Presentacin de PowerPoint

PREMISASPrimer paso: extraccin de los cidos nucleicosLisis celularConcentracin del cido nucleicoProteccin frente a la degradacin enzimticaEliminacin de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizarMtodosFsicos: sonicacin, congelacin/descongelacinQumicos:Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidinaEnzimticos: lisozimaDeteccin de microorganismos directamente en muestras clnicas identificando un fragmento especfico del genoma del microorganismo concretoIdentificacin del microorganismo tras su aislamiento por mtodos convencionalesCuantificacin del nmero de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vrica)Deteccin de factores de virulenciaDeterminacin de resistencia a antibiticos directamente en muestra o sobre cultivoEstudios epidemiolgicos: comparacin cepas aisladasTCNICASMuchas. Variantes de las preexistentes o nuevasClasificacin:Tcnicas de hibridacinTcnicas de amplificacinPREMISASDesnaturalizacin: cuando se calienta ADN por enciam de 90C las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original

Sonda: pequeos fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento gentico, en este caso el que queremos detectarHIBRIDACINUnin de la sonda con su secuencia complementaria. Muy especficaDeteccin: sondas marcadasSustancia radiactivaFluorescenteEnzimaAcs marcadas frente a ADN bicatenario

HIBRIDACINHIBRIDACINFormatosEn solucinSoporte o fase slidaINNO-LIPAIn situHIBRIDACIN

HIBRIDACIN

SustratoSustrato coloreadoHibridacinSondaADN complementarioSoporteTECNOLOGA DE LOS CHIPS O DE LOS ARRAYSTCNICAS DE AMPLIFICACINTCNICAS DE AMPLIFICACINHibridacin directa: baja sensibilidadPaso previo: amplificacinClonacin in vitro que permite obtener mltiples copias de un fragmento de:ADNARN: tras conversin en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa

TCNICASPCRNested-PCRPCR mltiplePCR cuantitativaPCR a tiempo realAmplificacin basada en la transcripcinOtras tcnicas que no amplifican una secuencia dianaPCRSe amplifica una secuencia diana espedfica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperaturaREACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Elementos qumicosADN problemaPrimers o iniciadores dNTPsPolimerasaIones....Elementos fsicosTemperaturaDesnaturalixacinApareamientoSntesis o extensinADN?IniciadoresPolimerasadNTPsIones...

DesnaturalizacinApareamientoExtensin

NESTED-PCRAmplificacin de un fragmentoReamplificacin de un fragmento interno con otros cebadoresEn 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubosPCR MLTIPLEMuestra extraida + varios juegos de cebadoresAmplificacin de diferentes dianasEj.: identificacin + determinantes de resistenciaPCR CUANTITATIVADeterminar el nmero de copias de la muestra inicialSuele utilizarse una tcnica competitivaADN ARN problemaADN ARN competidorCantidad conocida+Mismos cebadoresIgual longitud amplificadosMismas condicionesCantidadCantidadCiCf=CiCfRelacin linealPCR A TIEMPO REALRealizacin en muy poco tiempo (aprox. 30)Cuantificacin continua y precisa del ADN que se va formandoIgual que PCR convencional pero modificaciones tcnicasCapilar: cambios de temperatura muy rpidosFragmntos amplificados muy cortosTermociclador y lector especficosDiferentes mtodos de deteccinAMPLIFICACIN BASADA EN LA TRANSCRIPCINVariedades: NASBA, TMA, 3SROTRAS TCNICAS QUE NO AMPLIFICAN SECUENCIAS DIANAAmplificacin de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianasLCR (Ligase Chain Reaction)Ligar y amplificar los cebadoresQ-replicasa: no comercializadaREACCIONES ANTGENO/ANTICUERPO Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reaccin Ag-Ac ha tenido lugarBase fundamental: especificidad de la reaccin ?Conocido+Dco directo?Conocido+Dco indirecto