La determinación de la biomasa es

uno de los problemas que se presentaen muchos procesos biológicos.Existen diversos métodos, directos e

indirectos, que se han desarrolladousando técnicas físicas y bioquími-cas. En este trabajo se describen algu-nos de ellos, destacando sus ventaiase inconvenientes.

Pqlqbrqs clqve:Determinación de la biomasa, com-ponentes celulares específicos, méto-dos bioquímicos, métodos cinéticos,métodos directos, métodos indirec-tos, métodos de recuento, procesosbiolósicos

Determining biomass in biologícalprocesses,

Direct and indirect methods.Evaluation of biomass concentra-

tion is an important problem encoun-tered in many microbial and othe¡bioprocesses. Many direct and indi-rect methods have been developedusing physical and biochemicai tech-niques. In this work various methodsare discussed taking into the conside-ration their practical importance, use-fulness and constrains in application.

Keywords:Biochemical methods, biomass eva-Iuation, bioprocesses, counting met-hods, direct methods, indirect met-hods, kinetic methods, cellular speci-fic componenis'

l. lntroducciónT a determinación de la biomasa

I .t una de las variables más im-I / portantes de un bioproceso. yaque su determinación nos lleva a lacomprensión de la eficiencia delmismo. Se trata de una variable clavepara establecer las tasas de produc-ción, de consumo de nutrientes y elcálculo de los balances de masa decualqu ier proceso biológico.

Los métodos clásicos de deter-minación de biomasa son métodosdirectos que se basan en el númerode células o en el peso celular. Losmétodos de enumeración celularson métodos de observación, basa-dos en propiedades físicas o en laactividad biológica. Actualmentehay un gran interés en métodos al-ternativos de determinación de Iabiomasa. Estos métodos son indi-rectos y estiman algún componentecelular o alguna actividad metabó-lica específica. No requieren elexamen visual de los organismos nisu incubación. En la Figura 1 se

muestra un resumen esouemático

de los distintos métodos de deter-minación de 1a biomasa.

2. Mérodos directos dedeterminoción de lo biomosq

2,1. Métodos grovimétricosLa cantidad total de biomasa pre-

sente en una muestra puede medirseen lérminos de peso seco por uni-dad de volumen, ya sea como sóli-dos en suspensión totales (SST) o

sólidos en susoensión volátiles(SSV). Las célulis se separan del lí-quido bien por centrifugación bienpor filtración.

La principal desventaja de estastécnicas es que su determinación in-cluye no sóio microorganismos ac-tivos sino microorganismos muer-tos, material inerte, polímeros ex-tracelulares y materia orgánica ad-sorbida. Además, no puede aplicar-se cuando los sustratos a degradarson insolubles.

Los métodos gravimétricos son

simpies, pero consumen bastantetiempo y son poco reproducibles.

ARTICULOS TECNICOS

Determinación de la biomasa

en procesos biológicos

l. Métodos directos e indirectos

Por: Carmen Arnáiz, Laura Isac y Julián LebratoGrupo de Tratamiento de Aguas Residuales. Escuela Universita¡ia Politécnrca.Universidad de Sevilla. C/. Virgen de Africa, 7. 410).1 Sevilla.Tel. / Fax: 954 55 28 48 I 954 28 27 11 . E-mail: lebrato@cica.es

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-'I'ECNOLOGIA DEL AGUA

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Métodos directos

Métodos groviméiricos

Métodos espectrofofométri cos

Méiodos microscópicos de recuenio celulqr en cómoros

Microscopío de epifl uorescencio

ARTIEULOS TECh¡leo5

Métodos indirectos

COT, DQO

Ácidos nucleicos

Proteinos

Polisocóridos

Lípidos

ATP

Actividod esteroso

Noronio de ocridino, DAPI, queloto de europio, Mg-'A'NS

CTC, SFDA

FISH

OOc\

UMcOl(,orr)OC\

wffiffi

Métodos bioquímicos

Métodos cinéticos

Métodos en continuo

Fig. 1. Esquemo de los disiintos métodos de deferminoción de lo biomoso

Métodos de siembro

Méiodos físico-químicos indi rectos:

Componenfes celulores

2,2, MétodosesPeclrof otométricos

Se basan en la existencia de tlna

relación directa entre el número to-

tal de microorganisn-los Presentesen una nlllestra y stl valor de turbi-dez. Tras la determinación de la tur-bidez de la suspensión celular me-

diante espectrofotometría, el resul-

taclo se expresa en unidades de ab-

sorbancia. Sin embargo, antes de

utilizar 1a turbidez como método de

reclrento, hay que tealizar una recta

de calibrado qLre relacione medidas

directas (microscóPicas, Por re-

cuento en placa o Pcso seco) con las

indirectas de 1a turbidez. Esta recta

contiene datos sobre el nítmero de

células, permitiendo la estimación

,f IICNOI,OGIA I)IIL AGUA

Actividod deshidrogenoso

Adoptociones del Respirómeiro de Worburg

Tosq de respiroción

Toso de desoporición de sustroto

Poienciol bioquímico de producción de metono

de tal parámetro a partir de una sola

medida de la turbidez.Se trata de métodos ráPidos, Pero

de baja sensibilidad y que presentan

problemas de calibración (tiPo de

cultivo, medio de cultivo) y de inter-

ferencias con partículas.

2,3, Métodos microscóPicosde recuenlo celular encámoras

Existen diversos tiPos de cáma-

f as pafa el recttento de rnicroorga-nismos tales como la cámara de

Neubauer. Thoma, Bürker, Ttirk,Fuchs-Rosenth¿rl, Mal assez, PetroffH ttrser, etc. El recuenlo de microol'-ganismos se realiza en la cuadrícula

central cle la cámara y se multiplica

por la profundtdad, obteniéndose el

número de micrt-rorganismos Porunidad de volumen (núrrnero de cé-

lulas.ml r, generalmente).El recuento de microorganismos

en cámaras no es un método muY

exacto debido a las irregularidadesen la distribución de la muestra.Además. pueden confundirse las cé-

lulas con otras formas orgánicas e

inorgánicas existentes en el medio y

no permite distinguir células vivas

de células muertas.

2.4. Métodos microscéPicosmedianle epifluorescencid

La microscoPía de ePifluores-cencia comenzó a emPlearse a Prin-cipios de los 70 Y hoY en día se con-

Métodos de determinoción de lo biomosq

sidera como uno de los mejores mé-

todos para la estimación de la bio-masa. La epifluorescencia es debidaa un agente fluorocromo, a la adi-ción de algún anticuerpo marcadocon fluorescencia (inmunofluores-cencia) o a una autofluorescencianatural debida a la existencia de al-gún componente celular autofluo-rescente.

Cuando la epifluorescencia se

debe a un agente fluorocromo, elprocedimiento consiste en la tinciónde las bacterias con dicho agente yposterior recuento mediante mi-croscopía óptica con iluminación de

epifluorescencia. Los sustratosfluorescentes o fluorocromos que se

han empleado para la observációndirecta de bacterias se clasifican en

dos grupos. En el primero de ellosquedarían englobados aquellosfluorocromos que tras ser adsorbi-dos actúan específicamente sobreácidos nucleicos u otros componen-tes celulares. El segundo incluiría a

todos aquellos que tras ser sustratosde una determinada actividad meta-bólica, son convertidos en molécu-las fluorescentes.

AI primer grupo pertenecen losprincipales fl uorocromos utilizadospara la estimación de la poblacióntotal de una muestra: el naranja de

acridina y el 4,6-diamidino-2-feni-lindol (DAPI). Estos fluorocromospermiten distinguir células de partí-culas e identificar bacterias no sólopor su color, sino también por su

forma y tamaño.El naranja de acridina colorea

tanto el ADN como eI ARN de lascélulas emitiendo a una longitud de

onda aproximada de 470 nm. Losácidos nucleicos de hebra simple se

colorean de un color naranja-rojofluorescente, mientras que los dedoble hebra adoptan un color verdefluorescente. EI fluorocromo DAPIes un colorante específico del ADNy su pico de excitación se encuentrapróximo a la región ultravioleta(365 nm). A pesar de las ventajasque supone el uso de estos fluoro-cromos, no permiten distinguir en-tre las células muertas, metabólica-

ARTICULOS TECNTCOS

mente inactivas, y las vivas, ya queel ADN conserva sus propiedadesincluso en células muertas.

El quelato de europio, al igualque el naranja de acridina o el DA-PI, es un colorante específico de

ácidos nucleicos. Otros fluorocro-mos como las sales de magnesiodel ácido 1 -anilino-8-naftalensul-fónico (Mg-ANS) tiñen principal-mente componentes celulares co-mo proteínas, lípidos o membranascelulares. En cambio, el comporta-miento de estos agentes fluorocro-mos es el comentado anteriormen-te, sobrestiman el número de célu-las viables al no distinguir célulasvivas de muertas.

En el segundo grupo quedaríanenglobados fluorocromos como elcloruro de 5-ciano-2,3-ditolil te-trazolio (CTC, Rodríguez et al.,1992) ó el 5- (y 6-) diacetato desulfofluoresceína (SFDA, Tsuji etal., 1995). Ambos fluorocromos, a

diferencia con los anteriores, dis-tinguen bacterias metabólicamen-te activas de las que no lo son ne-diante la observación microscópi-ca del producto fluorescente resul-tado de Ia actividad metabólica pa-ra la que son específicos. En el ca-so del CTC 1a actividad metabólicaes la respiratoria y en el del SFDAes la actividad esterasa. La epi-fluorescencia basada en fluorocro-mos como eI CTC y el SFDA pon-drá de manifiesto aquellos micro-organismos en los cuales esténpresentes dichas actividades meta-bólicas, pero sin cuantificarlas.Salvando este obstáculo se en-cuentran las medidas bioquímicasde determinación indirecta de labiomasa, que sí cuantifican activi-dades metabólicas.

La epifluorescencia es un méto-do simple y rápido. No obstante, su

reproducibilidad está cuestionada ynecesita un equipamiento relativa-mente caro.

La fluorescencia mediante anti-cuerpos marcados con agentes fluo-rescentes está basada en las propie-dades inmunológicas de las células.Es una técnica muy sensible y espe-

La epifluorescencia

es un método

cífica, y puede realizarse in situ.También puede llevarse a cabo me-diante hibridación de sondas fluo-rescentes de ADN o ARN (Fluores'cent in situ hybridization, FISH),cadavezmás utilizadas en EcolosíaMicrobiana.

2.5 Mé¡odos de siembroEl recuento de microorganis-

mos viables se fundamenta en lacapacidad de dichas células via-bles de desarrollar una colonia vi-sible en un medio de cultivo apro-piado. En los recuentos.n piu.upor vertido, un volumen de 0,1- Iml de la suspensión microbiológi-ca se mezcla con el medio de culti-vo fundido y parcialmente enfria-do en una placa de Petri. En los re-cuentos en placa por siembra en

superficie, se extiende un volumende aproximadamente 0,1 ml de lasuspensión sobre la superficie delmedio de cultivo. Los resultadosde los recuentos en placa se expre-san como unidades formadoras de

colonia (UFC) por unidad de volu-men de la suspensión microbioló-gica. Para que el recuento sea esta-

dísticamente srgnificativo, el núl-

mero de colonias deberá estarcomprendido entre 30 Y 300 colo-nias. En el caso de muestras mttY

diluidas se puede emplear 1a filtra-ción de membrana, en la que tras lafiltración de la muestra es el filtroel que es colocado finalmente so-

bre el agar (Atlas, 1992).

Otro tipo de recttentos los consti-

tuyen aquellos que emPlean tln me-

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TECNOLOGIA DEL AGUA

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dio de cultivo líquido como es el ca-so de la estimación del número másprobabie (NMP).

El recuento de microorganismosviables se fundamenta en el desarro-llo de una colonia visible a partir de

cada organismo viable. El principalproblema de este método es que notodas las bacterias presentes en unamuestra pueden crecer en el medio ylas condiciones de cultivo seleccio-nado. Suelen ser, por tanto, métodosinfraestimativos y estadísticamentecuestionables (I .azarova y Manem,r99s).

3. Méfodos indirectos dedeterminqción de lobiomqsq

E,stos métodos se basan funda-mentalmente en la determinaciónde algún componente celular espe-cífico, en la cuantificación de algu-na actividad enzimática (métodosbioquímicos) o en la medida deconsumo de sustrato o de la forma-ción de algún producto (métodoscinéticos). También se incluyen eneste apartado algunos métodos fisi-coquímicos.

Los métodos bioquímicos y ciné-ticos determinan, más que la viabili-dad de las bacterias la actividad yaque dependen más del estado meta-bólico de los microorganismos quede1 número de individuos.

3. l. Componenles celularesespecíficos

Cualquier componente celularseleccionado para 1a estimación de

la biomasa viva de una muestra de-be responder a tres criterios filnda-mentales:o Estar presente únicamente en cé-

lulas vivas.o Ser rápidarrente degradado

cuando las células mueran.¡ Ser relativamente constante el.l

concentración respecto a c¿1u.1-

bios en ei estado fisiológico celu-lal y entle distintas especies.Hasta el nromento, no exi\tc nrn-

gún componente celular que cunplaestos tres requerimientos" Sin en-bargo, los ntás adecuados para esti-

l'T.]CNOI,OGIA DEI, AGUA

ARTIEULCIS TEeNTCOS

mar biomasa viva son los ácidos nu-cleicos, las proteínas, Ios polisacári-dos,los lípidos y el ATP.

3.1 .l . Ácidos nucleicosEl ADNI y el ARN son dos com-

ponentes de las bacterias cuya sínte-sis es proporcional a Ia tasa de creci-miento. Mientras que las concentra-ciones de ARN varían considerable-mente con el estado fisiológico ce-lular, la cantidad de ADN es relati-vamente más constante.

La cantidad de ADN se determi-na mediante espectrofotometría,tras su extracción y purificación.Existen diversas técnicas, si bienpresentan la desventaja de que losprocedimientos de purificación son

complejos, con diversas interferen-cias y bastante costosos.

3.1 .2. ProteínasExisten varias técnicas para el

análisis de proteínas totales de unamuestra biológica. Algunos estánmuy extendidos y se caracterizanpor su sensibilidad, rapidez y sim-plicidad. Es el caso de las técnicasde Lowry et al. ( 195 1 ) y Bradford(1916).

La principal desventaja de la de-terminación de proteínas es que su

cantidad en las células está sujeta a

fuertes variaciones debido, funda-mentalmente, a cambios en las con-diciones fisicoquímicas y al estadofisiológico celular.

3.1 .3. PolisacárídosLa mayoría de ias células proca-

riotas contienen ácido murámico(un peptidoglicano) como compo-nente de la pared celular. E,xistenvarias técnicas para 1a determina-ción del ácido murámico en mues-lras que conlengan microorganis-mos. Todas ellas se basan en la con-versión del ácido murámico a lac-tato, segLrida del análisis enzrmáÍi-co o químico de la concentraciónde lactato. El ácido murámico se

extrae de 1as células mediante unahidró1isis aicalina y se purificaposteriormente mediante cromato-grafía de intercambio iónico. Otros

análisis más sensibles necesitan deluso de cromatografía líquida(HPLC) o gaseosa (GC). Todas es-

tas técnicas son laboriosas. muylargas y necesitan de un equipa-miento caro (Figura 2).

3.1.4. LípidosLos lípidos son un componente

fundamental de las membranas ce-lulares. Su determinación para la es-

timación de la biomasa de una po-blación bacteriana ofrece muchasventajas sobre otros métodos. Laprincipal ventaja es su alto conteni-do específico y que se encuentran encantidades relativamente constan-tes. Otra ventaja muy importante es

que los lípidos no forman parte delas reservas ceiulares y se degradanrápidamente durante la lisis bacte-riana. Aproximadamente, entre un90-98Vo de los lípidos de las mem-branas celulares está en forma defosfolípidos (Lazarova y Manem,1 995).

Las técnicas de análisis se basan,

fundamentalmente, en la extraccióncelular de los fosfolípidos con un di-solvente orgánico, su posterior hi-drólisis ácida para liberar el fosfatoy, por último, 1a determinación co-lorimétrica de éste. Son técnicas re-lativamente sencillas, reproduciblesy sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos-fato; Findlay et al., 1989).

3.1.5. Trifosfato deadenosina o ATP

El ATP presenta las ventajas deser un componente bioquímico cen-tral presente en todos los microor-ganismos y específico de los micro-organismos vivos, circunstanciasambas que permiten relacionarlocon la biomasa viva.

Una de las técnicas más utiliza-das para medir ATP se basa en la re-acción luciferina-luciferasa, proce-so responsable de la luz emitida porlas luciérnagas y qlle ha sido am-pliamente estudiado. En este meca-nismo de luminiscencia se sabe que

intervienen luciferina (fenol hetero-cíclico, LH2), luciferasa (enzima,E), ATP, cationes de n-iagnesio y

¡1 h¿ ':' i: {: u 1 ,.--} ¡; ?fieNr€*s

aumentar las de ADP y AMP (Uh-linder y White, 1983).

Por cada molécula

I r .fde luciferina oxtdada

se emtte un cuanto

conversión enzimática la fluores-ceína. La fluoresceína puede ser vi-sualizada como un proclucto intra-celular mediante el en-rpleo de larrricroscopía de epi lluorescencia o

cuanti ficada mediante espectrofo-tometría tras ser extraída con disol-ventes orgánicos.

EI principio en el que se basa latécnic¿r del FDA es en el car¿'rcter hi-drofóbico del diacetato de lluores-ceína, lo que le permite penetrar a

través de la brcapa lipídica que for-ma la membrana celular. Una vez en

el interior celulal', es convertido me-

diante la actividad esterasa en fluo-resceína, mo1écula de carácter hi-drofílico que puede ser almacenadaintracelul¿irmente dada 1a baja per-neabilidad de la membrana a ésta.Ya que las células muertas se carac-terizan por presentar abundantesorificios en sus r.nembranas, el FDAsólo tefiirí célulls vivas.

El FDA se ha empleado princi-palnentc en la determinación de la

actividad de hongos y bacterias en

mllestras de suelos. Sin embargo, se

ha encontrado que no todas las espe-

cies plesentes en el suelo son sensi-

bles a esta técnica, ya sea porcllte el

FDA no penetra adecuadamettte en

las células o porqLle no es bien rete-nido. Tratanclo de ntinin-rizat estos

problemas, en el campo de la ePi-lluorescencia se han utilizado deli-vados clel FDA como el diacetato clc

6-calboxifluoresceína (CFDA) y el

diacetato de -5- (y 6-) strlfofluores-ceína (SFDA). este últitro Inencio-

Io

orígeno en un proceso de oxidorre-clLrcción que ocurre en doble etapa:

lH +\TP:tr ---_>""j +E,-LH,-AMP+O, _- _____-_-->

Ya que por cada molécr¡la de lu-cil'erina oxidada se emite un cuantocle 1r-rz, la detenninación del ATP en

Llnx mLrestra biológica puede hacer-se mediante extracción por ebulli-ción en tampón Tris (hipocloruro de

tr'i s-hi droximetil-aminoetano) delATP, incubación con lr,rciferina-lu-cif'crasa y posteriol medida de la luzpt'oducida en un fotómetro con re-gistro.

I-a mayor desventaja de esta téc-uica es 1a necesidad de procesar 1a

ttlue stra con rapidez, ya que el estadof isiológico de las célLrlas cambia r¿'r-

pidantente tras la toma de muestra.La lelación entre el ATP, el ADP

Y el AMP y el contenido total de de-sox i n'ibonucleótidos lefleja la cargaene r-uética de las células [(ATP + 0,5ADP)/(AMP + ADp + ATp)1. Estarelacitin puede duplicalse en sólottnos segundos. Aigur-ros autores sLl-gielcn que la carga energética es unt'alor ntucho ntás preciso qLre elconte nido absolr-rto de ATP ya que lacontposición celular de desoxir.ribu-nttclctiticlos varía con el estado fi-siolrir ieo cle los nlicloolglrnisrlo.:duriurte e l cr.ecimiento tlacteriano elpool energético clisrlinuye, al clis-mlnLrir la conccntración de ATp y

- ,i:" #

.- i :3--i*

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E-LH,-AMP + PPiL + H,O + bioluminiscenciu

(1)(2)

3,2. Métodos bioquímicosLas medidas de alguna actividad

enzimática pueden considerarse co-mo una alternativa a los métodostradicionales. Los ensayos enzimá-ticos son sirnples de realizar y sus

resultados se obtienen rápidamente.Adcm¿is. el equiparniento lrecesiu'iono es ni costoso ni complejo. La ma-yoría de las medidas de actividadenzimática se realiza mediante 1a

convelsión de sustratos específicosa productos coloreados que soncuanti ficados fotométricamente.

La principal desventaja de losmétodos bioquímicos es la varia-ción de las actividades enzimáticascelulares con los cambios fisiológi-cos y qlre, una vez que ios microor-ganisrnos rllueren, ]as enzimas libe-radas pueden seguir actirras. Entrelas distintas medicl¿ts de actividadenzimática cabe destacar l¿i activi-cl¿rd esterasa y 1a actrvidad deshidlo-genasa.

3.2.1 Actividad esterasaEl diacetato cle I'luoresceín¿t

(FDA) es uu courpllesto que puede

ser hiclr'oliz¿ido por enzimas talescoJro proteasas. lipasas y ester¿I-sas, sienclo e1 producto cle dicha

OOOC\

UMCOlt-

r)OC\

ffiffiffi1'I.]CNOI-OGIA DEI- AGUA

nado antefiormente y que Por el mo-mento se ha revelado como el más

apropiado.

3,2.2. Activídaddeshidrogendscl (DHA)

En una muestra biológica, la de-

terminación de 1a actividad del sis-

tema de transporte electrónico pue-

de realizarse por medida de la acti-vidad deshidrogenasa. Todos losmicroorgani smos aerobios poseen

un sistema de transporte de electro-nes activo, en el que el más impor-tante aceptor terminal de electroneses el oxígeno. En la corriente princi-pal de este transporte electrónicoparticipan, entre otras, las deshidro-genasas piridín-dependientes quenecesitan NAD o NADP como co-enzima y las deshidrogenasas fla-vín-dependientes que contienen fl a-

vín-adenín-dinucleótido (FAD) óflavín mononucleótido (FMN) co-mo grupo prostético. Las deshidro-genasas son enzimas de oxido-re-ducción que participan en el trans-porte de electrones desde un sustra-

to orgánico a un aceptor final de

electrones mediante la transferenciade hidrógeno. La determinación de

la actividad deshidrogenasa pttedehacerse midiendo la capacidad de

los microorganismos para reducirun indicador o colorante redox. En-tre estos colorantes se encLtentransales de tetrazolio tales como el clo-mro de 2,3,5-trifeniltetrazolio(TTC) o el cloruro de 2-(p-iodofe-ni l) - 3 - (p -n i trofenil )-5 -f'enil tetrazo-lio (lNT). Ambas se caracterizanpor ser soh-rbles en agua en su formaoxidada y por formar depósitos ce-

I ulares insolubles de TTC-fonnazáne INT-formazán (Figura 3), respec-

tivamente, cuando son reducidaspor la actividad respiratoria. Estosdepósitos rojizos de formazán, al ser

observados microscópicamente,permiten distir-rguir en mLlestras

acuos¿rs las bacterirrs qLte I'espilande aquellas qLre no (deternrinacióndirecta de la bionasa). O bien, elforrrazíu.r es extraído con disolven-tes orgánicos y deterrriinado espec-trofotométricamente, permitiendo

]'l.lcN0LO(;t^ t)lI_ AGU{

la cuantificación de la actividad res-piratoria de la muestra.

El TTC presenta el inconvenien-te de su elevada sensibilidad al oxí-geno (Chung y Neethling, 1989). ElINT no tiene esta limitación y su usoestá cada vez más extendido. Sinembargo, su precisión y correlacióncon la cantidad de biomasa viva no

está suficientemente demostrada(Singh etal.,1994).

3,3. ffétodos cínéticosLa base de estos métodos es la

medida del consumo de sustrato ode la formación de producto en en-

sayos en discontinuo. El ejemplomás típico en microorganismos ae-

robios es la determinación de laDBO, que indica la biodegradabili-dad de un sustrato en disolución a

través del consumo de oxíseno del

medio.

3.3.1. Adaptaciones delRespi rómetro d e Wo rb u r g

Le tasa de cortsumo de oxígenopuede ser detelminada según elplincipio en el que se basa el respi-rómetro de Warburg, por el que a

temperatura y volumen constantes,la variación en la cantidad de un gas

puede medirse por la variación de su

presión. En una planta piloto eqLrr-

pada para actúrar como Lllt respiró-metro, los microorganismos presen-

tes en la muestra metabolizanlama-teria orgánica con 1a consecuentedisminución del nivel de oxígeno,que es consumido, y el aumento de

la concentración de CO' que es pro-ducido. El dióxido de carbono es ad-

sorbido en una solución de potasa,por lo que la disminución de la pre-sión en este sistema cerrado es debi-da al volumen de oxígeno consumi-do por los microorganismos, lo cualpuede ser medido mediante un sen-

sor de presión y registrado. La re-presentación en el tiempo del oxíge-no disuelto (mg.l ') informa delconsumo de oxígeno, siendo la pen-

diente de la recta de ajuste óptimo latasa de consumo de oxígeno (OUR)en mg O' l-r.h-1.

Una adaptación del respirómetrode Warburg para medir el biogásproducido en procesos anaerobiospuede encontrarse en James et al.( 1 ee0).

3.3.2. Tasd de respiración(Oxígen Upfake Rate, OUR)

El consumo de oxígeno de losrnicroorganisnros presentes en ttna

muestra biológica debido a la respi-ración endógena de nrantenimientocelular y a la oxidación del sustrato

orgánico presente en dicha muestra(en ausencia de nitrificación), reci-be el nombre de respiración. Asípue\. se denomina tasa de respira-

ARTTCUTOS TECzuTCOS

Figuro 1.3 Visión ol microscopio ópiico { I OOOx) de uno muestro de fongo octivo trotodo según el protocolo de lo

INT-deshidrogenoso.

OOc\

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v)OC\l

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&*tTgf;¿-5t*s 'Ft:{r"*xcs5

Fig.4. Sistemo OXITOP lSó WTW poro o deierminoción de DBO

Instnimcnlo paru l;r rncclid;l

c1ctr crigeno

lllcct¡:ocloorígc11(]

La respiración

endógena es

directamente

proporcional a la

concentración de

microorganismos

ción (en mg O,.l t.¡-t) a la velocidadcon la que los microorganismos uti-lizan el oxígeno en función a estosdos conceptos.

La respiración endógena, en lapráctica, se considera qLle es cons-tante a temperatufa y concentraciónde rnicroorganismos fijos. Por tan-to, será directamente proporcional a

la concentración de microorganis-mos presentes en la suspensión bio-lógica, estimados como SSV.

La respiración debida a 1a meta-boliz¿rción del sustrato orgánicopresente en la muestra o respira-ción exógena, será proporcional a

la concentración de sustrato orgá-nico rápidamente biodegradable e

inch"riría, si lo hubiera, el consumode oxígelro ocasionado por nitrifi-cación.

La tasa de lespiración total refe-rida a la concentración de microor-ganisrnos, expresada como SSV, es

la tasa de respiración específica(SOUR). Su principal característicaes que define l¿i actividad biológicaen un momento dado de una bioma-sa específlca.

La medida cle la actividad bioló-gica SOUR está relacionada con lalclreiórr "al imento/nt icroorganis-rros" (F/M en terminología anglo-sajona), ya que conrprende la tasa c1e

respiración exógena (propolcional a

la DBO) y los SSV de un cultivobiológico. En la Figura 5 se r.nues-

tr¿l Lrn esquetrla simplificaclo del dis-positivo empleado para 1a meclicla

cle col.rsun'lo de oxígeno

OOOc\

M.Ol(_)C

Lr)OC\

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F g.5 Disposi"'o de medido del consur6 6ls er gero.

'f lrc\Ol,oct1 l)ril. AG L .\

3.3.3. Taso de desapariciónde svstrato

Es el método más convencionalpara determinar la actividad de unapoblación de microorganismos. Ladisminución de la concentración de

sustl'ato en el tiempo puede hacerse a

través de métodos indirectos, comola DQO o el COT, o mediante técni-cas específicas, fundamentalmentecromatográficas (GC o HPLC). Labúsqueda de nuevos métodos ha 11e-

vado al empleo de técnicas basadasen el empleo de electrodos selecti-vos, en los que el cálculo de la activi-dad de 1a muestra biológica se realizaen base al tiempo requerido para que

ocurra el 507o de la desaparición del

sustrato suministrado y para el que el

electrodo es específico.

3.3.4. Potenciol bioquímícode producción de rnetc'no(BMP)

Esta técnica consiste en medircon una jeringa o Lrn ft'asco de Ma-riotte relleno de agua Ia produccióntotal de biogás (CHo y CO,) produ-cida por un reactor anaerobio dis-continuo.

3.5. MéIodos fisícoquímicosindirecias

La medida del COT o de la DQOson métodos muy nsados para la es-

timación indirecta de 1a biomasasuspendida o f ijada. Son tnuy sensi-

bles y precisos, pero presentan las

misrnus importantes limitacionesque los SST y SSV.

4. Métodos en cont¡nuoDurante los años 90 se han desa-

lrolludo métodos cuantitutivos nrra

Arargfrait*s Tg€N¡CQ5

la determinación on-line de la bio-masa de un proceso biológico. Lastécnicas más importantes se basar.t

en propiedades eléctricas, microca-lorimétricas o espectrofotométricasde los cuitivos biológicos. Sin em-bargo, a pesar del desarrollo tecno-lógico, no existe un sensor ideal pa-

ra la monitorización en continuo de

la biomasa (Singh et al., 1994).

5. AgrodecimientosLos autores desean expresar su

agradecimiento a la Dirección Ge-neral de Investigación Científica y

Técnica, Ministerio de Educación yCultura, por la financiación de partede este trabajo mediante dos becas

del Programa de Formación de Per-sonal Investigador, Refs.: IN92-D28480461 y IN92-D28598661concedidas a M.C. Arniiz y L. lsac,respectivamente.

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