XV CONGRESO ARGENTINO DE BIOINGENIERIA: 124EI

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Termociclador para Biología Molecular usando un microntrolador

Juan Basso†, Oscar Mauricio Franco†, Enrique Avila Perona‡,Carlos Gil † ,Victor Rosales Fritz§

† Departamento de Electrónica, Facultad de Ingeniería, UNSJ oscarmauriciofranco@yahoo.com.ar

jibasso@hotmail.com ‡ Instituto de Automática Facultad de Ingeniería UNSJ

eavila@inaut.usnj.edu.ar §Hospital Dr. Guillermo Rawson San Juan

Resumen.El objetivo del trabajo desarrollado consistió en construir un termociclador, el cual es un dispositivo electrónico que realiza el control de perfiles de temperatura sobre un bloque portatubos que contiene muestras, con el fin de ejecutar un protocolo de Reacción en Cadena de la Polimerasa, para lograr la amplificación de segmentos específicos de la molécula de ácido desoxirribo nucleico. Dicho equipo usado en laboratorios de Biología Molecular, se basa en dispositivos termoeléctricos de Efecto Peltier que provocan el enfriamiento y calentamiento de las muestras. El sistema de control es implementado en un microcontrolador de la línea Motorola de bajo costo.

Palabras claves y acrónimos: Biología molecular, PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), ADN (Acido Desoxirribo Nucleico), PWM (Modulación de ancho de pulso), Control, Celdas Peltier, Electrónica potencia.

I. INTRODUCCIÓN

n muchas de las aplicaciones de la Biología Molecular es necesario disponer de una gran

cantidad de material genético, pero no siempre es posible obtenerlo en tal cantidad, por lo que es fundamental contar con un método capaz de realizar copias del material genético existente.

El ADN es el soporte físico que contiene toda la información genética de un organismo, en donde un gen es un segmento de ADN que tiene una determinada función y está constituido por una secuencia específica de bases. La replicación puede ser natural o artificial. La replicación natural del ADN es el proceso mediante el cuál se sintetizan dos moléculas hijas de ADN a partir de un ADN progenitor, que actúa como molde. Existen varios tipos de replicación natural: conservadora, semiconservadora y dispersora.

La reacción en Cadena de la Polimerasa PCR o replicación artificial es un proceso de síntesis que permite la obtención de un gran número de copias de una secuencia específica de bases. La reacción es muy sencilla y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos

reactivos, un ciclador térmico, el ADN sustrato y un par de oligonucleótidos específicos para la secuencia que se desea obtener y que actúan como cebadores. La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos, generalmente 30, cada uno de los cuales se produce un incremento exponencial del número de moléculas obtenidas como producto debido a que los fragmentos generados actúan como sustrato en los ciclos subsecuentes. En resumen la reacción “PCR” es una reacción de síntesis de ADN in Vitro que permite la obtención de un gran número de copias de una secuencia específica de bases a partir de moléculas de ADN que actúan como sustrato. [1].

Para llevar a cabo esta síntesis de ADN in Vitro se utiliza un dispositivo electrónico llamado termociclador, que tiene como función generar variaciones de temperaturas controladas sobre la muestra, para lograr la reacción mencionada, permitiendo realizar el proceso de replicación de ADN.

El dispositivo electrónico que realiza el control de temperatura sobre un bloque portatubos, que contiene la muestra con material genético, produce el calentamiento y enfriamiento del mismo gracias a las denominadas celdas de Peltier. [2].

El uso de la tecnología de microcontroladores para el control, permite el uso de programas predeterminados de tiempos y temperaturas. Se denomina programa a cada conjunto de datos térmicos y temporales de un protocolo PCR, dichos datos definen el perfil de temperaturas al cual se debe someter la muestra.

Se implementó un microcontrolador de la familia Motorota (MC68HC908KX8), el cual ejecuta las acciones de control demandadas e interactúa con el usuario por medio de una PC.

II DESARROLLO Termociclador

El equipo desarrollado posee un bloque portatubos que contiene las muestras con material genético, en donde se ejecuta en forma automática los eventos de la reacción PCR. En el bloque térmico se produce el

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calentamiento y enfriamiento a una velocidad determinada dependiendo de los distintos protocolos.

El rango de temperaturas va desde los 4 ºC a 95ºC. Cada protocolo PCR tiene su propio perfil de temperatura, el cual queda definido por un conjunto de programas, donde cada programa se define por una sucesión de segmentos.

A continuación se define un segmento de un programa determinado, la temperatura a especificar es T2, la cual debe ser alcanzada durante el tiempo t1, definiendo de esa forma la pendiente. El tiempo de mantenimiento en la temperatura lograda es t2 (time hold 2). El paso de T2 a T3 se define por otro segmento y corresponde a la programación del segmento 3. Dentro de cada programa se detalla el número de ciclos de repetición del mismo, como así también si se desea enlazar el programa en curso con otro programa, una vez que este finalice. Ver figura 1.

Figura. 1: Ejemplo de un segmento

Diagrama en bloques general

El diseño del termociclador consta de dos lazos de control en cascada, el primero de ellos tiene como referencia un dato enviado por el computador PC correspondiente al valor de temperatura deseado sobre la muestras para ese instante de tiempo. En la figura 2 se observa el dia grama de bloques general del termociclador.

El microcontrolador, que tiene implementado un sistema de control PID, genera una señal de salida que es la referencia del segundo lazo de control y corresponde a un valor de tensión aplicado sobre las celdas de Peltier. El circuito de realimentación cierra el lazo de control del actuador, este último constituido por una fuente conmutada.

PC PIDCircuito decontrol

Circuito depotencia

Celdas dePeltier

Circuito derealimentación

Circuito deacond. de señal

sensor

Microcontrolador Actuador

Transductor

+ +

--

> > > > > >

<<

< <

Figura 2: Diagrama de bloque general

El termociclador realizado se puede sintetizar en

cuatro Bloques principales: Calentamiento/

enfriamiento, de Potencia, de control e interfase usuario equipo.

El bloque de calentamiento y enfriamiento está conformado por diferentes partes, una de ellas es un grupo de cuatro celdas de Peltier, conectadas en serie y actúan a modo de una bomba de calor electrónica. En estas se aplica una tensión positiva o negativa dependiendo si se desea calentar o enfriar las muestras.

En la figura 3 se observan las celdas entre el sistema de disipación de calor ventilador y el bloque portatubos.

Figura 3: Celda de Peltier y ventilador

En las superficies superior e inferior de las celdas

Peltier aparece una diferencia de temperatura entre las por ellas circula una corriente. Para determinada polaridad de alimentación, la superficie de las celdas en contacto con el sistema de disipación genera un flujo de calor hacia la superficie que está en contacto con el bloque portatubos; si se invierte la polaridad también lo hace el sentido del flujo del calor. [3].

El bloque portatubos posee 2 perforaciones laterales que lo atraviesan transversalmente donde se colocan el sensor de temperaturas y una termocupla de protección.

En la figura 3 se observa el sistema de disipación compuesto por un disipador de aluminio y un ventilador, cuya misión es la de evacuar, por convección forzada, la mayor cantidad de calor posible cuando el proceso requiere enfriar las muestras. El encendido y apagado del ventilador se maneja por una señal generada por microcontrolador. Además sobre el portatubos hay una tapa calefactora que tiene como objetivo evitar la condensación de la muestra en la parte superior de los tubos y así evitar las pérdidas de muestras. Se optó por aplicar a esta etapa de un control de temperatura tipo si/no ya que la misma no interviene directamente en los perfiles de temperatura de un protocolo PCR y además no se requieren variaciones en los tiempos de calentamiento o enfriamiento. La tapa permanece encendida entre 40°C y 100°C. El circuito que entrega potencia a la configuración de resistencias para que las mismas eleven la temperatura del la tapa a 115°C tiene como componentes principales un circuito integrado TL 494 que lleva al estado de conducción un opto triac MOC 3041. El sensado de la temperatura se realiza con un termistor, la señal entregada por el mismo después de pasar por una etapa de comparación produce el corte de la alimentación a la etapa si la temperatura es mayor o igual a 115°C, mientras que el encendido del circuito

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viene dado por el microcontrolador, que activa una de sus salidas para habilitar el funcionamiento del mismo.

El bloque de potencia, llamado actuador, es el responsable de entregar la energía necesaria a las celdas. Para cumplir con este propósito el bloque consta de una fuente conmutada controlada por un sistema de control generador de una señal PWM y de un circuito de realimentación de la señal implementada en configuración comparador. La frecuencia de trabajo definid para la operación correcta es de 20 KHz.

En la figura 4 se esquematiza el actuador.

D2

D1T1

TRANSFORMER

1 5 4 8

+ -

LM348 12

1314

4 11

+ - LM348 3

21

4

11

+

10000

+ C2

10000

1K

L1 R1

C4

2200

C3

2200

L2

2 1

3

+ -

LM348 10

98 4

11

Diodo Schottky MBR 2045

R310K

R133K

R4 10K

R6

1K R7 1K

R233K

R71K

Celda -

Celda +

PWM + -

TL494

pin1

pin2 pin 9 y 10

MOSFET

Figura 4: Placa de potencia de la fuente conmutada

De la figura 4, la salida del TL494 controla la energía

entregada a las celdas a través de un transistor MOSFET IRF540. Para definir la polaridad de alimentación de las celdas de Peltier hay un relé y su circuito asociado siendo el microcontrolador el encargado de manejar la conmu-tación mismo.

El bloque de control, implementado en el microcon-trolador cumple con las funciones de generar las órdenes necesarias para que el actuador las ejecute, conmutar el relé, encender el circuito de alimentación del calefactor superior y comunicarse con el computador PC. El bloque de control toma la señal entregada por el sistema de sensado que realimenta al sistema de control, como se observa en figura 2 y consta de un termistor y la electrónica asociada para ajustar la señal a valores convenientes y la última etapa del acondicionamiento de la señal corresponde a un filtro de Bessel de segundo orden para eliminar al máximo ruido posible para ser ingresada al conversor analógico digital del microcontrolador.

El microcontrolador promedia las señales y guarda el resultado en un registro llamado media correspondiente al valor de temperatura en dicho instante y compara con el valor del registro Dserie enviado por la PC al microcontrolador a través del puerto serie.

Para generar la variable error, el microcontrolador realiza la siguiente operación: Error = Dserie - media

Una vez que el microcontrolador obtuvo la variable error, el controlador PID implementado proporciona la salida del algoritmo de control siguiente: [7].

)2(.)1(.)(.)1()( −+−++−= keCkeBkeAkuku

Donde A, B y C son los parámetros del controlador, u(k) y u(k -1) es la salida anterior anterior del algoritmo de control, e(k) es el error actual, e(k -1) y e(k -2) son pasados.

La salida del algoritmo de control u(k) se utiliza para generar el ciclo útil de trabajo de una señal PWM con el Timer Interfase Module del microcontrolador.

Como se muestra en la figura 5, la señal PWM tiene un período T=TMOD que corresponde a un registro de modulo TIM y un ciclo útil de trabajo TCHO, registro del mismo modulo que se actualiza con el valor de u(k).

T= Período=TMOD

TCH0

Figura 5 : Relación entre los registros TCH0, TMOD y la señal

PWM

Cuando la señal de error aumenta en su valor, el controlador PID proporcionará una salida u(k) mayor, lo que implica un ciclo útil de trabajo mayor.

En conclusión el microcontrolador genera la salida de control, que resulta ser la tensión de referencia del circuito de control de la fuente conmutada (Figura 2).

Finalmente el bloque interfase usuario equipo

comprende un programa desarrollado en lenguaje Visual Basic e implementado en una PC y tiene como funcion permitirle al usuario del equipo programar él o los protocolos PCR de una forma ágil y sencilla.

Una vez definido el protocolo, el computador PC comienza a enviarle valores de referencias de temperaturas al microcontrolador para que este produzca una determinada acción de control, al mismo tiempo el microcontrolador envié a la PC valores de temperaturas actuales cada 1 seg. para poder graficar el proceso en tiempo real y observar su evolución.

En la figura 6 se muestra la pantalla principal del software desarrollado. Se diferencian dos sectores, el sector superior referido al programa de temperatura que se ejecuta y el sector inferior referido a la evolución del proceso cuando este está en ejecución.

En el primero de los sectores titulado Programa de temperatura aparece el nombre del programa, junto con la extensión .gp

En el cuadro de texto central se listan los diferentes segmentos que conforman el perfil de temperatura. Los datos de cada segmentos ordenados en columnas son: 1º. Nombre del segmento. (S0, S1....) 2º: Temperatura del segmento. 3º Tiempo de sostenimiento del segmento. 4º Pendiente de ascenso o descenso de la temperatura, indicando de cuanto es la variación del nuevo dato que envía la PC (ºC) y cada cuantos segundos (s) envía el nuevo dato al microcontrolador.

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Figura 6: Pantalla Principal

5º Indica el enlace que tiene el segmento una vez que se ha finalizado, en caso de no especificarse nada en este campo se continúa con el segmento siguiente. 6º Define las veces que se repite un ciclo.

En el menú conexión micro se define las características del puerto de comunicación entre la PC y el microcontrolador.

En el menú Curva de temperatura se accede a la pantalla que muestra la evolución del proceso en tiempo real. Se observa en la figura 7, en línea verde la curva de referencia que graficada a partir de los valores que el computador PC envía al microcontrolador y la curva en línea roja representa la temperatura actual en el bloque portatubos recibida por la PC desde el microcontrolador.

III. PRUEBAS REALIZADAS Una vez que todas las partes que constituyen el sistema estuvieron desarrolladas e implementadas se procedió a ejecutar diferentes protocolos de una reacción PCR en el laboratorio de Biología Molecular con muestras biológicas. Se dispuso al ajuste del equipo, tarea que involucró buscar los valores de parámetros del controlador (valores de A, B y C), que permitieran ejecutar un perfil de temperaturas correspondiente a un protocolo PCR en tiempo y forma. Esto se hizo primero mediante una simulación en el programa MATLAB. Los parámetros se ajustaron luego por el método de sintonía de Ziegler Nichols y por ultimo prueba y error para el ajuste final. [7]. [8].

IV. CONCLUSIONES

Se obtuvo una amplificación de los segmentos específicos de segmentos específicos de una cadena de ADN para un d eterminado protocolo PCR.

Los resultados de las pruebas permiten concluir que el equipo opera de manera satisfactoria, en cuanto a que trabaja a temperaturas correctas y respeta los tiempos de las pendientes, tanto de ascenso como de

descenso, brindando precisión, estabilidad y confiabilidad durante los ciclos de temperatura.

Figura 7: Curvas de temperaturas

La interfase usuario-equipo desarrollada resulta ser

más amigable en relación a los equipos comerciales que usan un display incorporado, permitiendo observar una grafica del proceso en tiempo real y disponer de la opción de almacenar los protocolos PCR predeterminados por el usuario.

A pesar de que no se pudo evaluar la totalidad de los costos se considera que es factible el desarrollo nacional de es tos equipos a un costo menor que el ofrecido en el mercado actual.

REFERENCIAS

[1]. Biología 6ta Edición. Elena Curtis & Sue Barnes. Ed. Médica Panamericana.

[2]. Huang, L., Wang W., Murphy M. Peltier Effect module for highly localized temperature manipulations. American Institute of Physics, August 1999 Pag 4398 –4403.

[3]. TEC’s, provided by Marlow industries. Cooling the world with thermoelectrics http://www.marlow.com/d_intro.htm

[4]. Manual de datos técnicos del microcontrolador 68HC908Kx8 http://www.motorola.com/semiconductors

[5]. Hojas de datos de los Circuitos integrados utilizados www.national.com/ www.texasinstruments.com www.philipssemiconductors.com

[6]. Manual de usuario del termociclador original www.techne.com

[7]. "Ingeniería de Control Moderna", K. Ogata, Prentice Hall 1998

[8]. "Sistemas de Control Automático", B. Kuo, Prentice-Hall 1996;