selectividad y sensibilidad en métodos multi-target … · sensibilidad análisis de plaguicidas...

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Seminario en Línea15/01/2010Juan Aybar

Especialista de Producto GCMS LCMS

AGILENT TECHNOLOGIES SPAIN

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Selectividad y sensibilidad en métodos multi-target con GC/MS y

GC/MS/MS

Agenda1. Peculiaridades de los métodos multi-

residuos para compuestos volátiles y semi-volátiles

a) Novedades en GCMS que responden al usuario

2. Flujo de trabajo en análisis de residuosa) Deconvolución espectral vs. MS/MS en matriz

compleja. Kits de aplicacionesb) Agilent 7000 GC Triple Cuadrupolo y análisis de

residuos. c) Novedades de MassHunter Software. Métodos

Dynamic MRM (dMRM)

Aplicaciones multi-target en entornosregulados. Cuestiones de interés

LMRs establecidos en legislación local/europea/internacional. El problema de la armonización

Modificación de los flujos de trabajo tradicionales en análisis de residuos. Necesidad de nueva instrumentación

Cumplimiento con lo establecido en los documentos de las entidades de acreditación

Confirmación de la presencia de un residuo. Normativa relacionada

Contribución de la presencia de matrizMantenimiento de abundancias relativas entre

transiciones en presencia de matriz al trabajar en MS…

Normativa de análisis de plaguicidas en alimentos – Reglamento 396/2005

Cubre aproximadamente 1100 plaguicidasSe aplica un MRL por defecto de 0.01 mg/Kg para los productos para los que no

hay un MRL específico

Muchos compuestos a analizarDiferentes propiedades químicas (pesticidas neutros, ácidos, básicos)Matrices muy complejas

Contar con una preparación de muestra sencilla y barataConseguir una identificación seguraObtener confirmación y cuantificación en la misma inyección

RequerimientosRequerimientos

Reto AnalíticoReto Analítico

IdealmenteIdealmente

Las especificaciones de

sensibilidad no paran de mejorar

350:1400:1

300:1

200:1

Las especificaciones no reflejan lascondiciones de los análisis en un entornoreal

Agilent Technologies RESPONDESolución completa en análisis de residuos

7

NecesidadSimplificar/Facilitar procesos de preparación

de muestraInyección de gran número de viales

(muestras, controles, calibracion, ensayos de recuperacion, …

Responder a la elevada presencia de interferentes provenientes de la

matriz/problemas de mantenimiento

Elevada sensibilidad en métodos target

Responder al elevado número de compuestos - Automatización

Necesidad/Tendencia métodos de screeningMuestra “libre” de contaminantes

Dar respuesta a los requerimiento de normativa

Dar respuesta a métodos específicos

RespuestaDesarrollos en SPE – QUECHERS/SampliQ

Nuevo inyector automático XYZ con capacidad de 150 viales, MassHunter Batch-at a glance

Backflush, CFT, QQQ desarrollado específicamente para GC, Fuente/Cuadrupolo a elevada temperatura

Mejora de especificaciones/hardware, inyector multimodo

Dwell times de 1 ms, optimizacion y procesado por software prácticamente automatizado, ALS programable

Cuadrupolo Simple/QQQ con utilidades de deconvolución

Mejoras en sensibilidad, software batch-at a glance (outliers), abundancias relativas

Alta masa (PBDEs), Ionización Química (Nitrosaminas, PCBs …), compatibilidad con inyectores alternativos, ..

Nueva bandejacon capacidad para 150 viales

Nuevo inyector con capacidad para 16 viales

Nuevo Inyector Automático Agilent 7693A

Backflush gracias a la tecnología de flujocapilar

1 psi

45 psi

Durante GC Run

Tras GC Run

S/S Inlet

QuickSwapColumna

25 psi

4 psi

MSD

Aux EPCSplit Vent Trap

S/S Inlet

QuickSwapColumna

MSD

Aux EPCSplit Vent Trap

performance turbo recomendada

7890A GC para mejor productividadCapacidades avanzadasdel líder mundial en técnicasseparativas en fase gas

5975C GC/MSD con detección Triple EjeRendimiento optimizadodesde la inyección a la obtención del report final

7000 GC/MS/MS con Cuadrupolos de CuarzoLos menores límites de detección más herramientasque permiten unacuantificación de altavelocidad GC/MS/MS

• Nuevo 7693A Autosampler• Nuevo Multi-Mode inlet• CFT backflush de matriz• RVM tecnología en el horno

• Más de 10,000 sistemas vendidos• Librerías específicas por aplicación• Nuevo MassHunter software

• Sensibilidad a nivel de femtogramos• Adquisición MS/MS de alta velocidad• Basado en años de experiencia MSD• Nuevo MassHunter software

Clearly Better GC y GC/MSAgilent FY09 Nuevos Productos

Flujo de trabajo en análisis de

residuos

Flujo de trabajo simplificado. Análisis de plaguicidas

Preparación de muestra

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Data Analysis & Reporting

Cuantificar

Análisis de plaguicidasFlujo de trabajo

1. Extracción sencilla QuEChERS/SPE2. Análisis (rápido) en modo MS3. Comparación de bases de datos con un gran número de compuestos4. Confirmación de la presencia de plaguicidas basadas en espectro y/o RT5. Cuantificación con datos de altasensibilidad



QuEChERSQuick, Easy, Cheap, Effective, Rugged & Safe

• Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS

• Método de Preparación de Muestra orientado a los mercados de Seguridad Alimentaria.

• Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por lasAgencias Reguladoras de Alimentos Europeas(método prEn 15662: 2007)

• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de residuos de pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales.

Mercado al que se dirige1. Científicos en Seguridad Alimentaria que analizen residuos

de pesticidas/herbicidas en frutas y vegetales2. Agencias reguladoras/inspectoras del Gobierno3. Compañías de proceso de alimentos.4. Investigadores en la Universidad/Centros de Investigación

¡Solicite el catálogo de aplicaciones SPE para seguridad alimentaria!



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Deconvolución AMDIS extraeComponentes Individuales y espectros

TIC & EspectroTIC & Espectro

Suma de iones en Componente 1

Suma de iones en Componente 3

Suma de iones en Componente 2DeconvoluciónDeconvolución

Búsqueda “limpia” de componentes contra una libreríaBúsqueda “limpia” de componentes contra una librería

MSD ChemStation

Cuantificación

AMDIS + RTL

Deconvolución+ Búsqueda en espectroteca

NIST08 MS Search

Búsqueda en NIST de espectros

deconvolucionados

MSD-DRS Report

Información de la presencia/cuantificación de targets + de compuestos inesperados que puedan estar presentes en las bases de datos

p, p’-DDE

Los iones blancos representan el espectro extraído (limpio) que

confirma p,p’-DDE

Resolución de coeluciones con AMDIS - Primer match en AMDIS para un pico cromatográfico

Chlorpyrifos methyl AMDIS match = 95 Δ r.t. = 0.2 sec

NIST05 match = 89

Negro – espectro sin limpiar a 16.60 min –

Blanco - espectrodeconvolucionado a

16.605 min

Methyl parathion AMDIS match = 88 Δ r.t. = 0.0 sec

NIST05 match = 92

Negro – espectro sin limpiar a 16.61 min Blanco – Espectro

deconvolucionado a 16.609 min

Resolución de coeluciones con AMDIS - Segundo match en AMDIS para un pico cromatográfico

Resumen del Informe de cuantificación con resultados de MSD Chemstation y AMDIS

Informe Parcial

Agilent Analyzers. Deconvolution Reporting Software

GC/MSD DRS Analyzers disponibles en la actualidad:7890-0456 Pesticide DRS Screening GC-MS Analyzer7890-0457 Japanese Positive list GC-MS Analyzer7890-0458 Toxicology Screening GC-MS Analyzer7890-0459 Semi Volatile Compounds GC-MS Analyzer

¿Qué es un Agilent Analyzer?1.Es un sistema pre-configurado y chequeado en fábrica para una aplicación determinada (p.e. Columna, consumibles, sistema CFT para backflush, RTL, DRS…) usando una muestra de test2.Una vez instalado en el laboratorio, el sistema se prueba de nuevo con la muestra de test por parte del personal de Agilent3.Se proporciona un DVD al cliente con el método instalado, las guías utilizadas y los ficheros correspondientes a las muestras de test inyectadas4.El sistema puede chequearse con muestras proporcionadas por el cliente



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7000 Series Cuadrupolo MS/MSOptimizado para cromatografía de gases

Espectro de ImpactoElectrónico con todos

los iones de los compuestos y del

fondo químico

Celda de Colisión

Q3Q1

Q1 filtra todas lasmasas permitiendoúnicamente el paso

del ion precursor m/z210


Q1 Celda de Colisión

Q3

En la celda de colisiónse produce la

disociación del iónseleccionado en iones

producto



Q3

En Q3 se monitorizan sólo dos de los iones característicos

generados correspondientes al compuesto de interés. Uno con

finalidad cuantitativa y el otro con finalidad cualitativa



Q3

Cuadrupolo de Cuarzo Trabajando a Alta TemperaturaOperación hasta a 200ºC de temperatura proporciona una mayor protección y confianza frente al trabajo con matriz compleja

Los métodos MS/MS típicamente van destinados a matrices “sucias” de maneraque se benefician aún más de la temperaturacontrolable del cuadrupolo

Esta capacidad ELIMINA la necesidad de limpieza en los cuadrupolos como tarea de mantenimiento para el usuario

Sintonizados/Métodos más estables durante mástiempo incluso trabajando con muestras complejas

Ventajas del trabajo en MS/MSMejor selectividad que en SIM

Ion Precursor

Producto 1Producto 3

Producto 2

EI-SIMLa selectividad es proporcionala la resolución espectral. Por

tanto no hay selectividad frentea iones de igual m/z

EI-MS/MSLa selectividad para el precursor es

igual que en SIM. Hay una altaprobablidad de que al menos un ion

producto sea diferencial entre el compuesto de interés y la interferenciainterferencia

analito

interferencia

El precursor no debe ser usado para la medidade ion ratios ya que las interferencias serán

idénticas a las que pueden surgir en SIM

El precursor no debe ser usado para la medidade ion ratios ya que las interferencias serán

idénticas a las que pueden surgir en SIM

resolución unidad

Sistema de Puntuación para la confirmación de la presencia de un residuo (2002/657/EC)

MS – Technique IP / ion

Low resolution mass spectrometry (LR-MS) 1.0

LR-MSn precursor ion 1.0

LR-MSn transition products 1.5

High resolution mass spectrometry (HR-MS) 2.0

HR-MSn precursor ion 2.0

HR-MSn transition products 2.5

Para un compuesto para el que no hay MLR, la presencia de al menos 4 ionesrepresentativos de un compuestos deben usarse al trabajar en GC/MS o

LC/MS. 2 transiciones son suficientes en LC-MS/MS

Diseño de alto rendimiento en la celdade colisión

Alta presión – Diseño de Aceleración Lineal AxialSRM (MRM) de alta velocidad. Hasta 500 transiciones/sec permite más compuestos porgrupo de ionesNo hay cross-talk incluso usandodwell-times de 1 msecRango de masas especialmenteamplio para óptima sensibilidad sin tuning específicoReducción de ruido de neutros“Helium Quenching” (mejorasde S/N)

Quadrupole post-filter

Quadrupole pre-filter

Support cradle

(Cell housing and 2 rods removed for clarity)

301 MRMs de modo simultaneo301 MRMs de modo simultaneo

Desarrollo en la celda de colisiónIonización Penning

1 ml/min N2 Gas de colisión

Q1 Entradade Iones

Celda de Colisión

Salidade

iones

He* +

He* + He → 2 He + Q

He* + N2 → N2+. + He + e-

He gas de apoyo – Quench Gas

Eliminación de particulas metaestables de Helio de alta energía en la celda de colisión

3x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

+ MRM (283.79999 -> 213.90039) 1pgHCB_std_cond_UnkGain_2090EMV_He20pct_04.d Noise (RMS) = 6.03; SNR (6.465min) = 1294.0

6.465

Counts vs. Acquisition Time (min)4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7

S/N 1294:1 Gas Helio ON

3x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5


6.470

4.628 6.301

Counts vs. Acquisition Time (min)4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9

S/N 341:1 Gas Helio OFF

2x10

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2


Counts vs. Acquisition Time (min)4.7 4.75 4.8 4.85 4.9 4.95 5 5.05 5.1 5.15 5.2 5.25 5.3 5.35 5.4 5.45 5.5 5.55 5.6 5.65 5.7 5.75 5.8 5.85 5.9 5.95 6 6.05 6.1 6.15 6.2

Comparación de niveles de ruido

generados

Comparación de niveles de ruido

generados

N2+. + A → A+. + N2

Hexaclorobenceno en matriz complejaHexaclorobenceno en matriz compleja

7000B GC/MS/MS: La mejor solución para análisis de residuosSensibilidad mejorada en IE (Mejora x5)

– Nueva Extractor Source– Nuevo detector con Ramped-iris Triple-Axis

Opción PCI/NCI– Rendimiento y fiabilidad asegurados– Alto interés del ion pseudo-molecular como precursor para MS/MS

• Selectividad PCI/NCI – CI para screening (70ev - Universal)• PCI y NCI optimizados para grupos específicos de compuestos

Bomba previa de mayor capacidad RV-5 estándarEl sistema de Backflush más robusto de la industria

– Nuevo G1472B Universal GC/MS PCT Backflush Kit• Incluye manual para puesta en marcha, uso y mantenimiento

Novedades GC Triple CuadrupoloGCQQQ- Salida al mercado del Agilent 7000B GC Triple Cuadrupolo

- Nueva Extraction Source – Con cambios en los componentes de la fuente, electrónica y cableado

- Ramped Iris Detector – Con cambios en el Triple Eje, electrónica y cableado

• Formas de pico a alta masamejoradas• Sensibilidad mejorada a masasmedias/altas

Mass Iris (V) Signal Increase

69 -1 1.0X

131 -8 1.1X

264 -13 1.5X

414 -20 2.5X502 -30 2.8X614 -35 4.0X

Ramped Detector Iris

7000B Mejoras en Señal

Extractor Source w/Ramped Iris Detector

Standard Source & Detector mode

La mejora media obtenidaen 10 sistemas de test fue

de 3.5x / 5x en señal

La mejora media obtenidaen 10 sistemas de test fue

de 3.5x / 5x en señal

Japanese Positive List - Standard Mix II Comparación Tune estándar vs. Tune con Extractor Lens2 ppm

Extractor Lens – azulStd Tune - rojo

Endosulfan I, IIEndosulfan I, II

Resultados determinación de nitrosaminas – PCIGas Reactivo Amoniaco - 50 fg on column

6x10

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5+CI TIC MRM CID@** (** -> **) Nitrosamines-100ng_ml.D

Counts vs. Acquisition Time (min)9 9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 11 11.2 11.4 11.6 11.8 12 12.2 12.4 12.6 12.8 13 13.2 13.4 13.6 13.8 14 14.2 14.4 14.6 14.8 15

Recta de calibrado a niveles de pg/mLFemtogramos de compuesto en columna

Determinación de 350 plaguicidasRAFA 2009 GC/MS/MS PosterDownload: http://www.chem.agilent.com/en-US/Events/Pages/rafafollowup.aspx



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MassHunter Software1. Instrument Control

• Autotune2. Batch-at-a-Glance

• Navigación sencilla3. Parameter-less Integrator

• Sin parámetros4. Outlier Detection

• Más de 20 criterios5. Excel-based Reporting

• Reporting sencillo y fácilmente adaptable basado en Excel 2003

Instrument Control UI/Navigation

MassHunterEditor de métodos MRM

Con utilidades cut & paste para importar desde bases de datos o softwares de optimización

Batch-at-a-GlanceNavegación + Informacion

Batch-at-a-GlanceBatch Table: Uno o Múltiples Compuestos

Single Compound, Qualifier, ISTD, ISTD Qualifier

Multiple Compounds

Batch-at-a-GlanceInformación de compuestos

Tolerancias en Ratio de Abundancias Relativas entre

transiciones

Tolerancias en Ratio de Abundancias Relativas entre

transiciones

Batch-at-a-GlanceCalibracion

Integrador libre de parámetrosAmplio rango de trabajo

Nuevo integrador libre de parámetros• SIN parámetros• Discrimina entre picos y “spikes”

de ruido• Integra correctamente desde

concentraciones bajas a concentraciones elevadas

• Elimina virtualmente la necesidadde integración manual

Rendimiento > 4 órdenes de magnitud

RSD 14.0%Resp. Factor 1512





100 fg

1 pg

10 pg

100 pg

1 ng

Detección automatizada de valoresanómalos

Más de 20 criterios

Limitesestablecidos en el método

Avisos y filtros

Report específicode valoresanómalos

Reporting basado en ExcelExcel 2003 + XML

Selección de la plantilla correctaCola con reports múltiplesSelección Impresora/Pdf

ExcelCarga la plantillaImporta los resultadosFormatea el reportReport es:

a) Guardado como XLSb) OPT: Printerc) OPT: PDF

Report Resultados (XML) &Gráficos generados

Novedades en GC/MS MassHunter

Nuevas herramientasde optimización

Agilent Dynamic MRM

MassHunter y la línea GCMSGCMS - GCQQQ7000A Triple Cuadrupolo GC/MS – Sólo MassHunter• MassHunter Acquisition• MassHunter Data Analysis• MassHunter Reporting

GC/MSD – Disponible MassHunter SOLO para Data Analysis• MSD ChemStation Acquisition• MassHunter Data Analysis via Translator

– Traduccion sencilla y rápida desde MSD ChemStation– CUALQUIER fichero producido por MSD ChemStation

MassHunter Cuantitativo B.04.00Novedades

•Mejoras en reports (p.e. Drug Quant) y report de tendencias

•Soporte inmediato de todas las librerías GCMS

•GC/MS/MS Herramientas de Optimización

•Compounds-at-a-glancePosibilidada de ver múltiples cromatogramas en una vistaRevisado rápido de sets de datos grandes

•Soluciones para cuantificación en campo farmaceútico –P.e. ADME/DMPK

La propuesta de Agilent para proporcionarestas ventajas al usuario de GC/MS/MSProporcionar una serie de herramientas que asisten al usuarioen la CREACION y OPTIMIZACION del método de adquisiciónMS/MS

Dynamic MRM para GC/MS es una parte del flujo de trabajoque incluye la generacion del método (basado en RTs/transiciones conocidas y LA OPTIMIZACION DE LOS PARÁMETROS DE ADQUISICIÓN MRM

Design Experiments Assistant

Analyze Experiments Assistant

DynamicMRM Assistant

Flujo de Trabajo

Asistente de Diseñode ExperimentosCreación automatica de un set de experimentos MRMsbasados en diferentes CEs

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Asistente para análisisde experimentos

Proceso de datos generadosdesde el set de experimentosanterior.

Creación automatizada de un método MRM basado en las Cesque proporcionan señales másintensas para cada transiciónprogramada.

Herramientas de optimización. ¿Generación manual de segmentos?

Zonas de baja densidadde picos permiten una

division manual sencilla

En zonas de gran densidad de compuestos es casi imposible. Problema

clásico del campo de residuos

¿Como funciona Dynamic MRM para GC/MS a la hora de optimizar métodos MS/MS?Dynamic MRM optimiza scan cycle time, dwell times, y el orden de adquisición (generación automatizada de segmentos) para conseguir:

1. Maxima señal2. Mínimo ruido3. %RSD bajas4. La mayor velocidad de análisis5. La mayor robustez en el método

La aproximación tiene en cuenta la integración de picos y el ruido de línea de base en el proceso de optimización del valor de dwell time.

Visualizacion de la optimizacion del dwell time

Single-Transition RSD Model*

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 10 20 30 40 50 60

Dwell Time (ms)

RSD

(%) RSD_Noise

RSD_IntTotalRSD

El algoritmo de trabajode dMRM tiene en cuenta el hecho de que:

a) Incrementar el valor de dwell time disminuye el RSD debido a la disminución del ruido

b) Disminuye el número de puntos que definen el pico cromatográfico y, por tanto, aumenta el error debido a la integración

Dwell Time Optimo

Comparación DynamicMRM vs. Tradicional250 ppb, 123 compuestos, 298 transiciones

Original

17 segmentos

Original

17 segmentos

Dynamic MRM

60 segmentos

Dynamic MRM

60 segmentos

Resultados: %RSD ComparaciónCompoundName Expert-optimized

RSDDynamic MRM

RSD Improved?

Acetochlor 1.4 1.2 YAclonifen 15.7 12.4 YAlachlor 2.4 0.8 YAllethrin 16.8 11.2 YAncymidol 7.5 7.1 YAzaconazole 5.3 4.6 YAzinphos-methyl 71.1 25.3 YBenfuracarb 14.1 7.4 YBenodanil 10.1 8.8 YBenzoylprop ethyl 2.7 3.6Biphenyl 11.6 9.7 YBromacil 19.7 15.2 YBromocyclen 8.1 6.0 YBromopropylate 10.4 11.6Bromuconazole I 6.1 5.7 YBromuconazole II 5.7 5.7 YBuprofezin 6.2 6.1 YButachlor 8.7 8.3 YButralin 16.8 15.7 YCaptafol 44.7 46.6Carbofuran 68.3 57.1 Y…. … …

Average %RSD 11.1 9.3RSD Std Dev. 12.0 8.8

• dMRM proporciona un RSD medio 15% menor que el método tradicional• La distribución de %RSD es notablemente menor

La ventaja más importante de todas

es el TIEMPO INVERTIDO POR

EL USUARIO. Notablemente menos en el caso de dMRM

La ventaja más importante de todas

es el TIEMPO INVERTIDO POR

EL USUARIO. Notablemente menos en el caso de dMRM

Resumen - Dynamic MRM paraGC/MS• Dynamic MRM automatiza y simplifica la creación de métodos

complejos que requieren muchos segmentos

• Facilita el mantenimiento de lo métodos. Pueden ser regeneradosen segundos desde datos adquiridos si se cambia de columna/tune

• Dynamic MRM proporciona mejoras en %RSD vs. métodosoptimizados por expertos

• Para métodos de 40-min con hasta 300 transiciones puedenesperarse reducciones en torno a 10-20% para los valores de %RSD

• Dado que la mayor contribución a RSD proviene de erroressistemáticos (p.e. variación en el volumen de inyección), la disminucion de ruido en comparación, es bastante mayor

Gracias por su atención

PreguntasJuan Aybar

Especialista de Producto GCMSAGILENT TECHNOLOGIES

[email protected]

This information is subject to change without notice© Agilent Technologies, Inc. 2010Published in Spain, January 15, 2010

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