr, Figura 7.6. El procedimiento consiste en disolver el compuesto a hidrogenar en un solvente adecuado, (alcohol, alcano o ácido acético) al cual se le adiciona el catalizador y se agita continuamente bajo atmósfera de H2.

El progreso de la reacción puede monitorearse fácilmente midiendo el consumo de hidrógeno y el producto reducido se aísla ordinariamente con una filtración del catalizador seguida de la evaporación del solvente. En nuestro caso la reacción se siguió por

espectroscopia UV-Vis, dado que el espectro de la NDhCh es diferente al de su Ch precursora, Figura 7.8.

Tal como lo indican los textos de Química Orgánica básica, la reacción de hidrogenación se verifica en la superficie del metal, donde la sustancia a reducir, adsorbida sobre el catalizador, se pone en contacto con el hidrógeno [9,10], Figura 7.7.

El hidrógeno se adsorbe en la superficie del catalizador, debilitándose el enlace H-H. Una cara del enlace π del alqueno se enlaza con el catalizador produciéndose la adición del hidrógeno adsorbido. El producto se libera del catalizador, ambos átomos de hidrógeno se agregan a la cara del doble enlace que está unida en forma compleja con el catalizador.

7.3- REACCION DE OBTENCION DE NDhCh POR HIDROGENACION CATALITICA

La Figura 7.8 muestra los cambios espectrales y el cromatograma obtenido para la reacción de hidrogenación catalítica de Ch como catalizador. Las reacciones se llevaron a cabo disolviendo NCh en MeOH a la cual

Catalizador

H H

C CH H

CH2

CH2

CH3

CH2

Catalizador

H H C CH H

CH2

CH2

CH3

CH2

H

H

H

CH2CH2

CH3

CH2CCH

C CH HCH2

CH2

CH3

CH2

H H

Catalizador Catalizador

Figura 7. 7: Mecanismo de la hidrogenación catalítica heterogénea [9].


134

se le adicionó el catalizador, PtO2 para el caso de la Figura 7.8. La presión de H2 fue de 3 atm y la reacción se llevó a cabo a una temperatura de 25ºC.

En los espectros UV-Vis se observa la disminución de la banda asociada a la forma NCh, 366 nm, con la aparición simultánea de una banda centrada a 282 nm, característica de la forma NDhCh. La reacción fue corroborada por HPLC observándose el mismo comportamiento, la disminución del pico asociado con NCh, tR =11.5 min., y la aparición del pico de NDhCh, tR=12 min, corroborado por inyección de DhCh patrón, Figura 7.8.

A fin de optimizar las condiciones para la obtención de NDhCh, se compararon los rendimientos porcentuales utilizando dos catalizadores, PtO2 (IV) y negro de Pt en diferentes proporciones Ch/catalizador, se utilizaron diferentes presiones de H2, etc. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 7.1.

En todos los casos, se verificó el consumo total del reactivo en un tiempo promedio de 180 min.

PH2 (atm) Catalizador

Relación Ch/Cat

% Rendimiento

3 PtO2 20 33 3 PtO2 2 19 2 PtO2 20 22 2 PtO2 2 33

1.5 PtO2 2 23.5 3 Negro Pt 20 8.5 3 Negro Pt 2 26.5

Tabla 7. 1: Rendimientos para la reacción de hidrogenación catalítica de NCh.

El máximo rendimiento, 33% se obtuvo con PtO2 en una relación Ch/cat de 20 bajo una presión de H2 de 3 atm y también con una relación Ch/cat de 2 y una presión de H2 de 1.5 atm. Sobre la base de que la optimización del proceso implica el menor tiempo, el menor gasto de H2 y sobre todo el menor consumo del catalizador, la primera condición sería la más conveniente para la obtención de NDhCh.

Los bajos rendimientos obtenidos se deben probablemente a la reacción de otros grupos presentes en la molécula susceptibles a la hidrogenación, por ejemplo el grupo carbonilo o la inactivación del catalizador, entre otras.

200 300 400 500 6000.0

0.5

1.0

1.50 - 180 min

Abs

λ (nm)0 3 6 9 12 15

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

DhCh

Ch

t=0 min t=180 min

tiempo (min)

Figura 7. 8: Cambios espectrales y cromatogramas obtenidos para la reacción de obtención de DhCh Condiciones PH2 2 atm. Catalizador PtO (IV) (Relación Ch/Cat 2) columna Wakosil II, Fase móvil H2O-ACN-HOAc (74.5:25:0.5, v/v). Flujo de 1.0 ml/min. Detección 330 nm


135

Finalmente, se estudió la hidrogenación en medio básico, sin embargo la reacción no se produjo en estas condiciones. Este resultado puede asociarse a que en medio alcalino la deprotonación de los grupos fenólicos, especialmente los del anillo B, provocan deslocalización en el sistema π lo que probablemente dificulta la reacción.

Dada la importancia de la reacción estudiada, resulta interesante continuar los estudios trabajando con otros catalizadores, solventes, como así también reacciones alternativas como por ejemplo reducción del doble enlace por reacción con agentes reductores en fase homogénea, etc.


136

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Capítulo 8 Materiales y Métodos

137

MATERIALES Y METODOS 8.1.- REACTIVOS Y SOLVENTES 8.1.1- Flavonoides

Los F utilizados en este trabajo de

tesis fueron: Naringina (N) al 97% Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) sin tratamiento posterior, Hesperidina (H), Quercetina (Q), Rutina (R), al 97% recristalizadas antes de usar provistas por Parafarm. Las agliconas Naringenina (Ng), Hesperetin (Ht) fueron sintetizadas en nuestro laboratorio siguiendo el procedimiento de hidrólisis ácida descrito por Mabry y Markham.[4], este procedimiento es aplicable a la hidrólisis de todos los F O-glicosilados.

La técnica consiste en mezclar el F glicósido con 5 ml de solución acuosa de HCl al 6 %. La solución resultante se calienta en un baño de vapor durante 45 min., se enfría y se adiciona éter etílico. La fase acuosa contiene los azucares, mientras que de la evaporación del solvente de la fase etérea se obtiene las correspondientes agliconas.

NDhCh fue cedida por el Dr Paulo Bobbio y NCh se sintetizó de acuerdo al procedimiento descrito a continuación.

8.1.1.1.- Obtención de Chalcona de Naringina (NCh)

La forma Chalcona de Naringina se obtuvo a partir de la correspondiente flavanona por el método recomendado por Shimokoriyama:[1] el cual consiste en adicionar 1 g de Naringina a 4 ml de una solución de etanol-agua (1:1) conteniendo 2 g de hidróxido de Potasio y se calienta en baño de vapor por dos minutos. A la solución roja obtenida se le adiciona HCl en exceso (aproximadamente 20 ml) enfriado a hielo produciéndose un precipitado, el cual es filtrado a vacío, predisuelto en EtOH y enfriado nuevamente. Posteriormente se adicionan gotas de éter sulfúrico para recristalizarlo, se filtra nuevamente y se seca bajo atmósfera de nitrógeno. De este procedimiento se obtuvo un polvo de color amarillo cuyo punto de fusión fue de 182–186 ºC, concordante con lo informado en literatura; 185 – 200 ºC [2] y 170 – 183 ºC[3] El análisis del espectro UV-Vis en etanol estuvo de acuerdo con lo esperado,[3,4] con λmax= 366 nm, log ε= 4.51. El análisis por HPLC (ver detalles más adelante) dio un 98% de pureza.

Materiales y Métodos


138

8.1.2- Reactivos de uso general Durante las diferentes etapas de

este trabajo de tesis se utilizaron los siguientes reactivos: Ácido clorhídrico (HCl), hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH) acetato de sodio (NaOAc), Ácido Cítrico, Carbonato y Carbonato Ácido de Sodio (Na2CO3 y NaHCO3) de Ciccarelli. Fosfato ácido, diácido de sodio (Na2HPO4 y NaH2PO4, respectivamente) de grado analítico de Merck Química Argentina (Buenos Aires, Argentina). Etanol absoluto (EtOH), éter sulfúrico (Et2O), metanol (MeOH) y cloroformo (CHCl3) de Ciccarelli, n-octanol provisto por Riedel-de Häen.

Para la preparación de las soluciones se utilizó agua tridestilada.

Los análisis por Cromatografía Líquida de Alta resolución (HPLC) se realizaron utilizando Acetonitrilo (ACN), Ácido Acético (HOAc) provistos por Sintorgan, sin tratamiento posterior y agua ultrapura obtenida a partir de osmosis inversa

.

8.1.3-Reactivos Específicos En la determinación de la AAO y

AAR de los F se emplearon los siguientes reactivos: Radical 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•.) provisto por Aldrich, Ácido Ascórbico (AA) de Parafarm, β-caroteno Sigma previamente purificado por cromatografía en columna de sílica, Tween 20 (Polioxietileno sorbitan monolaurato) provisto por Aldrich. 8.2- METODOLOGIA e INSTRUMENTAL 8.2.1-EQUIPAMIENTO UTILIZADO

Las determinaciones por

espectroscopia UV- Vis se realizaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis Hewlett-Packard 8453 con detección de arreglo de diodos, operando en modo espectral y cinético. El intervalo de detección está comprendido entre 190 - 1100 nm, con ancho de banda de 1 nm

La temperatura del portacelda del espectrofotómetro fue controlada a ± 0.1 ºC, mediante circulación de agua termostatizada, que acciona además un

Mues tra

PC

E spectrofotómetro de arreglo de diodos

Hewlett-Packard 8453

200 300 400 500 6000.0

0.5

1.0

1.5

Abs

λ (nm)

0 4 000 8 000 12 0000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Abs

426

nm

t ime (s)

T ermos tato (± 0.1 °C)rango: 15 ≤ T (°C) ≤ 45

Figura 8. 1: Esquema del equipo utilizado para las determinaciones por espectroscopia UV-Vis.


139

sistema de agitación magnética en la base del portacelda permitiendo la homogeneización de la muestra. (Figura 8.1) El haz analizador fue atenuado con un filtro de densidad neutra, a fin de evitar reacciones secundarias, especialmente para el caso de NCh, donde experimentos preliminares indicaron la formación de un producto secundario, descrito en el Capítulo 5.

Los experimentos por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) se llevaron a cabo empleando un Cromatógrafo Líquido Konik, modelo KNK 500 Serie A, equipado con una columna Konik ODS- 2 (250x 46 mm i.d.; 5µm) operado a 25 ºC con fase móvil agua-acetonitrilo-ácido acético (79.5:20:0.5, v/v) en modo isocrático con un flujo de 1.2 ml/min. La detección se realizó usando un detector Konik UV- Vis 200.

El efecto de la luz se realizó irradiando las muestras con una lámpara de Xe de 150 W conectada a un monocromador con red de difracción de 1200 surcos/mm con una resolución espectral máxima de ± 2.5 mm.

8.2.2-METODOLOGIAS CAPITULO 4: Efecto de la composición del solvente sobre el equilibrio Flavanona-chalcona de Naringina

Los experimentos se llevaron a cabo

adicionando µl de soluciones stock (1

mM) de N, NCh y H a una celda de cuarzo de 1 cm de paso óptico conteniendo 2 ml de solvente (EtOH, H2O y mezclas de ambos con 0.03 ≤ XW ≤ 1.00) de manera tal de obtener una concentración de N ó NCh inicial de aproximadamente 40 µM. Para el caso

de H, dada su baja solubilidad en agua, se procedió a preparar soluciones sobresaturadas las cuales fueron posteriormente filtradas y cuyas concentraciones se determinaron, por espectroscopia UV-Vis.

A las celdas conteniendo las correspondientes flavanonas se adicionaron la cantidad necesaria de solución acuosa de NaOH 0.1 M de forma tal que la concentración final de base fue variada entre 0.062 y 12.5 mM. Los experimentos se realizaron en recipientes protegidos de la luz a fin de evitar reacciones secundarias.

Los espectros de absorción fueron tomados a intervalos de 15 segundos a partir del momento de adición de la base durante el tiempo suficiente como para no observar cambios espectrales mayores que ± 1%.

La composición final de las soluciones se determinó por análisis del espectro UV-Vis dado que N y NCh presentan espectros característicos diferenciales (Figura 1.2). En algunos casos, la composición final también se realizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mediante la utilización de las correspondientes curvas de calibración. Ambos métodos dieron resultados similares dentro de un 10% de desviación estándar.

Todos los experimentos se realizaron por duplicado, reportándose los valores promedios con sus respectivas desviaciones estándar.

CAPITULO 5: Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Flavanona- Chalcona de Naringina


140

Los datos cinéticos del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch se llevaron a cabo adicionando, con microjeringa, alícuotas de soluciones stock tanto de N como de NCh a celdas de cuarzo conteniendo: soluciones acuosas de buffer citrato fosfato (pH: 3) para los experimentos en medio ácido, EtOH y soluciones acuosas y etanólicas básicas cuyo pH se ajustó adicionando los µl apropiados de una solución concentrada de NaOH (0.1M).

Para las reacciones denominadas “a oscuras” o “sin irradiación” las celdas fueron cuidadosamente protegidas de luz, utilizándose en el espectrofotómetro filtros de corte al máximo de absorción UV-Vis de la forma NCh.

La irradiación se llevó a cabo en las mismas celdas iluminandolas con una fuente de luz conectada a un monocromador de manera de ajustar la longitud de onda al máximo de la forma NCh. Simultáneamente con el análisis por espectroscopia UV-Vis las reacciones se monitorearon por HPLC bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. CAPITULO 6. Determinación de las propiedades antioxidantes de los flavonoides Determinación de la Actividad Antiradicalaria de Flavonoides A una celda de cuarzo conteniendo 3 ml de solución metanólica de DPPH• de concentración aproximada 2 x 10-5 M, (determinada a partir de su coeficiente de absorción molar, ε= 12509 [5]), se adicionaron diferentes alícuotas de soluciones stock de cada F, AA, combinaciones de AA con F de manera

de lograr distintas relaciones de moles entre F y DPPH•. La disminución de la absorbancia a 515 nm se determinó en forma continua durante el tiempo necesario para alcanzar el estado estacionario, es decir hasta no observar cambios en la absorbancia del radical. La solución de DPPH• se preparó diariamente controlándose que la variación en su absorbancia no fuera mayor al 5% durante el intervalo de tiempo de cada experimento. Determinación de la AAO por el método del beta-caroteno

Una alícuota de una solución

stock de β-caroteno en cloroformo (0.2 mg/ml) se adicionó a un erlenmeyer conteniendo 600 µl de Tween 20, se mezcló y se evaporó el cloroformo bajo corriente de Nitrógeno por 10 minutos. A continuación, se adicionaron 150 ml de agua previamente burbujeada con oxígeno por 5 minutos y a la emulsión resultante se la colocó en un baño termostatizado a 50ºC durante 20 minutos para su estabilización (solución madre).

Alícuotas de 20 ml de la solución madre se adicionaron a frascos herméticos con septo de goma, conteniendo una mezcla de 10 µl de ácido linoleico más los µl apropiados de soluciones metanólicas estándar de cada F.

Las mezclas se introdujeron nuevamente en el baño termostatizado protegidas de la luz y se monitorearon cada 15 minutos hasta consumo total del carotenoide. Debido a que esta metodología es muy sensible a las condiciones del experimento, las


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alícuotas se extrajeron con una jeringa de manera de no abrir los recipientes y obtener resultados reproducibles.

Junto a cada serie de experimentos se prepararon blancos, sin adición de ácido linoleico ni F con el objeto de monitorear la estabilidad térmica del carotenoide y muestras control, sin adición de F que representaron el proceso de oxidación del ácido graso.

La reacción se analizó por espectroscopia UV-Vis al máximo de absorción del β-caroteno, 460 nm, durante el tiempo necesario para consumir el carotenoide (120 minutos).

Para el caso particular de NCh, y debido a que en agua neutra cierra inmediatamente a la forma Fl, se procedió en primer lugar a monitorear su estabilidad en la micela para luego realizar el análisis de la AAO.

Con el objeto de determinar la capacidad de cada F para penetrar en la micela de Tween 20 se determinaron los coeficientes de partición en n-octanol solvente que presenta un valor de constante dieléctrica similar al reportado para Tween 20 [6].

El procedimiento consistió en disolver cada F en n-octanol, se los colocó en frascos herméticos a los cuales se les adicionó igual volumen de agua. Los frascos se colocaron en un baño termostatizado a 50ºC por 1 h.

Los valores de absorbancia en la fase orgánica se determinaron al comienzo del experimento (A0) y a intervalos regulares de tiempo hasta obtener valores de absorbancia constantes (Ax). Las constantes de partición descritas en la Tabla 6.2, Ko/w y las fracciones de cada F en la fase

organica se calcularon de acuerdo a la ecuación 6.4.

Una solución de n-octanol saturado con agua se usó como blanco. Determinación de la AAR de combinaciones de Ácido Ascórbico con Flavonoides

A fin de determinar la interacción los F con AA frente a DPPH• se procedió en primer lugar a determinar el consumo de radical tanto de cada F como de AA en forma individual.

A una celda conteniendo 3 ml de solución metanólica de DPPH• se adicionaron alícuotas de solución stock de cada F y de AA. La reacción se monitoreó por espectroscopia UV-Vis a 515 nm hasta alcanzar el EE. Una vez determinados los consumos individuales se prepararon las diferentes combinaciones. Para los experimentos donde se partió de una mezcla de ambas sustancias (F y AA) se procedió de la siguiente manera: a una celda se adicionaron las alícuotas correspondientes a las concentraciones utilizadas en el primer paso y luego de adicionar 3 ml de la solución de DPPH• se monitoreó la reacción de acuerdo a lo descrito anteriormente determinándose los consumos de radical en el EE.

Para analizar las posibles reacciones entre F-AA y entre las formas oxidadas de una especie y la otra, se procedió a realizar las reacciones en etapas, esto es se hizo reaccionar con el radical libre uno de los compuestos (F y/o AA) hasta el estado estacionario, o sea hasta su forma completamente oxidada y luego se adicionó el segundo


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compuesto, analizándose los consumos de radical.

Las concentraciones de los compuestos, expresadas como relación de moles en función de moles de DPPH•, se escogieron en función de las reactividades, teniendo en cuenta los factores estequiométricos determinados anteriormente (Tabla 7.1)

Los resultados se expresan como % consumo DPPH• para distintas relaciones F-AA. Determinación de la AAR de jugos cítricos naturales

La capacidad antiradicalaria de

los diferentes jugos se determinaron utilizando el método de decoloración del radical libre DPPH• .

Los jugos se obtuvieron a partir de frutos adquiridos en comercios de la ciudad Capital de Santiago del Estero en Diciembre de 2004.

A cada fruto se lo lavó, cortó y exprimió en un exprimidor doméstico. El jugo obtenido fue filtrado a través de algodón y luego se centrífugo a 1500 r.p.m durante 5 minutos. Del sobrenadante se tomaron alícuotas de 20, 15, 10 y 5 µl y se adicionaron a una cubeta conteniendo 3 ml de solución metanólica de DPPH•. La reacción se monitoreó a 515 nm durante el tiempo suficiente como para no observar cambios en la absorbancia del radical.

Los análisis se realizaron por triplicado reportándose el valor promedio junto a la desviación estándar.

La cuantificación de AA en los jugos se realizó por HPLC según el método propuesto por Correa de Souza y col [7] utilizando una columna SS Wakosil C18 RS (250x 4.6 mm i.d.; 5µm)

operado a 25 ºC, utilizándose como fase móvil una solución acuosa de H2SO4 (pH 2.5) en modo isocrático con un flujo de 0.7 ml/min. La detección se realizó a 254 nm usando un detector Konik UV- Vis 200.

CAPITULO 7.Obtención de Dihidrochalcona de Naringina (NDhCh)

La reacción de obtención de NDhCh se realizó por hidrogenación catalítica, utilizándose un Hidrogenador tipo Parr (Figura 6.6). El procedimiento consistió preparar una solución metanólica de NCh conteniendo aproximadamente 0.2 mg/ml. Luego, la solución se trasvaso al frasco de reacción y se adiciono el catalizador (Negro de Platino u Oxido de Platino (IV)) en diferentes cantidades (expresadas como relación Ch/Cat, Tabla 6.1)

Dado que los primeros experimentos no mostraron formación de NDhCh se procedió a activar el catalizador sonicándolo por 10 minutos y transcurrido ese tiempo se la coloco en el Hidrogenador bajo una presión de 2-3 atm obteniéndose así resultados positivos. Las reacciones fueron monitoreadas por espectroscopia UV-Vis, dado que las formas NCh y NDhCh muestran máximos espectrales bien diferenciados, 282 nm y 366 nm respectivamente, Figura 6.8.A y por HPLC, columna Wakosil II, (250x 46 mm i.d.; 5µm) operado a 25 ºC con fase móvil agua-acetonitrilo-ácido acético (74.5:25:0.5, v/v) en modo isocrático con un flujo de 1.0 ml/min. La detección se realizó a 330 nm usando un detector Konik UV- Vis 200.


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BBiibblliiooggrraaffííaa

[1] M. Shimokoriyama, Interconversion

of chalcones and flavanones of a phloroglucinol-type structure. J. Am. Chem. Soc. 79, 4199 – 4202. 1957

[2] Shimokoriyama, M. Interconversion of chalcones and flavanones of a phloroglucinol-type structure. J. Am. Chem. Soc. 79, 4199 – 4202. 1957.

[3] C.O. Miles, and L. Main, The kinetics and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerization of naringin and the 4’-rhamnoglucoside of 2’,4,4’,6’-tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 195 – 198. 1988.

[4]. T. Mabry, K. Markham, and M. Thomas. “The systematic identification of flavonoids”. Springer-Verlag, New York, 1970. Capítulos VI y VII.

[5] Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E:; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie. 28. 25-30. 1995.

[6] Ghosh, S.; Moulik, S. P. Interfacial and Micellization Behaviors of Binary and Ternary Mixtures of Amphiphiles (Tween-20, Brij-35, and Sodium Dodecyl Sulfate) in Aqueous Medium. Journal of colloid and interface science 208. 357–366. 1998.

[7] Correa de Souza, M. C.; Toledo Benassi, M.; Almeida Meneghel, R.F.; Ferreira da Silva, S. Stability of unpasteurized and refrigerated orange juice. Brazilian Archives of Biology and Technology. 47.3.391-397. 2004.

Capítulo 9 Conclusiones Generales

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En este trabajo de se realizó un

estudio cinético del efecto del solvente en agua, EtOH y mezclas de ambos sobre el equilibrio entre las formas flavanona-chalcona de N y H, dos flavanonas presentes en cítricos.

Se planteó un mecanismo de reacción en condiciones bajo las cuales la isomerización es controlada por la formación de un carbanión intermediario o mecanismo E1cB.

Mediante la utilización de espectroscopia de absorción UV-Vis y cromatografía líquida de Alta Resolución (HPLC) se determinaron los parámetros cinéticos y termodinámicos asociados a la reacción de isomerización mediante la utilización de espectroscopia de absorción UV-Vis y Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC).

Se analizó el efecto del agregado de base, NaOH, sobre las constantes de velocidad de la reacción de apertura de flavanona, ka, y cierre de chalcona, kc, observándose que para N, ka alcanza un máximo en mezclas con XW ≈ 0.4-0.5, mientras que para la constante de cierre kc prácticamente no se observan mayores cambios con la composición de

la mezcla. Para H se observó un comportamiento diferente a N, donde la composición del solvente afecta sólo a la constante de velocidad de la reacción de cierre, kc siendo máxima para una mezcla XW ≈ 0.8. Esto se explicó en función de las diferencias en la sustitución del anillo B que presentan N y H. Para N el efecto donor del grupo 4’-O- del anillo B facilita la expulsión del grupo O- en posición C-2’ de la flavanona, favoreciendo la reacción de apertura. Por el contrario, en H la deprotonación del grupo hidroxilo en posición C-3’ no presenta ninguna estructura resonante que influya sobre el heterociclo C, consecuentemente el Cβ tiene menor densidad electrónica que en el caso de N dificultando la partida del grupo O- en posición C-2’ de la flavanona, predominando la reacción de cierre.

Estos efectos hacen que, en medio básico, pH aproximado de 11, N se encuentre desplazada hacia su forma Ch ocurriendo lo contrario para H.

Los parámetros termodinámicos, entalpía y entropía, para la reacción de isomerización de ambas flavanonas correlacionaron linealmente, sugiriendo

Conclusiones Generales


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la existencia de un efecto de compensación entalpía-entropía. La presencia de dicho efecto es una evidencia de que ambas reacciones operan bajo el mismo mecanismo, E1cB.

Los hechos experimentales sugieren que es posible obtener flavanona o chalcona controlando las variables pH, composición del solvente. Para la obtención de Ch, los valores de Keq, Tabla 4.2, indican que la reacción se encuentra más desplazada hacia la forma Ch a Xw =0.52 para N y Xw=0.24 para H ambas a pHap= 11.

Se estudió el efecto de la luz sobre las velocidades de reacción del equilibrio Fl-Ch en medio acuoso ácido, en EtOH neutro y en ambos solventes en medio básico, pH aparente 11.

Como primer resultado se observó que la irradiación no ejerce efecto sobre H ni su chalcona en ambas condiciones de pH.

Para N, tanto en agua pH 3 como en EtOH neutro, la luz no ejerce efecto sobre las velocidades de reacción, observándose que en estas condiciones el equilibrio se encuentra desplazada hacia la forma Fl.

Se planteó el mecanismo para la reacción de ciclización de NCh el cual implica una enolización catalizada por ácido y se determinaron los parámetros cinéticos y termodinámicos. Los resultados indican que la reacción de ciclización es más rápida en EtOH que en las soluciones acuosas ácidas, a pesar que los valores de entalpía de activación son mayores en EtOH. Esto indicó que la reacción está controlada por entropía

En medio básico se observó que, la irradiación cataliza la formación de un

producto P, el cual se forma a partir del estado excitado de NCh, tal como lo indicaron los parámetros cinéticos obtenidos.

Sobre los hechos experimentales se dedujo la estructura de dicho producto, el cual corresponde a la familia de las hidroxidihidrochalconas, denominándose β-hidroxi-4,2`,4`-trihidroxi dihidrochalcona.

Teniendo en cuenta los efectos benéficos para la salud que provoca la ingesta de F se determinaron las AAR y AAO de N, H, sus agliconas como así también la especie NCh, su correspondiente dihidrochalcona, NDhCh y los flavonoles R y, Q empleándose dos métodos ampliamente utilizados: el método de decoloración del radical libre DPPH• y el método del blanqueamiento de β-caroteno durante la cooxidación con ácido linoleico.

Con el objeto de simular las condiciones existentes en los jugos cítricos se realizó un estudio de las capacidades antirradicalarias de combinaciones de AA y F en diferentes concentraciones. Finalmente se determinaron las AAR de jugos naturales de naranjas, pomelos y limones.

Los resultados obtenidos indican que R y Q presentan la mayor AAR y AAO respectivamente, mientras que de las flavanonas, N presenta la mínima AAR y AAO. Sin embargo los resultados obtenidos durante el estudio de la interacción con AA indican que la combinación N-AA presenta efecto positivo comparado con la suma de los consumos individuales. Esto se explicó en función de los potenciales de reducción de las cuplas, los cuales indican que N reacciona con la forma


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oxidada del ácido ascórbico, DHA, regenerándolo.

Dentro de los derivados de las flavanonas, NDhCh, la forma hidrogenada de NCh, la cual presenta propiedades edulcorantes, presento la mayor AAO y AAR por lo que su uso en la alimentación tendría efectos benéficos adicionales, ya que presenta propiedades tanto como endulzante y como AO.

La determinación de las AAR de jugos de naranjas, pomelos y limones, indicaron que el jugo de naranja es el más eficiente en para atrapar radicales libres.

Dado que el AA es el componente mayoritario de los cítricos, se determinaron las concentraciones de este compuesto en cada jugo, y se encontró que existe una relación lineal entre la concentración de AA y la AAR.

Conocida las concentraciones de AA en los jugos se compararon los consumos de radical de los mismos con soluciones equimolares stock de .AA. Los resultados indicaron que el consumo de radical por parte de los jugos es mayor que el esperado, este hecho se explicó por la presencia de otras sustancias polifenólicas capaces de atrapar radicales libres entre las cuales

se encuentran los F que contribuyen a la AAR total, además de la posibilidad de que dichas sustancias puedan interactuar de manera positiva con el AA.

Finalmente, se obtuvo la forma Dihidrochalcona de N, un poderoso edulcorante de posible utilización en alimentos, mediante reacción de hidrogenación catalítica. Los resultados indicaron que el máximo rendimiento, se obtuvo en soluciones metanólicas neutras con PtO2 como catalizador, en una relación en peso Ch/cat de 20, bajo una presión de H2 de 3 atm.

En conclusión, a partir de residuos o desechos de la industria citrícola, actualmente desaprovechados, es posible la extracción de sustancias tales como las flavanonas de gran interés tanto para la industria alimentaría por ser precursoras de edulcorantes semisintéticos, como para la nutracéutica por sus propiedades AO.

Esta tesis plantea una alternativa interesante de aprovechamiento de fuentes naturales de nuestra región, tales como las cáscaras de los cítricos, que actualmente son poco explotadas para la obtención de productos de alto valor agregado

tesis

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