tendencias metodológicas en el análisis de residuos....para tener una mayor versatilidad en modos...

Tendencias metodológicas en el análisis de residuos.

Nuevas herramientas para el aumento de la productividad y la confianza en los resultados

Conferencia Web

Jose Juan RiveroEspecialistas de producto

Agilent Technologies, Spain

25 de Septiembre de 2020

Indice

Introducción

Aumento de productividad. Acelerando el análisis de residuos

Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución

Ventajas de la Alta Resolución

• Confirmación de falsos positivos

• Identificación de compuestos desconocidos

Situación actual. Reto analítico

Niveles;

• 0.001-10 mg/Kg

Múltiples matrices

FDA

EPA

EU

Diversidad química:

• Compuestos apolares, polares, volátiles, no volátiles

Orígenes diferentes:

• Naturales

• Procesos industriales o de transformación

• Tratamientos para combatir las plagas

Múltiples técnicas:

• Cromatografía de gases/Líquidos

Desarrollo de estrategias eficaces mediante análisis conjunto por GC/MS/MS y LC/MS/MS y que superen las limitaciones actuales de muchas normativas(FDA/EPA/EU)

• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas

• Aumentar el número de residuos analizados

• Acortar los tiempos de análisis

• Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES

Desarrollo de estrategias eficaces para determinación de residuos no target o desconocidos mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF

• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas

• Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos.

• Realizar screening no dirigidos.

Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente

• Revisión rápida y automática de resultados e informes: Más datos con menos recursos

• Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales

Tendencias en las estrategias del análisis de trazas de residuos

• El Fipronil es ilegal para la producción de alimentación

humana.

• Millones de huevos y productos derivados contaminados.

• Se reportaron productos contaminados en toda Europa a

excepción de dos países.

• Los huevos contaminados posiblemente se habían

comercializado durante un año.

https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/brochures-leaflets/fipronil-eggs-factsheet-december-2017

https://www.sgs.com/en/news/2017/10/fipronil-in-eggs-another-food-issue-in-europe

Huevos contaminados con Fipronil en 2017 en Europa

https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/brochures-leaflets/fipronil-eggs-factsheet-december-2017

https://www.sgs.com/en/news/2017/10/fipronil-in-eggs-another-food-issue-in-europe

Detectores selectivos

ECD/NCD/FID

Confirmación

con Masas

Cuantificación y Confirmación

con Masas/Masas

Aumento productividad, Inicio del LCMS

Mayor numero de materias activas

Aumento productividad. Popularización de los sistemas LCQQQ

Mayor numero de materias activas y acorte tiempos de análisis

Aumento sensibilidad manteniendo un mayor numero de materias activas y acorte tiempos de análisis

25 materias activas 1 hora 2 inyecciones

25 materias activas 1 hora 1 inyección (ppb altas)

60 materias activas 1 hora 1 inyección (±25 ppb)

125 materias activas 1 hora 1 inyección (±25 ppb)

500 materias activas 20 min (±5 ppb)

700 materias activas 20 min (±2 ppb)

80’s

90’s

2005

2010

Hoy dia

Documento SANTEDirectrices de la comisión Europea (Actual SANTE/12682/2019)

Indice

Introducción



Ventajas de la Alta Resolución



Analizador P&EP 4.0GC/MS/MS Pesticides and Environmental Pollutants Analyzer

con ~1100 compuestos y ~8500 transiciones optimizadas incluyendo más de 710 pesticidas y productos de degradación, y otros contaminantes medioambientales.

Base de datos MRM

que facilita la creación de métodos de adquisición y cuantificación dMRM

GUI

separación con una mayor grado de confianza en la identificación y cuantificación de picos (CF y CP)

RetentionTime Locked

para tener una mayor versatilidad en modos de inyección (LVI)

Inyector Multimode

Backflush para obtener ciclos más rápidos de análisis y reducción de los mantenimientos del sistema

Tecnología de flujo capilar

Analizador de Pesticidas y Contaminantes ambientales 4.0

Ejemplo 7010: ~250 pesticidas en 20 min(0,5µl iny)

App Note 5991-5507EN

1ppb inyectada

Mejorando y construyendo sobre plataformas confiables

Horno de calentamiento por convención Horno de calentamiento directo

Guard chip Desechable

Columnas sin corte

Calentamiento directo

Modular Intuvo flow chips

Innovando en la productividad de GCUna nueva forma de hacer GC

Conexiones en clic y libres de férrulas

Cambios rápidos de columna

No cortes de columnas

¿Hasta donde se pueden acortar las metódicas?Intuvo/7010. (203 plaguicidas)

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-017-0723-x

75 componentes coeluidos



https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-017-0723-x

https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-017-0723-x

Separación pares críticos e interferencias

Mismas transiciones ciproconazol y

clorobencilato, buena separación

Interferencia de matriz mejor resuelta

con rampa más rápida

Pocos puntos

Datos de Validación 12.4 min

2-Phenylphenol (Rt = 6.36 min) Chlorpyrifos-methyl (Rt = 9.14 min)

Antes de cambiar guard-chip

Después de cambiar guard-chip

No se necesita ajustar el Rt (Relock)

GC-Intuvo: Ventajas

Fenbuconazol (Rt = 16.41 min) Fludioxonil (Rt = 11.61 min)

Antes de cambiar guard-chip

Después de cambiar guard-chip

Mejora de la forma de pico

GC-Intuvo: Ventajas

Evolución de la columna

GC-Intuvo: Ventajas

Columna y Guard-chip nuevosColumna y Guard-chip

(500 inyecciones)Columna (500 inyecciones)

y Guard-chip nuevo

Mantenimiento más fácil y rápido cambiando guard-chip y columnas

GC-Intuvo: Ventajas

GC-7890 (antes de cortar columna) GC-Intuvo (antes de cambiar guard-chip)

Fludioxonil


GC-Intuvo: Ventajas

Mantenimiento 7890 GC GC-Intuvo # Inyecciones

Cambiar Septum 1 min 1 min 250

Cambiar Liner 1 min 1 min 100

Cortar columna vs Cambiar

guard-chip15 min 2 min 500

Ajustar Rt 20+5 min 0 min 500/0

Cambiar columnas 20 min + vacío (2 h) 2 min 2500/2500

Tiempo total (min) 63 min + 2 h 6 min


GC-Intuvo: Ventajas

Dynamic MRMAdquisicion de datos más eficiente

Más fácil de ver resultados cromatográficos en MassHunter Análisis Cualitativo

TS Cromatogram dMRM CromatogramaMiel ecológica

Dynamic MRM (dMRM)Un modo más intuitivo de usar MS

Más fácil de crear y editar métodos

• Añadir componentes es sencillo

• No trabaja con segmentos de tiempo

Métodos más eficientes

• optimiza los Dwell time

• Mejora la respuesta

Completamente automatizado

• Simle y sencillo

Dynamic MRM (dMRM)Interface de usuario

Tabla de compuestosVer todos los compuestos a la vez y

ordenar según sea necesario

Seleccione la

velocidad de datos

deseada aquí ...

…dwell times se ajusta

automáticamente aquí.

Encuentre y corrija fácilmente

las zonas "congestionadas"

JetClean Self-Cleaning Ion Source

• Respuesta constante durante meses o incluso años

• Reduce o elimina el tiempo de inactividad para la limpieza manual de fuentes

Fuente de iones autolimpiable JetCleanResultados cromatográficos de 2,5 ppb en miel ecológica

Sin

JetC

lean

Con J

etC

lean

Flu

jo=

0.1

5 m

L/m

inDBCP

MW 234

RT: 4.503min

RT: 4.636min

Parathion-methylMW 451

RT: 18.113min

RT: 18.091min

Flucythrinate-1MW 451

RT: 33.798min

RT: 33.776min

En modo de limpieza en línea:

• Mejora de la forma de los picos y de la línea de base para compuestos pesados que eluyen más tarde.

• Comparable% RSDs

• Sólo se observó una pequeña reducción en la respuesta máxima

Indice

Introducción



Ventajas de la Alta Resolución:



Full Scan o Análisis Dirigido (Target)

Análisis por Espectrometría de Masas

La medida genera un espectro. La

Resolución es la anchura espectral

de cada especie transmitida.

Solo se transmite la estrecha ventana

espectral escogida.

La Resolución es la anchura de la ventana

escogida.

HRMS QTOFTradicionalmente

Triple Cuadrupolo

NECESIDAD y PROBLEMATICAOBJETIVO

Tecnica de Screening: Consideraciones

Obtener toda la información disponible de la muestra

Mínima manipulación de la muestra

Factores inherentes a la química de los compuestos (LC/GC)

Factores inherentes a la detección

Limitaciones de sensibilidad

Multiples familias de compuestos

Buena seleccion de la preparacion de la muestra

Información complementaria entre técnicas separativas

Plataformas de QQQ vs QTOF

Correcta selección de la técnica y

de preparación de la muestra

Estrategias de trabajo TRADICIONALES

Análisis de conocidos

en alcance

Análisis de desconocidosAnálisis de conocidos

fuera alcance

Análisis no

dirigidos

Análisis

dirigidos

Estrategias de trabajo

* Análisis de conocidos

y sospechosos

• Adquisición NO dirigida

Full Scan

* Procesado dirigido

Patrones / Librerías

Análisis Dirigido *

Screening Cuantitativo Screening Cualitativo

Screening Cuantitativo

y Cualitativo

Single/Triple Cuadrupolo Single/HRMS QTOFHRMS QTOF

* Dirigido por el contenido de la librería

* Análisis de conocidos

en alcance

• Adquisición dirigida

MRM


Patrones

Análisis dirigido

* Análisis de sospechosos

(conocidos, fuera de

alcance)

*Adquisición NO dirigida

Full Scan


Librerías

Análisis dirigido*

Estrategias de trabajo

Capacidad de Análisis Retrospectivo

Facilidad de inclusión de nuevos compuestos sin

desarrollo

Capacidad de ver “Desconocidos”, ¿Qué

más hay en mi muestra?

Ventajas Adicionales

Tecnica de Screening

• Si es posible, pero…

• Alcanzar la mayor cantidad de analitos disponibles – LIMITACION QQQ

• Uso de librerías MSMS – INTERFERENCIAS MATRICIALES

• Tecnica de deconvolución – SOLO DISPONIBLE FULL SCAN

• Necesidad de existencia de estándares – METABOLITOS o DEGRADACIONES

• Alta selectividad gracias a la alta resolución

• Interferencias matriciales se minimizan

• Completas bases de datos en masa exacta

• GC vs LC: Información estructural del EI vs Pattern Isotópico. >>> Alta fiabilidad

• Complementariedad de ambas técnicas

• Análisis retrospectivo

• Volumen de Datos : Software de procesado Rápido y Fiable.

HRMS QTOF

Triple Cuadrupolo

Técnicas de Screening

• Menor manipulación de la muestra:

• Inyección directa, o

• Extracción lo mas simple posible para no modificar la muestra

• Capacidad de extracción genérica

• Inyección en sistemas de alta resolución debido a la gran selectividad de la masa exacta

Requerimientos

HRMS QTOF

Análisis por Espectrometría de MasasFull Scan o Análisis Dirigido (Target)

(Q-)TOFTriple Cuadrupolo

Beneficios:

- Alta resolución espectral

- Exactitud de masas de ppm

- Capacidad de Análisis retrospectivo

Beneficios:

- Estándar en cuantificación

- La más alta Sensibilidad

- Excelente intervalo dinámico

Limitaciones:

- Baja resolución (unidad) espectral

- Baja exactitud de masas

- SIN capacidad de Análisis retrospectivo

Limitaciones:

- Sensibilidad hoy comparable a los QQQ.

- Intervalo dinámico comparable.

SANTE/11945/2015 (actual SANTE/12682/2019)

Criterio:

• Full Scan

• 2 ions @ 5 ppm

• Pico “Real”

• Co-elucion

• Confirmacion con standard

https://www.eurl-pesticides.eu/userfiles/file/EurlALL/AqcGuidance_SANTE_2019_12682.pdf

Screening de Pesticidas mediante GCQTOF

• Sistema GC8890B + QTOF 7250

• Backflush

• RTL

• MassHunter Analysis Screener

• PCDL (Espectros en HR y RTL)

Pesticide Screener

Nota de aplicación: 5991-5894EN

7250 GC-Q-TOF-MS

▪ Modo de Inyeccion: Solvent Vent (EtAc)

Ultra-inert Splitless inlet liner, with a glass wool frit

▪ Columnas: 2 x HP5MS-Inerte 15mx250µmx0.25µm

Condiciones del GC

▪ Tiempo de analisis: 20 min

▪ Tiempo de Post run (backflush): 3 min (310 ºC)

▪ Linea de transferencia: 280ºC

▪ RTL (Clorpirifos metil)

▪ Flujo constante 1ml/min

Condiciones del MS

▪ Resolucion de masas: 40.000 FWHM (m/z 263)

▪ Tipo de Ionizacion: EI (70 eV)

▪ Temp. Fuente: 260 ºC

▪ Modo de Adquision: Full Scan m/z rango 60-500 amu

▪ Veloc. Acquisition: 3 spectra/s (333.33 ms/spectrum)

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5 10 15 20 25

Te

mp

(ºC

)

Run time (min)

Programa de horno

Condiciones Experimentales

Procesado de datos para extraer el máximo de información de “profile data” para un análisis más rápido

Quant 10: Conversión de Datos SureMass

Datos

Profile

Conversión de

Datos SureMassDatos

SureMass

– 3-5 min por muestra

– Ocurre automáticamente (*)

tras la adquisición

Óptimo en exactitud de masa

Históricamente más lento en

el procesado

Mejora en la velocidad de

procesado x 10

Exactitud de Masa a alta

abundancia

(*) Para el G6546. También compatible con

modelos anteriores de QTOF con un macro

post-adquisición

25/9/2020

Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Patrones y SospechososDesarrollo del Método

Preparación Muestra

• Sospechosos y patrones

Adquisición

• Full Scan GC

• Modo Q-RAI

• Modo All Ions

Crear Método desde PCDL

• Establecer Niveles de Calibración y parámetros de alarma

Analizar el Batch con Screener Tool

• Rápido análisis

• Fácil Informe

41

25/9/2020

Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Patrones y SospechososDesarrollo del Método

Analizar el Batchcon Screener Tool


• Fácil Informe

42

25/9/2020

Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Análisis en Rutina

Preparación Muestra

• Sospechosos y patrones

Adquisición

• GC Full SCan

• Modo Q-RAI

• Modo All Ions

Analizar el Batch con Screener Tool


• Fácil Informe

43

Indice

Introducción

Consideraciones en la preparación de la muestra


Ventajas de la Alta Resolución:



GC-QqQ-MS/MS

50 µg/kg Honey Sample

Ratio 40.7

Rt 8.94 min

Fenazaquin

Ratio 31.4

Rt 8.90 min

Fenazaquin

False positive

Fenazaquin in Honey matrix

Confirmación de falsos positivos

GC-QTOF

50 µg/kg Honey Sample

Fenazaquin in Honey matrix

Confirmación de falsos positivos

Rt 14.21 min

Mass Accuracy: 1.17 ppm

<5ppm

Fenazaquin

Rt 14.14 min

Mass Accuracy: 12.30 ppm

>5ppm

Fenazaquin?

Flujo de trabajo de Targets y sospechosos

September 25, 202047

Adquisicion en full-spectra

Screening de Desconocidos

Deconvolucion seguido por comparación en librerías

públicas…Ahora con Masa Exacta!

No

Metodo en Target

Screening Cuantitativode Targets

Screening de Sospechosos

Si¿Calibrado?

48

C14H20ClNO2Masa Exacta

Paso 1: Busqueda en libería:Formulas de Fragmentos de la librería (NIST, etc.)

Step 2: Comparación de masa exactaValor Medido (Source) comparado con la masa exacta más cercana (librería)

Maxima confianza en masa exacta con librerías de Masa Unitaria!

IDSeptember 25,

2020

c

Unknowns Screening Analysis of Beeswax Samples. NIST Library (Mass spectra of 240.000 compounds)

PCDL of Agilent (Accurate mass spectra and Retention time of 1.020 pesticides) Thymol Identification

C10H14O4 (mass 150.10447)

Library

spectrum

Sample

spectrum

Thymol

GC-QTOF-MS (Agilent 7250)

GC-QTOF-MS (Agilent 7250)Quantitative Analysis of Thymol in Beeswax Samples.

LINEARITY (Check from six levels)

R2 = 0.9994 > 0.99

Organic varroacide:

• Thymol

Thymol in Beeswax matrix

100 µg/kg Beeswax Sample

GC-QTOF-MS (Agilent 7250)

Mass Accuracy:

Rt 4.902 min

Thymol

Conclusiones finales

Situación

● Laboratorios de residuos requieren un alto rendimiento, no solo en

numero de muestras sino en numero de materias activas a analizar.

●Alta fiabilidad en Positivos pero también en los Negativos

●Capacidad de análisis retrospectivo

Retos

●El gran numero de matrices diferentes y analitos a abarcar

●El procesado de un lote de muestras puede ser una labor ardua

●Varios equipos para cubrir múltiples matrices

●Complementariedad de las técnicas de Alta Resolución.

Claves del HR

Resumen: Situacion y futuro del screening de residuos

●Posibilidad de abordar análisis Cualitativo y Cuantitativo a la vez

●Mejoras del software de trabajo en rutina

●Alta sensibilidad de los equipos actuales.

●Alta velocidad en procesado y manejo de datos.

…por su atención

[email protected]

Teléfono de atención

902116890

mailto:[email protected]

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