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Anlisis de nuevos marcadores moleculares enLeucemia Linfoctica Crnica
Travella, Ana Carolina2012
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la coleccin de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. LuisFederico Leloir. Su utilizacin debe ser acompaada por la cita bibliogrfica con reconocimiento de lafuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Fuente / source:Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Qumica Biolgica
Alisis de uevos arcadores oleculares e Leuceia Lifoctica Crica
Tesis presentada para optar al ttulo de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en
el rea de Qumica Biolgica
Lic. Ana Carolina Travella
Director de tesis: Dra. Irma Slavutsky
Consejero de Estudios: Dra. Elba Vazquez
Lugar de trabajo: Laboratorio de Gentica de Neoplasias Linfoides, Instituto de Medicina
Experimental (IMEX)/ CONICETAcademia Nacional de Medicina
Buenos Aires, 2012
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Resumen:
ANLISIS DE NUEVOS MARACDORES MOLECULARES EN LEUCEMIA LINFOCTICA CRNICA
La leucemia linfoctica crnica (LLC) constituye la leucemia ms frecuente en occidente, caracterizada
por presentar un curso clnico variable, siendo de inters la bsqueda de nuevos marcadores. En este
trabajo se estudiaron 223 pacientes con LLC mediante anlisis citogentico, citomolecular y
molecular. Los estudios citogenticos y citomoleculares permitieron identificar 35 alteraciones
estructurales no descriptas previamente en la literatura, siendo el cromosoma 8 el ms
frecuentemente implicado. El anlisis del estado mutacional y los rearreglos del gen IGVH
(immunoglobulin heavy chain variable gene), permiti caracterizar a nuestra poblacin de pacientes
con LLC, mostrando una distribucin similar a la de los pases Occidentales (IGVH3>IGVH1>IGVH4)con diferencias respecto de Asia y Brasil, sustentando variaciones en el background gentico y/o en
factores ambientales entre poblaciones. La evaluacin de los niveles de expresin de los genes SEPT-
10, MCL-1, LPL, ADAM-29 y CLLU-1, mostr gran heterogeneidad que refleja la variabilidad
caracterstica de la LLC, y permiti establecer la asociacin de la expresin LPL y ADAM-29 con las
caractersticas citogenticas de los pacientes, aspecto no explorado previamente. Estos estudios
resaltan la importancia de profundizar la caracterizacin biolgica y la comprensin de los
mecanismos patognicos de esta enfermedad tendiente a definir nuevos grupos de riesgo
especficos.
Palabras clave: leucemia linfoctica crnica, marcadores pronstico, citogentica, FISH, IGVH,
expresin gnica
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Abstract:
New molecular markers in chronic lymphocytic leukemia
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent form of leukemia in Western world,
characterized by a highly variable clinical course, being necessary the search for new prognostic
markers. In this study, we described cytogenetic, citomolecular and molecular analysis of 223 CLL
patients. Cytogenetic and citomolecular results showed 35 new structural abnormalities not
previously described in the literature, being chromosome 8 the most frequently involved. The
mutational status of the IGVH (immunoglobulin heavy chain variable genes) gene in our cohort
showed a family distribution similar to that observed in Western countries (IGVH3>IGVH1>IGVH4)
and different to CLL patients from Asia and Brazil, that may reflect variations in the genetic
background and/or environmental factors of their populations. Expression profiles of SEPT-10, MCL-
1, LPL, ADAM-29 and CLLU-1 genes showed great heterogeneity that may reflect characteristic
variability of CLL patients, and showed association between LPL and ADAM-29 with cytogenetic
features in our cohort, data not previously described in the literature. This results remarks the
importance of biological characterization and understanding of pathogenic mechanisms of this
disease in order to define specific risk groups.
Key words: chronic lymphocytic leukemia, prognostic factors, cytogenetics, FISH, IGVH, gene
expression
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Agradecimientos
Quiero expresar mi agradecimiento a todos los que contribuyeron, de una u otra forma, para
la realizacin de este trabajo.
A la Dra. Irma Slavustky, por su valiosa direccin y su invalorable dedicacin y esfuerzo que
contribuyeron a mi formacin, tanto a nivel profesional como personal.
A la Dra. Irene Larripa y al Departamento de Gentica de la Academia Nacional de Medicina,
por permitirme realizar este trabajo y por brindarme los recursos y equipos necesarios.
A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires por mi
formacin durante los aos de carrera y Postgrado. En especial al Departamento de Qumica
Biolgica, a la Secretara de QB, en especial a Ayeln, y a la Dra. Elba Vazquez, mi consejera de
estudios, quienes siempre se hallaron predispuestos a responder todas las consultas y resolver todos
los problemas surgidos en el proceso.
Al Dr. Fernando Bezares, del Hospital Alvarez, quin realiz el diagnstico de la mayora de
los pacientes evaluados y cordialmente remiti las muestras y los datos clnicos de los mismos. Sin su
colaboracin, buena predisposicin y ayuda no hubiera sido posible realizar este trabajo.
A la Dra. Carmen Stanganelli del Departamento de Medicina Nuclear de la Academia Nacional
de Medicina quien represent una ayuda invalorable en la puesta a punto de la tcnica de
mutaciones, siempre con buena voluntad y una sonrisa.
A la Dra. Marina Gutierrez quien con dedicacin y paciencia me ayudo en los primeros pasos
de la tcnica de PCR en tiempo real y adems colabor en la obtencin de los controles normales.
Al Dr. Pablo Oppezzo y al Instituto Pasteur de Montevideo, por recibirme amablemente en sulaboratorio, capacitarme en la deteccin de mutaciones y responder a todas mis preguntas. A Pilar,
Fernanda y Agustn por haberme hecho sentir por un tiempo parte del grupo.
A todos mis compaeros del laboratorio: Mariana, Vir, Marcelo, Lili, Fer, Caro, Yesi, Cristian,
Gustavo, Marcela, Ariela, Nati, Analia, Jorge, Graciela, Carlos, Martin, Vero, Leandro, Patricia, Ale,
Mica, Estela, Miguel, Susi y Liliana. En especial a July, Pame y Flavia, por ser amigas adems de
compaeras de trabajo, por escucharme, entenderme y alentarme.
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A mis amigos, los de ayer, los de hoy y los de siempre, por acompaarme en este camino y
por estar siempre, con buenos consejos y a pesar de la distancia.
A mi familia. A Mam y Pap, por ser quienes son y apoyarme siempre. A mis hermanos
Pablo, Mariano y Sebi, porque los adoro, gracias por escucharme siempre. A Gaby y Carla, mis
hermanas adoptivas, las quiero. A Luli y Fede que son todo. A mi abuela Ins, por estar siempre. A
mis abuelos. A todos por escucharme, alentarme y apoyarme incondicionalmente en todo.
A Fer, por estar siempre a mi lado. En las buenas y en las malas. Por su apoyo, compaa,
paciencia y amor incondicional sin los cuales nada de esto hubiera sido posible. Te amo.
Agradezco tambin al Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas por la beca
doctoral que me permiti desarrollar esta tesis.
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A mis padres, por ser mi ejemplo a seguir en la vida y por acompaarme siempre.
A Fer, con quien da a da comparto la vida y me enseo que con amor todo se logra.
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ndice Pag.
Abreviaturas 9
1. Introduccin 12
1.1. Caractersticas generales de la leucemia linfoctica crnica 121.2. Origen del linfocito B de la LLC 16
1.3. Biologa de la LLC 19
1.4. Factores pronstico 23
1.5. Estudios citogenticos y citomoleculares en LLC 28
1.5.1. Anlisis cromosmicos en neoplasias linfoides 28
1.5.2. Estudios de citogentica convencional en LLC 29
1.5.3. Estudios citomoleculares en LLC 30
1.6. Anlisis moleculares en LLC 36
1.6.1. Perfil mutacional de IGVH 36
1.6.2. Nuevos marcadores moleculares 41
2. Objetivos 49
3. Materiales y mtodos 51
3. 1. Poblacin estudiada 51
3. 2. Metodologa 51
3.2.1. Cultivo de sangre perifrica (SP) 51
3.2.2 Tcnicas citogenticas 53
3.2.2.1. Tincin con colorante Wright 53
3.2.2.2. Tcnica de bandeo G 53
3.2.3. Evaluacin microscpica 54
3.2.4. Tcnicas citomoleculares 55
3.2.4.1. Hibridacin in-situ con fluorescencia (FISH) 55
3.3. Estudios moleculares 60
3.3.1. Separacin de clulas mononucleares de SP
por Ficoll-Hypaque 60
3.3.2. Extraccin de ARN total 61
3.3.3. Cuantificacin espectrofotomtrica del ARN 61
3.3.4. Reaccin de retrotranscripcin inversa (RT-PCR) 62
3.3.5. Anlisis del estado mutacional de IGVH 62
3.3.6. PCR en tiempo real (QRT-PCR) 69
3.4. Anlisis estadstico 74
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4. Resultados 77
Captulo I: Estudios citogenticos y citomoleculares
4.1. Estudios citogenticos y citomoleculares 77
4.1.1. Anlisis de cariotipos complejos 79
4.1.2. Anlisis de cariotipos simples 86
4.1.3. Alteraciones estructurales recurrentes 87
4.1.4. Alteraciones numricas 89
4.1.5. Correlacin con parmetros clnicos 90
4.1.6. Discusin 93
Capitulo II: Anlisis del estado mutacional de los genes IGVH
4.2. Anlisis del estado mutacional de los genes IGVH 98
4.2.1 Correlacin entre el estado mutacional de IGVH
y las alteraciones genmicas 102
4.2.2 Anlisis de los rearreglos IGHV-D-J 104
4.2.2.1. Distribucin de familias y genes VH 104
4.2.2.2. Distribucin de familias y genes DH 105
4.2.2.3. Distribucin de segmentos y genes JH 106
4.2.3 Anlisis de longitud de HCDR3 y presencia de estereotipos 107
4.2.4 Comparacin de nuestros datos con los reportados previamente 108
4.2.5. Discusin 113
Capitulo III: Anlisis de expresin gnica
4.3. Anlisis de expresin gnica 119
4.3.1. Perfiles de expresin gnica 125
4.3.2. Correlacin con los parmetros clnicos 127
4.3.2.1 Distribucin de pacientes en funcin
de los niveles de expresin gnica 127
4.3.2.2. Distribucin de niveles de expresin
en funcin de los parmetros clnicos 129
4.3.3. Correlacin con caractersticas citogenticas y de FISH 131
4.3.4. Correlacin con perfil mutacional de genes IGVH 134
4.3.5. Discusin 136
5. Conclusiones 142
6. Bibliografa 145
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Abreviaturas:
13q14x1:delecin monoallica de 13q14
13q14x2:delecin biallica de 13q14
4T:buffer 4X SSC/ 0,05% Tween-20
aa:aminocidosADAM-29: desintegrin and
metallopeptidase domain 29
ADNdc: cido desoxirribonucleico doble
cadena
AE:alteraciones estructurales
AEN:anomalas estructurales nuevas
AER:alteraciones estructurales recurrentes
Ag:antgeno
AID:activation-induced cytidine deaminase
AN:anomalas numricas
APC:clulas presentadoras de antgeno
APRIL:A proliferation-inducing ligand
ARNm:cido ribonucleico mensajero
ATM:ataxia telangiectasia mutated
BAFF: B-cell inducing factor of the tumor
necrosis factor family
BCL2:B-cell leukemia/lymphoma 2
BCR:receptor de clulas B
BH: dominio BCL-2 homologyBMSC:bone marrow stromal cells
Btk:Brutons tyrosine kinase
C:grupo control
CA:cariotipo anormal
CC:cariotipo complejo
CD23s:CD23 soluble
CD38:cluster of differentiation 38
CD40L:CD40 ligando
CDRs: complementarity determining
regions
CG:centro germinal
CGH:comparative genomic hybridization
CI:proceso de conmutacin isotipica
CLLU-1: chronic lymphocytic leukemia up-
regulated gene 1
CN:cariotipo normal
cp:cariotipo compuesto
Cyt C:citocromo C
D:dominio de diversidad
DEPC: dietilpirocarbonato
EDTA: Etilen-diamin-tetra acetato de sodio
FANCC: Fanconi anemia, complementation
group C
FDC:clulas foliculares dendrticasFISH:Fluorescence in situ hybridization
GAPDH: gliceraldehdo 3-fosfato
deshidrogenasa
GTP:guanosine triphosphate
Hb:hemoglobina
HCDR3: heavy-chain complementarity-
determining regin 3
HMS: proceso de hipermutacin somtica
Ig:inmunoglobulinas
IGH@: locus del gen de la cadena pesada
de las inmunoglobulinas
IGVH: immunoglobulin heavy variable
region
IL-2:interleukina-2
ISCN: International System for Human
Cytogenetic Nomenclature
J:segmento de unin
LDH:lactato deshidrogenasa
LLC:leucemia linfoctica crnicaLLP:linfoma de linfocitos pequeos
LPL:lipoprotein lipase
LPS:Lipopolisacarido
M:mutado
MAS:mean alignment score
MBL:monoclonal B lymphocytosis
MCL-1:myeloid cell leukemia sequence 1
MDR:minimallydeleted regin
M-FISH:Multicolor FISH
MO:medula osea
MSC:mesenchymal stromal cells
NAHR: non-allelic homologous
recombination
ND:sin datos
NFD:solucin antifade
NK:natural killer
NLC:clulas nurse-like
NM:no mutado
PBS:phosphate-buffered saline
PI3K:phosphoinositide 3-kinasedelta
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PL:prolinfocitos
Pq:plaquetas
PW:Pokeweed mitogen
QRT-PCR: quantitative real time-
polymerase chain reaction
RB-1:retinoblastoma gene 1
ROC:Receiver Operating Characteristic
SEPT-10:Septin 10
SFB:Suero Fetal Bovino
SLT:sobrevida libre de tratamiento
SP:sangre perifrica
2M:2-microglobulina
SV:sobrevida
Syk:spleen tyrosine kinase
TD:respuesta inmune T-dependienteTDL:tiempo de duplicacin linfocitaria
TI:respuesta inmune T-independiente
TK:timidina-quinasa
Tm:temperatura de melting
TNB:TRIS-NaCl-Buffer
TNF-
:tumor necrosis factor
TNFRSF10A/B: tumor necrosis factor-
related apoptosis-inducing ligand receptor
(TRAIL-R1/2)
TNT:buffer Tris- NaCL- Tween
TP53:tumor protein p53
t-test:test tde Student
V:regin variable
VH:segmento V de cadena pesada
VL:segmento V de cadena liviana
WBC:recuento de glbulos blancos
WES:whole exome sequencing
WGS:whole genome sequencingWHO:world health organization
XPA:Xeroderma pigmentosum group A
ZAP-70: -chain associated protein kinase
70kDa
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1.Introduccin
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1. Introduccin
1.1. Caractersticas generales de la leucemia linfoctica crnica
La Leucemia Linftica Crnica (LLC) es la neoplasia a clulas B ms frecuente en el adulto,
caracterizada por la presencia de linfocitos B monoclonales pequeos, redondos, ligeramente
irregulares en la sangre perifrica (SP), mdula sea (MO), bazo y ganglios linfticos, asociados con
prolinfocitos y paraimmunoblastos que forman centros centros proliferantes pseudofoliculares
(pseudofoliculos) (Hallek et al, 2008). Esta acumulacin progresiva de linfocitos monoclonales con un
fenotipo B maduro es el resultado de un balance entre disminucin de la apoptosis y un aumento de
la proliferacin de estas clulas. El cuadro clnico presenta linfocitosis en SP (>5x109/L),
linfadenopatias, adenomegalias, hepato-esplenomegalia, infecciones recurrentes, falla medular,
anemia y plaquetopenia en las formas ms avanzadas y usualmente fenmenos autoinmunes
asociados (anemia hemoltica, prpura trombocitopnica autoinmune) (Chiorazzi et al, 2005; Zens et
al, 2009). Cuando la enfermedad involucra SP y MO, recibe el nombre de LLC, mientras que si ocurre
infiltracin de ndulos linfticos u otros tejidos por clulas B con morfologa e inmunofenotipo de
LLC pero sin manifestaciones leucmicas, recibe el nombre de linfoma de linfocitos pequeos (LLP).
Ambas son consideradas por la World Health Organization (WHO) (Mller-Hermelink et al, 2008)
como manifestaciones diferentes de una misma entidad (LLC/LLP) tomando como base las
caractersticas citolgicas, histopatolgicas, inmunofenotipicas y citogenticas.
La LLC presenta una mayor incidencia en hombres, con una relacin hombre:mujer de 1,7:1.
Afecta principalmente a personas mayores de 60-65 aos, incrementndose hacia la sptima dcada
de vida, con una edad media al diagnstico de 70 aos en hombres y de 74 aos en mujeres (Mller-
Hermelink et al, 2008; Zens et al, 2009). A pesar de ser rara su aparicin en menores de 50 aos,
actualmente hay un mayor porcentaje de casos con diagnstico temprano (aproximadamente un
20% ), que por lo general constituyen un hallazgo en un hemograma de rutina en pacientes
totalmente asintomticos (Dighiero & Hamblin, 2008).
En cuanto a los criterios para definir el diagnstico, los mismos incluyen: 1) recuento de
linfocitos de morfologa caracterstica mayor a 5x109/L, linfoadenopata o esplenomegalia; y 2)
inmunofenotipo comn que incluye co-expresin de CD5/CD19/CD23, bajos niveles de CD20 y CD79b
en comparacin con los hallados en clulas B normales, y ausencia de expresin de FMC7(Dighiero,
2005; Hallek et al, 2008; Marquez et al, 2011). El estudio del clon leucmico por citometra de flujo se
basa en un panel que incluye: CD19+, CD5+, CD20+ (dbil), CD22+ (dbil), CD79b+ (dbil), CD23+,
CD+ dil, CD+ dil, CD++, sIg /+ (dbil); y ausencia de expresin de sIgM, FMC7,
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CD10 y CD103, que permite confirmar el diagnstico y excluir otros desrdenes linfoproliferativos a
clulas B.
El curso clnico de la patologa es altamente variable con un amplio rango de sobrevida, entre
unos pocos meses y ms de una dcada a partir del diagnstico. Aproximadamente un tercio de los
casos permanecen asintomticos por muchos aos sin necesidad de tratamiento, con una sobrevida
similar a la de la poblacin general, otro tercio presenta una fase inicial indolente seguida de
progresin y muerte por causas ligadas a la enfermedad, mientras que el tercio restante debuta con
enfermedad agresiva, requiriendo tratamiento inmediato (Dighiero, 2003; Chiorazzi et al, 2005).
Puede estar precedida por una entidad pre-maligna denominada MBL (monoclonal B lymphocytosis)
caracterizada por la presencia de una poblacin clonal B
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al, 2000; Caporaso et al, 2004). Al presente se desconoce el mecanismo molecular implicado en este
fenmeno, no habindose observado la expansin de secuencias trinucleotdicas caracterstica de las
enfermedades neurodegenerativas (Auer et al, 2007). Sin embargo, en la gran mayora de los casos el
diagnstico de LLC no implica un riesgo aumentado para la descendencia de padecer la enfermedad
u otros sndromes linfoproliferativos. Asimismo, estudios recientes han identificado numerosos
genes o locus de riesgo que podran estar asociados a la agregacin familiar (2q13, 2q37.1, 6p21.3,
6p25.3, 11q24.1, 13q21.33-q22.2, 15q23 y 19q13.32) (Ng et al, 2007; Di Bernardo et al, 2008; Slager,
et al, 2011). No obstante, las dificultades para identificar una mutacin especfica sugieren
posiblemente el aporte de mltiples genes (Goldin & Slager, 2007) o bien la presencia de
polimorfismos en genes predisponentes a LLC familiar (Rudd, 2006; Auer et al, 2007).
Inicialmente, la LLC fue considerada una enfermedad homognea, de clulas B inmaduras,
inmuno-incompetentes, con bajo ndice de replicacin, que se acumulaban debido a inhibicin o falla
del proceso de apoptosis. En las ltimas dcadas, esta informacin se ha ido transformando y en la
actualidad es considerada una entidad de linfocitos B maduros estimulados por presencia antignica,
que pueden morir por apoptosis o evitarla a travs de la interseccin de seales externas (Chiorazzi
et al, 2005). Estas clulas neoplsicas seran renovadas slo por clulas precursoras proliferantes. En
la Tabla 1 se comparan los tems ms importantes de ambos puntos de vista.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Slager%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21131588http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Slager%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21131588 -
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Tabla 1: Comparacin de los puntos de vista histricos y actuales en LLC.
Punto de vista histrico Punto de vista actual
Enfermedad clnicamente heterognea con clula
de origen homognea
Enfermedad clnicamente heterognea originada
de linfocitos B con diferente estado de
maduracin, activacin y subgrupo celular
Efeedad deivada de lifoitos B naveEnfermedad derivada de linfocitos B post contacto
antignico y con diferente nivel de mutaciones en
los genes de las inmunoglobulinas
La acumulacin de clulas neoplsicas ocurre a
causa de un defecto inherente a la apoptosis que
involucra al total de las clulas leucmicas
La acumulacin de clulas neoplsicas ocurre a
travs de seales de supervivencia originadas en
el microambiente y captadas por un subgrupo de
clulas neoplsicas a travs de diferentes
receptores (ejemplo: BCR y receptores de
citoquinas)
La LLC es una enfermedad de acumulacin celular La LLC es una enfermedad de acumulacin celular
asociada a un mayor ndice de proliferacin que la
reconocida previamente.
Los marcadores pronsticos identifican pacientes
en varios niveles de riesgo (bajo, intermedio y
alto) con una reconocida heterogeneidad en su
evolucin clnica
Nuevos marcadores moleculares y proteicos
identifican pacientes dentro de los niveles de
riesgo bajo e intermedio, que presentan distinto
curso clnico
La terapia est basada en la observacin clnica y
usa mtodos de prueba y error
Nuevos descubrimientos proveen informacin
sobre posibles blancos para el desarrollo de
agentes teraputicos ms efectivos
(Adaptado de Chiorazzi et al, 2005).
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1.2. Origen del linfocito B de la LLC
La maduracin de linfocitos B se produce en la MO, proceso durante el cual se rearreglan los
genes de la regin variable (V) de las inmunoglobulinas (Ig), originando una molcula que formar
parte del receptor de clulas B (BCR), responsable del reconocimiento antignico. Al generarse este
reconocimiento antgeno-especfico, la clula B ingresa al centro germinal (CG) en los folculos
lifoides desatado ua epasi loal asiva. Este poeso oue e la llaada zoa osua
del CG y se acompaa de hipermutacin somtica (HMS) de sus genes V, mecanismo por el cual se
introduce un alto nmero de mutaciones en los segmentos V de las cadena pesada (VH) y liviana (VL)
del sitio de unin al antgeno (Ag). Luego de la expansin clonal, las clulas hijas hipermutadas
iga a la zoa laa del CG se seleioa auellas ue aduiieo utaioes de ao
afinidad. Aquellas clulas con mutaciones desfavorables (de baja afinidad o autorreactivas) mueren
por apoptosis. Estas vas de seleccin usualmente requieren de la presencia de linfocitos T en el CG
los cuales interactan con las clulas B en una respuesta inmune T-dependiente (TD). Sin embargo,
este proceso tambin puede ocurrir en ausencia de clulas T y fuera del CG, en la zona marginal de
los folculos linfoides, llamada respuesta inmune T-independiente (TI). Ambos procesos TD y TI,
originan clulas plasmticas o clulas B de memoria post- reconocimiento antignico. A su vez,
dentro del CG existe migracin celular entre las zonas clara y oscura, donde las clulas seleccionadas
positivamente sufren varias rondas de proliferacin, mutacin y seleccin antes de completar el
proceso de diferenciacin y abandonar el CG (Chiorazzi et al, 2005; Zenz et al, 2010a).
Al presente existen numerosos aspectos sin resolver en la LLC, entre los cuales sin duda
adquiere relevancia conocer el origen del linfocito B caracterstico de esta patologa, as como su
contrapartida normal, habindose desarrollado diferentes hiptesis al respecto (Figura 1).
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Figura 1: Reacciones en el CG y contrapartida celular normal de la clula leucmica. Las evidencias ms firmessugieren que las formas de LLC mutadas derivan de clulas B de memoria post-CG, aunque tambin sediscute la derivacin a partir de clulas B que acumulan mutaciones a travs de una respuesta Tindependiente. Con respecto a las LLC no mutadas, pareceran derivar de clulas B activadas porreconocimiento antignico, no siendo claro an si se trata de clulas B nave CD5+ o clulas B de lazona marginal. A su vez, tambin sigue siendo tema de estudio si esta activacin surge a travs de unarespuesta T independiente o T dependiente, involucrando una clula B autorreactiva (Zenz et al,2010a).
Una hiptesis inicial sostiene que la transformacin maligna sobreviene en diferentes
estadios del desarrollo del linfocito B. Las clulas que expresan Igs con sus genes VH sin que haya
ocurrido el proceso de HMS, seran originadas a partir de un linfocito B nave que an no tuvo
contacto con el Ag, y por lo tanto no ha transitado por el CG, mientras que aquellas que expresan Igs
con genes VH mutados (M) tendran su origen en un linfocito B que realiz su paso por el CG, post-
contacto antignico (Chiorazzi et al, 2005; Zenz et al, 2010a).
Otra hiptesis propone que ambas sub-poblaciones (LLC M y no mutadas (NM)) han tenido
contacto previo con un Ag, posiblemente un auto-Ag, el cual fue reconocido por el BCR con una
afinidad reducida (Stevenson & Caligaris-Cappio, 2004; Thorselius et al, 2006; Stamatopoulos et al,
2007). En el caso de las LLC M este modelo propone que estas clulas seran linfocitos B de memoria
que luego de la maduracin fueron anergizadas, explicando la sub-expresin del BCR, mientras que
en el caso de las clulas de LLC NM, luego de la unin del auto-Ag al BCR, el mismo sera incapaz de
inducir el proceso de HMS. El sesgo en la expresin de ciertos genes en las formas NM (ej: IGVH1-69,
IGVH4-39) con una expresin muy conservada de aminocidos en el HCDR3 (heavy-chain
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complementarity-determining regin 3) sustenta esta hiptesis contemplndose un proceso de
seleccin antignica (Zenz et al, 2010a).
Una tercera hiptesis (Chiorazzi & Ferrarini, 2011; Garcia-Muoz et al, 2012) sugiere que
ambas subpoblaciones leucmicas, derivan de clulas de la zona marginal de los folculos linfoides,
basado en el fenotipo particular de las clulas de LLC y la presencia de un mecanismo inmunolgico
alternativo a la clsica respuesta TD y TI (Weill et al, 2009). En este modelo la presencia de la HMS y
de conmutacin isotipica (CI) (mecanismo responsable de cambiar la regin efectora de las Igs para
permitir el correcto procesamiento antignico), tenda luga de ua foa o lsia es dei po
un camino alternativo al del CG luego de haberse encontrado con su Ag. En los ltimos aos han
surgido evidencias adicionales que sugieren la presencia de una respuesta inmunitaria independiente
del CG, en donde eventos como HMS, CI y la expresin de AID ( activation-induced cytidine
deaminase), poda se ediados tai po la peseia de eeptoes tipo Toll e ua
respuesta de inmunidad innata (Weller et al, 2005; Richard et al, 2008).
Finalmente, estudios recientes (Dhren-von Minden et al, 2012) sugieren una nueva hiptesis
para el origen de la LLC. Estos autores plantean que la presencia de BCRs estereotipados, casi
idnticos, en diferentes pacientes indicara que el reconocimiento de Ag especficos estara
involucrado en la patognesis de la LLC. Aproximadamente el 20% -30% de los pacientes con LLC
presentan receptores pertenecientes a determinados estereotipos basados en la secuencia de laregin HCDR3, y alrededor del 1% portan secuencias aminoacdicas de IGVH(immunoglobulin heavy
variable regin) casi idnticas (Ghiotto et al, 2004; Widhopf et al, 2004; Stamatopoulos et al, 2007). A
diferencia de otras neoplasias a clulas B, los autores demuestran que los BCRs derivados de las
clulas leucmicas inducen sealizacin autnoma Ag-independiente, a travs de la regin HCDR3 y
un epitope interno del BCR responsable de estas seales. Posiblemente, solo ciertas secuencias
HCDR3 posean esta capacidad sealizadora explicando el sesgo en el repertorio de BCRs en LLC. En
consecuencia, la presencia de distintos epitopes intrnsecos explicaran estas similitudes en los
receptores, los cuales se seleccionaran por su habilidad de interaccin con el HCDR3.
A pesar de las hiptesis propuestas y las diferencias en la sobrevida (SV) de los pacientes en
los diferentes subtipos o acorde al estado mutacional, todas las formas de LLC parecieran compartir
un perfil de expresin gnica similar, lo que sugerira un origen celular comn y/o mecanismos de
transformacin posteriores independientes del estado mutacional (Rosenwald et al, 2001; Klein et al,
2001; Linet et al, 2007).
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1.3. Biologa de la LLC
La sub-expresin del BCR en el linfocito B de la LLC constituye una de las principales
caractersticas de esta patologa. Este receptor est constituido por una Ig de superficie asociada con
el heterodmero Ig(CD79a)/Ig(CD79b). Inicialmente, se propuso que la presencia de mutaciones
putuales e la olula Ig ostitua la piipal ausa de epesin anmala del BCR (Thompson
et al, 1997; Payelle-Brogard et al, 1999), resultados que no fueron confirmados. Otros estudios
uesta epesi oal de los distitos opoetes del BCR Ig e Ig tato a ivel
transcripcional como proteico (Alfarano et al, 1999), asociando la sub-expresin a defectos en el
plegaieto gliosilai de la adea Ig, que bloqueara su salida del reticulo-endoplsmico,
impidiendo de esta manera el correcto ensamblado y transporte del receptor hacia la membrana
(Payelle-Brogard et al, 2003; Vuillier et al, 2005).
Por otra parte, las clulas de LLC en conjunto con las clulas estromales y de la matriz celular
constituyen el ioaiete de la LLC, tanto en MO como en tejido linfoide. La estimulacin
antignica, a travs del BCR, y la interaccin con clulas accesorias y citoquinas en este
microambiente especfico seran un factor promotor importante en las etapas iniciales de la
enfermedad (Ghia et al, 2008; Zenz et al, 2010a; Burger et al, 2009; Burger et al, 2011). Estas
interacciones afectan la sobrevida y proliferacin de las clulas leucmicas confiriendo resistencia a
drogas, y posiblemente sean responsables de la enfermedad residual post-tratamiento. A nivelhistopatolgico, la LLC presenta focos de clulas proliferantes acumuladas en los pseudofolculos
(Caligaris-Cappio et al, 2003). Seales recibidas por contacto directo con otras clulas o por medio de
factores solubles, simultneas o no a la activacin del BCR, pueden estimular la proliferacin y
rescatar de la apoptosis al clon leucmico in vitroy probablemente in vivo. Estas estructuras incluyen
tanto clulas T CD4+ como distintas clulas presentadoras de Ag (APC) (Ghia et al, 2002; Stevenson &
Caligaris-Cappio, 2004), lo que sugiere que algunos de los mecanismos requeridos para la expansin
de clulas B normales post contacto antignico en el CG tambin podran estar operando en la
patognesis de la LLC. An as se desconocen los procesos involucrados en el desarrollo y
mantenimiento de estos pseudofolculos. La quemoquina CXCL13, secretada por clulas foliculares
dendrticas (FDC) y clulas nurse-like (NLC), juega un rol importante como quemoatractante de
clulas leucmicas as como en el desarrollo de folculos normales (Burkle et al, 2007). A su vez, las
clulas de LLC, luego de la estimulacin va BCR o por contacto con NLC, secretan quemoquinas
(CCL22, CCL3 y CCL4) que atraen otros tipos celulares como clulas T y monocitos (Ghia et al, 2002;
Burger et al, 2009; Quiroga et al, 2009), indicando que este microambiente es creado y mantenido a
travs de una interaccin dinmica entre clulas leucmicas y normales. Todos los tipos celulares y
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citoquinas presentes en el mismo tendran un rol crtico estimulando la proliferacin e inhibiendo la
apoptosis de las clulas B malignas (Chiorazzi et al, 2005). A su vez, la generacin de un balance entre
seales pro- y anti-apoptticas, por ejemplo mediante up-regulacin de genes anti-apoptticos
(como BCL-2, Survivina y MCL-1) favorece la sobrevida de clulas LLC (Hui et al, 2006). En la Figura 2
se muestran las principales interacciones celulares y moleculares que tienen lugar en el
microambiente pseudofolcular, de importancia en la sobrevida y proliferacin de las clulas
leucmicas (Burger et al, 2009; Burger et al, 2011).
Figura 2: Interacciones moleculares entre clulas de LLC y clulas estromales en el microambiente de la mdulasea y/o tejido linfoide importantes para la sobrevida y proliferacin de clulas leucmicas, migraciny formacin de pseudofoliculos. El contacto entre las clulas de LLC y las accesorias es establecido ymantenido a travs de receptores de quemoquinas y molculas de adhesin expresadas por las clulasleucmicas (Modificado de Burger et al, 2009; Burger et al, 2011).
En este microambiente el BCR juega un rol clave en el mantenimiento y expansin del clon
leucmico, activado por contacto con auto-Ag o Ag microbianos (Chiorazzi et al, 2005; Chu et al,
2008; Catera et al, 2008) junto con otras seales coestimulatorias, involucrando quinasas especficas
downstream tales como Syk (spleen tyrosine kinase), Btk (Brutons tyrosine kinase) y PI3K
(phosphoinositide 3-kinasedelta). A su vez, la expresin de receptores de quemoquinas como CXCR4
y CXCR5, junto con molculas de adhesin (VLA-4 y otras), regulan el trfico celular y el homingde
clulas de LLC por medio de gradientes tisulares de sus respectivos ligandos. Miembros de la familia
TNF tales como CD40L, BAFF (B-cell inducing factor of the tumor necrosis factor familiy) y APRIL (A
Bcl- / Mcl-
IL4TNF
MSC/BMSC
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proliferation-inducing ligand) activan a las clulas leucmicas a travs de sus correspondientes
receptores. Las NLC atraen a las clulas de LLC mediante la secrecin de CXCL12 (Burger et al, 2000) y
CXCL13 (Burkle et al, 2007), y las protegen de sufrir apoptosis, espontnea o inducida por drogas, a
travs de la expresin de varias molculas: CXCL12, BAFF, APRIL, el ligando inductor de proliferacin
CD31, vimentina y plexina-B1, vas involucradas en el crosstalkdel microambiente de la LLC (Burger
et al, 2000; Nishio et al, 2005; Deaglio et al, 2005; Burger et al, 2011). Asimismo, las MSC
(mesenchymal stromal cells) y las BMSC (bone marrow stromal cells) poseen alta afinidad por las
clulas de LLC promoviendo su sobrevida por contacto directo y estimulando su migracin. Esta
unin es dependiente de la expresin de CXCR4 y VLA-4 por parte de las clulas leucmicas (Burger
et al, 1999; Burger et al, 2011). Interesantemente, la expresin de la integrina VLA-4 en las clulas de
LLC posee impacto pronstico, indicando la importancia de estas interacciones in-vivo(Gattei et al,
2008). Las FDC tambin estn presentes en el tejido linfoide y pueden ayudar a la proliferacin
leucmica. El crosstalk entre las clulas de LLC y las estromales es bidireccional provocando
activacin de ambos tipos celulares, siendo crtico el eje CXCR4-CXCL12 (Burger et al, 2011). En
cuanto a las clulas T, pueden estimular la progresin de la LLC, evitando el efecto antitumoral
desatado por otras clulas T especficas. Funcionalmente, estimulan la proliferacin mediante la
secrecin de citoquinas (como IL-4) o TNF-(tumor necrosis factor ) (Chiorazzi et al, 2005). En los
pseudofolculos, una proporcin importante de clulas T expresan CD40L el cual puede unirse al
CD40 en las clulas de LLC y evitar la apoptosis (Kitada et al, 1999; Stevenson & Caligaris-Cappio,2004). Esta activacin va CD40 induce up-regulacin de CD80 y CD54 en las clulas leucmicas
causando un feedback de estimulacin hacia las clulas T (Ranheim & Kipps, 1993). En estas
estructuras pseudofoliculares las clulas T CD4+ activadas co-localizan con las clulas de LLC CD38+
proliferantes (Burger et al, 2011).
A su vez, la baja expresin del BCR est relacionada con una menor actividad de tirosin-
quinasa, lo cual lleva a defectos en la movilizacin del Ca2+ intracelular y a la fosforilacin de
tirosinas. En la mayora de las LLC con peor pronstico se observa una mejor respuesta va el BCR que
en los pacientes con enfermedad indolente (Lanham et al, 2003). Recientemente se ha observado
que esta respuesta efectiva a la estimulacin va BCR tambin se encuentra relacionada con elevados
niveles de expresin de ZAP-70 (-chain associated protein kinase 70kDa), una tirosina-quinasa
asociada a receptor, presente en clulas T y NK (natural killer) pero ausente en clulas B normales
circulantes, que se encuentra sobreexpresada en pacientes con LLC progresiva. Esta quinasa puede
modular la sealizacin a travs del BCR, en clulas LLC post- estimulacin antignica (Chen et al,
2002), actuando indirectamente en las vas de sealizacin que se activan en este proceso. La
expresin de ZAP-70 puede determinar parcialmente la capacidad de respuesta de estas clulas a la
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estimulacin antignica mediante un aumento en la fosforilacin de tirosinas y alteracin del flujo de
Ca2+. Respecto al mecanismo/s involucrado/s en el impacto pronstico adverso de su expresin en
LLC, se sabe que las clulas ZAP-70+ poseen una capacidad aumentada de respuesta a seales
inducidas por estimulacin antignica va BCR, y en particular, la expresin de ZAP-70 y la
estimulacin sostenida del BCR han sido asociadas con una activacin prolongada de las kinasas Akt y
ERK, eventos requeridos para la induccin de protenas antiapoptticas como Mcl-1, Bcl-xl y XIAP
(Chen et al, 2005; Richardson et al, 2006; Efremov et al, 2007; Gobessi et al, 2007; Dighiero &
Hamblin, 2008; Dal-Bo et al, 2009).
Otra de las caractersticas del linfocito B de la LLC es la expresin clonal de sus Igs, a travs de
un rearreglo nico de los genes VH y VL. Si bien el fenotipo de las clulas tumorales (IgM+, IgD+,
CD5+) sugera fuertemente que las mismas deberan corresponder a una poblacin B nave de clulas
de la zona del manto sin un proceso activo de HMS, responsable de aumentar la afinidad por el
antgeno mejorando as su reconocimiento, se demostr que por lo menos el 50% de los pacientes
presentaban mutaciones en los genes variables de sus Igs (Fais et al, 1998). Si bien no est
totalmente claro el tipo de interaccin entre el microambiente y las clulas leucmicas, una
hiptesis sugerira que las mismas son ms eficientes en aquellos clones LLC con genes IGVHM, que
representaran variantes dependientes del microambiente, mientras que las formas NM seran
variantes ms estrictamente dependientes de las alteraciones genticas (Caligaris-Cappio, 2003; Zenz
et al, 2010a). En este sentido, otra de las molculas importantes en la biologa del linfocito B y de
importancia en la LLC es AID. Esta enzima de expresin exclusiva en el linfocito B, es indispensable en
los procesos de HMS y CI, y se ha encontrado sobre-expresada en pacientes LLC con genes IGVHNM
y con alta progresin tumoral (Oppezzo et al, 2003; McCarthy et al, 2003; Oppezzo et al, 2005).
Adems de sta, datos recientes proponen otras dos funciones adicionales para AID de gran
importancia en el rea tumoral y de la inmunologa: a) la capacidad de demetilar islas CpG a nivel del
ADN genmico con la consecuente implicancia en la regulacin gnica (Agarwal & Daley, 2010; Popp
et al, 2010); y b) su requerimiento para el control de clulas B autorreactivas (Kuraoka et al, 2011;Meyers et al, 2011).
Otra molcula expresada por algunas clulas leucmicas es CD38 (cluster of differentiation
38), cuya expresin se observa durante el desarrollo del linfocito B cuando las interacciones clula-
clula son cruciales as como al momento de la interaccin con otras clulas accesorias en el CG
(Malavasi et al, 1994). CD38 acta tanto como una enzima de superficie y como receptor, mediante
la unin a su ligando CD31, induciendo seales de activacin y diferenciacin en linfocitos T, B y
clulas NK (Ibrahim et al, 2003). En la LLC, su expresin predomina entre los pacientes con genes
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IGVHNM y ZAP-70+, asociados a un pronstico desfavorable. Las observaciones sobre su relevancia
pronstica permitieron determinar que tanto la proliferacin como la sobrevida de las clulas de LLC
son favorecidas a travs de interacciones entre CD38 y su ligando CD31, expresado en las clulas
accesorias presentes en el microambiente (Deaglio et al, 2005; Deaglio et al, 2007). Estas
interacciones ocurren mayoritariamente en los centros proliferantes de rganos linfoides perifricos
y/o en la MO dada la elevada expresin de CD38 en las clulas leucmicas, a diferencia de los bajos
niveles observados en linfocitos circulantes (Ghia et al, 2002; Jaksic et al, 2004; Patten et al, 2008). En
ambos compartimentos se provee accesibilidad a CD31, debido a su alta expresin en MSC, BMSC y
NLC (Burger et al, 2000; Tsukada et al, 2002; Caligaris-Cappio, 2003). A su vez, las clulas LLC CD38+
que co-expresan ZAP-70, caracterizadas por la migracin mediada por CXCL21, presentan
fosforilacin en tirosinas activadoras de la molcula ZAP-70 luego de la unin de CD38 con su ligando
(Richardson et al, 2006; Deaglio et al, 2007), siendo sta una molcula clave en la interseccin de
seales migratorias recibidas a travs del receptor de CXCL12 (Ottoson et al, 2001; Ticchioni et al,
2002; Dighiero & Hamblin, 2008; Dal-Bo et al, 2009).
1.4. Factores pronstico
Sabemos que la LLC se caracteriza por una gran heterogeneidad clnica, situacin que ha
motivado un gran inters en definir parmetros que permitan predecir el curso de la enfermedad. Alpresente existen diferentes factores pronstico de esta patologa que pueden dividirse en dos
grandes grupos: clsicos y biolgicos (Moreno & Montserrat, 2008).
Factores pronstico clsicos:
Estadios clnicos
Recuento de linfocitos en SP y morfologa linfocitaria
Tiempo de duplicacin linfocitaria
Patrn de compromiso de la MO
Existen actualmente dos sistemas de estadificacin clnicaaceptados para la LLC: el sistema
establecido por Rai et al (1975), el cual originalmente propona cinco estadios (0, I, II, III, IV) basados
en la presencia de linfocitosis, espleno y hepatomegalia, niveles de hemoglobina (Hb) y recuento
plaquetario, que fue reducido en 1987 a tres grupos de riesgo: bajo (estadio 0), intermedio (estadios
I y II) y alto (estadios III y IV) (Rai &Montserrat,1987), en tanto que el sistema de Binet et al (1981)
distingue tres estadios (A, B, C) acorde al nmero de reas linfoides involucradas y la presencia de
anemia y/o trombocitopenia. Ambos sistemas se basan en exmenes fsicos y pruebas de laboratorio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rai%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3686047http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Montserrat%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3686047http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Montserrat%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3686047http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rai%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3686047 -
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estndar. En la Tabla 2 se detallan ambas clasificaciones as como la correlacin entre las mismas.
Tabla 2: Cuadro comparativo de los estadios clnicos de Rai y de Binet para LLC
EstadioRai
(1987)
Grupos de
riesgo
Caractersticas
Clnicas
SV
(aos)
EstadioBinet
(1981)
Caractersticas ClnicasSV
(aos)
0 BajoLinfocitosis en SP y
MO>10 A
H g/dL;
P 9/L;
y hasta 2 reas
involucradas*
12
I
IIIntermedio
Linfocitosis +
Linfoadenop. +
Esplenomeg. y/o
hepatomegalia
5 B
Hb 10 g/dL;
Pq 100 x 109/L;
y 3 o ms reas
involucradas*
7
III
IVAlto
Linfocitosis +
Anemia +
Trombocitopenia
1,5 CHb < 10 g/dL;
y/o Pq < 100 x 109/L2
*reas involucradas: ndulos linfticos cervicales, axilares e inguinales, bazo e hgado; Hb: hemoglobina; SP:sangre perifrica; MO: mdula sea; SV: sobrevida; Linfocitosis: recuento de linfocitos >5x10
9/L; Anemia:
niveles de Hb
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Por otra parte, el anlisis histolgico de la biopsia de MOen la LLC, si bien no es necesario
para definir el diagnstico, permite analizar el patrn de infiltracin, su extensin y evaluar el tejido
hematopoytico, parmetros con importancia pronstica (Hallek et al, 2008). La presencia de un
patrn difuso, slido, que reemplaza al tejido hematopoytico y adiposo se asocia con citopenias y
corresponde a un estadio clnico avanzado (Viswanatha et al, 2011).Cuando ocurre compromiso de
la MO este suele ser ipotate, o % de las lulas de oige lifoide Bezares et al, 2009;
Marquez et al, 2011; Garcia-Muoz et al, 2012). Segn elpatrn de infiltracin se pueden evidenciar
dos subgrupos: los pacientes con infiltracin difusapresentan una SV media de 2-4 aos, mientras
que en aquellos con patrn no difusola SV es de 8-10 aos.
En cuanto a los factores biolgicos, los mismos comprenden una variedad de determinaciones
que permiten definir con mayor precisin la evolucin clnica de los pacientes.
Factores pronstico biolgicos:
Marcadores sricos: CD23s(CD23 soluble), 2M (2-microglobulina), TK (timidina-quinasa)
Mutaciones en IGVH
Alteraciones genmicas: citogentica convencional y FISH (Fluorescence in situ
hibridization)
Expresin de ZAP-70 y CD38
Marcadores moleculares
El uso de marcadores sricoscomo factores pronstico puede predecir SV o SLT. El CD23ses
un fragmento del antgeno de membrana CD23 con funcin de citoquina, funcionalmente relevante
en la LLC pero con valor pronstico no del todo definido. Los niveles de CD23s tendran implicancias
en la SV global y SLT en estadios tempranos de la enfermedad, encontrndose altos niveles de CD23s
asociados a mayor actividad tumoral, infiltracin medular difusa, TDL
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teraputica.
La presencia de mutaciones en los genes IGVHes considerado uno de los principales factores
pronstico en la biologa de la LLC, sobre todo en estadios tempranos. Estudios de Damle et al (1999)
y Hamblin et al (1999) mostraron que el anlisis de la presencia de mutaciones en los genes IGVH
permite dividir a la LLC en M y NM acorde a la homologa con la lnea germinal. A pesar de ser
considerado el principal factor pronstico en la biologa de la LLC, diferentes estudios han mostrado
heterogeneidad dentro de ambos grupos (Oscier et al, 2002; Tobin et al, 2002), situacin puesta de
manifiesto con el surgimiento de los nuevos marcadores moleculares que permiten discriminar
dentro de los pacientes previamente clasificados en funcin de IGVH(Heintel et al, 2005; Josefsson
et al, 2007; Kaderi et al, 2010). Este punto ser analizado ampliamente ms adelante.
Como se mencion previamente, la protenaZAP-70participa en la transduccin de seales
generadas a travs del BCR permitiendo la sobrevida y/o proliferacin del clon neoplsico (Nolz et al,
2005). Diferentes estudios retrospectivos en pacientes con LLC mostraron asociacin entre el
aumento de expresin de ZAP-70, tomando como punto de corte >20% de clulas positivas por
citometra de flujo, la ausencia de mutaciones en los genes IGVH y un pronstico desfavorable
(Rosenwald et al, 2001; Krober et al, 2006). No obstante al presente existen dificultades
metodolgicas y una amplia disparidad de resultados, siendo controversial su valor como marcador
pronstico. La expresin de CD38, protena de membrana que marca activacin y maduracin celulary participa en sealizacin, se ha encontrado asociada a morfologa linfocitaria atpica, infiltracin
medular no difusa, elevada linfocitosis en SP, grupos de riesgo por FISH, altos niveles de 2M y
pronstico adverso (Ibrahim et al, 2001; Chevallier et al, 2002; Thornton et al, 2004). Diferentes
estudios analizaron la correlacin entre CD38 y el estatus mutacional de IGVH, observndose
discordancias probablemente relacionadas con la variacin en su expresin a lo largo del curso
clnico (Damle et al, 1999; Hamblin et al, 1999; Hamblin et al, 2008). Actualmente este parmetro es
considerado un factor de valor pronstico independiente, existiendo controversias respecto de la
determinacin del punto de corte por citometra de flujo (entre 7-30% ) (Montillo et al, 2005; Moreno
& Montserrat, 2008; Boonstra et al, 2006), y presentando la desventaja de su variacin a lo largo de
la enfermedad.
Otro de los factores biolgicos importantes es el anlisis de las alteraciones genticas. En la
LLC, su estudio se ha visto dificultado por el bajo ndice mittico in-vitro de las clulas leucmicas y la
baja calidad de metafases en cultivo, an en presencia de mitgenos especficos. En los ltimos aos,
la introduccin de la tcnica de FISH como complemento de la citogentica convencional hapermitido mejorar la deteccin de rearreglos genmicos clonales en esta patologa as como evaluar
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su importancia como factores de valor pronstico independiente. Ambas tcnicas sern analizadas y
discutidas en extenso ms adelante.
Respecto a los marcadores moleculares, actualmente existe una amplia variedad en estudio,
basados en el anlisis de perfiles de expresin gnica caractersticos de la LLC, donde se destacan
genes diferencialmente expresados en pacientes con enfermedad estable (LLC M) o progresiva (LLC
NM) (Rosenwald et al, 2001; Klein et al, 2001). Entre estos cabe mencionar los niveles de expresin
de los genes: LPL(lipoprotein lipase) (Heintel et al, 2005), SEPT-10(Septin 10) (Bilban et al, 2006) y
ADAM-29 (desintegrin and metallopeptidase domain 29) (Opezzo et al, 2005), as como el cociente
de expresin LPL/ADAM29. Asimismo, un estudio reciente (Buhl et al, 2006a) mediante otra
metodologa experimental, identific un nuevo gen, CLLU-1 (chronic lymphocytic leukemia up-
regulated gene 1), sobreexpresado exclusivamente en clulas de LLC. Por otra parte, la definicin de
la LLC como una patologa caracterizada por defectos intrnsecos en la maquinaria reguladora de la
apoptosis (Gandhi et al, 2008), determin el estudio de diferentes genes relacionados con este
mecanismo, como es el caso de MCL-1 (myeloid cell leukemia sequence 1) (Pepper et al, 2008;
Veronese et al, 2008). Estos factores sern discutidos ampliamente ms adelante.
Existen asimismo otros marcadores moleculares actualmente en estudio, entre los que
encontramos el anlisis del perfil de microRNAs, una clase importante de pequeas molculas de
ARN no codificante que pueden regular la expresin de mltiples genes (Bartel, 2004; Kim, 2005;Carthew & Sontheimer, 2009). Su estudio en LLC ha permitido encontrar asociacin entre la
desregulacin en la expresin de algunas familias de miRNAs (miR-146a/b5p, miR-148a, miR-151-3p,
miR-15a, miR-155, miR-16-1, miR-181b, miR-195, miR-21, miR-29a/b/c, miR-331, miR-34a, miR-640,
entre otros) y la presencia de alteraciones genmicas asociadas a la LLC, as como su correlacin con
otros parmetros biolgicos de relevancia pronstica, particularmente el estado mutacional de IGVH,
sugiriendo su implicancia tanto en el inicio como en la progresin de la patologa (Fulci et al, 2007;
Zanette et al, 2007; Calin et al, 2008; Visone et al, 2009; Pekarsky & Croce, 2010; Visone et al, 2011).
Por otra parte, estudios de Zucchetto et al (2005) permitieron determinar la coexpresin de CD38
con la molcula de adhesin CD49d en clulas de LLC. Si bien este marcador presenta expresin
variable en estas clulas, permite discriminar dos grupos de pacientes con pronstico diferente,
aunque su empleo como factor pronstico necesita mayor profundizacin (Gattei et al, 2008).
Estudios recientes sugieren la expresin de CD69, una protena integral de membrana expresada en
clulas hematopoyticas, como un marcador de significado pronstico en LLC capaz de predecir SV,
encontrndose asociado con la expresin de CD38, CD49d, ZAP-70, estatus mutacional de IGVH,
estadios clnicos avanzados, presencia de linfadenopatias y bajo TDL, caractersticas de una
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enfermedad agresiva y una mala evolucin clnica (Dea et al, 2001; Del Poetaet al, 2012). Por
otra parte, tambin se ha considerado la determinacin de la longitud telomrica y actividad de
telomerasa (hTERT) en clulas de LLC, habindose observado que los telmeros ms cortos y el
aumento de actividad de hTERT estaban relacionados a un curso clnico desfavorable, IGVH no
mutado, sobreexpresin de ZAP-70 y CD38, y presencia de rearreglos genmicos (Damle et al, 2004;
Grabowski et al, 2005; Roos et al, 2008). Cabe resaltar que todos estos parmetros siguen siendo
actualmente tema de estudio a fin de definir su real implicancia en el inicio y la evolucin de la LLC.
Finalmente resulta importante mencionar el empleo de metodologas ms complejas que
permiten delinear aspectos ms especficos de esta patologa. Entre ellos, los estudios empleando
arrays de genoma completo y tcnicas de secuenciacin WGS (whole genome sequencing) y WES
(whole exome sequencing), han mostrado que la presencia de CNAs (copy number alterations)
(deleciones o amplificaciones de material gnico) o de disomia uniparental, as como la longitud y
nmero de CNAs en el genoma, correlacionan con progresin de la enfermedad, evolucin clonal y
enfermedad refractaria (Gunnarsson et al, 2011; Ouillette et al, 2011). Otros anlisis de WGS y WES
reportan la presencia de un amplio espectro de mutaciones en LLC, reflejando la heterogeneidad
tanto clnica como biolgica de esta patologa (Puente et al, 2011; Quesada et al, 2011; Fabbri et al,
2011; Rossi et al, 2012). Es de esperar que estos avances en las tcnicas genmicas permitirn en un
futuro prximo identificar marcadores genticos cuya presencia pueda orientar en forma ms
especfica a la eleccin del tratamiento (Clifford & Schuh, 2012).
1.5. Estudios citogenticos y citomoleculares en LLC
1.5.1. Anlisis cromosmicos en neoplasias linfoides
El anlisis de alteraciones genticas en neoplasias linfoides ha contribuido a la identificacin
de genes involucrados en la iniciacin y progresin de estas entidades y constituye una de las
herramientas ms tiles para la evaluacin de su caracterizacin biolgica. Estas alteraciones pueden
subdividirse en primarias y secundarias (Heim & Mitelman, 1995). Las anomalas primarias se
encuentran frecuentemente como cambios cariotpicos nicos asociadas a tumores especficos, y su
denominacin se refiere no slo al hecho de ser la primer aberracin observada en estas clulas, sino
que tambin reflejan un rol causal en la tumorignesis y son esenciales en el establecimiento de la
patologa. En cambio, las alteraciones secundarias, como su nombre lo indica, no se encuentran solas
y se desarrollan en clulas que poseen una alteracin primaria previa. Aunque son menos especficasque las anomalas primarias, no son al azar, pareceran tener un perfil relativamente especfico para
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cada tipo tumoral y se considera que otorgan ventajas selectivas y proliferativas a las clulas
neoplsicas (Be & Campo, 2008; Ferreira et al, 2008). El espectro de estas alteraciones es complejo
e incluye una amplia variedad de ganancias, prdidas y rearreglos cromosmicos que involucran
diferentes regiones del genoma y que implican la expresin diferencial de genes con probable
significado clnico, cuyo anlisis podra contribuir a definir formas estables o progresivas de estas
entidades, fundamentalmente en estadios tempranos de las mismas (Be & Campo, 2008; Ferreira et
al, 2008). Asimismo, en la mayora de los subtipos histolgicos de las neoplasias linfoides, el aumento
en el nmero de alteraciones secundarias se encuentra asociado al pronstico de la enfermedad,
sustentando el valor de las mismas en la evolucin tumoral (Be et al, 2004; Salaverra et al, 2007).
1.5.2. Estudios de citogentica convencional en LLC
Como se mencion previamente, el estudio de la LLC por citogentica convencional se ha
visto dificultado durante muchos aos debido al bajo ndice mittico in-vitro de las clulas
leucmicas as como a la sub-ptima calidad de las metafases obtenidas en cultivo, an en presencia
de mitgenos especficos para clulas B. En los ltimos aos se han incorporado nuevas
metodologas, que incluyen el empleo de oligonucletidos CpG (CpG-ODN) e interleukina-2 (IL-2)
(CpG-ODN/IL-2) y la estimulacin con CD40L, que han hecho factible incrementar el nmero de
metafases y el porcentaje de pacientes con alteraciones cromosmicas (Dicker et al, 2006; Mayr et
al, 2006).
Los estudios citogenticos iniciales en LLC permitieron identificar anomalas cromosmicas
clonales en aproximadamente el 40-50% de los casos, siendo la trisomia 12 la primer alteracin
recurrente detectada en esta entidad, con una incidencia que vara entre 6% y ms del 30% en
diferentes series de Europa y USA (Juliusson et al, 1990; Juliusson et al, 1991; Glassman et al, 2005;
Reddy et al, 2006). La misma constituye una alteracin secundaria, ya que en estudios combinados
de citogentica e inmunologa se observ que est presente slo en una parte de las clulas
neoplsicas (Crossen & Horn, 1987; Que et al, 1993; Athanasiadou et al, 2006). Esta anomala es la de
ms frecuente observacin por bandeo cromosmico, seguida con mucho menor incidencia por:
deleciones o traslocaciones que involucran 13q14, deleciones de 11q, 6q y 17p, y traslocaciones con
punto de ruptura en 14q32 (Haferlach et al, 2007; Cavazzini et al, 2008).
Si bien esta patologa, a diferencia de otras neoplasias linfoides a clulas B, no se encuentra
asociada a traslocaciones especficas, diferentes estudios han encontrado asociacin entre rearreglos
estructurales y/o cariotipos complejos con progresin de la enfermedad, menor SLT e inclusivemenor respuesta a la quimioterapia (Mayr et al, 2006; Shanafelt et al, 2006; Van Den Neste et al,
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2007; Rigolin et al, 2012). Asimismo, durante largo tiempo, la LLC fue considerada una enfermedad
genticamente estable. Sin embargo, trabajos posteriores han mostrado la presencia de evolucin
clonal en el 10-20% de los pacientes, fenmeno que se caracteriza por la aparicin de nuevas
alteraciones citogenticas y se asocia a un curso clnico agresivo (Chena et al, 2002; Shanafelt et al,
2006; Stilgenbauer et al, 2007; Berkova et al, 2009; Cavazzini et al, 2012; Janssens et al, 2012).
1.5.3. Estudios citomoleculares en LLC
La introduccin de las tcnicas de FISH, que combinan la citogentica con la resolucin de los
mtodos de biologa molecular, ha tenido un gran impacto en el estudio de la LLC mejorando
notablemente la deteccin de alteraciones, e incrementando al 82% el porcentaje de casos con
rearreglos genmicos (Dhner et al, 2000). Esta metodologa posee la ventaja de detectar la
presencia de alteraciones genticas tanto en metafases como sobre ncleos interfsicos
(citogentica de interfase) no siendo necesaria una poblacin celular en divisin activa, y permite
observar prdidas de material gentico en rdenes de magnitud de aproximadamente 100kb,
presentando un alto nivel de resolucin y sensibilidad. A su vez, la posibilidad de analizar ncleos
interfsicos, hace factible la determinacin precisa de alteraciones clonales en un gran nmero de
clulas, posibilitando la evaluacin de la verdadera incidencia de las mismas. Asimismo, el empleo de
diferentes tipos de sondas permite la identificacin de alteraciones cromosmicas de difcil
interpretacin, as como deleciones y amplificaciones gnicas (Popescu & Zimonjic, 1997). Estos
estudios mostraron como anomala ms frecuente la delecin 13q, seguida de la trisomia 12,
deleciones de 11q, 17p y 6q, y traslocaciones a nivel de 14q32, observndose un 18-20% de casos sin
alteraciones (Tabla 3). Estas anomalas fueron asimismo asociadas a diferentes caractersticas
morfolgicas y evolucin clnica, establecindose un modelo jerrquico de riesgo citogentico donde
las deleciones 17p y 11q constituyen las alteraciones de mayor agresividad y la delecin 13q como
nica anomala, tiene el mejor pronstico.
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Tabla 3: Frecuencia y significado clnico de los rearreglos genmicos ms frecuentes en LLC
Anomala Frecuencia(% )
Caractersticas clnicas y evolucin
Delecin 13q 35-60Morfologa tpica
Pronstico favorable si es nica anomala
Trisoma 12 15-25Morfologa atpica
Pronstico intermedio
Delecin 11q 10-20Adenopatas extensas
Pronostico desfavorable con corta SV y SLT
Delecin 17p 4-10Morfologa atpica frecuenteResistencia a quimioterapia
Pronstico desfavorable con corta SV y SLT
Delecin 6q 4-6 Morfologa atpicaEvolucin clnica poco definida
Traslocaciones 14q32 2-4Morfologa atpica
Pronstico desfavorable
Cariotipo normal 18-20 Pronstico favorable
Anomalas varias 8 Evolucin clnica variable
Los porcentajes abarcan diferentes estudios de citogentica y FISH. SV: sobrevida; SLT: sobrevida librede tratamiento (Adaptado de Montillo et al, 2005).
Las alteraciones del cromosoma 13 fueron reportadas por primera vez por Fitchett et al
(1987). Estas anomalas incluyen en su mayora a la banda 13q14 tanto en deleciones como en
translocaciones. La delecin monoallica de 13q14 (13q14x1), observada en aproximadamente el
50% de los pacientes por FISH (Dhner et al, 2000), implica la prdida de una regin critica de
aproximadamente 350 kb, siendo el locus D13S319 el ms frecuentemente afectado y, por lo tanto,
de eleccin para su anlisis. Mediante estudios de mapeo empleando YACs, diferentes autores
intentaron delimitar un rea mnima en la cual se producen la mayor parte de las deleciones,
definindose una regin de menos de 700 kb denominada MDR (minimallydeleted region)y ubicada
telomrica al gen RB-1 (retinoblastoma gene 1), entre los marcadores D13S319 y D13S25 (Kalachikov
et al, 1997; Kitamura et al, 2000; Migliazza et al, 2001). Distintos anlisis observaron la presencia de
un subgrupo de pacientes (35-45% ) en los cuales la delecin 13q14 constituye la nica alteracin
presente, confiriendo pronstico favorable con mayor SV respecto de aquellos casos con cariotipo
normal y sin alteraciones por FISH (Dhner et al, 2000; Krober et al, 2002; Shanafelt et al, 2006;
Haferlach et al, 2007). Estudios recientes han logrado detectar la presencia de un cluster de miRNAs
en la regin 13q14, constituido por los genes miR-15a y miR-16-1, y demostrado que ambos genes se
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encuentran delecionados o con una importante disminucin de su expresin en la mayora de los
pacientes con LLC, indicando la implicancia de los mismos como genes blanco de la delecin (Calin et
al, 2002; Cimmino et al, 2005; Linsley et al, 2007; Raveche et al, 2007; Calin et al, 2008; Klein et al,
2010). Dichos miRNAs actan regulando negativamente la expresin de genes involucrados en el
control del ciclo celular y la apoptosis como: BCL-2, MCL-1, ETS-1 yJUN (Cimmino et al, 2005; Calin
et al, 2005; Calin et al, 2007; Fulci et al, 2007; Ouillette et al, 2008). De todas maneras, la presencia
de delecin 13q14 no siempre se encuentra acompaada por sub-expresin de estos miR15a/miR16-
1, reflejando la heterogeneidad caracterstica de la patologa (Fulci et al, 2007; Ouillette et al, 2008).
Asimismo, se pudo observar que un subgrupo de pacientes (5-15% ) puede presentar prdida de los
dos alelos (13q14x2) o tener los dos clones concomitantes (13q14x1/13q14x2). Sin embargo, las
implicancias pronsticas de la delecin biallica de 13q14 son an controversiales. Estudios iniciales
de nuestro grupo (Chena et al, 2008) y otros autores (Hernandez et al, 2009) sugieren una mayor
agresividad clnica en pacientes portadores de esta alteracin, con menor SLT, menor TDL y estadios
Rai avanzados, probablemente como consecuencia de evolucin clonal y/o debido a la completa
inactivacin de esta regin crtica por mecanismos ms complejos, mientras que otros estudios no
encuentran diferencias en el pronstico de ambos grupos de pacientes (13q14x1 vs. 13q14x2) (Van
Dyke et al, 2010; Garg et al, 2012). Asimismo, reportes recientes sugieren la importancia de la
determinacin del porcentaje de clulas leucmicas portadoras de esta anomala, indicando que
aquellos clones con un porcentaje de delecin 13q14 mayor al 80% poseen un pronstico
desfavorable, independientemente de encontrarse como nica anomala (Hernandez et al, 2009; Van
Dyke et al, 2010). A su vez, Parker et al (2011) han observado que la amplitud de la regin de
delecin tambin tendra implicancias pronsticas, situacin relacionada a que grandes prdidas
estaran afectando a mltiples genes.
En cuanto a la trisoma 12, la utilizacin de sondas especficas para la regin centromrica de
este cromosoma, permite detectar esta alteracin por FISH sobre ncleos en interfase, siendo de
mucha utilidad en los casos con escasas clulas en divisin o con clones de baja expresin. Con estametodologa su deteccin se encuentra entre un 15-25% de los casos (Anastasi et al, 1992; Escudier
et al, 1993; Coignet et al, 1993; Dhner et al, 2000; Aoun et al, 2004; Glassman et al, 2005; Chena et
al, 2008). Si bien se desconoce el rol patognico o el mecanismo por el cual esta trisoma puede
contribuir a la transformacin maligna o a la progresin de la enfermedad, diferentes estudios con
metodologas moleculares indican que el cromosoma 12 extra se originara a partir de una
duplicacin de uno de los cromosomas 12 con retencin del otro homlogo (Mecucci et al, 1988;
Einhorn et al, 1989). Como se mencion previamente, anlisis moleculares permitieron identificar el
gen CLLU1 (Buhl et al, 2006a),ubicado a nivel de 12q22, como el primer gen especficamente sobre-
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expresado en clulas de LLC. Algunos estudios muestran que la trisoma 12 se encuentra asociada
con morfologa atpica de la enfermedad, incremento en la proporcin de prolinfocitos (CLL/PL),
mayor actividad proliferativa y un curso clnico ms agresivo (Knauf et al, 1995; Matutes, 1996;
Tefferi et al, 1997; Mittal et al, 2007; AbdelSalam et al, 2008), mientras que otros reportes no
encuentran asociacin entre esta alteracin y la morfologa, ni le asignan significado pronstico
(Geisler et al, 1997; Stilgenbauer et al, 2002). Por el momento, la presencia de trisomia 12 es
considerada de pronstico intermedio (Haferlach et al, 2007; Pfeifer et al, 2007), con una sobrevida
media de 7-8 aos (Brynes et al, 1995; Athanasiadou et al, 2006).
El 10-20% de los pacientes con LLC pueden presentar delecin de 11q, alteracin que con
frecuencia es de aparicin tarda y se encuentra acompaada por otras anomalas cromosmicas,
reflejando evolucin cariotpica. El grupo britnico de Neilson et al (1997) confirm la observacin
publicada por Fegan et al (1995), donde las deleciones en el brazo largo del cromosoma 11,
particularmente en 11q23, identifican a un grupo de pacientes con pronstico desfavorable,
enfermedad ms agresiva y SV ms corta que aquellos casos con cariotipo normal. Esta delecin se
observa ms frecuentemente en individuos menores de 55 aos y est asociada a un cuadro clnico
con extensas adenopatas, enfermedad progresiva, corta SV global y SLT (Dhner et al, 1997;
Starostik et al, 1998). El grupo alemn de Dhner et al (1997) mape la delecin 11q por FISH con
clones YACs, definiendo una regin critica de 2-3 Mb para esta anomala entre 11q22.3-q23.1. Esta
regin contiene varios genes entre los que se encuentra el genATM(ataxia telangiectasia mutated)
(11q22.3), considerado crtico en esta alteracin. Este gen codifica para una protena serina-treonina
quinasa, cuya actividad es inducida por roturas de doble cadena en el ADN. ATM protege la
integridad del genoma induciendo la detencin del ciclo celular, mantiene la estabilidad telomrica,
activa los mecanismos de reparacin del ADN y regula la apoptosis mediada por TP53 (tumor protein
p53) (Kastan & Lim, 2000). La disminucin de la expresin de ATMdetermina prdida del control del
ciclo celular y disfuncin de TP53(Bullrich et al, 1999; Boultwood et al, 2001; Stankovic et al, 2002;
Austen et al, 2005). Tambin se detect la existencia de un subgrupo de pacientes con delecin de11q22.3 y con presencia de una mutacin en el alelo de ATMrestante, lo cual lleva a la inactivacin
total del gen, situacin asociada a expansin clonal y progresin de la enfermedad (Austen et al,
2007).
Sin duda, las deleciones de 17p13.1, que implican la prdida del gen TP53, constituyen el
factor pronstico ms significativo en LLC, demostrado en estudios multivariados tanto prospectivos
como retrospectivos y en estadios iniciales y avanzados de la enfermedad. El gen TP53participa en el
control del crecimiento celular, la diferenciacin y la muerte celular programada siendo uno de los
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=AbdelSalam%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18702872http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=AbdelSalam%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18702872 -
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genes ms frecuentemente mutados en cnceres humanos. TP53 regula los mecanismos de estrs
extracelular, activacin oncognica y dao al ADN, y permite que la clula reaccione adecuadamente
frente a estos estmulos dada su participacin en el control del crecimiento celular, la diferenciacin
y la apoptosis, siendo uno de los genes ms frecuentemente mutados en cnceres humanos. La
incidencia de las alteraciones de TP53vara con el estadio de la enfermedad y las tcnicas utilizadas
para su estudio. En la LLC, las alteraciones de TP53ocurren en aproximadamente el 4% -10% de los
casos al diagnstico, alcanzando al 40-50% en pacientes refractarios, siendo consideradas un
importante mecanismo de resistencia al tratamiento (Shanafelt et al, 2006; Shanafelt et al, 2008;
Stilgenbauer et al, 2007; Zenz et al, 2008; Dicker et al, 2009). Estudios recientes han permitido
determinar que la resistencia al tratamiento en pacientes con delecin 17p13 se encuentra
relacionada con el porcentaje de clulas portadoras de esta alteracin. Mientras que aquellos clones
con un porcentaje de delecin mayor al 20% se relacionan con un pronstico desfavorable y
resistencia al tratamiento, los pacientes con delecin entre 5-20% presentan tasas de respuesta y SV
similar a los casos que no tienen esta anomala (Catovsky et al, 2007; Tam et al, 2009). A su vez,
alrededor del 80% de los pacientes con delecin de TP53poseen una mutacin en el alelo restante,
llevando a la inactivacin completa del gen, en tanto que slo el 4,5% de los casos tiene mutacin
como nico evento (Zenz et al, 2008; Zenz et al, 2010b). El anlisis de la SV en pacientes con
delecin/mutacin, mutacin sola o delecin sola ha mostrado ser muy corta en todos los grupos
(Zenz et al, 2008; Dicker et al, 2009; Rossi et al, 2009), indicando la importancia de su estudio en esta
patologa (Oscier, 1994; Catovsky, 1997; Gonzalez et al, 2011).
Las alteraciones de 6qson encontradas en el 4-6% de los casos (Oscier, 1999). Los puntos de
ruptura se presentan principalmente en 6q15, 6q21 y 6q25, siendo en su mayora deleciones.
Algunos estudios han descripto la presencia de deleciones en 6q como una anomala secundaria,
asociada a enfermedad progresiva, con alto recuento linfocitario, morfologa atpica, CD38+ y
presencia de linfadenopatas, habindose sugerido tambin que esta alteracin podra representar
una entidad citogentica y clnico-biolgica con un perfil hematolgico caracterstico, asignndole un
pronstico intermedio (Stilgenbauer et al, 1999; Stilgenbauer et al, 2002; Cneo et al, 2004; Wang et
al, 2011), no siendo claro an su real significado clnico.
Otras alteraciones de inters clnico son las deleciones y translocaciones que involucran a
14q observadas en el 10% de los pacientes (Dhner et al, 2000; Dicker et al, 2006). El valor
pronstico de las anomalas que comprometen a 14q es de difcil evaluacin debido a que estos
cambios suelen ocurrir en cariotipos complejos. El empleo de tcnicas moleculares y citomolecularesha permitido detectar translocaciones que involucran la banda 14q32, lugar donde se ubica el gen de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21281237http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21281237 -
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la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IGH@), crticas en la patognesis de diferentes sndromes
linfoproliferativos, pero de muy baja frecuencia en la LLC (2-4% ). Entre ellas encontramos la
t(14;18)(q32;q21) y sus variantes en la que participa el gen BCL-2observada en 1-2% de los casos,
usualete o puto de uptua haia del ge (Adachi et al, 1990; Nguyen-Khac et al, 2011).
Trabajos recientes sugieren que estas translocaciones representan una de las ms frecuentes
alteraciones adquiridas durante el proceso de evolucin clonal e identifican a un subgrupo de
pacientes con pronstico adverso (Cavazzini et al, 2008; Cavazzini et al, 2012) en tanto que otros
autores no le confieren significado clnico (Put et al, 2009). La t(14;19)(q32;q13) que involucra al gen
BCL-3, se la detecta solo en el 0,5% de los pacientes, presenta pronstico desfavorable y podra
identificar a un subgrupo de pacientes con LLC con caractersticas clnico-patolgicas y genticas
particulares (Huh et al, 2011; Nguyen-Khac et al, 2011). Aparte de los mencionados, tambin pueden
involucrarse en muy baja frecuencia otros genes como: BCL11A (2p12), CCND3 (6p21) y CDK6 (7q21),
encontrndose todas estas alteraciones asociadas a un pronstico desfavorable.
Otros tipos de anomalas halladas son: +3, +8, +18 y +19 observadas en menos del 5 % de los
pacientes (Dhner et al, 2000; Aoun et al, 2004; Sellmann et al, 2007). Estas alteraciones no poseen
implicancias pronsticas por s mismas. El 15% de los pacientes que desarrollan alteraciones
cromosmicas adicionales, no presentan cambios en los parmetros clnicos o de laboratorio. El 8% -
10% de las LLC citogenticamente anormales no posee ninguno de los rearreglos nombrados,
presentando en su mayora cariotipos complejos o translocaciones poco frecuentes, indicadores de
un peor pronstico (Mayret al, 2006; Dicker et al, 2006).
En resumen, la combinacin de los datos citogenticos y citomoleculares en LLC, permite la
clasificacin de la LLC en diferentes grupos de riesgo citogentico basados en la presencia de los
distintos rearreglos genmicos (Tabla 4):
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Tabla 4: Grupos de riesgo citogentico
Grupospronstico
Rearreglos genmicos
Desfavorable
del(17p13) (>20% )
del (11q22)cariotipos complejos con 3 o ms alteraciones
Intermedio
trisoma 12del(6q)13q14x2 (controvertido)cariotipos con 1 o 2 alteraciones
Favorable13q14x1 como nica anomala (
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unin de estos segmentos, la introduccin de mutaciones somticas a travs del proceso de HMS en
el CG, genera una gran variedad en el repertorio de BCRs. Estas regiones reciben el nombre de CDRs
(complementarity determining regions), siendo la tercer regin hipervariable en la cadena pesada
(HCDR3) el producto de la unin V-D-J y la de mayor importancia en la generacin de diversidad y
especificidad antignica en las Igs (Pristch et al, 1999) (Figura 3a).
Aunque la definicin de LLC M y NM recae en la presencia/ausencia de mutaciones somticas
clonales en las clulas leucmicas de un determinado paciente, tambin se han reportado
divergencias dentro de un mismo clon (Gurrieri et al, 2002). Sin embargo, los niveles de
hipermutaciones activas son en general bajos y esta divergencia intraclonal puede deberse a la
estimulacin antignica que induce activacin de la enzima AID. Se ha visto expresin de AID en un
subgrupo de casos de LLC con genes IGVHNM y CI activa (Oppezzo et al, 2003), los cuales se asocian
con progresin, presencia de rearreglos genmicos y menor SV (Albesiano et al, 2003; Heintel et al,
2004; Palacios et al, 2010; Hancer et al, 2011).
Figura 3: A) Estructura de una molcula de inmunoglobulina (Ig), compuesta por dos cadenas polipeptdicasidnticas pesadas (H; heavy) y dos livianas (L; light). Los primeros 110aa aproximadamente,constituyen la regin variable (V) requerida para el reconocimiento antignico. La regin constante (C)posee actividad biolgica. Se muestra la estructura gnica codificante de la regin VH. Las regionesCDRs (complementarity-determinig regions) poseen la mayor diversidad, involucradas en el
reconocimiento antignico, siendo la regin HCDR3 la de mayor variabilidad. D: diversidad; J: unin(adaptado de Walsh & Rosenquist, 2005). B) Localizacin cromosmica del locus IGH@ humano en elbrazo largo del cromosoma 14 (14q32.33). El locus contiene los diferentes segmentos VH, DH, JH ysegmentos constantes (C); con un total de 170-176 genes en un rea aproximada de 1250Kb. Elrepertorio funcional es de aproximadamente 76-84 genes por genoma haploide (Lefranc, 2001).
Tal como mencionamos previamente, el locus de genes IGH@se encuentra localizado a nivel
de 14q32.33, en un rea aproximada de 1250Kb, y contiene los diferentes segmentos V, D y J, sujetos
a reordenamientos en el proceso de desarrollo y diferenciacin linfoide. Existen entre 123 y 129
segmentos VH, 26 segmentos DHy 6 segmentosJHorganizados en sentido desde el teleo
CDR1 CDR2 CDR3
A) B)
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hacia la regin centromrica (Lefranc, 2001) (Figura 3b). Entre ellos, existen 42-55 segmentos VH
capaces de producir rearreglos funcionales, agrupados en 7 familias (VH1-VH7) (Figura 4). La familia
VH3es la ms extensa seguida de VH4 y VH1, con 64, 32 y 19 miembros, respectivamente. Por el
contrario, las familias VH2(4 miembros), VH5(2), VH6y VH7(1 cada una) (Duke et al, 2003), son de
tamao reducido.A su vez, en clulas B normales, los segmentos ms frecuentemente utilizados en
los diferentes rearreglos son los pertenecientes a las familias VH3(30-50% ), VH4(20-30% ) y VH1(10-
20% ) (Pritsch et al, 1999; Duke et al, 2003; Ghia et al, 2005; Mauerer et al, 2005).
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Figura 4: Representacin del locus IGH@ humano en 14q32.33, mostrando los diferentes segmentos de cadafamilia VH. Los nmeros romanos designan pseudogenes, no asignados a subgrupos de genesfuncionales (Lefranc, 2001).
En particular, el repertorio IGVH encontrado en LLC es sesgado, siendo los genes
pertenecientes a las familias VH3>VH1>VH4los ms frecuentemente hallados en los pacientes. A su
vez, se ha visto que las mutaciones somticas no se distribuyen de manera uniforme entre las
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diferentes familias, observndose mayor proporcin de VH3y VH4entre los casos M y de VH1entre
los NM (Fais et al, 1998; Mauerer et al, 2005). Esta jerarqua en el uso de las diferentes familias
puede reflejar diferencias en el tipo de Ag involucrado en la transformacin leucmica y/o en el
estadio de maduracin en el cual se llev a cabo la misma (Stilgenbauer et al, 2002). Asimismo,
adems de la sobre-representacin de VH3 y VH4 entre los casos M y de VH1en los NM, existen
diferencias entre ambos subgrupos en el uso de los segmentosJHy DH, as como en la estructura de
la regin HCDR3, particularmente en su longitud.
El anlisis de estas secuencias permiti tambin observar un repertorio sesgado en el uso de
genes VH en los clones LLC, en comparacin con clulas B normales, hallndose una mayor
representacin de los segmentos IGVH1-69, IGVH4-34, IGVH3-23 e IGVH3-21 con frecuencias que
varan entre las diferentes cohortes analizadas (Bomben et al, 2007; Marincevic et al, 2010).
Asimismo, distintos estudios revelaron el uso preferencial de los segmentos pertenecientes a la
familia VH1, siendo VH1-69el mayormente utilizado en LLC (12-21% ) en comparacin con clulas B
normales (1,6% ), habindose asociado el uso de este segmento casi exclusivamente a pacientes NM
(Potter et al, 2003; Murray et al, 2008). Por otra parte, el gen IGVH3-21es considerado un factor
pronstico desfavorable independientemente del estado mutacional, explicando en parte la
presencia de pacientes M con mala evolucin clnica (Tobin et al, 2002; Lin et al, 2003; Ghia et al,
2005).
A su vez, se ha observado expresin diferencial de algunos genes IGVHen diferentes regiones
geogrficas. Mientras en pases occidentales, los segmentos ms frecuentemente utilizados son
IGHV1-69, IGHV3-7, IGHV4-34e IGHV3-23 (Hamblin et al, 1999; Potter et al, 2003; Donisi et al, 2006;
Bomben et al, 2007; Bomben et al, 2009), se ha detectado una frecuencia muy baja de casos IGVH1-
69en pases asiticos (Koiso et al, 2006; Irons et al, 2009; Hojjat-Farsangi et al, 2009). Asimismo, se
ha encontrado una mayor representacin de IGHV3-21 en pases del norte de Europa en
comparacin con pases de la regin Mediterrnea (Ghia et al, 2008; Cahill et al, 2012). Por el
contrario, existe muy poca informacin sobre la distribucin de genes IGVHen pacientes con LLC de
Amrica Latina (Pimentel et al, 2008, Bianchi et al, 2010, Marquez et al, 2012).
Como se mencion anteriormente, el segmento HCDR3 es creado de novo a travs del
proceso de recombinacin VDJ, a diferencia de los segmentos HCDR1 y 2, los cuales son codificados
ntegramente por el gen IGVHcorrespondiente (Maizels, 2005). Diferentes trabajos han observado la
presencia de rearreglos IGH e IGL especficos y no al azar en LLC tanto M como NM, los cuales
posea BCRs o seueias HCDR asi idtias estereotipadas Ghiotto et al, 2004; Widhopfet al, 2004; Messmer et al, 2004; Tobin et al, 2004; Stamatopoulos et al, 2007). La expresin de estos
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receptores estereotipados ha sido reportada ms frecuentemente en casos con IGVH NM (Messmer
et al, 2004; Stamatopoulos et al, 2007) que presentan caractersticas moleculares y clnicas
determinadas (Murray et al, 2008). En este contexto, estudios previos demostraron la utilizacin
sesgada del segmento VH1-69 en casos NM, en combinacin con los genes DH3-3 y JH6, y con
secuencias aminoacdicas HCDR3 ms largas y altamente conservadas (Widhopf & Kipps, 2001;
Potter et al, 2003). Estas similitudes halladas entre los BCR de pacientes no relacionados, as como
geogrficamente distantes, estaran indicando la implicancia de un componente antignico en la
patognesis de la LLC, ya sea a travs de Ag especficos o epitopes estructuralmente similares
(Mauerer et al, 2005; Stamatopoulos et al, 2007). Sin embargo, a pesar de las asociaciones descriptas
entre receptores estereotipados, la presencia de alteraciones genmicas (Athanasiadou et al, 2008;
Marincevic et al, 2010; Maura et al, 2011) y caractersticas clnicas especficas (Ghia et al, 2005;
Stamatopulos et al, 2007; Bomben et al, 2007; Rossi et al, 2009), este campo es an motivo de
amplio estudio para lograr definir su significado en el pronstico de la patologa.
1.6.2. Nuevos marcadores moleculares
El anlisis de los perfiles de expresin gnica ha introducido un nuevo aspecto en la
comprensin de la biologa y el comportamiento clnico de la LLC (Rosenwald et al, 2001; Klein et al,
2001; Vasconcelos et al, 2005), permitiendo la identificacin de numerosos genes con potencial valorpronstico y/o teraputico. La sobreexpresin especfica de stos en las clulas leucmicas, su baja o
nula expresin en clulas B normales as como los resultados similares en linfocitos totales y
purificados de LLC, los ubican como parmetros de inters para el estudio de esta patologa. Entre
ellos encontramos los genes LPL, SEPT-10, MCL-1, ADAM-29y CLLU-1(Opezzo et al, 2005; Bilban et
al, 2006; Buhl et al, 2006a; Van Bockstaele et al, 2007; Pepper et al, 2008; Veronese et al, 2008).
El gen que codifica para la protena LPL se ubica en 8p22, en un rea aproximada de 30Kb,
posee 10 exones que dan lugar a varias isoformas proteicas, mediante el mecanismo de exon-
shuffling, ua isla CpG CpG e la egi pootoa uiada e el UTR Figua 5) (Holmes et
al, 2011).
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Figura 5: Estructura del gen LPL humano. Se mues