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Arch. Latinoam. Prod. Anim. 2005. 13(1): 30-42 2005 ALPA. Todos los derechos reservados

Recibido Octubre 21, 2003. Aceptado: Diciembre 11, 20041 Enviar correspondencia a E-mail: atilioaranguren@icnet.com.ve2 Facultad de Veterinaria, Universidad Autnoma de Barcelona. Bellaterra 08193.Barcelona, Espaa. E-mail: Jordi.Jordana@uab.es

Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADN porexcelencia para programas de conservacin: una revisin

J. A. Aranguren-Mndez1, R. Romn-Bravo1, W. Isea1, Y. Villasmil1, y J. Jordana2

Facultad de Ciencias Veterinarias, La Universidad del Zulia. Apartado 15252, Maracaibo,Estado Zulia, Venezuela.

Microsatellites (STRs), ADN Molecular Markers for Excellencyfor conservation programs: A review

ABSTRACT. The science of genetics has been revolutionized in recent years by the techniques of molecularbiology, which make it possible to elucidate complex physiological functions at the gene level: especially afterdiscovery of the Polymerase Chain Reaction (PCR), which enabled studying and measuring genetic variabilityat the molecular level. The utilization of molecular markers of the microsatellite type is especially noteworthyin this regard, because of the particular intrinsic properties which make them the markers of choice for bothbasic genetic studies and animal improvement The most important advances achieved in genetics based oninformation provided by these markers have been analysis of population genetics, creation of the mostsophisticated gene maps, and detection of important genes. Measurement of DNA polymorphism by means ofthese genetic markers in organisms with complex genomes, has made possible the mapping, manipulationand cloning of genes associated with characters of biological interest. This article reviews some of the practicaluses derived from identification and analysis of DNA polymorphism, especially those related to studies basedon microsatellite-type markers.

Key words: Microsatellite, DNA, polymorphism, conservation

RESUMEN. La gentica ha sido revolucionada en los ltimos aos por las tcnicas de biologa molecular,haciendo posible dilucidar complejas funciones fisiolgicas a nivel del gen. En especial y luego del descubri-miento de la PCR, la cual ha permitido el estudio y la medicin de la variabilidad gentica a nivel molecular;as podemos citar la utilizacin de los marcadores moleculares del tipo microsatlite, los cuales debido a susparticulares propiedades intrnsecas, se han convertido en los marcadores de eleccin para estudios tantos degentica bsica como de la mejora animal. Desde los anlisis de gentica poblacional, seguidos de las creacio-nes de los ms sofisticados mapas genticos hasta la deteccin de genes importantes, han sido las principalesincursiones realizadas por los genetistas a partir de la informacin aportada por estos marcadores. La medi-cin del polimorfismo del ADN, mediante estos marcadores genticos en organismos con genomas complejos,ha hecho posible adems mapeos, manipulacin y clonacin de genes asociados con caracteres biolgicos deinters. En este artculo se plasman algunas de las utilidades prcticas de la identificacin y anlisis delpolimorfismo del ADN, especialmente lo referido al estudio mediante los marcadores del tipo de microsatlite.

Palabras clave: Microsatlite, ADN, polimorfismo, conservacin.

Introduccin

En gentica, tanto desde el punto de vista de lamejora como de la conservacin, el principal objetivoque se persigue es estudiar, determinar y medir lavariacin existente, entre y dentro de los individuos

de una poblacin.El reciente desarrollo de la biologa molecular y

las nuevas herramientas estadsticas han permitidola posibilidad de identificar y utilizar esa variacingenmica para la mejora del ganado. Desde el puntode vista molecular, esta variacin, tambin denomi-

31Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADNnada polimorfismo derivada de cambios espont-neos en el ADN puede medirse hoy da a travs dediferentes tcnicas disponibles. Los cambios obser-vados van desde la substitucin de un simplenucletido, que representa el tipo ms comn demutacin y que puede ser detectado a travs del estu-dio y anlisis de los polimorfismos de base nica(SNP), hasta mutaciones que involucren mayoresnmeros de sitios nucleotdicos (Dodgson et al., 1997).

Para efectuar estos estudios, ha sido de gran im-portancia el desarrollo de la tcnica de la reaccin encadena de polimerasa (PCR) por Mullis et al. (1986),la cul es una reaccin enzimtica catalizada poruna ADN polimerasa, que permite la amplificacin oreproduccin in vitro de grandes cantidades de unaregin particular del ADN, a partir de una pequeacantidad original de ADN molde. Esta enzima re-quiere, para la sntesis, de un par de oligos denomi-nados iniciadores o primers, cuyas secuencias soncomplementarias a la de las regiones flanqueantes 5y 3 del segmento particular de ADN que se aspiraamplificar.

Los marcadores de ADN, y en especial losmicrosatlites, estn rpidamente reemplazando ocomplementando a otros marcadores o metodologasgenticas en las aplicaciones evolutivas y la conser-vacin de las especies. Dado su elevado nivel depolimorfismo, resultan tiles para definir un nicogenotipo multilocus, de particular inters en estudiosdonde se requiera una escala muy fina de resoluciny en los cules otros tipos de marcadores podranpresentar algunas limitaciones, siendo especialmen-te estos estudios los referidos a: anlisis de paterni-dades, parentescos, asignacin de individuos a raza,

planificacin de apareamientos y otros aspectos dendole reproductiva (Jones et al., 1986).

Un buen marcador molecular debe reunir una se-rie de caractersticas para maximizar su utilidad,entre ellas, debe tener una buena distribucin a lolargo del genoma y alto grado de polimorfismo. Latcnica para analizar el marcador debe ser rpida,prctica y debe repetirse con fiabilidad en otros labo-ratorios (Cheng y Crittenden, 1994).

Variacin gentica y mtodos de deteccinDesde la aparicin de la PCR se han desarrollado

una serie de tcnicas utilizadas para los estudios devariabilidad gentica en las especies animales. Entreellas tcnicas se cita el uso de los marcadoresgenticos (Cuadro 1), la cual se basa en la clonaciny secuenciacin de fragmentos de ADN, mientras queotros, ms aleatorios, se basan en la deteccin depolimorfismos al azar (fingerprint markers o huellasdigitales moleculares) (Dodgson et al., 1997).

Algunas caractersticas y particularidades nota-bles de los principales marcadores moleculares msutilizados en gentica de poblaciones se detallan acontinuacin:

SNP (polimorfismo de base nica)Es un tipo de polimorfismo que corresponde a la

diferencia en una simple posicin nucelotdica, porejemplo sustituciones, delecciones o inserciones deun solo nucletido. La mayora de este tipo depolimorfismo presenta slo dos tipos de alelos (bi-alelica), y por ello son referidas algunas veces comomarcadores biallicos. Con la presencia solamentede dos alelos, la mxima heterocigosidad esperadapara cada SNP es de solamente 50%, siendo por lotanto menos informativo que las regiones satlites de

Cuadro 1. Principales tipos de marcadores de ADN y mtodos de deteccin.

Tipo de Marcador Acrnimo Alias Requiere: Principal uso

Polimorfismo de base nica SNPs ADN clonado, secuencias, Mapas de LigamientoPolimorfismo de Longitud etc.de Fragmentos de Restriccin RFLP ADN clonado usualmente Mapas de LigamientoSecuencias Repetidas Cortas SSR Microsatlites AND clonado y secuencias Mapas de LigamientoSecuencias de Sitios Marcados STS Secuencias de ADN Mapas fsicosSecuencias ExpresadasMarcadas EST Subset de STS Secuencias de ADNc Mapeos fsicos y deligamientoPolimorfismo AmplificadoAleatoriamente RAPD DAF, AP-PCR Oligos aleatorios FingerprintingSecuencias de Numero yTamao Variable VNTR Minisatlites Secuencias repetitivas y FingerprintingPolimorfismo de Longitud pruebas de hibridacindeFragmentos Amplificados AFLP Set de oligos diseados y Mapas de ligamiento

especficos

Modificado de Dodgson et al., 1997.

32 Aranguren-Mndez et al.ADN (minisatlites y microsatlites), las cuales ge-neralmente presentan mltiples alelos y sus valoresde heterocigosis superan el 70%. En forma general,para la construccin de mapas genticos a partir deSNP son requeridos hasta 3 veces mas marcadorescomparativamente que con los STRPs (Kwok et al.,1996).

Aunque muchos de los SNPs se localizan en re-giones no codificantes, un nmero importante de es-tas mutaciones que corresponden a sitios de genes(codificantes) se han asociado a enfermedades u otraexpresin fenotpica. Su alta frecuencia en el genomay su baja tasa de mutacin, hacen que se constituyancomo elementos deseables para la construccin demapas genticos. En el caso del genoma humano,donde mayoritariamente se han estudiado los SNPs,se estima que un SNP con una heterocigosis por enci-ma del 30% se espera que se presente cada 1.3 kb(Kwok et al., 1996).

Minisatlites o Nmero de Secuencias de TamaoVariables (VNTR)

Marcadores polimrficos descubiertos por Jeffreyset al. (1985), en el que ciertas pruebas de hibridacinpara secuencias repetitivas generaban un complejopatrn de bandas que contenan un polimorfismoheredable. Los VNTR son repeticiones al azar en tn-dem de 10 a 60 pb, altamente polimrficos y con ele-vadas tasas de heterocigosis en las poblaciones(Vance y Othmane, 1998).

Microsatlites o Secuencias Repetidas Cortas (SSR)Los microsatlites son segmentos cortos de ADN

de 1 a 6 pares de bases (pb), que se repiten en tndemy de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos(Figura 2). Algunas de las caractersticas de estos

marcadores versus otros (minisatlites, RFLPs,RAPDs, etc.) que son considerados por la mayora deautores como una poderosa herramienta para estu-dios genticos son: presentan un elevado grado depolimorfismo, su herencia es mendeliana simple, soncodominates (pudindose diferenciar los individuoshomocigotos de los heterocigotos), son fciles de me-dir y analizar, tienen una confiabilidad del 100%,repetitivos y automatizables. Estos marcadores seencuentran generalmente en regiones no codificantesdel genoma y distribuidos uniformemente (Goldsteiny Schlotterer, 1999).

Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Res-triccin (RFLP)

Es una de las primeras tcnicas descritas (Botseinet al., 1980), desde la aparicin de la PCR, y consisteen visualizar las diferencias al nivel de la estructuradel ADN, basndose en el uso de enzimas de restric-cin que cortan el ADN en sitios donde se encuen-tran una secuencia especfica de nucletidos. La iden-tificacin de los fragmentos (RFLPs) requiere del usode geles de electroforesis que permitan separar losfragmentos que difieren en tamao. La limitacin deesta tcnica es que nicamente identifica dos alelospor locus, por lo que la variabilidad obtenida es redu-cida. Otra limitacin es que la aproximacin conRFLPs, para la bsqueda de polimorfismo en pro-ductos de PCR no es metodolgicamente efectiva al100%, ya que muchos SNPs potenciales podran nocambiar un sitio de restriccin, y por tanto no serandetectados por ella (Vance y Othmane, 1998).

Polimorfismo Amplificado Aleatoriamente(RAPD)

Representan a marcadores que se basan en el uso

Figura 1. Descubrimiento de un SNP (1), obtenido mediante el alineamiento de fragmentos a partir desecuenciacin directa de un producto de PCR. Fuente: Vignal et al., (2002).

33Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADN

de oligonucletidos (iniciadores) cortos, los cules atravs de una reaccin PCR, que se caracteriza portemperaturas de annealing bajas, lo cual genera unaserie de fragmentos de amplio espectro a partir delADN molde. La habilidad consiste entonces en en-contrar aquellos fragmentos amplificados y que re-sulten ser polimrficos, los cules pueden posterior-mente ser mapeados. Una de las principales limita-ciones del uso de los RAPDs es la baja repetibilidadde los anlisis, aunado a la necesidad de usar ungran panel de RAPDs, lo que representa un elevadovalor econmico y un laborioso trabajo analtico.Asimismo, y dado que es un marcador gentico detipo dominante, no podemos discriminar la existen-cia de heterocigotos, subestimando la cantidad depolimorfismo existente (Levin et al., 1994).

Marcadores microsatlitesDado que los microsatlites estn ms o menos

distribuidos a lo largo de todo el genoma de loseucariotas, aunque con baja frecuencia en las regio-nes codificantes y, quizs tambin en los telmeros,su presencia en estas regiones se ha descrito asocia-da a enfermedades (Armour et al., 1994; Hancock,1999; Tautz y Schlotterer, 1994). Sin embargo, an sedesconoce el significado funcional de estas secuen-cias, a pesar de que la hiptesis ms aceptada apun-ta a que pueden estar relacionados con elempaquetamiento y la condensacin del ADN en loscromosomas (Vanhala et al., 1998).

Debido a particulares ventajas, el uso demicrosatlites ha tenido un gran impacto en el estu-dio de la gentica de animales y plantas. Desde sudescubrimiento en 1989 (Litt y Luty, 1989, Tautz,1989, Weber y May, 1989). El anlisis conmicrosatlites involucra la deteccin de fragmentosespecficos de ADN y nos da la medida de los alelos(en pares de bases, pb) en cada una de las regiones.

Aplicaciones de los microsatlitesIdentificacin Individual y Pruebas de Paternida-

des:El principio de las pruebas de paternidad utili-

zando marcadores genticos consiste en la compara-cin del genotipo y/o fenotipo de la descendencia

con el de sus progenitores. Como principiomendeliano, uno de los alelos que presenta un in-dividuo proviene del padre y el otro de la madre. Endicho anlisis, al igual que la identificacin indivi-dual, la identificacin del (os) testigo (s), tanto a nivelfenotpico como genotpico debe ser perfectamenteconocida y concordante con la informacin obtenidaen los anlisis realizados al individuo.

El elevado polimorfismo que presentan estos mar-cadores y la posibilidad de poder detectar ambosalelos, los hace muy tiles para identificaciones in-dividuales, ya que resulta muy poco probable quedos individuos elegidos al azar, si son analizadospara una serie de marcadores, compartan todos susalelos. Para seleccionar los marcadores a utilizar,estos deberan reunir las caractersticas descritasanteriormente y presentar adems: alta variabilidad,herencia estable (baja tasa de mutacin), elevadareproductividad y precisin, la no presencia de alelosnulos, ser un procedimiento fcil, rpido, econ-mico, potencialmente automatizable, que la informa-cin del genotipo pueda ser transferida rpidamen-te, que la fuente de ADN no est limitada nicamentea muestras sanguneas frescas ni a grandes cantida-des de ADN y por ltimo, presente una segregacinindependiente con otros marcadores al ser combina-dos en la prueba.

Durante las ltimas dcadas las pruebas de pa-ternidad en quidos (especficamente en caballos) sehan venido realizando principalmente a travs de latipificacin sangunea, incluyendo tanto pruebasserolgicas como grupos sanguneos (hemotipados);as como, anlisis electroforticos del polimorfismode protenas y enzimas sanguneas (alozimas). Sietesistemas de grupos sanguneos y 16 polimorfismosbioqumicos han sido reconocidos internacional-mente y utilizados rutinariamente a nivel mundial,como herramientas oficiales para la prueba de pater-nidad (ISAG, International Society of AnimalGenetics). La combinacin de estos sistemas propor-ciona un 97% de probabilidad de detectar o asignarun padre o una madre incorrecta y cerca del 100% deprobabilidad para un cruzamiento entre individuos

Figura 2. Microsatlites, ejemplo de un di-nucletido A-C(n).

34 Aranguren-Mndez et al.de otras razas (Bowling y Clark, 1985, Bowling, 2001).Actualmente, con un conjunto aproximado de 10-12marcadores microsatlites, se obtiene una efectividadterica para detectar parentescos incorrectos (PE) porel orden del 99.99% (Aranguren-Mndez et al., 2001;Bowling et al., 1997).

Mapas Genticos y Genmica Comparativa:Otra aplicacin, de los microsatlites es la cons-

truccin de mapas de ligamiento ms completos ydetallados; as como la identificacin de genes deinters (QTLs).

Todos los marcadores pueden ser utilizados paramapas de ligamiento; sin embargo, se requiere, quelos alelos se segreguen independientemente y queadems puedan ser monitoreados a travs del pedi-gr. La descendencia puede ser informativa si los pro-genitores son doble heterocigotos en los loci analiza-dos. Los loci situados en cromosomas distintos po-dran recombinarse libremente durante lagametognesis parental hasta un 50% (segregacinindependiente); mientras que, si se encuentran en elmismo cromosoma recombinaran con una frecuen-cia que oscila entre 0 a 50% dependiendo de la dis-tancia en centi-morgans (cM) presente entre ellos.

As, un mapa gentico bien surtido de marcado-res se convierte en una herramienta muy til paraidentificar genes responsables de caracteres de inte-rs. Se trata de buscar asociacin entre varios alelos,en cualquiera de los marcadores, segregando en po-blaciones que presentan el carcter de inters, paraidentificar regiones del genoma donde es ms proba-ble que se encuentre el gen responsable de ese carc-ter (Cheng et al., 1995).

Actualmente existen proyectos internacionalespara elaborar mapas genticos en las principales es-pecies domsticas (Roslin Institute, http://www.ri.bbsrc.ac.uk), los cuales describen abundan-tes marcadores de este tipo.

Estudios de Gentica Poblacional:Representa una de las reas en donde los

microsatlites han sido ms ampliamente utilizados,ya que nos permite estimar los niveles de variabili-dad gentica dentro de las poblaciones y analizar lasrelaciones genticas existentes entre las mismas. Estetipo de estudio es de gran importancia para realizarestimaciones de la diversidad gentica y de la con-sanguinidad existente en poblaciones de animalesdomsticos en peligro de extincin.

Durante los ltimos aos se han realizado mu-chos estudios que han utilizado los microsatlitespara anlisis filogenticos, concluyendo que, con unbuen nmero de loci analizados y con apropiadastasas de mutacin, los microsatlites pueden dar unabuena aproximacin de la filogenia (Aranguren-Mndez et al., 2001, 2002(a), 2002(b), 2002(c), 2002(d);Farid et al., 2000; Ishida et al., 1994; Ishida et al., 1994;

Loftus et al., 1994; Peelman et al., 1998; Saitbekova etal., 1998; Takezaki y Nei, 1996).

En los estudios de gentica de poblaciones, losmarcadores permiten la identificacin de cada alelopor locus, la obtencin de datos poblacionales, y elclculo de las frecuencias allicas. De esta manerapodemos estimar las distancias genticas entre po-blaciones o entre individuos (Bowcock et al., 1995,Ponsuksili et al., 1999); as como tambin realizaranlisis filogenticos y de estructura de la poblacin.La diversidad o variabilidad gentica se puede defi-nir como la capacidad gentica para variar, y porende, la capacidad a responder tanto a variacionesde ndole ambiental como a cambios en los objetivosde seleccin. Es as, como la variabilidad genticaconstituye la base del progreso gentico (Rochambeauet al., 2000).

Asignacin de Individuos a Raza:Diferentes procedimientos han sido informados

para este propsito, indicando una gran variedad deaplicaciones y de metodologas para la correcta iden-tificacin de la fuente poblacional (Cornuet et al., 1999,Paetkau et al., 1995, Rannala y Mountain, 1997).

Los dos mtodos ms utilizados para asignar in-dividuos a poblaciones o razas son: basados en pro-babilidades y basados en distancias genticas. Enlos primeros, los individuos son asignados a aquellapoblacin en la que su genotipo presenta una mayorprobabilidad de pertenencia; mientras que, en lossegundos, los individuos son asignados a la pobla-cin que genticamente sea ms cercana.

Mtodos Basados en Probabilidades:a.- Mtodo de frecuencias:Este mtodo fue descrito originalmente por Paetkau

et al. (1995), y consiste en asignar un individuo a unapoblacin basndose en el valor de probabilidad desu genotipo individual de pertenecer a ella. La asig-nacin por este mtodo se realiza en tres etapas: a.1.-Calcula las frecuencias allicas de todas las pobla-ciones potenciales. a.2.- Calcula la probabilidad deocurrencia de cada genotipo multilocus para cadauna de las poblaciones y a.3.- Asigna el individuo aaquella poblacin en la cul el genotipo multilocusobtuvo la mayor probabilidad.

b.- Mtodo Bayesiano:Este mtodo es bastante similar al anterior y est

muy relacionado con lo reportado por Rannala yMountain (1997), quienes utilizaron la metodologaBayesiana para detectar migrantes mediante el usodel genotipado multilocus. Asumiendo una funcinde densidad igual a priori de las frecuencias allicasde cada locus en cada poblacin, Rannala y Mountain(1997), mostraron que la probabilidad marginal deobservar un individuo con un genotipo AkAk en ellocus j y en la poblacin i es igual a:

((nijk + 1 / Kj + 1) (nijk + 1 / Kj)) / ((nij + 2) (nij + 1)) si k = k

35Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADN (2 (nijk + 1 / Kj ) (nijk + 1 / Kj)) / ((nij + 2) (nij + 1)) si k k

donde nijk es el nmero de alelos k muestreados en ellocus j y en la poblacin i (que no contiene al indivi-duo a ser asignado), nij es el nmero de copias degenes muestreados en el locus j y en la poblacin i y Kjes el nmero total de alelos observados del locus j enlas poblaciones estudiadas.

Mtodos Basados en Distancias:Los mtodos basados en distancias asignan el in-

dividuo a la poblacin genticamente ms cercana oprxima. Para ello se requiere definir una distanciaentre el individuo y la poblacin. Se han definidonumerosas distancias genticas; sin embargo las po-demos agrupar en dos grandes bloques: las distan-cias entre poblaciones (p.e. distancias de Nei; distan-cia de cuerda de Cavalli-Sforza y Edwards, etc.) y lasdistancias entre individuos (eje. distancia de aleloscompartidos (DAS)) (Chakraborty y Jin, 1993).

En el primer caso se adaptan estas distancias a larelacin entre individuo-poblacin, considerando alos individuos cmo una muestra de dos genes (losposibles valores de frecuencias allicas son 0, 0,5 y1). Mientras que, en el caso de los alelos compartidos(DAS), la distancia entre un individuo y la poblacinse toma como el promedio de distancia entre el indi-viduo y los miembros de esa poblacin (Aranguren-Mndez et al., 2002(b)).

A pesar de las grandes ventajas que poseen losmicrosatlites como marcadores moleculares, existentambin otros factores a considerar que pueden dis-minuir el poder y/o la sensibilidad de stos comomarcadores de eleccin, o pueden ser fuente de errorque disminuya su utilidad en los estudios genticos.Estos factores son: el patrn de mutacin, los alelosnulos y la homoplasia.

Mutacin, alelos nulos y homoplasia en losmicrosatelites

Mutacin:Las mutaciones son alteraciones del material

gentico y en ellas se incluyen desde simples sustitu-ciones de un solo nucletido hasta las deleciones oinserciones de uno o ms nucletidos. La mayora delas mutaciones en animales no conllevan a cambiosen el fenotipo, ya que, ocurren en regiones no-codificantes (mutaciones silentes). De forma general,las regiones o secuencias codificantes muestran unabaja tasa de mutacin que se ve reflejada en la escasavariabilidad existente dentro de especies y el alto gra-do de conservacin que presentan estas regiones en-tre especies (Eisen, 1999). El elevado grado de con-servacin de estas regiones se pueden explicar mu-chas veces por el hecho de que las mutaciones dentrode esta regin son deletreas, ya que causan la prdi-da de una funcin importante y por lo tanto son eli-minadas por seleccin purificadora.

Entender el proceso mutacional de losmicrosatlites es esencial antes de inferir las relacio-nes existentes entre la variacin observada y las dis-tancias genticas o la estructura de una poblacin.Los microsatlites, a diferencia de otros marcadores,tales como protenas o enzimas, presentan un patrndiferente de mutacin, ya que en primer lugar, lamayora de las mutaciones estn involucradas por laganancia o prdida de una simple unidad de repeti-cin (Weber y Wong, 1993), adems de la propia pre-sencia de homoplasia, la cul a su vez causa unasubestimacin de la cantidad total de variacin entrepoblaciones y por ende de las distancias genticas;por lo tanto, ocurre una sobreestimacin de las simi-litudes entre las poblaciones.

La tasa de mutacin en los microsatlites ha sidoestimada en un rango que oscila entre 10-3 y 10-5 mu-taciones por gameto (Bowcock et al., 1995, Forbes etal., 1995); sin embargo, el mecanismo cmo losmicrosatlites mutan es an desconocido. Dos meca-nismos son los que principalmente han sido propues-tos: en primer lugar se cita un desigual cruce en lameiosis y en segundo lugar un desliz de la hebra delADN durante la replicacin, siendo al parecer estaltima, la principal causa de mutacin de losmicrosatlites (Goldstein y Schlotterer, 1999).

In vitro, algunos factores intrnsecos, tales como,la longitud de la repeticin y la composicin (tipo debase nitrogenada) han demostrado que pueden afec-tar la tasa de mutacin de los microsatlites. Es ascomo los dinucletidos presentan tasas de mutacinms elevadas que los trinucletidos, y las secuenciascon alto grado de AT (adenina-timina) en su compo-sicin mutan a mayores tasas que las que presentanaltas combinaciones de GC (guanina-citosina)(Schlotterer y Tautz, 1992).

Los dos principales modelos que se han utilizadopara modelar el proceso mutacional de losmicrosatlites son: el modelo de alelos infinitos (IAM)y el modelo mutacional por pasos (SMM). En el IAMse supone que la mayora de nuevas mutaciones danlugar a nuevos alelos distinguibles, es decir, los nue-vos alelos mutantes son siempre diferentes a los queya existan en la poblacin original, por lo que eneste caso la homoplasia no existe o es despreciable.En el SMM los alelos slo pueden mutar por la ga-nancia o prdida de una sola unidad de repeticin;debido a esto, queda claro que puede existir una grancantidad de homoplasia. Ambos modelos son por lotanto extremos. Otro modelo intermedio que se citaen la literatura, aunque con menor frecuencia es el dedos fases (TPM) y es igual al SMM, pero permite quese puedan dar mutaciones de mayor magnitud (Teo-ra de la Coalescencia) y predice la varianza espera-da en nmero de repeticiones de un microsatlite,bajo distintos procesos mutacionales e historias de-

36 Aranguren-Mndez et al.mogrficas. En este modelo se pueden dar mutacio-nes viejas (alelos ya existentes en la poblacin), perotambin mutaciones nuevas (alelos nuevos en lapoblacin), con lo cul la cantidad de homoplasiaexistente siempre ser menor que en el modelo SMM.Por lo tanto TPM en la prctica sera ms parecido alIAM (Di Rienzo et al., 1994; Murray, 1996).

Al principio se esper que los microsatlites si-guieran el SMM, pero los anlisis experimentales handemostrado que no se trataba de un modelo simple(Kwok et al., 1996). Parece ser que, dependiendo deltamao de la unidad de repeticin, un microsatlitese adapta ms a un modelo o al otro. Losmicrosatlites de repeticiones de 3-5 pb parece que ssiguen el SMM (Tautz y Schlotterer, 1994), mientrasque los de 1-2 pb siguen el IAM o el TPM (Vanhala etal., 1998), al igual que los minisatlites (repeticionesde 10-60 pb) (Estoup et al., 1999).

Alelos Nulos:Se habla de alelos nulos cuando estos no pueden

ser amplificados por PCR, debido principalmente auna mutacin en el punto de hibridacin del inicia-dor. Uno de los alelos no amplifica y por lo tanto elindividuo es catalogado como homocigoto para elotro alelo (Dawson et al., 1997). La existencia de alelosnulos es especialmente difcil de detectar cuando sufrecuencia en la poblacin es baja y cuando no sedispone de informacin genealgica fiable. Su deter-minacin sera posible si se presentara enhomocigosis, ya que no obtendramos producto am-plificado de un determinado individuo para ese locus.

En los casos de verificacin de paternidades, po-demos sospechar la presencia de alelos nulos en unmarcador cuando todos los dems marcadores apun-tan a un progenitor y sin embargo, es homocigotopara ese marcador excluyente, siendo el descendien-te homocigoto para ese marcador para uno de losalelos parentales. Un alelo nulo podra llevarnos ainterpretaciones errneas y excluir a estos animalescomo posibles progenitores en un anlisis de pater-nidad, adems de sesgar las estimaciones de las fre-cuencias allicas en las poblaciones. Otra manerapara detectar la presencia de alelos nulos sera a par-tir del clculo del dficit de heterocigotos para el equi-librio Hardy-Weinberg (Neuman y Wetton, 1996).

Para solucionar el problema de los alelos nulos sepueden disear cebadores alternativos fuera del pun-to de mutacin y volver a analizar los individuosclasificados como homocigotos. Asimismo, esto sepuede evitar no utilizando marcadores que han sidoreportados como portadores de alelos nulos en cier-tas poblaciones o razas, ya que pueden darnos pro-blemas de esta ndole (Dawson et al., 1997, Mundy yWoodruff, 1996).

Homoplasia:Originalmente, el trmino homoplasia fue utili-

zado por los evolucionistas para referirse al hechode que un mismo carcter, presente en dos especies,no siempre ha derivado del mismo carcter ances-tral. A nivel gentico, se dice que dos alelos sonhomoplsicos cuando poseen un estado idntico,aunque no sea por descendencia (Estoup y Cornuet,1999).

La homoplasia se refiere al hecho de que dos alelostengan el mismo tamao (pb) pero no es debida a quesean idnticos. Se toma como idnticos por tener elmismo tamao pero intrnsecamente existen clarasdiferencias en cuanto a su estructura, presencia deinserciones y/o deleciones, cambios de bases o va-riaciones en la regin flanqueante (Primmer yEllergren, 1998).

ste es un tipo de polimorfismo que puede detec-tarse nicamente por secuenciacin, y puede pasarinadvertido en caso de analizar individuos median-te amplificacin por PCR y electroforesis para asig-nar tamaos. La homoplasia en las pruebas de pater-nidad y parentesco nos supone una relacin cuandono la hay o viceversa. Tambin puede ser fuente deerror en estudios poblacionales o de evolucin por-que la tasa de mutacin de los microsatlites est re-lacionada de forma compleja con el tamao y compo-sicin del alelo. Por ejemplo, los alelos interrumpi-dos o compuestos conllevan con ms frecuencia acasos de homoplasia (Tautz y Schlotterer, 1994).

En modelos mutacionales del tipo IAM se suponela no presencia de homoplasia, ya que una nuevamutacin produce la creacin de un nuevo alelo; eneste caso totalmente distinto al que exista previa-mente en la poblacin. Sin embargo, los otros mode-los de mutacin (SMM, TMP) pueden llegar a gene-rar homoplasia y la cantidad depender de la tasa demutacin presente en la poblacin.

En los marcadores del tipo microsatlite se esperaen teora una cierta cantidad de homoplasia, ya queexiste evidencia de que directa o indirectamente losmicrosatlites presentan un tipo de mutacin del tipoSMM o TPM; los microsatlites se caracterizan porpresentar una elevada tasa de mutacin que puedeoscilar entre 10-3 y 10-5 mutaciones por locus y genera-cin (Renwick et al., 2001); por ltimo, el rango limi-tado de tamaos de alelos presentes en losmicrosatlites reduce los posibles estados allicosfavoreciendo la cantidad de homoplasia (Nauta yWeissing, 1996; Estoup et al., 1999).

Anlisis de la variabilidad genticaExiste una gran diversidad de estadsticas para

cuantificar la variabilidad gentica y resumir la in-formacin a trminos ms manejables. Los estadsti-cos ms empleados son: porcentaje de locipolimrficos, el nmero medio de alelos por locus, laheterocigosidad esperada (HE) y observada (HO) y elndice de contenido de polimrfico (PIC) (Aranguren-

37Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADNMndez et al., 2001, 2002(b).

Porcentaje de loci polimrficos:Un locus se considera polimrfico si podemos de-

tectar ms de un alelo en una poblacin. General-mente el criterio ms utilizado es el del 1%, es decir,un locus ser polimrfico si el alelo ms comn pre-senta una frecuencia menor al 99% en la poblacinbajo estudio.

Nmero medio de alelos por locus:Esta estadstica indica el nmero medio de alelos

que presenta un locus en una poblacin. Sin embar-go, dicha medida depende mucho del nmero de in-dividuos analizados, ya que cuando el nmero esgrande, mayor es la probabilidad de detectar alelossuplementarios. No obstante, este estadstico es tilpara estudiar la existencia de variabilidad crpticaen los loci.

Heterocigosidad (H):Representa una mejor medida de la variacin

gentica, ya que es precisa y no arbitraria. Laheterocigosidad la podemos estudiar como HO y HE.

La HO se define como la frecuencia relativa de in-dividuos heterocigotos observados en la muestra paracualquiera de los loci y se calcula por cmputo direc-to. Mientras que la HE, desde el punto de vista mate-mtico, es la probabilidad de que dos alelos tomadosal azar de la poblacin sean diferentes (Crow yKimura, 1970). En una poblacin en equilibrio H-W,la frecuencia de los heterocigotos viene dada por laecuacin 2 pq.

El clculo de la HE en la poblacin puede realizar-se a travs de: HE = 1 - S pi 2

siendo pi2 = (homocigosidad) o tambin su equi-valente: HE = S pi (1 - pi) siendo este termino tambinconocido como diversidad gnica de Nei (1977).

Segn Zapata (1987), la HE es un buen estimadorde la variabilidad, dado que se aplica a cualquierespecie, independientemente de su estructurareproductiva o gentica, pudindose por tanto reali-zar comparaciones entre ellas.

ndice de Contenido Polimrfico (PIC):El PIC es similar al valor de heterocigosidad y os-

cila entre 0 y 1. Este ndice evala la informatividadde un marcador en la poblacin de acuerdo a las fre-cuencias de los alelos. Para su clculo se multiplicala probabilidad de cada posible cruzamiento (esti-mado a partir de las frecuencias allicas) por la pro-babilidad que sean informativos, es decir, que se pue-da identificar al progenitor del que procede el alelo(Botsein et al., 1980).

n n-1 nPIC = 1 ( pi2) - 2 pi2 pj2 i=1 i=1 j=i-1

Donde pi ...pn son las frecuencias de los n alelos.

Probabilidad de exclusin (PE):Expresa la probabilidad de que la asignacin err-

nea de un progenitor sea detectada por el anlisis(Jamieson, 1994).

PE= pi 2pi2 + 2"pi3 + 2"pi4 3"pi5 2(pi2)2 +3pi2"pi3

PE = pi (1-pi)2 - (pi pj)2 (4 3 (pi + pj));

donde i > j y pi ...pn son las frecuencias de los alelos.PEtot = 1 ((1-PE1) (1-PE2)........(1-PEn)); a la probabi-

lidad global de un conjunto de marcadores.Equilibrio Hardy-Weinberg (H-W):La ley de Hardy-Weinberg (Hardy, 1908;

Weinberg, 1908) representa a una poblacin grandede individuos diploides, con reproduccin sexualaleatoria, sin seleccin, mutacin y migracin, las fre-cuencias gnicas y genotpicas permanecen constan-tes de generacin en generacin y, adems, existe unarelacin simple entre ambas. As, una poblacin confrecuencias gnicas y genotpicas constantes, se diceque est en equilibrio H-W.

Cuando la poblacin se desva de manera signifi-cativa de estas proporciones se habla de desequili-brio H-W, y se puede medir mediante el ndice defijacin F (Wright, 1965), el cul se expresa para unlocus cualquiera como:

F = (HE HO) / (HE);Siendo HE y HO la heterocigosidad esperada y ob-

servada para ese locus, respectivamente. Cuando elndice de fijacin F es igual a cero se indica que lapoblacin est en equilibrio; mientras que si F es dife-rente de cero, ya sea en forma positiva o negativa,indicara que existe un dficit o exceso deheterocigotos, respectivamente.

Anlisis de la estructura poblacionalAntes de realizar los anlisis de la estructura

poblacional es esencial probar la variacin genticaencontrada mediante los microsatlites, con el objetode que no se haya violado alguna de los supuestosbsicos en un anlisis poblacional. Estos supuestosson tres: a) selectiva neutralidad de cada locus, b) lainexistencia de alelos nulos y c) independencia delos loci (Murray, 1996).

Efectos como la seleccin, puede confundir los re-sultados, y cualquier loci que est presumiblementeligado a un carcter de inters selectivo debe ser des-cartado del anlisis. Aunque la mayora de losmicrosatlites se comportan de manera neutral(Murray, 1996).

Para los estudios de la estructura de la poblacinlos anlisis de la F-estadstica han mostrado ser unaherramienta til para dilucidar los patrones y extraerla variacin gentica residente entre y dentro de laspoblaciones. Segn estos estadsticos, la variabilidadde una poblacin global puede ser subdivida entre

38 Aranguren-Mndez et al.sus subpoblaciones (Aranguren-Mndez et al.,2002(d).

Wrigth (1965) defini tres F-estadsticas: FIS, FIT yFST, como correlaciones entre unidades gamticas enla poblacin a diferentes niveles. Los estadsticos FISy FIT explican las correlaciones entre dos unidadesgamticas tomadas al azar de una subpoblacin ydel total de la poblacin como un todo respectiva-mente; y nos indica el exceso o dficit de heterocigotospresentes; mientras que el FST es la correlacin entredos gametos tomados al azar de cada una de lassubpoblaciones y mide el grado de diferenciacingentica entre dos subpoblaciones. Estos parmetrosse relacionan a travs de la siguiente expresin:

(1 - FIT) = (1 - FIS) (1 - FST) (1)

Pudindose inclusive en algunos casos extenderel anlisis a niveles jerrquicos adicionales dentrode la poblacin, y en casos de anlisis de variabili-dad gentica intraracial, subdividiendo las razas ensubpoblaciones, hasta dos niveles jerrquicos, por loque la ecuacin (1) extendida sera:

(1 - FIT) = (1 - FIS) (1 - FSC) (1 - FCT)

donde FSC y FCT miden el grado de diferenciacingentica entre subpoblaciones dentro de razas y den-tro de las subpoblaciones, respectivamente (5).

La desviacin del equilibrio H-W puede ser debi-da a una variedad de causas. Si los resultados arro-jan un exceso de heterocigotos, podra en este casoser atribuida a la presencia de una seleccinsobredominante o la ocurrencia de migraciones en lapoblacin estudiada; si por el contrario los hallaz-gos son de dficit de heterocigotos, podra deberse acuatro factores principalmente; en primer lugar, queel locus est bajo seleccin; en segundo lugar, a lapresencia de alelos nulos en esa poblacin, dandouna falsa lectura de un exceso de homocigotos; entercer lugar a altos niveles de consanguinidad en lapoblacin, producto de apareamiento entre indivi-duos emparentados y, en cuarto lugar, se atribuira ala presencia de una cierta subestructuracinreproductiva de la poblacin (efecto Wahlund)(Nei, 1987).

Nei (1977), reformul los ndices F, basndose enlos valores de HO y HE. En este modelo, el cul esindependiente del nmero de alelos presentes en cadalocus, la diferenciacin o estructura de la poblacinse mide por un parmetro denominado GST (Nei, 1973,1977), anlogo al FST y que cumple la siguiente rela-cin:

(1 - GIT) = (1 - GIS) (1 - GST);donde: GST = (HT HS) / (HT)

HS es equivalente a la anterior HE, mientras que HTse define como la heterocigosidad media esperadapor locus en la poblacin total: HT= (k hT) / k; siendok el nmero de loci y hT la heterocigosidad esperadaen la poblacin total para un determinado locus. Unavez introducida la definicin de diversidad genticade Nei (GST), HS viene a representar la diversidadgentica dentro de la subpoblacin y HT la diversi-dad gentica en la poblacin total.

Anlisis de la diferenciacin genticaPara estudiar las diferencias entre poblaciones se

han de comparar las frecuencias allicas observadasde cada locus mediante una prueba adecuada y cal-cular las distancias genticas entre ellas. En este sen-tido, la distancia gentica mide el grado de diferen-ciacin existente entre poblaciones de una mismaespecie, o entre especies, pudindose cuantificar esadiferencia mediante diferentes ndices de distancias.

Las distancias genticas ayudan a entender lasrelaciones evolutivas entre poblaciones y nos permi-te obtener informacin para caracterizacin de razas(Nagamine y Higuchi, 2001). De las distanciasgenticas es importante estudiar el tipo de distancia,el mtodo de construccin del dendrograma oalgoritmos y el anlisis de remuestreos.

Distancias Genticas:Las distancias genticas son estimadoras del tiem-

po de separacin entre poblaciones y se basan enciertas diferencias genticas existentes dentro y entrepoblaciones. Algunas de las distancias genticas es-tn enfocadas en los cambios de las frecuenciasgnicas (p.e. FST); mientras que otras incorporan ade-ms el proceso mutacional, y en el caso especfico delos microsatlites stas se denominan distancias porpaso o etapas (stepwise). Las matrices de las distan-cias genticas entre poblaciones pueden ser conver-tidas en rboles evolutivos utilizando mtodos deagrupamiento, tales como, el mtodo de agrupamientono ponderado por pares utilizando la media aritm-tica (UPGMA) o el Neighbour Joining (NJ) (Goldsteiny Schlotterer, 1999).

Suponiendo diferentes modelos mutacionalespara los loci que codifican para protenas (IAM) ypara los loci microsatlites (SMM), Takezaki y Nei(1996) estudiaron la eficacia mediante simulacin porordenador de diferentes medidas de distancia en lacorrecta reconstruccin de una filogenia conocida.Dichas distancias correspondieron a:

a.- Distancia estndar de Nei (DS (Nei, 1972)):

DS = -ln (Jxy / Jx Jy )donde Jx y Jy son las homocigosis medias sobre

loci en la poblacin X e Y, respectivamente .Bajo el proceso mutacional IAM se espera que

la DS incremente linealmente con el tiempo, si se man-tiene un balance entre deriva y mutacin a travs de

39Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADNtodo el proceso evolutivo.

b- Distancia mnima de Nei (Dm (Nei, 1973) ):

Dm = (Jx + Jy) / (2 Jxy)

En este caso la esperanza de Dm es conocida como:E(Dm) = J( 1 e -2vt ), donde J es la homocigosis de lasdos poblaciones.

c.- Distancia de Reynolds (Reynolds et al., 1983):

DL = -ln (1 - FST); FST @ qST = ((Jx + Jy) / (2 Jxy)) / 1 - Jxy

d.- Distancia de Rogers (Rogers, 1972):

r mj DR = (1/r) S ( (xij - yij)2 / 2) j i

e.- Distancia de Prevosti (Cp; (Prevosti et al., 1975) ):

Esta distancia posee las mismas propiedades es-tadsticas que la DR y se define como:

r mj Cp = xij yij / (2r) j i

f.- Distancia de cuerda (DC; (Cavalli-Sforza yEdwards, 1967) ):

r mj DC = ( 2 p r) 2 (1 - xij yij) j i

La DC representa las poblaciones como puntos enla superficie de una hiperesfera multidimensionalusando las frecuencias allicas. La distancia entreellas sera dada a partir de la longitud cordal entrelos puntos.

g.- Distancia A de Nei (DA; (Nei et al., 1983) ):

r mj DA= (1/r) ( 1 - (xij yij) ) j i

Nei simul esta distancia (DA) con el procesomutacional IAM y demostr que era ms eficiente quela DS, Dm, DR y DC en la asignacin de correctastopologas.

Otra distancia es la dm2 de Goldstein et al. (1995),la cul es la ms reciente y como producto de la apa-ricin de los primeros estudios con ADNmicrosatlite. Dado que estos marcadores poseen unelevado grado de polimorfismo con respecto al n-mero de repeticiones, su nmero puede aumentar o

disminuir por un proceso mutacional del tipo SMM.Bajo este modelo de mutacin, un alelo i (alelos con irepeticiones) se supone que puede mutar a otro aleloen un estado i + 1 i 1 con igual probabilidad, alu-diendo un mejor anlisis para este tipo de marcadory denotndose de la siguiente manera:

r(dm)2 = (mxj - myj)2 / r; j

donde mxj= (i ixij) y myj= (i iyij) representan losestados allicos medios del j-simo locus y xij e yij sonlas frecuencias de los alelos en el estado i en el j-simolocus en la poblacin X e Y, respectivamente.

En estos estudios Takezaki y Nei (1996) conclu-yen con respecto a las distancias genticas genera-das a partir de datos de estudios con marcadores cl-sicos, los cules presentan un modelo de mutacinIAM, y con microsatlites con mutacin del tipo SMM.Las distancias ms eficientes para ambos modelosresultaron ser DC y DA para la correcta asignacin detopologas, y la distancia estndar (DS) y dm2 resulta-ron ser las ms apropiadas para estimar los tiemposevolutivos, coincidiendo con otros reportes(Aranguren-Mndez et al., 2002(b), Nagamine yHiguchi, 2001, Ruane, 1999).

Matemticamente, cualquiera de estas funcionesdebe poseer ciertas propiedades para poder ser con-sideradas como una distancia. Primero, la distanciaentre una poblacin A y ella misma debe ser cero (0),de aqu que d(A,A)=0. Segundo, la distancia entre lapoblacin A y la poblacin B debe ser simtrica, o loque es lo mismo d(A,B) = d(B,A); si una distancia satisfa-ce estas propiedades se denomina distancia semi-mtrica y si adems logra satisfacer la desigualdadtriangular d(A,B) d (d(A,C) + d(B,C)) se denomina dis-tancia mtrica (Eding y Laval, 1999); la distancia DSde Nei, no cumple estas propiedades, ya que no esuna distancia mtrica.

Mtodos de Agrupamiento o Algoritmos:En la construccin de los rboles filogenticos exis-

ten diferentes mtodos para dibujar la matriz de dis-tancias. Sin embargo, los ms empleados son el NJ yel UPGMA, los cules generalmente dan muy bue-nos resultados. A pesar de ello el primero parece sersuperior cuando se suponen en el modelo diferentestasas de evolucin (Eding y Laval, 1999, Takezaki yNei, 1996).

El mtodo NJ fue descrito por Saitou y Nei (1987),se caracteriza por que construye rboles mediante su-cesivos agrupamientos de alineaciones, tomando encuenta las longitudes de rama para dichosagrupamientos. Una vez realizado el agrupamientoderiva la mejor aproximacin para la mxima parsi-monia, construyendo los grupos apareados sobre labase de la mnima longitud de rama. Las dos princi-

40 Aranguren-Mndez et al.pales caractersticas de este mtodo son que los resul-tados nos dan un rbol no rotado (sin raz u origenevolutivo), y luego este no supone un reloj evolutivo.

Por otra parte, el mtodo UPGMA construye losrboles o dendrogramas mediante sucesivosagrupamientos bajo el criterio del promedio de la dis-tancia de cada par. Se caracteriza porque supone unatasa constante de cambios evolutivos, es decir, supo-ne la existencia de un reloj evolutivo y los rboles sonrotados. Weir (1996) lo defini como una distanciaentre grupos, producto del promedio de todas las dis-tancias entre pares de cada una de las combinacio-nes.

Es as como los dendrogramas no son ms que larepresentacin grfica de una matriz de distancias, yque bajo ciertas condiciones, esta representacin pue-de ser tomada como una estimacin de la filogenia

Anlisis de Remuestreos:Dado que la estimacin de las distancias genticas

entre poblaciones es un mtodo estadstico, el proce-so de muestreo es sumamente importante. Existenvarias tcnicas estadsticas para remuestreos de losdatos de loci genticos. Entre ellas se encuentran elBootstrapping y el Jackknife. Estas tcnicas permi-ten la posibilidad de dibujar mltiples rboles y esti-mar la fiabilidad para los diferentes nodos en el r-bol, as como el nivel de confianza del rbol (Weir,1990).

El bootstrapping es una tcnica que genera in-formacin adicional acerca de la distribucin de losparmetros. Dado que los datos consisten en n obser-vaciones, un bootstrap genera una muestra de ndibujos al azar, realizado por medio del reemplaza-miento de los datos originales. De este modo, todaslas observaciones originales tienen la misma oportu-nidad de ser reemplazados, y al final el valor de losnuevos bootstrap ser el promedio para elparmetro muestreado (Tivang, 1994; Weir, 1990).Generalmente este proceso se repite un gran nmerode veces ( 1000), creando un gran nmero de nue-vos conjuntos de datos, pudindose usar ademspara estimar medias y desviaciones estndares deun estimador calculado con los datos en cuestin.

La tcnica del Jackknife, por otro lado, es un sim-ple re-muestreo numrico, que consiste en generarun nuevo valor estimado a partir de la tcnicaiterativa basada en la estimacin de mxima verosi-militud despus de excluir la i-sima observacin. As,cada nuevo valor estimado estara basado en n-1 ob-servaciones. La principal limitacin de esta tcnicaes la poca informacin que proporciona acerca de ladistribucin de los estimadores (Weir, 1996).

Diversidad de Weitzman:El anlisis de Weitzman es otro mtodo para la

construccin de rboles filogenticos basado en lafuncin de diversidad (Weitzman, 1992, 1993). Dado

que en los programas de conservacin gentica elprincipal objetivo es preservar la variabilidad dentrode la poblacin, bajo la hiptesis de existencia decorrelacin entre la variacin gentica y la viabili-dad de la poblacin, se hace necesario cuantificar labiodiversidad para as racionalizar mejor la polticade conservacin (Weitzman, 1992).

La diversidad de Weitzman se define como la di-versidad esperada despus de un cierto periodo detiempo, y se basa en la probabilidad de extincin decada elemento (poblacin o raza) en un conjunto ogrupo considerado. Si n elementos estn en peligrode extincin, ambos patrones (supervivencia y/o ex-tincin) pueden ocurrir con una cierta probabilidad.Para cada uno de ellos pueden calcularse los corres-pondientes valores de diversidad (Thaon Darnoldiet al., 1998). Una vez conocida la consanguinidad deuna poblacin o raza, sta puede utilizarse como supropia probabilidad de extincin, proporcionandoun orden prioritario sobre las razas a conservar(Aranguren-Mndez et al., 2002(c)).

Conclusiones

Los anlisis con marcadores genticos del tipomicrosatlite para el estudio de poblaciones resultanmuy tiles y valiosos, ya que adems de la evalua-cin de la variabilidad gentica, la informacin ge-nerada permite estudiar con mayor exactitud la es-tructura gentica y la caracterizacin molecular delas poblaciones y/o razas. As mismo, esta revisinconfirma que los microsatlites pueden ser usadoseficazmente para establecer las relaciones genticasentre poblaciones y razas, de gran utilidad en la eva-luacin global de la diversidad (dentro y entre ra-zas), que es sumamente til y debera ser tomada encuenta a la hora de tomar decisiones para poner enprctica planes de conservacin y mejoramiento ani-mal. Finalmente, la informacin generada por losmicrosatlites puede ser integrada al Banco Globalde Diversidad de los Animales Domsticos de la FAO(FAO Global Data Bank on Domestic Animal Diversity(DAD-IS)), para el conocimiento y divulgacin de lasrazas y poblaciones en estudios biolgicos.

Literatura Citada

Aranguren-Mndez, J. A., J. Jordana, R. Avellanet y M. Torrens.2002(a). Estudio de la variabilidad gentica en la raza bo-vina Mallorquina para propsitos de conservacin. RevistaCientfica, FCV-LUZ. XII(5): 358-366.

Aranguren-Mndez, J. A., M. Gomez y J. Jordana. 2002(b).Potencial de los Microsatlites para la asignacin de indivi-duos dentro de raza en poblaciones a ser conservadas. VCongreso de la Sociedad Espaola para los RecursosGenticos Animales y III Congreso Ibrico sobre RecursosGenticos Animales. (SERGA & SPREGA). El Arca. 5: 37

Aranguren-Mndez, J. A. y J. Jordana M. Gmez. 2002(c).

41Los microsatlites (STRs), marcadores moleculares de ADNGenetic conservation of five endangered Spanish donkeybreeds. J. Anim. Breed. Genet. 119: 256-263.

Aranguren-Mndez, J. A., M. Gmez y J. Jordana. 2002(d).Hierarchical analisis of genetic structure in Spanish donkeybreeds using microsatellite markers. Heredity. 89: 207-211.

Aranguren-Mndez, J. A., J. Jordana y M. Gomez. 2001. Geneticdiversity in Spanish donkey breeds using microsatelliteDNA markers. Genetics Selection and Evolution. 33: 433-442.

Armour, J. A., R. Neumann, S. Gobert y A. J. Jeffreys. 1994.Isolation of human simple repeat loci by hybridizationselection. Human Molecular Genetics. 3: 599-605.

Botstein, D., R. L. White, M. Skolnick y R. W. Davis. 1980.Construction of a genetic linkage map in man using restrictionfragment length polymorphisms. American Journal ofHuman Genetics. 32: 314-331.

Bowcock, A. M., A. Ruiz-Linares, J. Tomfohrde, E. Minc, J. R.Kidd y L. L. Cavalli-Sforza. 1994. High resolution of humanevolutionary trees with polymorphic microsatellites. Nature.368: 455-457.

Bowling, A.T. y R. S. Clark. 1985. Blood group and proteinpolymorphism gene frequencies for seven breeds of horsesof United States. Anim. Blood Gr. and Biochem. Genet. 16:93-108.

Bowling, A. T., M. L. Eggleston-Stott, G. Byrns, R. S. Clark, S.Dileanis y E. Wictum. 1997. Validation of microsatellitemarkers for routine horse parentage testing. AnimalGenetics. 28: 247-252.

Bowlingv, A. T. 2001. Historical development and applicationof molecular genetic tests for horse identification andparentage control. Livestock Production Science. 72: 11-116.

Cavalli-Sforza, L. L. y W. F. Edwards. 1967. Phylogeneticanalysis: Models and estimation procedures. AmericanJournal of Human Genetics. 19: 233-257.

Chakraborty, R., L. Jin. 1993. A unified approach to studyhypervariable polymorphisms: Statistical considerations ofdetermining relatedness an population distance. In: Pena,S.D.J., Chakraborty, R., Epplenj, J.T., Jeffreys, A.J. (eds).DNA finger-printing: state and the science. BirkhuserVerlag, Basel. Switzerland. pp. 153-175.

Cheng, H. H. y L. B. Crittenden. 1994. Microsatellite markersfor genetic mapping in the chicken. Poultry Science. 73:539-546.

Cheng, H. H., I. Levin, R. L. Vallejo, H. Khatib, J. B. Dodgson,L. B. Crittenden y J. Hillel. 1995. Development of a geneticmap of the chicken with markers of high utility. PoultryScience. 74: 1855-1874.

Cornuet, J. M., S. Piry, G. Luikart, P. A. Stoup y M. Solignac.1999. New methods employing multilocus genotypes toselect or exclude populations as origins of individuals.Genetics. 153: 1989-2000.

Crow, J. F. y M. Kimura. 1970. An introduction to populationgenetics theory. New York, Evanston and London. Harperand Row Publishers. pp. 83-98.

Dawson, R. J. G., H. L. Gibbs, K. A. Hobson y S. M. Yezerinac.1997. Isolation of microsatellite DNA markers from apasserine bird, Dendroica petechia the yellow warbler, andtheir use in population studies. Heredity. 79: 506-514.

Di Rienzo, A., A. C. Peterson, J. C. Garza, A. M. Valdes, M.Slatkin y N. B. Freimer. 1994. Mutational processes of sim-ple-sequence repeat loci in human populations. Proceedingsof the National Academy of Sciences of USA. 91: 3166-3170.

Dodgson, J. B., H. H. Cheng y R. Okimoto. 1997. DNA markertechnology: a revolution in animal genetics. Poultry Science.76: 1108-1114.

Eding, H. y G. Laval. 1999. Measuring genetic uniqueness inlivestock. In: Oldenbroek, K. (Ed.). Genebanks and themanagement of farm animal genetic resources. IDO-DLpress. The Netherlands, pp. 33-58.

Eisen, J. A. 1999. Mechanistic basis for microsatellite instability.In: Goldstein, D., Schtterer, C. (Eds.). MicrosatellitesEvolution and Applications. Cap. 4, pp.34-48. Oxford

University Press, New York.Estoup, A. y J. M. Cornuet. 1999. Microsatellite evolution :

inferences from population data. En: Goldstein, D. andSchltterer, C. (Eds.). Microsatellites Evolution andApplications. Oxford University Press, New York. Cap. 5,pp.49-65.

Estoup, A., L. Garnery, M. Solignac y J. M. Cornuet. 1995.Microsatellite variation in honey bee Apis mellifera L.populations: hierarchical genetic structure and test of theinfinite allele and stepwise mutation models. Genetics. 140:679-695.

Farid, A., E. Oreally, C. Dollard y C. R. Kelsey Jr. 2000. Geneticanalysis of ten sheep breeds using microsatellite markers.Canadian Journal of Animal Science. 80: 9-17.

Forbes, S. H., J. T. Hogg, F. C. Buchanan, A. M. Crawford y F.W. Allendorf. 1995. microsatellite evolution in congenericmammals: Domestic and Bighorn sheep. Molecular Biologyand Evolution. 12: 1106-1113.

Goldstein, B. D. y C. Schlotterer C. 1999. Microsatellitesevolution and applications. Oxford University Press, NewYork, 352pp.

Goldstein, D. B., A. Ruiz-Linares, L. L. Cavallis-Sforza y M.W. Feldman. 1995. Genetic absolute dating based onmicrosatellites and the origin of modern humans.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA.92: 6723-6727.

Hancock, J. 1999. Microsatellites and other simple sequence:genomic context and mutational mechanisms. En: GoldsteinD., Schlotterer C. (eds.). Microsatellites evolution andapplications, Oxford University Press, New York, pp. 1-10.

Hardy, G. H. Mendelian proportion in a mixed population.Science. 28: 49-50. 1908.

Ishida, N., T. Hasegawa, K. Takeda, M. Sakagami, A. Onishi,S. Inumaru, M. Komatsu y H. Mukoyama. 1994.Polymorphic sequence in the D-loop region of equinemitochondrial DNA. Animal Genetics. 25: 215-221.

Jamieson, A. 1994. The effectiveness of using codominantpolymorphic allelic series for 1 checking pedigrees and 2distinguishing full-sib pair members. Animal Genetics.25(Suppl. 1): 37-44.

Jeffreys, A. J., V. Wilson y S. L. Thein. 1985. Hypervariableminisatelite regions in human DNA. Nature. 314: 67-73.

Jones, A. G., S. stlund-Nilsson y J. C. Avise. 1998. Amicrosatellite assessment of sneaked fertilizations and eggsthievery in the fifteenspines stickelback. Evolution. 52: 848-858.

Jordana, J., P. Folch y J. A. Aranguren. 2001. Microsatelliteanalysis of genetic diversity in the Catalonian donkey breed.Journal of Animal Breeding and Genetics. 118: 57-63.

Jordana, J., P. Folch y A. Sanchez. 1999. Genetic variationprotein markers and microsatellites in endangeredCatalonian donkeys. Biochemical System Ecology. 27: 791-798.

Kantanen, J., I. Olsaker, L. E. Holm, S. Lien, J. Vikki, K.Brusgaard, E. Eythorsdottir, B. Danell y S. Adalsteinsson.2000. Genetic diversity and population structure of 20 NorthEuropean cattle breeds. Journal of Heredity. 91: 446-457.

Kwok, P., Q. Deng, H. Zakeri y D. A. Nickerson. 1996.Increasing the information content of STS based genomemaps: Identifying polymorphism in mapped STSs.Genomics. 23: 138-144.

Levin, I., L. Santagelo, H. Cheng, B. Crittenden y B. Dodgson.1994. An autosomal genetic linkage map of the chicken.The Journal of Heredity. 85: 79-85.

Litt, M. y J. A. Luty. 1989. A hypervariable microsatelliterevealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeatwithin the cardiac muscle actin gene. American Journal ofHuman Genetics. 44: 397-401.

Loftus, R. T., D. E. Machugh, D. G. Bradley, P. M. Sharp y P.Cunningham. 1994. Evidence for two independentdomestications of cattle. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of USA. 91: 2757-2761.

Mullis, K. B., F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn y H.

42 Aranguren-Mndez et al.Erlich. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA invitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring. Harb.Symp.Quant.Biol. 51: 263-273.

Mundy, N. I., y D. S. Woodruff. 1996. Polymorphicmicrosatellite markers in the loggerhead shrike, Laniusludovicianus, isolated from a library enriched for CArepeats. Molecular Ecology. 5: 811-813.

Murray, B. W. 1996. The estimation of genetic distance andpopulation substructure from microsatellite allele frequencydata. Http://www.helix.biology.mcmaster.ca/brent/brent.html

Nagamine, Y. y M. Higuchi. 2001. Genetic distance andclassification of domestics animals using genetic markers.Journal of Animal Breeding and Genetics. 118: 101-109.

Nauta, M. J. y F. J. Weissing. 1996. Constrains on allele size atmicrosatellite loci: implications for genetic differentiation.Genetics. 143: 1021-1032.

Nei, M. 1972. Genetic distances between populations. AmericanNaturalist. 106: 283-292.

Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdividedpopulations. Proceedings of the National Academy ofSciences of USA. 70: 3321-3323.

Nei, M., F. Tarima y T. Tateno. 1983. Accuracy of estimatedphylogenetic trees from molecular data. Journal Molecularand Evolution. 19: 153-170. In: Nei, M. Molecularevolutionary genetics. Columbia University Press. NewYork. 1987.

Nei, M. 1977. F-statistics and analysis of gene diversity insubdivided populations. Ann. Hum. Genet. 41: 225-233.

Neuman, K. y J. H. Wetton. 1996. Highly polymorphicmicrosatellites in the house sparrow, Passer domesticus.Molecular Ecology. 5: 307-309.

Paetkau, D., W. Calvert, I. Stirling y C. Strobeck. 1995.Microsatellite analysis of population structure in Canadianpolar bears. Molecular Ecology. 4: 347-354.

Peelman, L. J., F. Mortiaux, A. Van Zeveren, A. Dansercoer, G.Mommens, F. Coopman, Y. Bouquet, A. Burny, R. Renavilley D. Portetelle. 1998. Evaluation of the genetic variabilityof 23 bovine microsatellite markers in four Belgian cattlebreeds. Animal Genetics. 29: 161-167.

Ponsuksili, S., K. Wimmers, F. Schmoll, P. Horst y K.Schellander. 1999. Comparison of multilocus DNAfingerprints and microsatellites in an estimate of geneticdistance in Chicken. The Journal of Heredity. 90: 656-659.

Prevosti, A., J. Ocana y G. Alonzo. 1975. Distances betweenpopulation for Drosophila subobscura based onchromosome arrangement frequencies. Theorical AppliedGenetics. 45: 231-241.

Primmer, C. R. y H. Ellergren. 1998. Patterns of molecularevolution in avian microsatellites. Molecular Biology andEvolution. 15: 997-1008.

Rannala, B. y J. Mountain. 1997. Detecting immigration byusing multilocus genotypes. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of USA. 94: 9197-9201.

Renwick, A., L. Davinson, H. Spratt, J. Patrick-King y M.Kimmel. 2001. DNA dinucleotide evolution in Humans:fitting theory to facts. Genetics. 159: 737-747.

Reynolds, J., B. S. Weir y C. C. Cockerham. 1983. Estimationof the coancestry coefficient: Basis for a short-term geneticdistance. Genetics. 105: 767-769.

Rochambeau, H., F. Fournet-Hanocq y J. Vu Tien Khang. 2000.Measuring and managing genetic variability in smallpopulations. Ann. Zootech. 49: 77-93.

Rogers, J. S. 1972. Measures of genetic similarity and geneticdistance. En: Studies in Genetics VII. University of Texas

Publication 7213, pp. 145-153.Ruane, J. A. 1999. Critical review of the value of genetic distance

studies in conservation of animal genetic resources. Journalof Animal Breeding and Genetics. 116: 317-323.

Saitbekova, N., C. Gaillard, G. Obexer-Ruff y G. Dolf. 1999.Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatelliteanalysis. Animal Genetics. 30: 36-41.

Saitou, N. y M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a newmethod for reconstructing phylogenetic trees. MolecularBiology and Evolution. 4: 406-425.

Schlotterer, C. y D. Tautz. 1992. Slippage synthesis of simplesequence DNA. Nucleic Acids Research. 20: 211-215.

Takezaki, N. y M. Nei. 1996. Genetic distance andreconstruction of phylogenetic trees from microsatelliteDNA. Genetics. 144: 389-399.

Tautz, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as ageneral source for polymorphism markers. Nucleic AcidsResearch. 12: 4127-4138.

Tautz, D. y C. Schlotterer. 1994. Simple sequences. CurrentOpinion in Genetics and Development. 4: 832-837.

Thaon dArnoldi, C., J. L. Foulley y L. Olliver. 1998. Anoverview of the Weitzman approach to diversity. GeneticsSelection and Evolution. 30: 149-161.

Tivang, J. G., J. Nienhuis y O. S. Smith. 1994. Estimation ofsampling variance of molecular data using the bootstrapprocedure. Theoretical and Applied Genetics. 89: 259-264.

Vance, J. F. y K. M. Othmane. 1998. Methods of genotyping.In: Haines, J.L., Pericak-Vance, M.A. eds. Approaches togene mapping in complex human diseases. A John Wiley &Son, Inc., Publication. NY. pp 213-228.

Vanhala, T., M. Tuiskula-Haavisto, K. Elo, J. Vilkki y A. Maki-Tanila. 1998. Evaluation of genetic variability and geneticdistances between eight chicken lines using microsatellitemarkers. Poultry Science. 77: 783-790.

Vignal, A., M. Milan, M. Sancristobal y A. Eggen. 2002. Areview on SNP and other types of molecular markers andtheir use in animal genetics. Genetic Selection and Evolution.34: 275-305.

Weber, J. L. y P. E. May. 1989. Abundant class of humanDNA polymorphism which can be typed using thepolymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396.

Weber, J. L. y C. Wong. 1993. Mutation of human short tandemrepeats. Human Molecular Genetics. 2: 1123-1128.

Weinberg, W. 1908. ber den Nachweis der Vererbung beimMenschem. Jh. Ver. Vaterl Naturk. 64: 369-382.

Weir, B. S. 1990. Genetic data analysis. Methods for discretepopulation genetic data. Sinauer Associates, INC.Publishers, Sunderland, Masachusetts. 377 p.

Weir, B. S. 1996. Genetic data analysis II. Methods for discretepopulation genetic data. Sinauer Associates, INC.Publishers, Sunderland, Masachusetts. 283 p.

Weitzman, M. L. 1992. On diversity. The Quarterly Journal ofEconomics. 107: 363-405.

Weitzman, M. L. 1993. What to preserve? An application ofdiversity theory to crane conservation. The QuarterlyJournal of Economics. 108: 157-183.

Wrigth, S. 1965. Interpretation of population structure by F-statistics with special regard to system of mating. Evolution.19: 395-420.

Zapata, C. 1987. La variabilidad gentica de las poblaciones.En: Espinosa de los Monteros, J., Labarta, U. (Eds.).Gentica de la acuicultura. pp. 33-57. Caicyt-Feuga, Ma-drid.