tecnología del adn recombinante1

8/9/2019 Tecnologa del ADN recombinante1

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TECNOLOGA DEL ADN

RECOMBINANTE

Curso : TPICOS EN BIOLOGIA


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Principales metas de la biotecnologa

del ADN recombinante Entender mejor los procesos de la herencia y su

expresin gentica.

Proporcionar un avance en el conocimiento ytratamiento de diversas enfermedades,especialmente enfermedades genticas.

Generar beneficios econmicos, creando plantasy animales mejorados y para la produccineficaz de molculas biolgicas valiosas.


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Secuencia de procedimientos que se utilizan

para producir un producto especfico.

a) Producir una biblioteca de ADN de unorganismo.

b) Identificar los genes individuales de inters.c) Producir una copia o preferentemente

muchas copias del gen.

d) Insertar el gen dentro del organismodeseado y regular la expresin del mismo deuna manera til.


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Enzimas de restriccin

Las enzimas derestriccin separan elDNA de dos hebras ensecuenciasnucleotdicasespecficas.


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CLONACIN Un clon es una estirpe celular o serie de individuos

pluricelulares nacidos de una misma y que songenticamente homogneos.

Hall y Stillman (1993) obtuvo clulas humanas

clonadas genticamente homogneas. La clonacin del DNA se basa en un aumentoprogramado del nmero de copias de secuencias deDNA seleccionadas. De qu manera se logra esto?.

1) Clonando el DNA en sistemas celulares (in vivo) usandobacterias.

2) Clonando en sistemas libres de celulas (reaccin in vitro)mtodo puramente enzimtico a travs de l reaccin encadena de la polimerasa (PCR)


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AAAAAAAm7Gppp

AAAAAAAm7GpppTTTTTTT

TTTTTTTAAAAAAAm7Gppp

AAAAAAATTTTTTT

Sntesis de laprimera cadena

Oligo dTAMV reverse transcriptase

Sntesis de lasegunda cadena

RNAsa HDNA polimerasa I

mRNA/DNA duplex

AAAAAAATTTTTTT

T4 DNA polim.dNTPs

Rellenadode extremos

cDNA duplex

T4 Ligasa

Construccin de una biblioteca de cDNA:

Sntesis de cDNA


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Construccin de una biblioteca de cDNAAAAAAAATTTTTTT

EcoRI

AAAAAAATTTTTTT

Me

CGAATTCCGCTTAAGG

AAAAAAATTTTTTT

Me

CGAATTCCGCTTAAGG

AATTCCGG

AAAAAAATTTTTTT

MeCGGCTTAA

AATTCCGG

AAAAAAATTTTTTT

CGGCTTAACTTAA

G

G

AATTC

Me

G

AATTC

CTTAAG

DNA metilasa

CGAATTCCGCTTAAGG

CGAATTCCGCTTAAGG

Ligacin de linkers EcoRI

Digestin EcoRI

Digestin EcoRI

Ligacin

Empaquetamiento in vitro

Infeccin deE. coliy propagacin

de la biblioteca

Recogida de fagosy almacenamiento

GAATTCCTTAAG

EcoRI

Pgt10


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Anlisis de una biblioteca de cDNA

Infectar E. coli

Placas con calvas

de lisis

Aplicarmembrana

Fagos adheridosa la membrana

Sondamarcada

con 32P

Hibridacin

LavadosAutoradiografa

Recuperacin del fago

y anlisis del inserto


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Clonacin de genes


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Clonacin del DNA en sistemas celulares


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Intentos de clonacin en animales

J. Gurdon (1967) ganador del Premio Nobel, logrdesarrollar embriones de la rana Xenopus laevisclonando huevos irradiados no fecundados con ncleosde clulas intestinales ya diferenciadas de la misma

especies, luego sigui experimentando con ratones. En la dcada de los 80s S. Williansen del Instituto de

Fisiologa Animal en Cambrige logr la clonacin deovinos adultos a partir de clulas embrionarias.

El Fisilogo N. First de la Universidad de Madison enWisconsin (USA) tomando una clula de embrin debovino d 6 das de gestacin consigui clonar un ovocitoanucleado por medio de la descarga elctrica y obtuvoclones viables. El embrin fue implantado en una vacadel que naci un ternero natural.


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En 1993 J. Halt y R. Stillman dela escuela de Medicinade la Universidad de George Washington (USA) dividiembriones en varias partes antes de la implantacinpara aumentar la probabilidad de embarazos.

Un 27 de febrero de 1997 en la revista Nature sepublic el nacimiento de la oveja Dolly llevado acabo por el escocs J. Vilmut y col. En el institutoRoslim de Edimburgo. En sus resultados logr

demostrar que el material gentico de las clulas deun tejidos adulto conserva la capacidad de dar origena un nuevo organismo.


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Clonacin de las clulas de sapo


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Clonacin por disgregacin de clulasembrionarias.


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Clonacin por transferencia nuclear

1. El vulo recin eclosionado, obtenido, por ejemplo,de una oveja, es manipulado bajo microscopio agrandes aumentos, para hacer succin del materialnuclear.


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2.- la clula donante se obtiene de un cultivode clulas embrionarias de una ovejapreada.


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3.- El material nuclear de la clula donante esinyectado al vulo vaci. Con impulsos elctricos selogra la fusin y el inicio de la divisin celular. Lamrula inicial es colocada en el tero de una madre

sustituta.


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El experimento de lo oveja Dolly


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Dolly fue desarrollada por Wilmut y colaboradores (Nature 385:810-813, 1997) en elInstituto Roslin de Edinburgo, Escocia.


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Esquema general de la clonacin de Dolly


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Etapas para realizar una clonacinnuclear ( De la oveja Dolly)

1. Se provee una clula somtica especializada.2. Esta clula contiene la copia de cada gen necesario

para la creacin del ser vivo especfico que sepretenda clonar.

3. Como slo estn activo los genes para sintetizar lasprotenas indispensables para dicha clula somticaepecializada, entonces las clulas crecen y se dividencopindose a s mismas.

4. Si se disminuyen los nutrientes durante el cultivo invitro de dichas clulas, se logra que entren eninactividad.

5. En este momento todos los genes pueden ser activa


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6. Un ser vivo de la misma especie aporta el vulo uovocito y se mantiene vivo in vitro.

7. Se le saca el ncleo con toda la informacin gentica alvulo.

8. La clula somtica y el ncleo se funden con una chispade electricidad. Y las molculas de vulo programangenes en las clulas somticas especializada paraproducir el embrin.

9. Se desarrollan las clulas embrionarias y se implantanlos embriones en una madre portadora.10. El nuevo ser vivo es idntico al donante de la clula

somtica especializada.


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Novedades de la clonacin de Dolly1) No se trata de una divisin (escisin gemelar) sino de una

reproduccin asexual encaminada a producir producirindividuos biolgicamente iguales al individuo adulto queproporcion el patrimonio gentico.

2) Se crea que el DNA de clulas somticas de los animalessuperiores al haber sufrido la diferenciacin no podranrecuperar su potencialidad original. Es decir la cpacidad deseguir desarrollando un nuevo individuo.

El xito de los trabajos de Wilmut, es haber encontrado unmtodo para resolver la compatibilidad entre citoplasmareceptor y el ncleo donante tomando una clula somtica detejido adulto diferenciado.


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Clonacin de terneros y cerdos

En diciembre (1998) en la revista Science se publico elnacimiento de 8 terneros de las clulas de una vacaadulta, trabajo dirigido por Y. Tsunada de la universidadde Kinki en Nora (Japon) usando la tcnica de Wilmut

soo que utilizo clulas de tracto reproductivo de unaanimal sacrificado. Una de las mas recientres investigaciones respecto a la

clonacin de animales es el nacimiento de 5 cerditos enVirginia (2000); Millie (nuevo milienio), Christe

(C.Bernard) Alexis y Correl (nombre de un premio Nobel)y Dotcom (lenguaje del internet). En diciembre del 2000 dieron a conocer la manipulacin

de gallinas para encontrar en lo huevos sustancias para eltratamiento del cncer (ovario, mama y piel).


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La primera oveja transgnica Polly que lleva clulasgenticamente transformadas con un gen humano nosolamente es clnica sino tambin transgnica.

Las vacas Holly y Belly fueron clonadas con la

finalidad de producir leche con alto contenido deLactoferritina (protena human utilizada en tratamientode enfermedades infecciosas). Es otro avance de labiotecnologa.

En diciembre 2001 en el instituto Roslin de Edimburgose han producido cerdos clonado y se proponedesactivar los genes responsables del rechazoinmunolgico entre las especies utilizando labiotecnologa para de esra manera resolver el problemade transplante de rganos.


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Caso A. MUJER INFERTIL QUE DESEA CLONARSE Y US A A SU HERMANA COMOUNA PROVEEDORA DEL VULO Y A SU MADRE COMO RECEPTORA Y MADRESUSTITUTA


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Caso B


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Caso C


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Principales usos de clonamientos degenes

La produccin de grandes cantidades de protenas especficas.

Las sntesis de vacunas ( protenas virales pueden utilizarsepara utilizarlas como vacunas)

El diagnstico de enfermedades genticas (anemia, Tay Sachs,Huntington , la distrofia muscular, etc.)

La modificacin del ADN en organismos intactos (produciendobacterias, animales y plantas transgnicas) para usosespecficos.

La modificacin del ADN de las clulas de organismosespecficos en seres humanos para corregir defectos genticos(terapia gnica).

Por lo tanto los genes duplicados pueden utilizarse co nfines

de investigacion industriales mdicos o en agricultura.


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