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TRABAJOS DE ACTUALIZACIÓN

Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón"

TELÓMEROS Y TELOMERASAS

Dr. Rolando A. Hernández Fernández

RESUMEN

Los telómeros son estructuras cromatínicas especializadas que se encuenlocalizadas en los extremos de los cromosomas eucariontes. Tanto el ADcomo las proteínas que los constituyen presentan características singulareslos diferencian del resto de los cromosomas. Parecen estar implicados en nurosas funciones celulares, especialmente las relacionadas con el control dduración de la vida de diferentes estirpes celulares. Estas estructuras se repdurante el ciclo celular gracias a la acción de enzimas denominadas telomeraque están formadas por proteínas y ARN y presentan un mecanismo pecuRecientemente se ha estudiado el comportamiento de las telomerasas encélulas cancerosas y sus posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticaseste trabajo se presenta un resumen de los principales hallazgos más reciesobre la estructura y funciones de los telómeros y la acción de las telomera

Descriptores DeCS: TELOMERASA/fisiología; TELOMERO/fisiología; CI-CLO CELULAR.

Rev Cubana Invest Biomed 1999;18(2):121-9

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Los telómeros constituyen estructurespecializadas que forman los extremoslos cromosomas eucariontes que partipan en funciones celulares tan importancomo la mitosis, la estabilidacromosómica y el tiempo de vida de lestirpes celulares. Recientemente sedemostrado su relación con algunenfermedades, especialmente con el ccer. Durante las últimas 2 décadas mucse ha avanzado en el conocimiento deestructura y dinámica. En este trabajo resumen los hallazgos recientes más portantes.

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ESTRUCTURA DE LOS TELÓMEROS

Los telómeros fueron identificados porH.J. Muller durante la década de los años30. Desde entonces, se ha profundizadoextraordinariamente en el conocimiento deestas estructuras, gracias a la introducciónde la moderna tecnología de la GenéticaMolecular. Un resumen de los principalestrabajos realizados en los primeros añosde aplicación de estas técnicas fue publi-cado en 1984 por Blackburn y Szostack.1

Los estudios se han realizado princi-palmente en ciliados, cuyos macronúcleos

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pueden contener de 40 000 a 1 000 000telómeros según la especie, por lo que cotituyen una excelente fuente de componetes teloméricos y de las enzimas que pacipan en su replicación. Posteriormense ha comprobado que los aspectos destos en ciliados están presentes en otrosganismos. En los ciliados y en S. cerevisiaelos telómeros se encuentran en una forde estructura cromatínica particular nnucleosómica que ha sido denominatelosoma. Los nucleosomas adyacentepresentan histonas hipoacetiladas caracrísticas de la cromatina que no se transcractivamente. En mamíferos, donde smucho más largos, se presentan formadpor nucleosomas pero hacia la zona mextrema aparecen como telosomas. Eevidencia que al menos en parte hay coservación estructural de los telómeroTambién muestran diferencias interespecalgo sorprendentes.

EL ADN TELOMÉRICO

En casi todos los eucariontes estuddos, el ADN telomérico (ADNt) consisteen repeticiones en tanden de pequeñascuencias nucleotídicas con una distribuciasimétrica de los pares G:C, pues las Gacumulan en una de las hebras (hebra Gse encuentran agrupadas. La hebra G eorientada de 5' a 3' hacia el extremo dtelómero y forma el extremo 3’del ADNcromosómico. En la zona más extrema está apareada formando un segmento fimonofibrilar con una longitud que varísegún la especie. Las principales caracrísticas estructurales de los telómeros resumen en la figura 1. La longitud dtelómero es variable. En Oxytricha yEuplotes es apenas de 38 pb mientras ratones alcanza 150 kb. Cada organisposee una longitud media característica.

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cantidad de ADNt por cromosoma tambiéfluctúa. En algunos organismos la longitud promedio de los telómeros respondecambios genéticos o nutricionales.

Las secuencias de ADNt mejor caracterizadas se muestran en la tabla 1 confecionada a partir de la excelente revisión dV.A. Zakian.2 La mayoría de las secuenciason cortas y precisas, como en Tetrahymeque es de 6 pb (TTGGGG). Sin embargo, eS. cerevisiae es heterogénea, y muy largaen K. lactis donde presenta 25 pb. Especiemuy distantes pueden presentar la mismsecuencia, como los vertebrados, y espcies muy cercanas como Tetrahymena yOxytricha ser diferentes aunque muy relacionadas.

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Fig. 1. Representación esquemática de la estructura de lostelómeros. (A) El ADN telomérico consta de pequeñas secuen-cias repetidas ricas en bases de guanina con un extremomonofibrilar. (B) El extremo monofibrilar puede formar estructu-ras de tipo secundario por apareamiento de las bases de guanina.(C) Estas repeticiones sirven para la unión a proteínas tanto enla doble hebra como en la zona monofibrilar.

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TABLA 1. Secuencias de ADN telomérico mejor caracterizadas

Organismo Secuencia

Tetrahymena TTGGGGOxytricha TTTTGGGGGiardia TAGGGPhysarum TTAGGGKluyveromyces TCGGATTTGATTAGGTATGTGGTGTNeurospora TTAGGGCaenorphabditis TTAGGGVertebrados TTAGGG

Mientras más secuencias teloméricase conocen, más difícil resulta encontrauna secuencia consenso. La existencia múltiples secuencias teloméricas sugieque las funciones de los telómeros no rquieren de una secuencia única. El hallago de secuencias teloméricas en sitios iternos de los cromosomas demuestra qellas por sí mismas no hacen los telómeroIn vitro, las hebras G pueden aparearse formas diversas. Una de ellas es la de hlices tetrafibrilares o cuartetos G, que smantienen por múltiples pares G:G. Sestas estructuras son importantes parafunción de los telómeros se explicaría eagrupamiento de las G que se observa las secuencias.

Dos excepciones notables apareceentre los telómeros. En Parascaris no seobserva la distribución asimétrica de laG, éstas ni siquiera están agrupadas pusu secuencia es TTGCA. En Drosophilapresentan una estructura totalmente difrente representada por repeticiones de ementos de transposición.

LAS PROTEÍNAS TELOMÉRICAS

Las proteínas teloméricas (PT) pueden presentarse asociadas al extremmonofibrilar o a la zona adyacente de doble hebra. Entre las primeras se ha ide

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tificado una proteína de Oxytricha que noestá relacionada estructuralmente con niguna otra proteína. In vitro, esta proteínafacilita la formación de cuartetos G, lo cuasugiere la existencia de estas estructurin vivo. No se le ha detectado unión a zonas internas del cromosoma.

Una proteína de unión a la hebra Gmonofibrilar en levaduras es el productdel gen EST1. La unión de EST1p es epecífica para las repeticiones (TG

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una sola hebra y requiere de un extrem3’ libre.3

La principal PT de unión a la zona dedoble hebra en S. cerevisiae es el productodel gen RAP1. Su unión a las repeticione(TG

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menos afinidad que a las de doble hebrSe ha demostrado que RAP1p contienemotivos estructurales de unión al ADN quson homólogos a los del oncogen myb.

A partir de células HeLa se purificóuna proteína de 60 kDa que se une a ltelómeros humanos y se le denominó hTRLa proteína tiene 439 aminoácidos para unmasa molecular de 50 341 dalton y su epresión in vitro da lugar a una proteína detamaño similar a la identificada en los extractos nucleares de células HeLa.4 Alre-dedor de la posición 350 hTRF contiene secuencias de localización nuclear, la zonN terminal es rica en aspártico y glutámicy en la zona C terminal presenta fuerthomología con la región de unión al ADNdel oncogen myb. Ver la referencia5 parauna comparación con otros TRF de mamíferos. A partir del hTRF se pudo locali-zar una proteína telomérica con motivodel oncogen myb en Schizosaccharomycespombe.6

Es de esperar que en los próximos añse puedan identificar otras proteínas implicadas en la estructura y función de lotelómeros.

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LAS TELOMERASAS

El descubrimiento de las telomerasaresolvió en principio el problema de lareplicación de los estremos de molécullineales de ADN. La actividad detelomerasa fue detectada por primera ven Tetrahymena y después en otroseucariontes. En la referencia7 aparece unarevisión de los principales trabajos sobesta enzima. La enzima es unribonucleoproteína y para su actividad soesenciales tanto el componente proteínicomo el ARN.

En Tetrahymena el ARN telomerásico(ARNtl) tiene una longitud de 159nucleótidos (nt) y contiene 9 repeticionedel molde 5' CAACCCCAA3'. Esta característica que se observa también en todlos otros ARNtl identificados, permite eapareamiento del telómero en crecimiencon el ARNtl y que aún quede una regióque pueda servir de molde.

Las telomerasas difieren de todas lapolimerasas en que utilizan un molde interno en vez de uno externo, lo cual impne limitaciones estéricas específicas pala elongación del iniciador y la catálisisLa telomerasa alarga el ADN iniciador pola adición uno a uno de losdesoxinucleósidos trifosfatados y así genra las repeticiones en tanden de lotelómeros. La de Tetrehymena puede alar-gar ADN iniciadores Oxytricha, humanos,plantas y levaduras. Esto sugiere que enzima tiene afinidad general por las scuencias ricas en G más que por un movo específico como sucede con otras prteínas de unión al ADN. Pero en todos locasos, la secuencia añadida se correspde con el molde de ARN de la enzima.

Actualmente, se propone la existencde 2 sitios enzimáticos independientes interacción con el ADN iniciador. Unocontiene el molde de ARN y alínea el ex

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tremo 3' del iniciador para su elongacióen el centro catalítico. El otro se une ADN iniciador hacia el lado 5’del molde yproporciona una vía de salida para la hbra en crecimiento. Este modelo explica adición de varias repeticiones sin que enzima se disocie del ADN iniciador. Estsitio catalítico único debe moverse en relción con el ARN molde. Experimentos eEuplotes apoyan este modelo de los 2 stios.8 La enzima posee también actividaendonucleolítica que pudiera estar relcionada con una función de correcció(fig. 2).

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Fig. 2. Mecanismo de acción de la telomerasa. (1) La enzimacontiene el ARN telomerásico con un sector complementario ala secuencia de los telómeros. (2) La unión del ADN teloméricocon el ARN telomerásico se produce por apareamiento de basescomplementarias. (3) La enzima alarga el telómero usando comomolde el ARN. (4) Al completar un alargamiento la enzima sedesplaza y comienza un nuevo ciclo de alargamiento y así suce-sivamente.

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EL ARN TELOMERÁSICO

El ARNtl ha sido aislado de numerosas especies. La longitud de éste varía dde 160 a 190 nt en los ciliados hasta 1 3en levaduras y cada uno de ellos contieuna secuencia molde apropiada para la stesis de las repeticiones teloméricas. LARNtl presentan poca homología de scuencia, sin embargo, al menos en ciliadla estructura secundaria está muy consvada. En Tetrahymena solamente 159 nt sonsuficientes para un funcionamiento adecudo. Se ignora por qué en otras especiesmucho más largo. Algunas característicde estos ARN se recogen en la tabla 2

Los estudios con mutantes de ARNen Tetrahymena han mostrado que cambioen algunos de los 6 nt del extremo (CAACCCCAA) producen secuencias repetidas alteradas, sin embargo los 3 últimno son utilizados como molde y más bieparecen participar en alinear el iniciadoEn el mutante (AAACCCCAA) se produce una disociación prematura de la enzimantes de arribar al nucleótido cambiadtal vez por efectos estéricos de lonucleótidos alterados en el molde o poque el ARN desempeñe algún papel encatálisis u otra función.9

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PROTEÍNAS TELOMERÁSICAS

La telomerasa de Tetrahymena constade 2 polipéptidos, p80 y p95, el menor seune al ARNtl y el mayor al ADN inicia-dor. La enzima contiene una copia de cadauna de las proteínas y una del ARNtl parauna masa molecular aparente de 250 kDaLas secuencias de p80 y p95 no guardanuna extensa homología con otras proteí-nas, lo que indica que se trata de proteínasnuevas. No obstante, se ha encontrado unhomología limitada entre p95 y las ARNpolimerasas dependientes de ARN(transcriptasas inversas, T1) así como conmotivos estructurales de algunas ADNpolimerasas. Este motivo de T1 tambiénse encuentra en la p123 de E. aediculatus yen el producto del gen EST2 de S. cerevisiaecuya deleción produce defectos teloméricos.Los cambios de un aminoácido por otro enel motivo de T1 de EST2p produce acorta-miento de los telómeros y senescencia enlevaduras, lo que indica su importancia parael alargamiento de los telómeros in vivo.10

También se han identificado en mamí-feros 2 proteínas con homología secuenciacon p80. Una de ellas designada TP1interactúa con el ADNt.11 La otra obtenidade ratas se ha denominado TLP1 y su ADNc

TABLA 2. Características de algunos ARN telomerásicos

Organismo Molde Longitud (nts)

Tetrahymena CAACCCCAA 159Euplotes CAAAACCCCAAAACC 190Oxytricha CAAAACCCCAAAACC 190Humanos CUAACCCUAAC 450Ratón CCUAACCCU 450S. cerevisiae CACCACACCCACACAC ~1 300K. lactis UCAAAUCCGUACACCAAUACCUAAUCAAA ~1 300

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codifica una proteína de 2 629 aminoácidpara una masa molecular deducida de 2kDa (p240).12 Esta p240 es modificada invivo y convertida en p230, tal vez como umecanismo postraduccional de regulacide la actividad de la telomerasa.

GENÉTICA DE LA TELOMERASA

Al introducir cambios en la secuencmolde del ARNtl en Tetrahymena las célu-las se hacen muy grandes con problemala división nuclear y pierden viabilidad depués de varias generaciones. Existe unateración en los mecanismos que regulanlongitud de los telómeros, tal vez porqueinhibe la unión de las PT al cambiar la scuencia. En S. cerevisiae la deleción deEST1 produce un acortamiento progreside los telómeros y al cabo de unas 50 geraciones las células se hacen muy grany muchas de ellas mueren. La deleción gen TLC1, que codifica el ARNtl y de EST2EST3 y EST4 produce fenotipos similarque no se agravan en los dobles mutanlo que sugiere que estos genes estánepistasis.13

REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS

En la estructura de los telómeros prdomina la zona de repeticiones en la dohebra y solamente el extremo terminal psenta la estructura monofibrilar. Aunquetelomerasa es necesaria para mantenelongitud de los telómeros, esta enzima salarga la hebra G. La replicación de la hbra C debe hacerse por el sistema convcional de las polimerasas. En levadurmutantes para la polimerasa a y la proteínareplicativa C (RFC) tienen alteraciones

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la síntesis de los telómeros. Tanto en leva-duras, en humanos, como en otros organismos los telómeros se replican al final de lafase S.14

La replicación de los telómeros es sólonecesaria para compensar la pequeña y lentpérdida de ADN que resulta de lareplicación incompleta, por lo tanto debeser considerada como una función de repa-ración. En este proceso, el ADN teloméricono tiene exactamente la función de molde.In vitro la telomerasa de Tetrahymena pue-de añadir hasta 500 nt antes de separarsdel ADN. La síntesis de la hebra C por elsistema convencional de las polimerasas ge-neraría una larga molécula bifibrilar con unextremo monofibrilar de 8 a 12 nucleótidos,que es un buen sustrato para la telo-merasa.

El estado dinámico de los telómerosdepende de varios factores, entre ellos, laprocesividad de las telomerasas, la frecuencia de su acción sobre cada telómero parti-cular y la velocidad de degradación delADNt.15 Las PT como el hTRF1 tambiénpueden regular su longitud.16

Se ha visto que en levaduras, unmutante (TEL1) deficiente en la regulaciónde los telómeros es homólogo de 2 genesimplicados en la regulación del ciclo celu-lar: el MEC1 en levaduras y el de la ataxiatelangiectásica (ATM) en humanos, lo cualapunta a un vínculo entre la replicación delos telómeros y el ciclo celular.

FUNCIONES DE LOS TELÓMEROS

Los telómeros representan estructurasesenciales para las células, pues evitan lafusión cromosómica, desempeñan un impor-tante papel en mantener la estabilidadcromosómica17 y participan tanto en lameiosis como en la mitosis.18

Sin embargo, su función más notoriaes la de servir como un reloj mitótico quemide y regula el número de las divisiones

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celulares.19 Los telómeros se acortan cocada división celular y el número de divisiones que la célula puede experimentarcorrelaciona con la longitud de lostelómeros.20 Este acortamiento pudiera eliminar genes indispensables para la vidasilenciar genes cercanos por el efecto posición del telómero. Una longitud crítica pudiera ser la señal para la entrada la senescencia celular. Sin embargo, vatener presente que no está relacionada cla edad del organismo.

La actividad de la telomerasa varía ediferentes etapas de la vida. Se ha detecdo en ovarios y testículos en fetos, reciénacidos y adultos, pero no en óvulos espermatozoides maduros. El blastocistola mayoría de los tejidos somáticos de 1620 semanas de desarrollo exhiben un anivel de telomerasa que desaparece dpués del nacimiento.21 También es alta entejidos adultos con una intensa proliferación celular como en las célulaendoteliales22 y el endometrio.23 En otrascélulas puede ser inducida en determindas etapas de la vida como ocurre conactivación de los linfocitos T24 y los B.25

Esta función de los telómeros los relaciona de inmediato con la transformaciócancerosa. En uno de los primeros trabjos sobre el tema se encontró que en célas cultivadas de 18 diferentes tejidos hmanos 98 de cada 100 inmortales y ningna de 22 mortales mostraban actividad telomerasa. Asimismo 90 de 101 biopsiade 12 tipos de tumores y ninguna de 50 tejidos somáticos normales poseían activdad de la enzima.26

Estudios posteriores han confirmado unactividad incrementada de telomerasa

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cáncer de mama,27 próstata,28 astrocitomas29

y otros. Estos hallazgos pudieran tener importantes implicaciones clínicas. La determinación de la actividad de telomerasa pudiera ser utilizada para el diagnóstico precoz del cáncer en pruebas no invasivas30 ylos inhibidores de la enzima pudieran seusados como agentes antitumorales con ualto grado de selectividad para las célulatransformadas.

PERSPECTIVAS

El descubrimiento de la singular es-tructura nucleoproteínica de los telómeroy su conservación filogenética estructuray funcional demuestran el carácter esencial de esas estructuras para la vida de célula. La existencia de las telomerasasoluciona el viejo problema sobre lareplicación de los extremos de moléculalineales de ADN. Sin embargo, estos hallazgos plantean nuevos problemas. Entrellos está determinar la función del ARNtlen la zona que no funciona como molde y sposible participación en la catálisisenzimática. Los factores que regulan laactividad de la enzima por una parte y lalongitud de los telómeros por otra. Diluci-dar los mecanismos moleculares que vinculan los telómeros con la regulación de lproliferación celular. También será intere-sante y trascendental la posible aplicacióde estos conocimientos para el diagnósticy tratamiento de enfermedadesproliferativas, especialmente el cáncerPara dar respuesta a estos y otros problemas deben encaminarse las futuras investgaciones.

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SUMMARY

Telomeres are specialized chromatin structures located in the extremes of eukaryotic chromosomes. BothDNA and proteins present singular characteristics that differentiate them from the rest of chromosomes. seem to be involved in a member of cell functions, especially those related to the control of life span of diffecell species. These structures replicate in the cell cycle thanks to the activity of telomerases. which are encomposed by proteins and RNA with a peculiar mechanism. Recent research works have studied the behavtelomerases in cancer cells and their possible diagnostic and therapeutical uses. This paper shows a summthe main and most recent findings on the structure and functions of telomeres and the action by telomeras

Subject headings: TELOMERASE/physiology; TELOMERE/physiology; CELL CYCLE.

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Recibido: 29 de septiembre de 1998. Aprobado: 19 de julio de 1999." Dr. Rolando A. Hernández Fernández. Instituto de Ciencias Básicas y Pereclínicas "Victoria de Girón",Calle 146 y Ave. 31, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.

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