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UNIVERSIDAD DE JAÉNFacultad de Ciencias Experimentales
Alumno: JOSE MARIA NARVAEZ LOPEZ
JUNIO DE 2020
Trabajo Fin de Grado
ZEARALENONA:
PROBLEMÁTICA Y METODOS DE
ANALISIS EN TRIGO, MAIZ Y DERIVADOS
1. RESUMEN / ABSTRACT2. INTRODUCCIÓN
2.1Micotoxinas2.1.1 Concepto y origen……………………………………………………2.1.2 Tipos………………………………………………………………2.1.3 Toxicidad…………………………………………………………………
2.2ZEA………………………………………………………………………2.2.1 Concepto y origen2.2.2 Propiedades físicas y químicas de la ZEA
2.3Procedimientos para reducir la presencia de micotoxinas en alimentos.
2.4Normativa sobre contenidos máximos de ZEA en cerealaes (masa de pizzas), trigo y derivados del trigo
2.5Técnicas de extracción y de purificación de la ZEA en trigo y derivados
2.6Técnicas de análisis de ZEA en trigo y derivados3. Objetivos4. Revisión de métodos de análisis.5. Conclusiones.6. Bibliografía.
1 .RESUMEN/ABSTRACT
Las micotoxinas son metabolitos secundarios generados por hongos de las especies
Aspergillus, Penicillium, Fusarium, que causan efectos tóxicos en humanos y
animales. Esta contaminación se ve clara en alimentos con crecimiento fúngico
como semillas y cereales. Nuestro estudio va a consistir en investigar la presencia
de la ZEA en trigo y derivados como por ejemplo en derivados de harina de trigo.
También vamos a comparar las diferentes técnicas que se llevan a cabo en todos los
análisis que se hacen para el estudio de esta micotoxina. Lo que se ha comprobado
es que para el análisis de estos contaminantes presentes en el trigo, en este caso la
técnica que más se utiliza es la cromatografía líquida de alta eficacia.
Mycotoxins are secondary metabolites generated by fungi of the species Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, which cause toxic effects in humans and animals. This
contamination is clear in food with fungal growth, such as sedes and cereal. Our
study will consist of investigating the presence of Zearalenone in wheat and derivates
such as wheat flour derivates. We will also compare the different techniques that will
be carried out in all the analyzes performed for the studt of this mycotoxin. What has
been shown is that for the analysis of these contaminants present in wheat in this
case, the most commonly used technique is high performance liquid
chromatography.
1
2. INTRODUCCIÓN2.1 Micotoxinas 2.1.1 Concepto y origenLas micotoxinas son producidas por hongos, se tratan como compuestos de bajo
peso molecular y para nada volátiles a temperatura ambiente como por ejemplo
vemos en la Figura 1. Estas micotoxinas actúan como mecanismo de defensa
frente a otros microorganismos. Las micotoxinas que presentan una mayor
toxicidad son las aflatoxinas, las fumonisinas, la patulina y la ZEA.
Debido a la toxicidad de las micotoxinas, la mayoría de las que hemos
comentado son cancerígenas como las aflatoxinas pero luego hay otras que no
se puede decir que son cancerígenas como la patulina y ZEA.
La cantidad de micotoxinas presentes en los alimentos van a depender de los
tipos de sustrato, la nutrición, la humedad, la temperatura, con concurrencia con
otros hongos, y el daño físico debido a insectos entre otros.
Las concidiones favorables para que se produzcan las micotoxinas seria a una
temperatura entre 10 y 40ºC con un pH entre 4 y 8.
La especie Fusarium suele crecer la especie fúngica a temperaturas bajas y alta
actividad acuosa, sin embargo la Penicillium crece con actividad acuosa baja y
temperatura alta. Las micotoxinas en nuestro cuerpo son metabolizadas
mediante el hígado y el riñón y por el tracto digestivo. Nosotros lo ingerimos a
través de alimentos como cereales, frutas, bebidas e indirectamente ya que los
animales pueden ingerir alimentos contaminados y luego al comernos parte de
esos animales como puede ser la carne, leche o cualquier otro se produzca una
contaminación en cadena un ejemplo de esos alimentos lo podemos ver en la
figura 1 que vemos granos de maíz y el crecimiento del maíz como vemos que es
diferente cuando está contaminado por alguna micotoxina.
Las micotoxinas se dan a pesar de los resultados negativos de un análisis por
motivo de dos razones principales. En primer lugar se localizan en los llamados
“puntos calientes” donde pueden permanecer sin ser detectados según los
procedimientos de muestreo.
En segundo lugar, las micotoxinas que están escondidas pueden aparecer en la
alimentación. Estas son producto de una reacción bioquímica donde las
micotoxinas se pueden unir a ciertas moléculas como glucósidos, esteres de
ácidos grasos y proteínas.
2
Pero claro, debido a la modificación bioquímica, estas micotoxinas no son
detectadas con métodos analíticos convencionales. El enlace micotoxina-
molecula se puede dividir en el tracto del animal y se libera la micotoxina. El
simple echo de que las muestras contengan hongos, genera la producción de
mas micotoxinas en el alimento, también la aplicación de pesticidas a los cultivos
produce un mayor riesgo para que se generen sustancias contaminantes para la
salud.
Figura 1.Granos de maíz contaminados por cualquier micotoxina. Imagen obtenida de la revista
digital de la Universidad Nacional y Autonómica de México.
2.1.2 Tipos
En la tabla 1 vemos las diferentes micotoxinas que existen y sus
correspondientes hongos que generan dichas micotoxinas y también los cultivos
afectados por cada una de estas toxinas.
3
MICOTOXINA HONGOS PRODUCTORES
CULTIVOS AFECTADOS
Aflatoxina B1, B2,G1,G2,M1
y M2
Aspergillus (flavus,
parasiticus, nomius)
Frutos secos , maíz, semilla
de algodón, arroz, especias,
higos
Ocratoxina A
Ocratoxina B
Asperdillus ( ochraceus ,
fumigatus, versicolor…)
Legumbres, semillas, frutos
secos , café, granos de cacao
Fumonisimas B1, B2, B3 Fusarium (F.moniliforme, F.
proliferatum)
Maiz , uvas
Tricotecenos tipo A
diacetociscirpenol
Fusarium spp, Stachybrotis
F. langsethiae, F . cereales
Cereales
Tricotecenos tipo B
Deoxinnivalenol y sus
derivados acetilados
Fusarium graminearum,
Fusarium culmorum
Trigo , maíz , cebada, avena,
centeno , arroz
ZEA Fusarium spp Todo tipo de granos
Patulina Byssochlamys spp,
Penicillium spp, Aspergillus
spp
Frutas , aceitunas y cereales
Tabla 1. Tipos de micotoxinas (Elaboración propia)
2.1.3 Toxicidad
La toxicidad de las micotoxinas puede ser aguda y crónica. En casos agudos, los
efectos de la toxina aparecerán después de un corto tiempo de exposición
(segundos, minutos u horas). Por lo general, la toxicidad aguda es el resultado de la
exposición a altas dosis y se caracteriza por la presencia de síntomas graves
fácilmente reconocibles. La toxicidad crónica se caracteriza por síntomas más
débiles que solo pueden ocurrir después de un período inicial de exposición. La
toxicidad crónica puede ocurrir con la exposición prolongada a bajas dosis de
micotoxinas. Un efecto crónico de algunas micotoxinas es la inducción de cáncer,
especialmente del hígado (por ejemplo, aflatoxina). Algunos efectos de esta
toxicidad son: Deterioro de la función hepática y renal, Cáncer de hígado, ictericia
(piel amarilla), hepatitis crónica, anorexia.
4
Los efectos tóxicos de las micotoxinas pueden ser reversibles e irreversibles. Los
efectos reversibles incluyen daños menores que pueden curar, como irritación de la
piel. Los efectos irreversibles implican un daño permanente a la salud. Un ejemplo
es la constricción de los vasos sanguíneos causada por alcaloides, que conduce a la
necrosis de las extremidades (por ejemplo, dedos de los pies, orejas o cola)
Los principales efectos tóxicos de las micotoxinas son carcinogenicidad,
genotoxicidad, nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, estrogenicidad, trastornos
reproductivos y digestivos, inmunosupresión y efectos dérmicos.
Existen varios factores que influyen en los síntomas:
-Tipo de micotoxinas consumidas, nivel de ingesta, como vemos en la Figura 2 que
se ve el trigo contaminado perfectamente pero no se aprecia el nivel de
contaminación y duración de la exposición
-Especies animales, sexo, raza, edad, salud general, estado inmunológico.
-Gestión de fincas: higiene, temperatura, densidad de producción.
-Posible sinergismo entre las micotoxinas presentes simultáneamente en los
alimentos
5
Figura 2. Imagen donde se distingue el trigo contaminado con el sano.
Imagen obtenida por la web SlideShare en un artículo llamado micotoxinas por el Dr.
Lucas Burchard Señoret.
2.2 ZEA
2.2.1 Concepto y origen
La ZEA es una de las micotoxinas más comunes producidas por las diferentes
especies de Fusarium, que es considerado el género productor de micotoxinas de
mayor prevalencia en los cereales cultivados en las regiones templadas de América,
Asia y Europa.
La ZEA se forma principalmente después de la cosecha de los cereales (maiz y trigo
principalmente) por inadecuadas practicas de higiene y conservación de los
cereales, sin embargo, también se encuentra en otros cultivos importantes como el
trigo, la cebada, el sorgo y el centeno en varios países del mundo. En el trigo, las
condiciones para la aparición de ZEA serían esencialmente las mismas que para la
aparición de desoxinivalenol, ya que el organismo gana la entrada en la planta
huésped de la misma manera
6
Este compuesto es principalmente un metabolito fúngico estrogénico. Se observa en
placas cromatográficas de capa fina bajo luz ultravioleta de longitud de onda corta
como un compuesto fluorescente verdoso.
La principal especie de hongo responsable de la producción de esta micotoxina es
Fusarium graminearum. El grano infectado con este organismo a menudo tendrá un
color rosado debido a un pigmento que puede producirse simultáneamente con la
ZEA.
En general, las especies de Fusarium crecen en condiciones de frío húmedo e
invaden de manera similar los cultivos en estas condiciones más favorables. El
hallazgo de aflatoxina coexistente con ZEA y desoxinivalenol implicaría que la
infección fue establecida por dos hongos diferentes, Aspergillus flavus en el caso de
aflatoxina y F. graminearum en el caso de las dos últimas micotoxinas.
En el trigo, el sorgo y el maíz, está bien establecido que la ZEA se produce en el
grano antes de la cosecha, pero en otros productos, las encuestas son insuficientes
para determinar si la ZEA ocurrió antes o después de la cosecha. Las variaciones en
la incidencia de ZEA ocurren con diferentes años de cosecha, cultivos de cereales y
quizás áreas geográficas. Sin embargo en un estudio que se realizo en Europa
(Hueza et al 2014), donde prevalece la ZEA, se informo que esta micotoxina estaba
presente en el 32% de 5010 muestras de cereales mixtos. Muchos informes han
revelado la prevalencia de altos niveles de contaminación por ZEA en cultivos de
cereales y otros alimentos en todo el mundo. Además, ZEA es un compuesto estable
durante el almacenamiento, molienda y el procesamiento, coción de alimentos como
lo indica su presencia de algunos productos de granos como el pan, cervezas y
alimentos procesados. En cuanto a la obtención de ZEA en alimentos contaminados
se ha visto implicada como una causa de cambios reproductivos femeninos como
resultado de su poderosa actividad estrogénica: su acción hormonal excede la de la
mayoría de los otros estrógenos no esteroideos naturales. Los síntomas
hiperestrogénicos de ZEA se han reportado en animales de laboratorio como son las
ratas, ratones, cobayas, cerdos que son las especies más sensibles a la toxicosis
por ZEA. Mas adelante añadiremos los niveles máximos tolerados de ZEA para el
consumo humano.
7
2.2.2 Propiedades físicas y químicas de la ZEA
Su formulación es 3,4,5,6,9,10 hexahidro-14,16-dihidroxi-3-metil-1H-2-
benzoxaciclotetradecina-1,7 (8H) dieno.
Sus cristales son de color blanco, su punto de fusión está entre 164-165ºC. En
cuanto a sus propiedades espectrales podemos decir que el IR, UV, RMN de
protones y espectral de masas, los datos han sido reportados. Las absorciones
molares de ZEA en acetonitrilo a 236,274 y se establecieron a 314 nm, una longitud
de onda de referencia común a 274 nm con capacidad de absorción molar de 12623
± 111 L /mol cm. Con respecto a las propiedades químicas, primero hablamos de la
solubilidad, en la que la solubilidad a 25ºC los porcentajes en peso son: 0,002 de
agua; 0,05 de n-hexano; 1,13 de benzeno; 8,6 de acetonitrilo; 17,5 de metanol; 24
de etanol; y 58 de acetona. Por último vamos a hablar de la estabilidad de la ZEA.
La ZEA se mantuvo estable cuando calentando a 120ºC, 29% descompuesto cuando
se calienta a 150ºC durante 60 minutos y 69% cuando calienta a 200ºC durante 60
minutos. Estable a la hidrólisis en neutro o soluciones tampón de acido. Menos de
23% de ZEA se perdió cuando calentando en solución acuosa tampón para 125ºC
durante 60 minutos, pero 34-68% se perdió después de 60 minutos a 150ºC
dependiendo del pH del tampón. Más de 92% se perdió después de 60 minutos a
175ºC y para completar se observo perdida en <30 minutos a 225ºC
independientemente de pH. ZEA era más estable a pH 7 y la mayoría de las
perdidas ocurrieron por encima de 175 ºC.
Figura 3. Estructura molecular de la ZEA. Imagen obtenida de la wikipedia.
8
2.3 Procedimientos para reducir la presencia de micotoxinas en alimentos
Para empezar, vamos a hablar de diferentes estrategias de prevención y de
reducción de los niveles de micotoxinas y el cumplimiento de las normativas de los
máximos tóxicos. La forma más factible de gestionar y controlar la contaminación por
micotoxinas en productos alimenticios (Arroyo-Manzanares et al, 2014). La
prevención se basa en la aplicación de diferentes sistemas preventivos. El sistema
de análisis de peligros y de puntos críticos de control (APPCC) forma un sistema de
gestión de la inocuidad de los alimentos en el cual se quiere dar seguridad de los
alimentos. La buena aplicación del sistema (APPCC) debería de permitir la
reducción de los niveles de micotoxinas en materias primas, piensos, alimentos para
el consumo humano. Se debe basar en una Buena Practica Agrícola como bien se
refleja en la Tabla 2 y en una Buena Práctica de Fabricación.
La primera línea de defensa para la prevención de la contaminación es en el campo
pero es muy difícil de controlar esto debido a que estos factores están relacionados
con las condiciones climáticas.
La Buena Práctica Agrícola:
Practicas previamente a la cosecha
Practicas durante la cosecha
Practicas tras la cosecha
Plan de rotación de
cultivos
Selección del momento
exacto para recolectar los
cereales
Determinar los niveles de
humedad para eitar la
proliferación de los
hongos
Selección de variedades
vegetales resistentes y
selección de semillas
modificadas
genéticamente
Elegir la maquinaria
adecuada para cada
recolección
Aplicación de la limpieza
de los granos y
eliminación de daños
dañados y deteriorados
Control de suministro del
agua a través del sistema
de riego
Utilización de
contenedores adecuados
para el transporte de la
Control de las
instalaciones, tanta la
humedad como la
9
materia prima, que esten
limpios, secos y libres de
insectos
temperatura para que no
se genere mohos
micotoxigenicos durante el
almacenamiento
Uso de fertilizantes para
garantizar un buen pH
Utilización de las
sustancias adecuadas
para la no generación de
mohos e insectos
Empleo de fungicidas para
inhibir los hongos que
producen micotoxinas
Tabla 2. La buena práctica agrícola dividida en las tres partes desde la plantación de
cultivos hasta después de la recolección. (Tabla de elaboración propia)
La Buena Práctica de Fabricación:
La principal idea de esto es evitar que estas micotoxinas sean la fuente de
contaminación. Las micotoxinas son peligros químicos, pero de origen biológico. La
buena Practica de Fabricación comprenden el desarrollo de procedimientos para su
adecuado mantenimiento y desinfección de instalaciones, control de plagas etc.
También estudia cómo hacer para que no se produzca una contaminación cruzada y
el desarrollo de un plan de homologación de proveedores.
Si es verdad que en ocasiones la prevención no es suficiente para detener el
desarrollo fúngico y la producción de micotoxinas. Por eso ahora lo que debemos
hacer es aplicar procedimientos de descontaminación para reducir niveles de toxinas
al mínimo.
-Se deben de destruir, eliminar o inactivar las micotoxinas, para asegurar que
no se vuelvan a producir micotoxinas
-No se deben de producir residuos tóxicos, carcinógenos en el producto final
-No deben alterar las propiedades tecnológicas del producto final.
10
-Tienen que ser económicamente viables para permitir la aplicabilidad gran
escala
-No debe producir alteraciones en el ambiente de los tratamientos aplicados
Actualmente el análisis de micotoxinas presenta diversos retos que no han
encontrado una solución definitiva. Por lo que cabe destacar el metabolismo de
algunas plantas que poseen mecanismos naturales de detoxificación y el procesado
de alimentos, que pueden dar lugar a compuestos conjugados conocidos como
micotoxinas enmascaradas que tienen comportamientos diferentes a las micotoxinas
de origen. Esto ocurre en las toxinas Fusarium (tricotecenos, ZEN y fumonisinas).
Algunas plantas son capaces de convertir los apolares tricotecenos y ZEN en
derivados mas polares a través de la conjugación con azucares, aminoácidos o
grupos sulfato. Serán hidrolizadas en el tracto digestivo de los animales, pudiendo
presentar efectos tóxicos comparables a los de las micotoxinas libres.
Igualmente los procesos tecnológicos tienen un papel importante en los mecanismos
de enmascaramiento, fundamentalmente en productos derivados de cereales, ya
que pueden inducir reacciones con macromoléculas tales como azúcares, proteínas
o lípidos. Los datos toxicológicos relativos a micotoxinas enmascaradas son
escasos, pero se da un dato para la seguridad de los consumidores. En particular, la
posible hidrólisis de la micotoxina enmascarada durante la digestión de los
mamíferos sería un factor de riesgo a tener en consideración. Así, productos con
una aparentemente baja contaminación por micotoxinas, han inducido efectos
tóxicos debido a la presencia de fumonisinas "ocultas", liberadas tras la hidrólisis.
De este modo, las micotoxinas enmascaradas pueden contribuir cuantitativamente a
la cantidad total de micotoxinas presentes en matrices como el maíz y sus
derivados. Por lo que es prioritario que se desarrollen métodos analíticos para la
determinación de micotoxinas que incluyan a sus distintos productos de
transformación, con objeto de evaluar el riesgo que suponen para la salud del
consumidor
Cuando la matriz se trata de alimentos, no se pueden tratar con productos químicos
ya que la materia prima quedaría deteriorada por lo que se utiliza lo siguiente:
11
Absorbentes:
Son un tipo de sustancias usadas para disminuir las micotoxinas en materias primas.
Uno de los aspectos más importantes en el proceso de adsorción es saber las
características del adsorbente y del adsorbato. Las características más importantes
del adsorbente que se tienen que tener en cuenta son la estructura física, la
distribución de carga, la carga total, el tamaño de los poros y la superficie accesible
de éste. Por otro lado, las características más importantes del adsorbato que se
deben de tener en cuenta, son el tamaño de éstas, la solubilidad, la forma, su
polaridad. Algunos de los adsorbentes usados para disminuir las micotoxinas en
materias primas pueden ser:
-Carbon activo: Este tipo de absorbente actúa muy bien en disolución acuosa pero
es un absorvente inespecífico por lo que puede absorber nutrientes esenciales del
alimento que se trata.
-Polimeros: La resina colestiramina se utiliza para la unión de ácidos biliares y para
la disminución del colesterol en sangre. La eficacia de este absorbente in vitro ha
destacado con ocratoxina A, ZEA y fumonisinas (Mishra et al, 2003).
Metodos físicos:
Como sabemos, para la reducción de micotoxinas en alimentos se utiliza un
absorbente como es el carbón activo que es un excelente absorbente en ambientes
acuosos. Durante la clasificación y separación mecánica, el producto limpio se
separa de los granos contaminados con micotoxinas, mientras que los
procedimientos de lavado con agua o solución de carbonato de sodio también
pueden dar lugar a una reducción de las micotoxinas en los granos. Por eso la
limpieza del trigo genera un 50% de reducción de esta micotoxina al igual que la
molienda de trigo duro para producir harina blanca resulto en una reducción de
aproximadamente el 65%, y se produjo una disminución adicional del 10% durante la
coción.
12
Métodos químicos:
Algunos de los métodos químicos comúnes usados son:
H2O2 , Ozono: es uno de los métodos más efectivos para la detoxificación y usados
en procesos para alimentos. Por ejemplo en la Patulina, ZEA y Aflatoxinas han sido
perfectamente degradadas con este método.
Acido Formico : Se ha demostrado que con la albumina de huevo se elimina sin
eliminas el polifenol con la dosis de un 16%. También es verdad que utilizando el
compuesto complejo basado en las plantas de proteínas se puede reducir hasta un
40% en vinificación notando un ligero efecto en la concentración del polifenol y en su
intensidad del color.
Metodos biológicos:
La desintoxicación de las micotoxinas también puede lograrse enzimáticamente.
Algunas enzimas pueden realizar una transformación de las micotoxinas
naturalmente en los productos alimenticios, se generan durante la etapa de
fermentación o la introducción de enzimas purificadas. Una de las características
más importantes de la desintoxicación enzimática es que es muy específica, y
debido a esto y a su perfil toxicológico, las enzimas tienen un potencial alto para
desintoxicar los contaminantes orgánicos en los alimentos. Diferentes tipos de
bacterias y hongos pueden transformar las micotoxinas en productos no tóxicos.
Como resumen podemos decir que cualquier proceso de reducción de micotoxinas
en alimentos tiene que cumplir las siguientes pautas:
-La micotoxina tiene que ser destruida o transformada en un compuesto que no sea
toxico
-Las esporas de hongos deben destruirse para que no se formen de nuevo nuevas
toxinas.
13
-Las propiedades físicas del alimento no deben cambiar mucho.
-El proceso de desintoxicación debe ser viable económicamente. Que cueste menos
que el alimento que se va a analizar.
2.4 Normativa sobre los contenidos máximos de ZEA en alimentos.
Por dar una introducción, como sabemos, la Comisión del Codex Alimentarius (CCA)
apunta a facilitar el comercio mundial y a proteger la salud de los consumidores
mediante el dasarrollo de normas internacionales para los alimentos. Dentro del
(CCA), el comité del Codex para aditivos alimentarios y contaminantes de alimentos
(CCFAC) establece límites máximos para los aditivos y los contaminantes en los
alimentos que son decisivos en conflictos comerciales. El CCFAC desarrolla normas
basadas en un procedimiento, donde los principios del análisis de riesgo según las
reglas y los métodos establecidos en el manual del Codex y en la norma para
contaminantes y toxinas del Codex.
El procedimiento requiere la presentación de documentos de discusión relacionados
con todos los aspectos relevantes de un contaminante de alimentos siempre y
cuando haya motivos para esperar problemas sanitarios o comerciales.
Estos requisitos son los de poder sustanciar los problemas de salud, de preferencia
basados en una evaluación de la exposición y toxicológica por parte de JECFA y y
disponer de datos confiables acerca de los niveles en los alimentos.
En la Unión Europea, JECFA y EFSA son las organizaciones encargadas en el
proceso de evaluación del riesgo de contaminantes alimentarios. Los datos
toxicológicos y los datos de presencia de micotoxinas en productos alimentarios
proporcionan información para la evaluación del riesgo y de ahí se disponen los
limites reglamentarios. La ZEA ya había sido evaluada por el comité mixto de
FAO/OMS de expertos en aditivos alimentarios (JECFA) en el año 2000. Y se
estableció una ingesta diaria tolerable de 0.5 µg/Kg por peso corporal.
14
En el atículo 2 del Reglamento (CEE) nº 315/933 del Consejo estipula que los
alimentos que contengan un contaminante en una cantidad inaceptable para la salud
pública no se comercializara, los niveles se tienen que mantener tan bajos como sea
posible y si es necesario, La Comisión Europea establece niveles máximos para
contaminantes específicos.
Estos niveles máximos se establecen en el Anexo del Reglamento (CE) nº
1881/2006 de la Comisión 4 y pueden incluir límites para los mismos contaminantes
en diferentes alimentos que lo vamos a ver mejor reflejado en la Tabla 3, límites de
detección analítica y referencia a los métodos de muestreo y análisis que se
utilizaran. Los niveles máximos de ZEN se enumeran para varios alimentos a base
de granos no procesados y procesados que varían de 50 a 200 µg/Kg. Por lo tanto el
cereal solicito un aumento temporal del nivel de la ZEA en los cereales de desayuno
ricos en fibra de 50 µg/Kg a 135 µg/Kg. Según una evaluación de riesgos realizada
por la Agencia de Normas Alimentarias (FSA) se puede decir que es poco probable
que exista un riesgo para la salud por el aumento de límite de la ZEA.
Sobre la base de esta evaluación y para garantizar el suministro y la disponibilidad
de cereales para el desayuno ricos en fibra, dados sus efectos beneficiosos para la
salud, se recomendó a los Estados miembros que presenten una solicitud de forma
temporal durante un período de tiempo limitado (es decir, cereales para el desayuno
ricos en fibra con fecha de producción anterior al 31 de octubre de 2009) un nivel de
100 µg / kg de ZEA para cereales de desayuno ricos en fibra que no sean cereales
de desayuno a base de maíz (el nivel máximo actual de ZEA en cereales de
desayuno a base de maíz es 100 µg / kg). El salvado de trigo para usar en los
cereales de desayuno ricos en fibra no debe tener un nivel superior a 125 µg / kg
para permitir a los productores de cereales de desayuno ricos en fibra cumplir con el
nivel temporal propuesto de 100 µg / kg para cereales de desayuno ricos en fibra
que no sean cereales de desayuno a base de maíz pero en la Tabla 3 esta todo
mejor explicado.
15
ZEACONTENIDOS
MAXIMOS(µg/Kg)1 Cereales sin procesar distintos del maíz 100
2 Maiz sin procesar con la excepción del maíz sin
procesado destinado a ser procesado por molienda
humeda
350
3 Cereales destinados al consumo humano directo,
harina de cereales, salvado y germen como producto
final
75
4 Aceite de maíz refinado 400
5 Pan, galletas pasteles, refrigerios de cereales, y
cereales para desayuno
50
6 Maiz para el consumo humano, aperitivos a base de
maíz y cereales para el desayuno a base de maíz
100
7 Alimentos procesados a base de cereales y
alimentos para bebes y niños
20
8 Alimentos elaborados a base de maíz para lactantes
y niños pequeños
20
9 Fresado de fracciones de maíz con un tamaño de
particula > 500 micras y otros productos de molienda
de maíz con un tamaño > 500 micras no utilizado
para el consumo humano directo.
200
10 Fresado de fracciones de maíz con un tamaño de
particula < 500 micras y otros productos de molienda
de maíz con un tamaño < 500 micras no utilizado
para el consumo humano directo.
300
Tabla 3. Los niveles máximos de ZEA legislados por la Comision de regulación (EC)
1881/2006. Tabla obtenida del Ministerio de agricultura y pesca en un articulo
llamado (Recomendaciones para la prevención, el control y la vigilancia en las
fabricas de harina y sémolas)
16
2.5. Técnicas de extracción y de purificación de la ZEA en trigo y sus derivados.
Lo primero que habría que hacer a la hora de saber la extracción y técnicas de
purificación, es la toma de muestra, se puede muestrear en cualquier supermercado.
Muestras relacionadas con productos de trigo como la harina, macarrones,
spaguetti, pizzas, mezcla de harinas….
Las muestras después se deben de llevar a un laboratorio para ser analizadas bajo
condiciones ambientales y con todas sus etiquetas correspondientes. Las muestras
se deben de guardar en condiciones iguales y congeladas a -4ºC hasta que se
acabe su análisis.
La extracción de ZEA en derivados de productos de trigo se lleva a cabo mediante
diferentes técnicas de extracción y purificación que vamos a explicas ahora. Se
puede utilizar la extracción solido-liquido o extracción liquido-liquido.
Extracción Solido-Liquido (SPE):
La extracción en fase sólida SPE es una técnica preparativa para “limpiar” la
muestra previa. Se le llama extracción en fase sólida ya que el material de soporte
es un sólido a través del cual pasa un líquido. Los analitos son absorbidos en el
soporte y luego eluidos debido a sus diferentes afinidades entre el material
absorbente y la fase móvil utilizada. La separación de una mezcla de compuestos
solidos se puede llevar a cabo aprovechando diferencias de solubilidad en un
determinado disolvente. El caso favorable de una mezcla de sólidos en la cual uno
de los compuestos es soluble en un determinado disolvente (disolvente orgánico),
sin embargo los otros son insolubles, podemos hacer una extracción consistente en
añadir este disolvente a la mezcla contenida en un vaso o matraz en frio o caliente.
Agitar con varilla y separar por filtración la disolución que obtendríamos el producto
extraído y la fracción insoluble con las impurezas. Al contrario, lo que se pretende es
disolver las impurezas de una mezcla solida dejando el producto deseado como
fracción insoluble, el proceso en vez de extracción, se llama lavado.
17
En cuanto a la extracción Sólido- Líquido en continuo donde la sustancia a extraer
se encuentra en estado sólido y el extractor es un liquido se utiliza el Soxhlet, que es
la técnica más utilizada y consistente en extraer la mezcla con un disolvente soluble
en todos los componentes. Podemos decir que esta extracción se trata de una
combinación entre la extracción y la destilación que permite la recuperación de
disolvente
Ventajas en la utilización de la extracción en fase sólida:
- Tamaño de muestra puede ser grande o pequeño
- El volumen de elución es pequeño
- Pocas posibilidades de contaminación
- Existen columnas especiales de vidrio y de teflón con fritados de teflón que tienen
un nivel de extraíbles cero.
Figura 4. Columnas SPE que se utilizan en la extracción solido-liquido. (Imagen obtenida
de la web de análisis vínicos)
Extracción liquido-liquido:
La extracción líquido-líquido es un proceso químico que sirve para separar una
mezcla de compuestos debido a su diferencia de solubilidad entre dos líquidos
inmiscibles como por ejemplo el agua, éter etílico, acetonitrilo. Es decir, tratar la
mezcla de compuestos que hemos dicho anteriormente con un disolvente de tal
18
forma que uno de los componentes se disuelva en dicho disolvente y el resto de
sustancias no lo haga. Los compuestos orgánicos en disoluciones acuosas se
extraen generalmente agitando vigorosamente dicha solución con el disolvente
orgánico no miscible. El proceso se realiza con un embudo de decantación.
Por poner un ejemplo vamos a decir que algunas veces la extracción por disolvente
se usa como una alternativa a la separación por destilación o evaporación. Por
ejemplo el acido acético se separa del agua por destilación. Después de esta
operación el producto resultante se destila, la elección de destilación o extracción
con disolvente depende de gran parte, de los costos relativos. Se utiliza una
columna de tipo Rotating disk contactor en la que se efectúa la extracción con
acetato de etilo a contracorriente. El acido pasa mayoritariamente a la fase orgánica
y sale de la columna en la corriente que se conoce como extracto, sin embargo el
refinado es fundamentalmente el diluyente con el soluto que no se ha extraído.
Este proceso de extracción Líquido-Líquido se desarrolla en tres etapas: Primero se
agita vigorosamente ambas capas, se deja sedimentar ambas capas, se separan y
la eliminación del disolvente se realiza en un rotavapor.
La función de este rotavapor se trata de eliminar un disolvente orgánico de una
mezcla de reacción, el motor eléctrico produce el giro de un tubo con ajuste
esmerilado al cual se acopla el matraz de fondo redondo con dicha disolución, el
matraz debe estar parcialmente sumergido en un baño de agua que tiene que estar
entre 35-40ºC. Acoplado al sistema tenemos un refrigerante que circula agua que es
el que produce la condensación de vapores del disolvente que se recogen en el
colector, este mismo proceso se podría realizar con destilación simple pero sería un
proceso más lento e incomodo.
19
Figura 5. Representación de la extracción liquido-liquido. (Imagen obtenida de la web De
Dietrich process system)
2.6.Tecnicas de análisis de ZEA en trigo y derivados.
Para dar una breve introducción sobre el proceso de análisis de muestras en
materias primas, piensos, alimentos hay que saber que es un punto crítico de control
en el ámbito de la seguridad alimentaria. Con el fin de alcanzar el nivel de protección
deseado, para la evaluación de riesgos se debe de disponer de datos fiables. Por lo
que necesitamos métodos apropiados que permitan la correcta identificación y
cuantificación de las micotoxinas en las diferentes matrices en las que pueden estar
presentes.
Los criterios que deben de reunir los métodos de muestreo y de análisis para el
control oficial de micotoxinas, se han establecido en el Reglamento nº 401/2006. Los
análisis de micotoxinas requieren una primera parte de muestreo y después se debe
de hacer un tratamiento de muestra que consiste en la extracción y purificación
según las micotoxinas que se vayan a estudiar. En cuanto a técnicas de extracción
podemos destacar las más tradicionales como la extracción líquido-líquido.
En cuanto a las técnicas de separación, cuantificación y detección de mayor difusión
podemos hablar del HPLC, acoplada con diferentes detectores como son los
detectores de espectrometría de masas, y el detector fluorescente. En un solo paso
tenemos al LC-MS/MS que ha permitido el desarrollo de métodos multi-componente
ofreciendo más sensibilidad, selectividad y fiabilidad permitiendo una identificación
de micotoxinas exacta.
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es un tipo de cromatografía de elución.
Tenemos una fase móvil y una fase estacionaria, en la móvil circula en intimo
contacto con un sólido y en la estacionaria otro sólido o líquido pero inmiscible. En
cromatografía liquida, utilizando como mecanismo de separación el reparto, cuando
la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil el sistema se llama fase
reversa y los analitos polares tienen menos afinidad por la fase estacionaria que los
apolares. El mecanismo de separación será el reparto por lo que los solutos se
20
repartirán entre una fase estacionaria liquida y apolar y una fase móvil también
liquida, mas polar que la anterior.
Al introducir una mezcla de analitos, cada uno avanzara con una velocidad diferente
el uno del otro que esto depende por la afinidad por cada una de las fases. Al acabar
el recorrido por la columna, cada una de las sustancias eluirá en el sistema a
tiempos diferentes por lo que estarán separadas
La fluorescencia es de particular interés por su alta sensibilidad y selectividad, el
HPLC-FD se considera más interesante desde el punto de vista analítico que el
HPLC-MS/MS debido a que el acoplamiento con detector de masas proporciona un
aumento de sensibilidad. Además el HPLC-FD no requiere líneas de gas portador a
altas presiones y su mantenimiento es sencillo, como desventaja, para algunas
familias de compuestos no fluorescentes es necesaria una etapa de derivatización
que permita la conversión a un producto fluorescente.
Los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos son:
-Bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes, el sistema de bombeo debe
soportar presiones de hasta 6000 psi, debe proporcionar flujos en un rango de 0,1 a
10 mL/min, control de flujo y reproducibilidad < 0.5% y resistentes a la corrosión. El
sistema de bombeo puede ser isocrático o de gradiente.
-Inyector: Esta el inyector manual y el automático, dentro del automático está el de
precisión, termostatización y programabilidad. Los inyectores automáticos son más
precisos y lineales, tienen compatibilidad con viales, placas y multipocillo, tiempo de
equilibrado, contaminación cruzada.
-Conductos y conexiones. Los tubos de conexión pueden ser de metal o de
politetrafluoroetileno, fluoroetienpropileno, polieteretercetona.
-Detector y registrador. Hay detectores generales y específicos, los generales
responden a las propiedades de la fase móvil que varían en presencia de solutos y
los específicos responden a alguna propiedad del soluto, no presente en la fase
móvil.
21
-Columna
El detector es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una
propiedad física del eluyente, que deberá depender de la composición de este. La
detección se hace siempre en continuo aunque es posible la utilización de colectores
de fracciones para la identificación de pequeñas fracciones de eluyente.
Hay que saber que la fase estacionaria es la fase apolar y la fase móvil es polar, la
fase estacionaria es menos polar que la fase móvil. La fase reversa se trata de que
la retención está basada en la interacción, de tipo hidrófobo, entre la fase
estacionaria y la región no polar del analito. Sin embargo mas del 90% de las
aplicaciones HPLC de compuestos de bajo peso molecular se hacen en
cromatografía de partición en fase reversa. El control de la retención en fase reversa
nos dice que para aumentar el tiempo de retención de analitos, aumentar la
polaridad de una fase móvil, esto suele conseguirse incrementando el porcentaje de
agua.
Figura 6. Esquema de HPLC utilizando en la mayoría de los artículos. (Imagen obtenida de
laboratory-journal.com)
HPLC combinado con Espectrómetro de Masas:
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La cromatografía líquida o de gases acoplada a Espectrometría de masas, ofrece
una poderosa técnica analítica que combina la cromatografía como técnica de
separación y la espectrometría de masas como técnica de detección, identificación y
cuantificación. La espectrometría de masas es una potente técnica instrumental de
análisis, de alta sensibilidad, basada en la ionización de las moléculas y en la
separación de sus iones producidos según la relación (masa/carga). Esta técnica
puede utilizarse tanto al análisis cualitativo como al cuantitativo de una muestra
siendo especialmente potente cuando se une a una técnica de separación previa
como es la cromatográfica. En su vertiente cualitativa, la espectrometría de masas
nos da las herramientas que necesitamos para la identificación de sustancias, tanto
a partir de sus iones fragmentos que se producen al romper la molecula como
utilizando el valor de su masa exacta.
Los equipos de HPLC-MS pueden tener dos tipos distintos de interfases que se
incluyen dentro de la denominada ionización a presión atmosférica (API),
denominadas electrospray (ESI) e ionización química a presión atmosférica (APCI)
ambas son combatibles con la mayoría de los solventes volátiles utilizados como
fases móvil en HPLC.
3. OBJETIVOS
El objetivo del trabajo es la realización de una revisión de los diferentes métodos de
análisis que se utilizan en determinaciones como la ZEA en trigo y derivados. Aquí
hemos hablado de técnicas de extracción, purificación y también de las técnicas de
análisis, y con esto se lleva a cabo el estudio de la presencia de ZEA en diferentes
productos y nosotros comparar las técnicas que se han utilizado en cada caso y
asegurarnos si son positivos o negativos por su presencia de contaminantes en los
alimentos.
23
4. REVISION DE METODOS DE ANALISIS DE ZEA EN TRIGO Y DERIVADOS.
Según nuestro sondeo de artículos de análisis de ZEA podemos decir que se habló
que en 2011 la EFSA (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria) propuso un
nuevo TDI de 0,25µg /Kg basado en un dato reciente en cerdo pero habría una
diferencia entre el cerdo y los humanos. En este articulo de (Ramos Aldana, et al,
2014) se evalúa la cantidad de ZEA presente en maíz, trigo, mezcla de harinas para
el consumo humano en el mercado portugués y holandés. Para analizar la muestra
utilizan un HPLC con detector fluorescente.
La fase móvil fue ajustada a un Ph de 3,2 con ácido acético glacial. 1 mL/min. Los
patrones de ZEA fueron preparados con 5 mg/mL a una temperatura de -20ºC. La
disolución intermedia fue preparada a partir de la disolución de reserva con una
concentración de 50 µg/mL en acetonitrilo, también hay que trabajar con las
disoluciones de los patrones. Estos deben de estar en la oscuridad a 4ºC hasta su
análisis. La curva de calibración de las disoluciones patrón fue preparada con una
concentración de entre 12.5 y 200 nm/mL en acetonitrilo.
El HPLC estaba equipado de una bomba y una columna C18, como detector se uso
un espectrofluorímetro para medir las longitudes de onda de emisión y de excitación
respectivamente.
Todo el contenido de ZEA fue analizado y se ha obtenido que en tanto en maíz,
como trigo y mezcla de harinas. El 50% de las muestras de harina de maíz estaban
contaminadas, sin embargo la mezcla de harinas han salido un 35,2% y un 31.6%
de harinas de trigo contaminadas. La harina de trigo holandesa muestra unos
valores muy altos de ZEA con respecto a Portugal 13,1 y 10,7 µg/Kg
respectivamente.
Tras este estudio hemos visto que esta mas presente la ZEA en harinas, ya que en
estudios anteriores veíamos una de cada 7 muestras en Portugal contaminadas, en
todos los países se han ido viendo una mayor cantidad de ZEA presente en los
productos.
24
Muestra Cantidad muestra
Frecuencia (%)
Rango (µg/Kg)
Valor (µg/Kg)
Harina de trigo
Portugal
17 4 (23,5) 7,4 – 15,3 10,7
Harina de trigo
Holanda
2 2 (100) 12,4 – 13,7 13.1
Tabla 4. Diferencia de los resultados de contaminación de harinas de Portugal o en
Holanda
En conclusión como hemos visto, los valores más altos son los de maíz y mezcla de
harinas, pero también es importante ver los datos de la harina de trigo que aunque
sean más bajos, están por encima de los límites establecidos para los niños
pequeños según la EC 401/2006.
Estudiamos otro análisis de (Shahzad Zafar, et al, 2014) de muestras de spaguetti,
noodles, macarrones etc… El muestreo se realizo en diferentes supermercados
donde se cogían productos de diferentes marcas.
La fase móvil para los análisis de ZEA fueron acetonitrilo-metanol y agua en una
proporción (20:20:60), después para el análisis se utilizo también un HPLC equipado
con un detector fluorescente y la columna cromatográfica utilizada es una C18 al
igual que se utiliza en el artículo de (Ramos Aldana, et al, 2014). La longitud de onda
de excitación y de emisión para la ZEA es 274 y 450 nm respectivamente.
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Figura 6. Tabla comparativa de los resultados del artículo entre pasta, noodles,
macarrones y Lasagna (Tabla de elaboración propia)
A continuación vamos a ver en un cuadro las muestras que dan resultados positivos,
la cantidad de muestras en productos de trigo de los diferentes tipos de muestra.
Tipo de Muestra
Cantidad de Muestras
Muestras Positivas
Rango (µg/Kg)
Media (µg/Kg)
(n > 20 µg/Kg)
Spagueti 25 7(28) LOD-69.8 7.36±0.80 4(16)
Noodles 34 6(18) LOD-26.5 6.80±0.91 5(15)
Macarrones 29 10(34) LOD-26.7 4.98±1.10 6(21)
Lasagna 37 12(32) LOD-45.9 6.90±1.50 7(19)
Bucatini 22 11(50) LOD-38.6 8.89±0.56 8(36)
Total 147 46(31) LOD-55.9 30(20)
Tabla 5. Tabla comparativa de resultados de las muestras analizadas (Tabla de elaboración
propia)
En cuanto a los resultados del estudio presente, mostramos el nivel razonable de
contaminación tanto en los productos de trigo procesados como los de trigo crudo.
La contaminación de las muestras en cuanto a ZEN Y AFs se puede explicar ya que
se concentran las micotoxinas en los alimentos debido a las condiciones climáticas
en su cultivo ya que todo proviene de Pakistan. Es cultivado en invierno y es
recogido en verano para que así aumenta las posibilidades de pre-cosecha. El
tratamiento que se lleva a cabo en el cultivo es el más tradicional posible para evitar
problemas de contaminación.
Como conclusión:
26
Hay que decir que en las muestras de trigo naturales de Pakistan (spaguetti,
noodles, macarrones….), el 30-31% del total de las muestras han sido encontradas
como positivos en contaminación por ZEA, AFs. Eso sí, los niveles encontrados eran
niveles permitidos en todo momento. Pero es un buen estudio para implementar las
nuevas leyes en cuanto a la eliminación ya que se sabe el % de contaminación que
sale en las muestras. Al igual que en el artículo de (Ramos Aldana, et al, 2014)
también se da positivo en mezcla de harinas que han salido un 35,2%
contaminadas y un 31.6% de harinas de trigo contaminadas.
Un estudio que se realizo de (Roigé, et al, 2009) en Buenos Aires (Argentina) sobre
granos de trigo y muestras de harina. El proceso es el mismo en todas las
investigaciones ya una vez realizada la toma de muestra, las muestras se llevan al
laboratorio y se almacenan a 4ºC, se aíslan y se identifican los hongos.
La ZEA fue cuantificada también mediante la fase reversa del HPLC con un detector
fluorescente al igual que los dos artículos anteriores. Un mililitro del extracto original
fue limpiado mediante una columna de inmunoafinidad. Las condiciones
cromatográficas consisten en una fase móvil de la mezcla acetonitrilo:agua:metanol
(32:40:28). El detector fluorescente tiene una longitud de onda de excitación de
236nm y una longitud de onda de emisión de 418nm.
En este estudio que se hizo de maíz, trigo y muestras de alimentos fermentados, el
49% de los productos de trigo fueron encontrados como contaminados por ZEA, el
36% de productos de maíz fueron contaminados por la misma micotoxina y el 16%
de los productos fermentados fueron encontrados también con contaminación de
ZEA. Sin embargo en este articulo a diferencia del artículo de el de (Ramos Aldana,
et al, 2014) las muestras de trigo dan un porcentaje más alto de contaminación que
los productos de maíz.
En el siguiente articulo (Yazhi Zheng, et al 2014) vamos a hablar tanto de la
toxicidad como de las propiedades nutricionales del trigo que es particularmente
importante en la dieta humana. Como ya sabemos la ZEA es una importante toxina
Fusarium y causa síndrome hiperestrogénico y disfunción reproductiva. El análisis se
lleva a cabo mediante un HPLC con un detector de fluorescente con una columna
C18 donde la composición de la fase móvil es acetonitrilo:agua en una proporción
65:35.
27
Los granos fueron plantados en la tierra y las plantas fueron tratadas con toxinas,
todo esto ocurrió en Japón en una isla llamada Honshu y en el sur de Japón cuyo
nombre es Kyushu. La longitud de onda de excitación es de 276nm y la de emisión
es 460nm. Para concluir, podemos decir que la determinación de ZEA en trigo
japonés no ha sido válido para el método. Como observamos en la siguiente tabla la
harina tanto de una forma u otra en un sitio u otro tiene menor % de contaminación
de micotoxina que el grano limpio pero sin embargo el salvado presenta mayores
valores de contaminantes que la harina y el grano limpio.
Cantidad (mg/Kg)
% medio de Norin 61
RSD Norin 61 en %
% medio de Chikugoizumi
RSD Chikugoizumi
Grano limpio
0.4 112.9 9.4 112.1 2.8
Harina integral
0.4 102.8 2.0 103.8 3.1
Harina de bajo grado
0.4 109.3 4.9 105.4 2.1
Salvado 0.4 116.7 13.1 108.1 3.9
Tabla 6. Tablas comparativas de resultados de las muestras analizadas (Tabla de
elaboración propia)
Con respecto al artículo (Zaied, et al, 2012) de Túnez, se ha realizado un estudio
sobre los granos de maíz de allí. Allí el sistema de agricultura está más diversificado.
El tiempo allí es uno de los principales motivos por lo que se infectan los granos de
trigo, en Túnez se consume en gran cantidad los alimentos de trigo y sus derivados.
Doscientas cinco muestras son analizadas de granos de trigo, 155 de trigo duro y 50
de muestras de trigo de diferentes partes del país.
La técnica utilizada es el HPLC equipado con ion cuadrupolo y un auto inyector, por
supuesto con un detector fluorimétrico. La separación se llevo a cabo mediante una
columna C18. La fase móvil consiste en una mezcla de acetonitrilo:agua:metanol en
proporción (48:50:3). Los resultados que se dan en los análisis de estas muestras
son presentados en la siguiente tabla.
28
Vamos a ver en la tabla las muestras contaminadas con ZEA de muestras de grano
de trigo duro, recogido en 2010 en las diferentes zonas de Túnez.
Regiones Muestras contaminadas
Rango de ZEA
(µg/Kg)
Promedio de
muestras totales
(µg/Kg)
Promedio de contaminacion
(µg/Kg)
Mediana
Jendouba 37/50 0-560 61 68 35
Beja 32/37 0-148 36 50 26
Siliana 34/40 0-204 56 70 35
Bizerte 14/14 16-525 176 176 64
El kef 6/14 0-120 31 58 84
Total 123/155 0-560 58 110 35
Tabla 7. Tabla comparativa de resultados. (Tabla de elaboración propia)
Como vemos en este articulo, el maíz se encuentra bastante contaminado en este
caso en la zona de Túnez, pero todas las muestras analizadas, más de la mitad de
las muestras salen contaminadas, como bien veíamos en los artículos anteriores el
maíz se detecta con mucha contaminación de ZEA con respecto al trigo aunque este
articulo solo estudie muestras de trigo y una vez más el HPLC con detector
fluorescente consigue un resultado parecido en la mayoría de los artículos
estudiados hasta ahora.
Como sabemos, la ZEA es una micotoxina estrogénica que es co-producida
principalmente por Fusarium graminearum y Fusarium culmorum. En Turquía,
(Golge, et al 2020) un total de 240 muestras, de las cuales 50 de trigo, 15 de
cebada, 50 de harina de trigo… son muestreados de diferentes supermercados de
Turquía. La extracción se llevó a cabo mediante una fase líquido-líquido y el análisis
de las muestras se llevo a cabo mediante un HPLC con fotodiodo array y con un
detector fluorescente. Como conclusión de este articulo destacamos que la
sensibilidad del método analítico era la adecuada para cumplir con los límites de las
micotoxinas que era el objetivo establecido por la Unión Europea y los parámetros
de validación cumplen con los requisitos de los criterios de rendimiento establecidos
29
en el Reglamento de la comisión Nº 401/2006. En cuanto a la ZEA un 4% de trigo y
también 4% de harinas de trigo fue encontrado como resultados positivos. Aquí en
este articulo al estudiar solo trigo con el mismo equipo que en el artículo anterior de
(Zaied, et al, 2012) se obtiene un porcentaje de muestras contaminadas muy inferior
al del articulo anterior que era un estudio de muestras de maíz.
Otro artículo en el que se utiliza la misma técnica de análisis es (Zhang, et al 2018).
Un total de 85 muestras de harina de trigo integral y harina de trigo refinada fueron
analizadas en el estudio. Se realizó el análisis mediante HPLC con un detector
fluorescente como todos los anteriores. Esto ocurrió en China y este estudio refleja
la importancia de comparar los riesgos para la salud causados por múltiples
micotoxinas entre la harina de trigo integral y la harina de trigo refinada. Esta es la
razón para así consumir harina refinada mientras que la harina de trigo integral
podría causar unos importantes problemas para la salud. Como ya hemos visto en
los anteriores artículos, el trigo es el más detectado como contaminación de ZEA en
comparación de el maíz con esta técnica de HPLC-FD y en este último artículo lo
que vemos es la diferencia que hay dentro de las distintas harinas de trigo.
Producto Parámetros ZENTrigo Integral Muestras positivas (%) 6 (17.14)
Rango (µg/Kg) <LOD
Media muestras
positivas (µg/Kg)
7.12
Media valor (µg/Kg) 1.22
Mediana (µg/Kg) <LOD
Trigo Refinado Muestras Positivas (%) 0 (0)
Rango (µg/Kg) <LOD
Media muestras
positivas (µg/Kg)
<LOD
Media valor (µg/Kg) <LOD
Mediana (µg/Kg) <LOD
Tabla 8. Tabla comparativa de resultados entre el trigo integral y refinado. (Tabla de
elaboración propia)
30
Al igual que hemos visto una comparación de todos los artículos realizados con la
técnica de HPLC con un detector fluorescente, ahora vamos a hacer una
comparación de todos los artículos que hemos encontrado con la utilización del
HPLC-MS/MS
Un estudio que se hizo de (Rickes da Luz, et al 2017) en Brasil, fue el de analizar
unas replicas de muestras biológicas para cada tratamiento con una distribución y
tratamiento aleatorio. A las plantas se le fueron añadiendo los diferentes fungicidas.
Las plantas de trigo fueron cosechadas 30 días después de la aplicación de
fungicidas, respetando y esperando los tiempos de espera correspondientes.
Las micotoxinas y fungicidas fueron detectados por un HPLC acoplado con un
espectrómetro de masas, con un detector de diodo array y una columna C18 en la
fase reversa. El espectrómetro de masas esta equipado con una fuente de
ionización, el filtro de masas para cuadrupolo y es muy rápido a la hora de medir.
Los compuestos ionizados estaban en el modo positivo con una serie de parámetros
para operar, tipo voltaje capilar, presión del nebulizador
Todas las muestras fueron encontradas con contaminantes, a pesar de los
tratamientos de fungicidas para reducir la existencia de ellos no fue posible. Por lo
general las micotoxinas son producidas cuando los hongos están por debajo del
estrés, como la temperatura, actividad del agua o la cantidad de oxigeno es menor
para el desarrollo favorable. Aquí la utilización del HPLC-MS/MS es bastante
efectiva ya que todas las muestras que se someten al análisis son detectadas como
positivas en ZEA, se supone con los tiempos de espera al añadir el fungicida es el
adecuado.
Una serie de muestras de trigo fueron analizadas en el siguiente articulo (Stanciu, et
al 2016) tanto alimentos sin procesar como harinas blancas de trigo. Todas las
muestras fueron analizadas mediante un HPLC-MS/MS utilizando como en todas las
investigaciones que hemos estudiado una columna C18.
La ZEA fue detectada en un 9% de las muestras analizadas, todas las muestras de
ZEA que dan positivas se exceden de 100 µg/Kg que es el límite máximo en trigo.
31
La incidencia en nuestro estudio fue menor que los niveles encontrados en otros
estudios pero con valores de máximas concentraciones encontrados como 1135
µg/Kg y 73 µg/Kg respectivamente.
En artículos de muestras de ZEA en trigo fueron encontradas en un 69% de las
muestras de trigo, eso fue en un artículo de (Alexa et al. 2013) en Rumania, otro
como el del (Pleadin el al. 2013) también un 69% de 51 muestras de trigo analizadas
y muchos más artículos. Como conclusión de este estudio, sabemos que se ha
realizado la cromatografía de LC-MS/MS después de aplicar una extracción solido-
liquido. Se confirma que las incidencias y rangos de micotoxinas son probablemente
correlacionados con los factores ambientales. Lo que aquí obtenemos con el equipo
utilizado también nos dice que el método utilizado es bastante eficaz puesto que los
compuestos que se dan contaminados tienen niveles muy altos por encima del
máximo establecido incluso.
En el siguiente artículo (Wenjing Xu, et al 2018) habla de el análisis de muestras de
grano de trigo donde se analiza para ver si se da el contaminante ZEA en la
diferentes muestras obtenidas en China. La extracción se realiza igual que en las
demás investigaciones y también se utiliza el HPLC para el análisis de las muestras
y se utiliza una columna C18. La fase móvil consta de una mezcla de agua y
acetonitrilo.
Después de analizar la muestra en el HPLC se utiliza el MS/MS que fue utilizado en
modo negativo por ionización por electropulverización (ESI-) con múltiple función
monitorizada para todas las micotoxinas (RMN). La fuente del MS depende de los
siguientes parámetros:
Voltaje de pulverización de iones (IS) a 4500 V
Fuente de temperatura (TEM) a 600ºC
Gas 1 (GS1) a 55 psi y Gas 2 a 50 psi (GS2).
En 2015 los cultivos que crecieron en la zona de Anhui fueron muy negativos debido
a las condiciones especialmente en la época de cultivo del trigo. Los hongos
producidos podrían generar micotoxinas debido a las altas temperaturas y la
actividad del agua. En este articulo, 370 muestras de grano de trigo fueron
32
analizadas de las cuales un 68,7% de muestras son contaminadas. Aunque si es
verdad que las muestras positivas de ZEA dan un nivel bajo de contaminación ( 25,7
µg/kg) ya que su rango es de 0,3 a 1091,4 µg/kg aproximadamente. Por el
porcentaje obtenido vemos que más de la mitad de las muestras analizadas dan
positivo en contaminación de ZEA.
Según un estudio realizado por (Tralamazza, et al 2016) en Brasil sobre la
diversidad fúngica y ocurrencia natural de ZEA, con respecto a la investigación de la
microbiología de las especies en granos de trigo es importante producir y mantener
la calidad de los productos para su comercialización.
El estudio que se ha llevado a cabo consta de analizar 150 muestras de granos de
trigo, 3-6 días después de su recolecta en diferentes regiones de Brasil. Con
respecto a la extracción, tres gramos de granos de maíz fue homogeneizado en 24
ml de metanol/agua en disolución.
La técnica utilizada es el HPLC-MS/MS equipado con un triple cuadrupolo de
espectrometría de masas con una fuente de electropulverización. Con una columna
de C18.
La detección fue mediante un ion negativo de electrospray usando una múltiple
reacción monitorizada (RMN)
En conclusión, con respecto al estudio realizado podemos decir que se ha detectado
ZEA en 6 muestras de 50 analizadas en Sao Paulo y 42 de 50 muestras analizadas
de Rio Grande. Las de Sao Paolo con un rango de concentración de 22,5-133 µg/kg
y un 57,9 µg/kg de media, y las de Rio Grande con un rango de concentración de
20.4-233 µg/kg y de media un 70.9 µg/kg.
Ahora hablamos con otro artículo que habla sobre la contaminación de productos
alimentarios de trigo y sus derivados (Stanciu, et al 2018) en Rumania. Como
sabemos los contaminantes nos lo podemos encontrar o bien en las plantas o en los
animales e irían directamente al cuerpo de los humanos al ingerir o bien uno u otro.
Se han analizado 181 muestra de productos de trigo que fueron comprados en
mercados de Cluj-Napoca. Harina blanca, pasta, cereales para desayunos, galletas
integrales etc.
33
La extracción que se llevo a cabo fue solido-liquido, todos los experimentos que se
realizaron se hicieron repetidos tres veces. El sistema que se utilizo tenía una fuente
de electro ionización con triple cuadrupolo de espectrómetro de masas, tiene dos
transiciones el MS-MS que una fue de cuantificación y otra de confirmación
mostrando GC-QqQ-MS/MS. En conclusión, esta investigación proporciona
información acerca de muchas toxinas de las que pueden estar presentes en
productos de trigo para el consumo de los humanos en Rumania.
El riesgo asociado a las regulaciones de las micotoxinas pueden traer fallos en
productos que nunca se han estudiado en Rumania. Tres muestras de harina y dos
de pasta se exceden del nivel máximo establecido por la comisión europea. La
misma situación ocurre con las muestras de pan y de galletas aun así no pasa nada
según el estudio con este exceso puesto que podríamos consumir los alimentos de
trigo sin tener problema aunque si es verdad que todos estos estudios son los que
deberíamos de hacer en todos los países y con todos los alimentos para que asi
sepamos lo que comemos llevando este control alimenticio. Si es verdad que todos
los productos que estamos estudiando que se llevan a cabo con un equipo HPLC-
MS/MS en la mayoría de los casos hay un exceso de contaminación que excede el
nivel máximo establecido.
Otro artículo (Quiles, et al 2016) que nos habla de análisis de micotoxinas en masas
de pizzas refrigeradas, se analizaron unas 60 muestras de masa de pizzas de las
cueles un 100% de las muestras salieron contaminadas por ZEA, en un rango de
28,64-176,28 mg/Kg y el promedio fue 77,78 mg/Kg. El 12% del total las muestras
en exceso de contaminación de ZEA. El límite legislado es 75 mg/Kg. El análisis de
las muestras se realizo mediante un HPLC-MS/MS donde se utilizo para separar los
disolventes una columna C18. El método de extracción y purificación de la muestra
fue extracción liquido-liquido. De nuevo observamos lo mismo que en los otros
artículos ya estudiados anteriormente
Hay un estudio de ZEA en harina de maíz (Vidal et al 2013) mediante
electroluminiscencia para así ver la seguridad alimentaria y la calidad en productos.
El estudio se hizo mediante un sensor de electroquimioluminiscencia, se fabricó
mediante electrodo de carbón de cristal. Fueron obtenidos buenos datos que fueron
consistentes según el método HPLC-MS, el sensor muestra tres valores más altos
34
que el HPLC-MS. Por lo que el sensor fue utilizado para supervisar la ZEN producida
durante el moho producido en la harina de maíz. Para verificar la fiabilidad, el
método del sensor electroquimioluminiscente en la muestra, hay que realizar una
adición estándar para determinar la ZEA en harina de maíz. Los requerimientos
están entre el 92.2% y el 111.1% y el valor medio sobre un 100,2%
Otro estudio diferente (fue el de realizar un análisis de 21 muestras de harinas con
HPLC-MS y su extracción se realizo mediante liquido-liquido. De todas las muestras
solo fue una encontrada con ZEA en un nivel muy bajo como es 4.9 µg/Kg. L
muestra que dio positivo era una muestra de harina de maíz producida en Vizcaya.
En 2009 se realizo un estudio (Alborch, et al 2012) en muestras de harina de maíz y
granos de palomitas (maíz) en España. Fueron 30 muestras de harina de maíz y 30
muestras de granos de maíz recogidos en tiendas de España pero cada muestra
tiene un país de origen diferente. Los niveles obtenidos para la ZEA son 50 µg/Kg
con unos límites entre 85 y 92,6 µg/Kg. Finalmente la ZEA no estuvo presente en
ninguna de las muestras. Con este articulo lo que vimos es que en comparación con
los demás artículos el maíz no sale presente como contaminación de ZEA ni con
HPLC-FD ni con HPLC-MS/MS y si se obtiene algo de micotoxina es en muy poca
presencia.
Lo que representamos a continuación son dos tablas resumen de todos los artículos
estudiados. En la primera tabla resumen mostramos las técnicas de extracción y de
purificación, las técnicas que se van a llevar a cabo en cada análisis y por supuesto
la referencia del articulo para saber de cual estamos hablando.
En la segunda tabla, vamos a representar también el país donde se lleva a cabo el
análisis, desde que se recogen muestras hasta que se analizan, el año de
recolección de las muestras que se van a analizar, el numero de muestras totales
que se analizan, el intervalo de concentraciones máximas y mínimas, la
concentración media, técnica utilizada para realizar el análisis y referencia del
articulo del que estamos hablando.
35
Técnicas de extracción y purificación
Técnicas de análisis Referencia
Extracción Liquido-Liquido HPLC-FD (Ramos Aldana, et al,2014)
Extracción Solido-Liquido HPLC-FD (Iqbal, et al 2014)
Extracción Solido-Liquido HPLC-FD (Roigé, et al 2009)
Extracción Liquido-Liquido HPLC con espectrómetro de
masas con un detector diodo
array
(Da luz, et al 2017)
Extracción Solido-Liquido HPLC-MS/MS (Stanciu, et al 2016)
Extracción Liquido-Liquido HPLC-MS/MS (Xu, et al 2018)
Extracción Liquido-Liquido HPLC-MS/MS (Tralamazza, et al 2016)
Extracción Liquido-Liquido GC-QqQ-MS/MS (Stanciu, et al 2018)
Extracción Solido-Liquido HPLC-FD (Zheng, et al 2014)
Extracción Solido-Liquido HPLC-FD (Zaied, et al 2012)
Extracción Liquido-Liquido HPLC-MS/MS (Quiles, et al 2016)
Extracción Liquido-Liquido HPLC con fotodiodo array y
también con detector de
fluorescencia
(Golge, et al 2020)
Extracción Solido-Liquido (Vidal, et ael 2013)
Extracción Solido-Liquido HPLC-FLD (Manova, et al 2009)
Extracción Liquido-Liquido HPLC-FLD (Ibañez-Vea, et al 2011)
Extracción Liquido-Liquido HPLC-MSD (Perez-Torrado, et al 2010)
Extracción Solido-Liquido HPLC-MS/MS (Zhang, et al 2018)
Extracción Solido-Liquido HPLC-MS/MS (Alborch, et al 2012)
Tabla 9. Tabla resumen de las técnicas de extracción y de las técnicas de análisis
utilizadas en todos los artículos estudiados. (Tabla de elaboración propia)
36
País Año recoleccta
Muestras totales
Rango de concentración
máxima y minima(ppm)
Concentracion media(ppm)
Tecnica de análisis
Referencia asticulo
Portugal y
Holanda
Diciembre
2012-Marzo
2013
19 7.4-15.3 en
Portugal
12.4-13.7 en
Holanda
10.7 ± 3.5
En Portugal
13.1 ± 1.0
En Holanda
HPLC-FD (Ramos
Aldana, et
al,2014)
Pakistan Abril 2013 147 LOD- 69.8 en
espaguetis
LOD-26.5 EN
Noodles
LOD-26.7 en
Macarrones
7.36±0.80
6.80±0.91
4.98±1.10
HPLC-FD (Iqbal, et al
2014)
Argentina Durante 2005
y 2006
56 muestras
de trigo y 53
muestras de
maíz
>0.1 a 1.56 ppm Alimentos
fermantados
De 38, 6
positivos de ZEA
Maiz
De 58, 21
positivos e0n
ZEA
Trigo
De 45, 22
positivos en ZEA
HPLC-FD (Roigé, et al
2009)
Brasil 2017
-
-
No lo
suficientemente
detectable
Todas las
muestras
analizadas
dieron positivas
HPLC con
espectrometr
ometro de
masas con
un detector
diodo array
(Da luz, et al
2017)
Rumania Entre enero y
marzo de
2015
66
LOD 51 µg/Kg
LOQ 1135 µg/Kg
La ZEA fue
detectada un 9%
de muestras
analizadas
HPLC-MS/
MS
(Stanciu, et al
2016)
China 2015 370
LOD 31.1 µg/Kg
LOQ 57.9 µg/Kg
42.6 µg/Kg HPLC-MS/
MS
(Xu, et al 2018)
Brasil Entre
septiembre y
noviembre de
2012
50 muestras
de SP
50 Muestras
de RS
SP
LOD 22.5 µg/Kg
LOQ 133 µg/Kg
RS
SP
57.9 µg/Kg
RS
70.9 µg/Kg
HPLC-MS/
MS
(Tralamazza, et
al 2016)
37
LOD 20.4 µg/Kg
LOQ 233 µg/Kg
Rumania De Abril a
Octubre de
2016
181 LOD 5 µg/Kg
LOQ 10 µg/Kg
Muy presente la
ZEA en
productos de
trigo, donde mas
GC-QqQ-
MS/MS
(Stanciu, et al
2018)
Japon 2008 Muestras de
dos cultivos
diferentes
LOD 0.036-0.039
mg/Kg
LOQ 0.072-0.078
mg/Kg
HPLC-FD (Zheng, et al
2014)
Tunez - 205 - 58 Es la media
110 es la media
de las muestras
positivas
HPLC-FD (Zaied, et al
2012)
España De Marzo a
Junio 2015
60 20% de las
muestras esta por
encima del limite
establecido que es
75 µg/Kg
100% de las
muestras fueron
contaminadas
entre 28.64 y
176.28 µg/Kg
con una media
de 77.78 µg/Kg
HPLC-MS/
MS
(Quiles, et al
2016)
Turquia De
Septiembre de
2015 a Agosto
de 2018
240
muestras
mezcladas
de trigo,
harina de
trigo, maíz,
arroz.
Trigo
LOD 1,12 µg/Kg
LOQ 3,5 µg/Kg
Maiz
LOD 1.06 µg/Kg
LOQ 3.7 µg/Kg
20% muestras
de maíz fueron
contaminadas
4% muestras
contaminadas
de trigo
55% de
muestras
contaminadas
de arroz
4% de muestras
contaminadas
de harina de
trigo.
HPLC con
fotodiodo
array y
también con
detector de
fluorescencia
(Golge, et al
2020)
España 2012 67 muestras
en total.
37 muestras
de trigo y 30
muestras de
salvado de
avena
LOD 2 µg/Kg
LOQ 6 µg/Kg
10 DE 67
muestras salen
contaminadas
por ZEA
HPLC-FD (Vidal, et ael
2013)
Bulgaria 2007 91 muestras
totales, 54
de trigo, 18
de cebada y
19 de maíz
Cebada
LOD 3,5 µg/Kg
LOQ 11.6 µg/Kg
Maiz
Cebada
29 µg/Kg
Maiz
80 µg/Kg
HPLC-FLD (Manova, et al
2009)
38
LOD 17.7 µg/Kg
LOQ 58.8 µg/Kg
Trigo
LOD 3.7 µg/Kg
LOQ 12.4 µg/Kg
Trigo
10 µg/Kg
España - 46 muestras
de cereales,
21 muestras
de maíz, 14
de trigo, 8
de trigo y
arroz, 2 de
trigo y maíz
y 1 de arroz.
LOD 1.9 µg/Kg
LQO 8.0 µg/Kg
104.6 µg/Kg HPLC-FLD (Ibañez-Vea, et
al 2011)
España - 21 LOD 1.5 µg/Kg
LOQ 5 µg/Kg
Una sola
muestra dio
positivo con 4.9
µg/Kg
HPLC-MSD (Perez-Torrado,
et al 2010)
China Invierno de
2018
85
-
6 muestras
contaminadas
del trigo integral
y 0
contaminadas
del trigo refinado
HPLC-MS/
MS
(Zhang, et al
2018)
España 2009 30 muestras
de harina de
maíz y 30
muestras de
palomitas
LOD 0.01 µg/Kg
LOQ 3.0 µg/Kg
Ninguna
muestras de las
analizadas fue
detectada como
contaminada por
ZEA
HPLC-MS/
MS
(Alborch, et al
2012)
Tabla 10. Tabla resumen de todos los artículos estudiados con sus límites y valores
medios. (Tabla de elaboración propia)
39
5. CONCLUSIONES
Según los estudios anteriores, sacamos las siguientes conclusiones. En principio al hablar de técnicas de extracción y purificación podemos decir que se han utilizado tanto la extracción sólido-líquido como la líquido-líquido que según el caso se puede utilizar una u otra ya que en una se utilizan solo líquidos que son inmiscibles como ya sabemos y en la otra a partir de un sólido se genera un líquido. En cuanto a las técnicas de análisis utilizadas en los artículos como es el HPLC ligado a un detector fluorescente podemos decir que es un método que se utiliza por su alta sensibilidad y selectividad, como ya sabemos mide la emisión fluorescente por parte de analitos, solo es aplicable para compuestos fluorescentes aunque si es verdad que su campo de aplicación puede ampliarse mediante reacciones de formación de compuestos fluorescentes mediantes un reactor antes o después de la columna.
También se utilizó el HPLC ligado a un espectrofotómetro de masas que tiene un gran potencial y además, sirve para separar, identificar, cuantificar componentes de bajos pesos moleculares, caracterizar productos de altos pesos moleculares, podemos decir que ha sido una técnica que se ha extendido en estos últimos años para el medio ambiente, alimentos y salud pública. Se combina la gran versatilidad del HPLC con la buena sensibilidad y especificidad que produce el MS. En los siguientes pasos se puede explicar el funcionamiento de la MS. a) Las moléculas de los analitos pasan a gas ionizándose, adicionándose o eliminándose un electrón o un protón. b) Separación y el análisis de la masa de los iones moleculares y sus fragmentos cargados basándose en la en la relación masa/carga. c) Medida, amplificación y creación de espectros de masas. Es necesario trabajar con altos vacios.
Como vemos, el HPLC ligado a un MS/MS es un método más universal, sirve para muchos contaminantes y tienes más utilidad que por ejemplo nos da un HPLC-FD pero si es verdad que este último es más barato. Por lo que he sacado en conclusión que se debería de utilizar MS/MS ya que con este método se podría cuantificar más los valores de cada análisis y sus límites de detección y cuantificación serian más bajos, por lo que sería mejor para nuestra salud ya que estaríamos dando valores mas cuantificados.
Vemos que tanto la harina de maíz como la harina de trigo se encuentra contaminada, una más que otra dependiendo de las localizaciones, en Portugal y Holanda la harina de maíz esta mucho más contaminada que la harina de trigo e incluso la harina mezclada que esta última es la que menos contaminada encontramos.
40
También observamos como en estudios de granos de trigo están más contaminados que los de maíz al menos en Argentina con una diferencia del 15% aproximadamente. Lo dicho, en la mayoría de los casos, los granos de trigo salen positivos en micotoxinas, también es verdad que muchas veces la ZEA sale por debajo del límite estipulado como pasa en muchos estudios en China.
Tenemos que tener cuidado con las condiciones alimentarias al menos en Pakistan en el estudio que utilizamos ocurre mucho. Se debe de cuidar más el cultivo y cuando se recoja la cosecha. También tenemos que tener cuidado a la hora de sembrarlo el cultivo y llevar a cabo con un buen mantenimiento, otro factor que nos llamo la atención era que utilizando otra técnica de riego que es el riego suplementario la cantidad de muestras contaminadas era abismal con respecto a otros cuidados.
Como comenté al principio si es verdad que en estudios que vimos de Turquía incluso de Bulgaria, la contaminación era mayor en muestras de maíz que en muestras de trigo. El trigo nos lo podemos encontrar de dos maneras, integral y refinado, el integral sale con una contaminación altísima y el refinado sin un resto de contaminación de micotoxinas.
41
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