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Microbiología I 2011


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1.2. MICROBIOLOGÍA: Definición. Relación con otras ciencias. Bacterias, rickettsias, virus, y hongos: su natu-raleza. Distribución y función. Clasificación de la microbiología. Bacteriología división.

La microbiología es la rama de la biología que se encarga del estudio de los

microorganismos; organismos procariotas o eucariotas simples, que sólo son visibles a

través del microscopio.

Se relaciona con ciencias como la veterinaria, no sólo por el daño que los

microorganismos producen en la salud de los animales, sino también por las

enfermedades que éstos pueden transmitirle al hombre. Pero no todos los

microorganismos son patógenos, la mayoría, de hecho, son apatógenos y muchos son

utilizados en la industria alimenticia (quesos, vino, yogurt), en la fabricación de

medicamentos (ATB), en curtiembres y en ecología para la degradación de distintos

compuestos.

La microbiología estudia 4 tipos de microorganismos: bacterias, virus, levaduras y

mohos. Y se divide en 4 ramas: parasitología, micología, bacteriología y virología.

A su vez, se puede clasificar en microbiología: general, industrial, ecológica,

sistemática, agrícola y médico/sanitaria.

Los microorganismos se encuentran distribuidos en el suelo, aire, y agua, y algunos en

los organismos vivos (piel, mucosas, intestino) formando parte de la “flora normal” y

son denominados microorganismo nativos.

Bacteriología, división: las bacterias son procariotas que se dividen en 4 categorías

principales.

Eubacterias Gram- que

tienen pared celular:

poseen una pared

completa (membrana

externa y una fina capa

de peptidoglicano que

contiene ácido

murámico). Pueden ser

esféricas, ovales, bacilos

rectos o curvos,

helicoidales o filamentosos. Se reproducen por fisión binaria principalmente.


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Eubacterias Gram+ que tienen pared celular: procariontes que tiene un perfil

de pared de G+, aunque

no siempre tiñen como

tal. Pueden ser esféricas,

bacilos o filamentos,

pero muchas muestran

verdaderas ramas. Se

reproducen por fisión

binaria, algunas

producen esporas y

formas de descanso (endosporas o esporas en hifas).

Eubacterias que carecen de pared celular: procariontes que han perdido su

pared celular, llamados Mycoplasmas e incluyen las clases Millicutes (que no

sintetizan los precursores de peptidoglicanos). Están encerrados en la

membrana plasmática. Son altamente pleomorfos, aunque las formas

filamentosas con proyecciones en forma de ramas son comunes. Se reproducen

por división por gemación, así las células permanecen unidas entre sí por medio

de hifas. Las células se tiñen como Gram, usualmente no son móviles, las

colonias tiene aspecto de “huevo frito”. Los organismos recuerdan a las formas

L-bacterianas, aunque se diferencian de éstas ya que no revierten a las forma

primaria.

Archeobacterias: microbios terrestres y acuáticos, que ocurren en ambientes

anaerobios, hipersalados, en ambientes geotermales y como simbiontes en el

intestino animal. Algunas especies crecen por encima de los 100°C. poseen

lípidos de glicerol isopranil éter. La pérdida de mureína en las células hace a las

Archeobacterias insensibles a los Antibioticos b-lactámicos. Con la coloración

de Gram pueden aparecer como positivos (con pseudomureína) o negativos.

Cada una de ellas se divide en clases, órdenes, familias o grupos morfológicos (si no

hay familia.), género y especie.

1.3. ESTERILIZACIÓN: Asepsia y antisepsia: definiciones. Esterilización por calor y por filtración. Agentes químicos. Valoración de la acción desinfectante. Coeficiente fenol. Bioseguridad en el laboratorio.

La esterilidad indica la ausencia total de formas viables de microorganismos.

No existen grados de esterilidad y es por lo tanto un término absoluto.

Asepsia (sin sepsis) que consisten en evitar la sepsis mediante procedimientos que

intentan impedir la introducción de microorganismos y reducir el número de los que

están presentes


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Antisepsia (contra la sepsis) que es el proceso que se aplica al tejido vivo con el objeto

de prevenir la multiplicación de las formas vegetativas de los gérmenes y provocar la

sepsis.

Desinfección consiste en la destrucción de los microorganismos patógenos en estado

vegetativo que se encuentran sobre elementos inertes.

Control del crecimiento microbiano: puede hacerse de dos maneras; matando al

microorganismo o inhibiendo su crecimiento. El control del crecimiento generalmente

involucra el uso de agentes físicos o químicos que matan o previenen dicho

crecimiento. Los agentes que matan las células se denominan con la terminación

“cida” o “biocida”, mientras que los agentes que inhiben el crecimiento de las células

(sin matarlas) son llamados agentes “estáticos”. Por ej.: fungicida, bacteriostático.

Agentes Físicos

CALOR Es el método más confiable para la esterilización. El tiempo de esterilización está

relacionado con el tiempo de exposición. Tres parámetros pueden ser usados para

indicar el grado de resistencia al calor que tiene los microorganismos.

El punto térmico letal: que es la temperatura más baja en la cual muere una

población bacteriana en determinado tiempo (10min.)


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El tiempo térmico letal: que es el menos tiempo necesario para matar el 100% de

una población a determinada temperatura bajo condiciones específicas del medio

La reducción decimal del tiempo: es el tiempo en minutos necesario para matar el

90% de la población. Es una modificación del tiempo térmico letal.

CALOR SECO

Puede clasificarse en calor directo (o incineración), como la llama del mechero de

Bunsen. Pasar los objetos por la llama es útil para esterilizar tijeras y pinzas, que se

sumergen previamente en alcohol y se dejan flamear fuera de la llama del mechero

para evitar que se destemplen, pero no es el método de elección para esterilizar el

material de cirugía. También se emplea para esterilizar el asa del mango de Kolle,

antes y después de efectuar la siembra.

El mismo método se usa para destruís animales de laboratorio infectados, esqueletos y

otros materiales de en hornos crematorios.

El calor seco puede aplicarse en forma indirecta mediante el uso de hornos de

esterilización de aire caliente. (160°C durante 2hrs. ó 170°C durante 1 hr.), se

recomienda para elementos de vidrio (placas de Petri, pipetas, Erlenmeyer) o de metal.

Pero no se emplea para material de caucho, papel o telas porque se queman, ni

tampoco para medios de cultivo. En el caso de los elementos de vidrio hay que tener

en cuenta que, en el proceso térmico, puede variar su tamaño hasta un 5%, por lo que

no es recomendable para material de mediciones volumétricas. Tiene la ventaja de

eliminar los pirógenos de las bacterias G-.

Dentro de un horno NO VENTILADOR se produce una estratificación del calor, donde

las temperaturas más altas se registran en la bandeja inferior y las más bajas en la

superior, lo que debe tenerse en cuenta cuando se acopian grandes cantidades de

material. Con un sistema de ventilación forzada se logra unificar las temperaturas y

solucionar así éste problema.

CALOR HÚMEDO

Con presión: autoclave

Cuando a un líquido cualquiera se le aplica calor, se calienta hasta cambiar su estado y

pasar a su forma gaseosa. La temperatura que alcanza un líquido para pasar a al estado

gaseoso se llama punto de “ebullición” (éste punto no se altera por mucho calor que

se le aplique). Mientras el líquido está recibiendo calor, aumenta su temperatura, pero

llegando al punto de ebullición, se necesita calor extra, el cual es usado para vencer la

presión que ejerce la atmósfera sobre la superficie del líquido y convertirse en vapor;

esta cantidad extra de calor se denomina ”calor de vaporización”.

Este fenómeno se produce exactamente en direcciones opuestas; si el vapor es

enfriado, llega a convertirse en líquido, y en ese cambio de estado emite exactamente


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el mismo calor que recibió para convertirse en vapor. Este fenómeno se denomina

“condensación”.

El agua con presión atmosférica, al pasar al estado de vapor, aumenta

considerablemente su volumen. Este aumento es contenido por las paredes del

autoclave, las que, al no poder aumentar su volumen, incrementen la presión interna.

Este aumento de presión hace que el agua cese de bullir y que, por el momento, se

establezca un equilibrio, el que no es más que un punto de ebullición del agua a esa

presión. Se necesita otra vez cierta cantidad de vapor para producir más vapor y, como

consecuencia, aumentar la presión. Esta situación se repetiría hasta que la presión

destruiría las paredes del autoclave, lo cual se evita con una válvula de seguridad que a

cierta presión deja escapar el vapor.

El calor sensible es la cantidad de calor necesaria para llevar 1 litro de agua a

ebullición, el calor latente es el necesario para llevar 1 litro de agua hirviendo a vapor.

En el autoclave debe existir, por lo tanto, una relación constante entre presión y

temperatura, en la cual el volumen no varía. Esta relación se produce sólo si el gas que

se encuentra en su interior es vapor de agua saturado, si no hay condensaciones

bruscas y hay buena circulación del vapor.

El autoclave: dentro de los autoclaves usados en laboratorios se encuentras los de tipo

Chamberland. Este es uno de los más sencillos, existen modelos verticales,

horizontales y de diferentes tamaños, pero todos con el mismo principio.

Están constituidos por la caldera de cobre batido y estañado interiormente, sostenido

por una cámara metálica. En su parte inferior lleva una fuente calórica, a gas o

eléctrica (o calderas en industrias). En la parte superior lleva una tapa que debe poseer

los siguientes elementos:

a) Un termómetro indicador de temperatura (100C° – 200°C)

b) Un nanómetro, indicador de presión. (libras/pulgadas², kg/cm² ó en

atmósferas)

c) Una espita, que sirve para liberar el aire durante el calentamiento (purga).

d) Una válvula de seguridad que permite el escape del vapor a presión que hay en

el interior, cuando excede la adecuada.

En el interior del autoclave se encuentra un enrejado y una lámina cribada, sobre la

cual se apoya el material a esterilizar.

Ciclo de esterilización por autoclave:

1. Tiempo de calentamiento del autoclave, aprox. 20 min desde 20°C

(temperatura ambiente) a 121°C.


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2. Tiempo de penetración: tiempo que tarda el calor en llegar a todo el objeto

(121°C). (El calor debe penetrar el contenedor, el recipiente y el volumen de lo

que se desea esterilizar hasta llegar a su centro).

3. Tiempo de alojamiento: es el tiempo que va a estar el objeto a la temperatura

de 121°C. contempla el tiempo de muerte más el de seguridad.

4. Tiempo de enfriamiento: desde 121°C hasta 60°C.

Controles de esterilización:

Método químico: consiste en introducir papeles en forma de cintas adhesivas que

contienen sustancias que, a determinada temperatura, cambian de color

(generalmente 120°C y, por ej., de gris a negro). Peor no indican tiempo de

exposición.

Método biológico: es el más seguro, consiste en introducir entre los elementos a

esterilizar un tubo con trozos de papel de filtro embebidos en un cultivo de un

microorganismo esporulados, resistente a altas temperaturas, apatógenos y fáciles

de cultivar. Luego de realizada la esterilización se lleva el papel a un medio de

cultivo y se incuba durante 24 hrs. A 56°C. la falta de desarrollo indicará que la

esterilización a sido correcta. Este mismo papel viene encerrado en una ampolla

que tiene un indicador púrpura de bromocresol, que vira a amarillo si el

microorganismo es capaz de crecer.

Método físico, de termocuplas: consiste en un electrodo ubicado en el interior del

autoclave que va conectado por fuera a una aguja inscriptora que registra en un

gráfico la temperatura en función del tiempo de esterilización. Cualquier variación

de temperatura por debajo de la necesaria se debe agregar como tiempo extra de

esterilización.

Sin presión:

Ebullición: el agua en ebullición alcanza una temperatura de 100°C a nivel del

mar, la cual destruye en unos 10 min. las formas vegetativas de la mayoría de

las bacterias y muchos virus, pero no tiene efecto sobre las esporas y ciertos

virus como la hepatitis humana y la anemia infecciosa equina. Es un método

útil para higienizar o disminuir la carga bacteriana en forma rápida y con un

equipo sencillo. Se utiliza para ciertos elementos como; jeringas, utensilios

varios y aún instrumental de cirugía en casos extremos.

Tindalización: este proceso de conoce también como esterilización fraccionada.

Consiste en 3 calentamientos de 60-80°C durante 30 minutos, separados por 2

incubaciones de 37°C durante 24horas. Con el primer calentamiento se

destruyen las formas vegetativas. Con la incubación, las esporas presentas

pasan a formas vegetativas que se destruyen con el segundo calentamiento.

Este se repite para asegurar la esterilización. Se emplea sobre elementos en los


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cuales la alta temperatura pueda alterar sus propiedades, como por ej.;

hidratos de carbono y leche. Es poco usado en laboratorios.

Pasteurización: no es una técnica de esterilización, ya que se eliminan

solamente las formas vegetativas de los microorganismos. Se aplica a

sustancias que no toleran la temperatura de esterilización sin perder sus

características organolépticas. Para establecer la temperatura y el tiempo

adecuados, se tiene en cuanta la resistencia de los patógenos que con mayor

frecuencia se encuentran el producto.

Óxido de etileno: es un agente químico, pero se lo tiene en cuenta porque es

esterilizante. Es un gas muy soluble en agua y explosivo. Al igual que el formol,

actúa como agente alquilante, sustituyendo los átomos de H en radicales NH₂,

OH, COOH y HS de las proteínas, combinándose de forma irreversible y

desnaturalizándolas. Es muy eficaz tanto en formas vegetativas como en

formas esporuladas. Constituye un excelente medio de esterilización para

superficies secas, pero es más lento que el vapor y más costoso. Por otro lado

resulta peligroso por ser explosivo y puede dejar residuos tóxicos, no se

descarta una posible actividad mutagénica y carcinogénica. Se utiliza para

esterilizar objetos sensibles al calor como materiales plásticos, sondas, jeringas,

cánulas, guantes, instrumental de cirugía y equipos quirúrgicos.

Se puede utilizar con o sin autoclave. En el primer caso, se colocan los elementos a

esterilizar dentro de una bolsa de polietileno de no más de 100um de espesor, se

hace vacío y luego se llena el autoclave con el gas que viene en garrafa. En el

segundo caso se coloca el material dentro de una bolsa y esta, a su vez, dentro de

otra bolsa que contiene una ampolla de óxido de etileno, se cierra la ampolla y se

rompe la ampolla. Luego de 24 hrs. el material está estéril, pero de deben esperar

otras 24 horas para utilizar su contenido por los residuos tóxicos.

FRÍO

Las temperaturas inferiores a la óptima para el desarrollo disminuyen la actividad

microbiana y, si son bastante bajas, ésta cesa, al igual que el metabolismo. Las bajas

temperaturas son útiles para preservar cultivos, los cuales pueden almacenarse

durante largos períodos a temperaturas de refrigeración (4-7°C).

Muchas bacterias, y sobre todos muchos virus, se mantiene con éxito congelados a

temperaturas de -20 a -70°C. en estos procedimientos, el enfriado inicial mata a cierta

parte de la población, pero los sobrevivientes permanecen viables durante largo

tiempo. A esto se debe que las bajas temperaturas, aún excesivas (-196°C del N

líquido), no se puedan emplear como método de esterilización. Los microorganismos

mantenidos a baja temperatura se consideran en latencia, ya que no desarrollan

actividad metabólica detectable.


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Los procesos de congelamiento y descongelamiento repetidos producen un efecto

destructivo sobre los microorganismos. Este efecto parece depender de dos

fenómenos: uno menor, que consiste en la formación de cristales de hielo que

ocasionan lesiones sobre las membranas. Y otro más importante, que es la formación

de cristales de hielo extracelulares, que causan la salida de agua desde el interior de la

célula, y da como resultado el aumento de la concentración intracelular de electrolitos

y la desnaturalización de las proteínas. Con la lesión de la membrana se produce la

salida de compuestos intracelulares y por ende la muerte celular.

FILTRACIÓN

Se entiende por filtración al pasaje de un fluido (líquido o gas) a través de una

sustancia porosa que retiene a los microorganismos contenidos en él. Este medio es un

material fibroso o poroso que contiene perforaciones o poros interconectados entre sí

de manera tal que permita el paso del fluido.

Mecanismos que interactúan en la retención de partículas: los sólidos suspendidos en

un fluido son retenidos por medio de 3 mecanismos.

1) Intercepción directa o tamiz: en un medio filtrante se pueden observar un conjunto

de fibras que definen poros o ranuras a través de las cuales para un fluido. Si las

partículas en el fluido son mayores que los poros, serán retenidas. Aún las

partículas más chicas son muy irregulares en su forma, y producen un efecto

puente sobre las aberturas el filtro.

2) Mecanismo de inercia: las partículas en un fluido en movimiento tienen masa y

velocidad, y por lo tanto una cantidad de movimiento asociada a ella; a medida que

el líquido y las partículas pasan a través del medio filtrante, la vena fluida sigue la

trayectoria de menor resistencia al flujo y se desvía alrededor de la fibra. Una

partícula impulsada por la vena fluida, debido a su masa y velocidad, no sigue el

trayecto de ésta, e impacta con la fibra y queda retenida.

3) Intercepción por difusión: es un mecanismo inverso al de la inercia, para partículas

extremadamente pequeñas, submicrónicas. En este proceso las partículas se

encuentran en choque permanente con las moléculas del fluido. Estos choques

frecuentes hacen que las partículas suspendidas se muevan con movimientos

desordenados alrededor de las líneas de la vena fluida. estos movimientos que

pueden observarse con el microscopio, se denominan “movimientos brownianos “.

La difusión browniana es la causa de que las partículas pequeñas se desvíen de la

línea de flujo, con lo cual aumenta la posibilidad de que impacten la superficie de

las fibras y sean allí retenidas.

Clasificación de los filtros:

Filtros de poros deformables: dependen de los mecanismos de separación por

inercia o difusión browniana.


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Filtros de poros fijos o indeformables: depende de los mecanismos de

intercepción directa o tamiz, aunque a veces pueden actuar mecanismos de

impacto inercial o intercepción por difusión.

Sistemas de filtración:

Filtración por presión positiva:

Se realiza introduciendo el líquido a filtrar en un contenedor de cierre hermético, que

posee una válvula de entrada de agua a presión mediante un compresor. El conductor

de salida del líquido a filtrar es inferior, y el líquido es transportado mediante gomas

hasta el soporte del filtro. Este consta generalmente de dos partes, una superior y otra

inferior, y el elemento filtrante se coloca entre ambas. El líquido atraviesa el filtro y de

la pared del soporte saldrá el líquido filtrado, que es conducido mediante gomas al

elemento receptor final. Todos los elementos deben haber sido autoclavados antes de

la filtración.

Este sistema puede ser utilizado en filtros de jeringas: consiste en colocar el líquido a

filtrar en una jeringa (de vidrio y a rosca), el elemento filtrante en su extremo y hacer

presión (+) en el émbolo, de esta forma el líquido atraviesa el filtro y luego es recogido

en algún recipiente estéril.

Filtración con presión negativa:

En necesario contar con una bomba de alto vacío conectada a un frasco Kitasato

mediante mangueras de goma rígida para evitar que colapsen. El soporte del filtro es

colocado sobre el Kitasato, y el líquido a filtrar sobre un receptor superior. El vacío

producido por la bomba hará que el líquido atraviese el filtro y sea recibido en el frasco

Kitasato.

Aplicación:

Los filtros sirven para tratar fluidos. Como este proceso no produce elevación de la

temperatura, es útil para esterilizar líquidos como medios de cultivo que no resisten el

tratamiento térmico, sueros u otras sustancias que contienen proteínas que se

desnaturalizarían con el calor. Tienen como inconveniente que el proceso suele ser

algo tedioso, ya que es necesario filtrar sucesivas veces un mismo elemento para

lograr su esterilización.

Otra aplicación son los filtros absolutos, también llamados HEPA (High Efficiency

Particulate Air) destinados a la filtración de aire en un flujo laminar. El HEPA, por

definición, es un filtro con una eficiencia mínima de 99.97% en la partícula más difícil

de filtrar, que es la de 0.03um de diámetro. Consta de una sola hoja de papel de

celulosa, amianto y fibra de vidrio de diámetro inferiores al micrómetro, éste papel es


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doblado en muchísimos pliegues que se mantienen separados por entre sí por medio

de separadores metálicos o de cartulina corrugada.

- El flujo laminar: las áreas estériles son ambientes cerrados y pasteurizados con una

sobrepresión de aire donde éste entra al área a través de filtros de muy alta

eficiencia (HEPA).

Pueden observarse dos tiempos de flujo laminar:

1) Destinado a la preparación de medio, y trabajo con sustancias no peligrosas. (el

flujo de aire estéril llega al operador, se protege el producto)

2) Destinado al uso de sustancias peligrosas, la corriente de aire circula dentro de

la campana impidiendo la salida de aire hacia el operador. (se protege al

operador).

ULTRAPRESÍON

Tanto la alta como la baja presión, no parecen producir la muerte de las bacterias, sin

embargo los microorganismos no sobreviven a los cambios bruscos de presión. El

fraccionador de Ribi produce la ruptura de la célula primero creando alta presión y

después expulsándolas a través de un pequeño orificio que está sujeto a presión

atmosférica normal. Este proceso depende de la formación de burbujas de gas

intracelulares para su efecto.

ULTRASONIDO

Mediante osciladores sónicos se puede lograr vibraciones con una frecuencia que

puede llegar a 20.000Hz., lo que produce un fraccionamiento celular. Pero no suele

utilizarse como método de esterilización ya que quedan muchas células vivas

El fundamento radica en que, al pasar el sonido a través de un líquido, provoca

cambios de presión, los cuales generan cavidades en el líquido, las cuales aumentan su

tamaño hasta que colapsan violentamente produciendo altas velocidades y presiones

que desintegran a las células.

RADIACIONES

La energía se transmite a través del espacio en una gran variedad de formas, una de

ellas es la radiación. Dentro de éstas se encuentran las ionizantes o electromagnéticas

de alta energía, y las no ionizantes o de baja energía.

Radiaciones ionizantes: comprende los rayos alfa, beta, gamma y X, los cuales

poseen suficiente energía para empujar los electrones fuera de las moléculas y

ionizarlos, mediante una reacción en cadena. Cuando las radiaciones pasan a

través de las células se producen H libres, radicales HO y algunos peróxidos que

ocasionan diferentes tipos de daño intracelular. Como el daño recae en una gran

variedad de constituyentes celulares, la radiaciones ionizantes son poco específicas

en sus efectos, pero tiene alto poder de penetración.


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Radiaciones no ionizantes: comprende la radiaciones ultravioletas (UV) e

infrarrojas (IR). La luz UV es absorbida por muchos materiales celulares, peor es en

los ác. nucleicos donde causa mayor daño. Esta absorción se efectúa sobre todo en

sus bases pirimídicas, donde puede formar un dímero entre dos bases vecinas que,

al menos que sea desdoblado por enzimas intracelulares específicas, inhiben la

replicación del ADN.

Las radiaciones IR son inicuas a las sustancias químicas y, por lo tanto, a los

microorganismos. Únicamente causan un alargamiento y desdoblamiento

molecular y algo de rotación, de manera que no les da la energía suficiente para

reaccionar.

Agentes Químicos

Los antimicrobianos son agente químicos que matan o inhiben el crecimiento de los

microbios. Éstos incluyen preservantes químicos y antisépticos, además de fármacos

usados en el tratamiento de enfermedades infecciosas de las plantas y los animales.

Los agentes antimicrobianos pueden ser de origen natural o sintético, y pueden tener

un efecto “biocida” o “bioestático”.

Antisépticos

Alcoholes

Iodo

Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros

Órgano Mercuriales

Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro y Compuestos clorados

Aldehídos

Oxido de Etileno

Compuestos Fenólicos

Ácidos y Álcalis

Tipos de agentes antimicrobianos:

- Antisépticos: agentes microbicidas poco tóxicos que pueden ser aplicados sobre la

piel o membranas mucosas; no deben ser ingeridos. Por ej.: alcoholes, detergentes,

soluciones de yodo.

- Desinfectantes: agentes que matan a los microorganismos pero no necesariamente a

sus esporas; no son seguros para su uso en tejidos vivos. Se utilizan sobre objetos

inanimados como pisos, mesadas, utensilios. Por ej.: cloro, hipoclorito, compuestos de

amonio cuaternario, sulfato de cobre.

Los desinfectantes y los antisépticos se definen sobre la base de seguridad de uso

sobre las membranas mucosas por ello, en algunos casos, un mismo compuesto,


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dependiendo de su concentración, puede ser un desinfectante o un antiséptico. Por

ej.: hipoclorito de sodio.

- Conservantes o preservativos: son agentes estáticos usados para inhibir el

crecimiento de microorganismos, utilizados con frecuencia en alimentos. Obviamente,

si son ingeridos, no deben ser tóxicos. Por ej.: propionato de Ca, benzoato de Na,

nitrato, etc.

Coeficiente Fenol.

Es un valor experimental que se realiza a las sustancias que tienen propiedades

biocida, tomando como referencia la capacidad biocida del fenol.

El método estandarizado para obtener el valor del coeficiente fenólico, es una

modificación de la técnica de dilución en tubo, en la cual se prepara una serie de tubos

conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. A la vez se

prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol.

Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del

microorganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella typhi o

Staphylococcus aureus). A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una cantidad alícuota de

cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estéril. Estos

tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del

microorganismo (aparición de turbidez). La mayor dilución del desinfectante que mate

a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la

dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados.

El número obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.

Bioseguridad en el laboratorio.

El laboratorio biológico representa un riesgo potencial de exposición a la enfermedad

especializado y auxiliar al trabajar con material infeccioso. Por lo tanto, se deben

administrar todas las medidas necesarias para que el ambiente institucional esté

exento de microorganismos hasta el límite de lo posible.

Toda actividad conlleva un riesgo, pero su conocimiento anticipado puede prevenirlo o

controlarlo. Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a; materiales

infecciosos, químicos o radioactivos y a las instalaciones físicas.

Los objetivos de la bioseguridad consisten en proteger al laboratorio, a la comunidad y

al medio ambiente de agentes potencialmente peligrosos.

- Los factores aplicables al agente incluyen: virulencia, dosis infecciosa, vías de

infección y toxigenicidad.


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- En cuanto al hospedador, las variables que influyen en el riesgo son: edad, sexo,

raza, embarazo, presencia y nivel de anticuerpos o inmunidad celular y

disponibilidad y uso de vacunas, compuestos terapéuticos específicos o

medicamentos.

- Finalmente el tiempo de actividad: diagnostico, producción, investigación) pueden

afectar notablemente el riesgo del personal debido al tipo, la cantidad y la

concentración de agentes manejados y manipulaciones utilizadas en la tarea.pos

de riesgo.

Según el riesgo relativo que entrañan los microorganismos infectantes, se pueden

clasificar 4 grupos de riesgo.

Grupo de riesgo I

Escaso riesgo individual y comunitario. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades humanas o enfermedades de importancia veterinaria en los animales.

Grupo de riesgo II

Riesgo individual moderado, riesgo comunitario limitado. Agente patógeno que puede provocar enfermedades humanas o en animales, pero que tiene un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero se dispone de medios de tratamiento y de prevención y el riesgo de propagación es limitado.

Grupo de riesgo III Riesgo individual elevado, riesgo comunitario escaso. El agente patógeno suele provocar enfermedades humanas graves, pero de ordinario no se propaga de una persona infectada a otra.

Grupo de riesgo IV

Elevado riesgo individual y comunitario. Agente patógeno que suele provocar enfermedades graves en las personas o animales y que puede propagarse fácilmente de un individuo a otro directa o indirectamente.

En cuanto al los laboratorios, se clasifican según sus características de diseño, construcción y

medios de contención en 3 tipos: laboratorios básicos, laboratorios de contención y

laboratorios de contención máxima.

Normas de bioseguridad:

Los errores humanos y las prácticas incorrectas de laboratorio pueden contrarrestar la eficacia

de las medidas y los aparatos que se utilicen para proteger a las personas. Por ésta razón el

elemento clave para prevenir accidentes e infecciones es un personal preocupado por la

seguridad y bien informado sobre la manera de reconocer y combatir los riesgos presentes en

el laboratorio:

Inhalación: formación de aerosoles) siembra de placas, pipeteo, centrifugación,

esterilización a la llama de de asas de platino, apertura de recipientes de cultivo.

Ingesta: manipulación de muestras, frotis y cultivos.

Eliminación de material infeccioso.


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Eliminación de materiales:

La descontaminación (desinfección o esterilización) y eliminación de desechos son operaciones

íntimamente relacionadas. Los métodos y las instalaciones para efectuar la evacuación

comprenden desde lo más simple, hasta lo más complejo.

Los desechos de laboratorio no pueden ser desechados de la misma forma que los desechos de

una casa. Por lo tanto hay que establecer categorías:

Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura: evitar su acumulación

para prevenir que alberguen microorganismos que puedan propagarse a otra área del

laboratorio.

Objetos aguzados y cortantes: se colocan en recipientes que no puedan ser fácilmente

perforados, cuando se llenaron, se colocan dentro de otro recipiente para ser incinerados

(aunque hayan sido esterilizados en autoclave)

Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización: se colocan en el

autoclave junto con desinfectantes.

Material contaminado para eliminación; autoclave e incinerador.

*En la incineración se destruye el contenido y el continente.

Pautas complementarias de la bioseguridad en el laboratorio:

La experiencia ha demostrado que la inocuidad del trabajo de investigación con

microorganismos peligrosos depende de: las buenas prácticas de laboratorio, la disponibilidad

y el uso de equipos de contención y el diseño y funcionamiento del local.

Hábitos y prácticas de higiene personal:

Muchas prácticas de higiene personal en el laboratorio están destinadas a prevenir lesiones o

enfermedades directamente relacionadas con el trabajo. Las precauciones y prácticas

recomendadas son;

Lavado de manos: las manos nunca están libres de gérmenes, estos pueden ser

transitorios (recogido por contacto con material contaminado, no sobreviven

indefinidamente pero pueden ser transmitidos al paciente) o residentes (no provocan

infección al menos que entren en contacto con heridas abiertas).

Para efectuar un buen avado existen 3 factores esenciales: agua corriente, jabón y fricción.

Ropa y equipos de protección: se emplean ropas y equipos especiales para proteger al

personal del laboratorio en contacto con agentes infecciosos, tóxicos, corrosivos, calor

excesivo, fuego, para evitar la contaminación de los materiales de experimento, etc.

La clase ropa y equipos será acorde a la naturaleza de la investigación y los peligros que

ésta conlleve, y deberán ser utilizados correctamente para beneficiarse de la protecciones

que proporciona.

La ropa suele ser de algodón o poliéster, o una mezcla de los dos. Los microorganismos

permanecen viables en tejidos de algodón o lana y pueden propagarse fácilmente a través

de éstos, por ésta razón es necesario usar una prende protectora como guardapolvo o

delantal (que no deben salir del laboratorio sin ser desinfectados).


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Otra prenda importante del equipo son los guantes de seguridad. Deben ser cómodos y lo

suficientemente largo como para evitar la exposición de la muñeca. Según el uso que se

pretenda darles, los guantes deben ser de una composición y un modelo que proporcione

agilidad, fuerza, baja permeabilidad y resistencia a la penetración de objetos puntiagudos

y protección contra frío y calor. No se puede esperar que una clase sea satisfactoria para

todos los usos.

Limpieza del laboratorio: compete al supervisor del laboratorio determinar con qué

frecuencia se hará de efectuar la limpieza, individual y colectiva, suministrar los planes

respectivos y realizar inspecciones a menudo para cerciorarse de su cumplimiento.

Cuidado del piso: se debe evitar barrer y limpiar el polvo en seco para disminuir la

formación de aerosoles ambientales no específicos. Se recomienda limpiar con agua o

con una aspiradora equipada con filtro HEPA.

o Si no hay derrames peligrosos visibles, la tarea de limpieza consistirá en aspirar

y luego limpiar con un trapeador humedecido con una solución

descontaminante que contenga detergentes.

Barrida en seco: no es un método recomendado, pero de ser preciso su uso, se deben

evitar la formación de aerosoles de polvo

Selección de una solución de limpieza: la selección de una mezcla de desinfectantes y

detergentes para la limpieza se basará en las exigencias de área que tenga la mayor

posibilidad de contaminación con el más amplio espectro de microorganismos

(detergentes + fenoles).

Lavado con agua con el método de los dos baldes: se emplea un dispositivo que consta

de dos baldes, uno celeste y otro rojo. El primero contiene una solución limpia de

detergente y desinfectante que se aplica en el piso con un trapeador, y el segundo

(vacío) recoge la solución que se saca del trapeador el retorcerlo dentro del mismo.

Si la limpieza se efectúa después de un derrame de material infeccioso, la solución usada para

desinfectar debe esterilizarse en autoclave o tratarse con cloro (dejar en contacto por 15´)

antes de ser desechada por la alcantarilla sanitaria.

Plan de emergencia:

Los laboratorios que trabajan con agentes infecciosos deben contar con planes de emergencia

para anticiparse al tipo de accidentes más probables dentro de las instalaciones. Es

responsabilidad del supervisor del laboratorio:

Valorar la probabilidad de accidentes y emergencias en las tareas operativas del

laboratorio.

Preparar un plan de emergencia.

Instruir al personal en los procedimientos aplicables.

Ensayar la aplicabilidad de dichos procedimientos.


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1.4. MORFOLOGÍA MICROBIANA: I.Bacterias: forma, tamaño y agrupación. II.Rickettsias: forma, tamaño y disposición. III.Virus de animales, de plantas y de bacterias: Forma, tamaño. IV.Hongos: Mohos y levaduras. Micelio, forma y tamaño. Estructura de los cuerpos o formaciones fructíferas. Reproducción asexuada y sexuada. Su importancia en taxono-mía.

Bacterias:

Las bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya. En la Tierra, existen sólo dos tipos básicos de células que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son células procariontes. Estas células poseen un único cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o núcleo primitivo. Otra de las características principales de las células procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retículos endoplásmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas. Las células bacterianas son muy pequeñas, de menos de una micra hasta 10 micras de longitud y de 0.2 a 1 micra de anchura. Casi todas las especies bacterianas son unicelulares pero las hay filamentosas o bajo forma de células con cierto grado de unión. En vista de su pequeño tamaño y semejanza estructural suelen clasificarse por sus estructuras fisiológicas o bioquímicas y no exclusivamente morfológicas. Las bacterias tienen una estructura menos compleja que la de las células de los organismos superiores: son células procariotas (su núcleo está formado por un único cromosoma y carecen de membrana nuclear). Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden desarrollarse más dentro de las células y que sólo contienen un ácido nucleico. Las eubacterias poseen las siguientes características:

Presentan una pared celular, con excepción de los Mycoplasmas, por fuera de la célula que otorga rigidez y protección en medios osmóticamente inadecuados. La membrana citoplasmática posee una estructura trilaminar típica y está formada

por lípidos, proteínas y pequeñas cantidades de hidratos de carbono. Se reproducen por fisión binaria o división simple. No poseen un núcleo verdadero sino un cromosoma de DNA que se encuentra, más o

menos libre, en el citoplasma. No poseen organelas rodeadas por membranas. Sus ribosomas son 70s formados por las subunidades 30s y 50s. Poseen gránulos citoplasmáticos que son acumulaciones de materiales de reserva

como polisacáridos, lípidos y polifosfatos.


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Las bacterias pueden clasificarse, atendiendo a su forma, en cocos (esféricas), bacilos (bastones rectos) y espirilos (bastones curvos). Otra forma de clasificar las bacterias es aerobia, las que necesitan aire para vivir, anaerobia, que no pueden vivir en presencia de aire y por último, aquella que indiferentemente pueden vivir con aire o sin éste.

Dentro de las eubacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relación a la estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificación, y basta con un microscopio óptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La forma más sencilla de iniciar una identificación del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloración o tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial porque no todas las células se tiñen de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram positivas y Gram negativas. Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta después de la coloración de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado. El tercer grupo de eubacterias es el de los Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloración de Ziehl-Neelsen. La diferencia en la coloración no se debe a reacciones químicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura física de la misma.


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Gram positivos: Estás células poseen una membrana citoplasmática con fosfolípidos y proteínas. Por fuera de la membrana citoplasmática se encuentra la pared celular que está compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan. Estos puentes peptídicos son característicos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto más completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la célula, y evita que la célula estalle en medios hipotónicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula. La pared celular Gram positiva también contiene ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodiésteres, y están unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodiéster en el oxidrilo del C6 del N-acetilmurámico. Los ácidos lipoteicoicos son polímeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmática y no están unidos al peptidoglicano. La función de estos compuestos sería estructural, pero existen evidencias que indican que también participarían en la regulación de las enzimas hidrolíticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que serían sitios de fijación de fagos. Gram Negativos: Las células se encuentran envueltas por una membrana citoplasmática formada por una bicapa fosfolipídica y proteínas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoproteínas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipofílicas. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa queda delimitado el espacio periplásmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotónica respecto al citoplasma, isotonicidad que es


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mantenida mediante los oligosacáridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalíticos de suma importancia para la viabilidad celular. La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimétrica en donde la cara externa está compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolípidos. Además, esta membrana es rica en proteínas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianas y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS está formado por tres regiones: el polisacárido O (Antígeno O), el polisacárido del centro (KDO) y el lípido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la célula una efectiva protección contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la célula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune específica por alteración de la superficie antigénica y adherirse a ciertas células del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no específicos que pueden ser atravesados por pequeñas moléculas hidrofílicas. En la membrana externa se encuentran otras proteínas que funcionan como canales de difusión específicos y facilitan el paso de di, tri y oligosacáridos. RICKETTSIAS Bacilos Gram-negativo Aerobios Pertenecientes a la familia Rickettsiaceae, junto con Ehrlichia, estos dos géneros se subdividieron en dos géneros, gracias al análisis de secuencias de ADN.

El género Rickettsia se subdivide en dos géneros: Rickettsia y Orientia Anteriormente se consideraban virus por su diminuto tamaño: 0.3 x 1 a 2 µm; pero poseen características típicas de las bacterias Intracelulares obligados; crecimiento restringido al citoplasma de las células eucariotas. Tinción escasa método de Gram con el. Algunos animales son reservorios y los artrópodos son reservorios y vectores Las infecciones en el hombre son accidentales. Se subdividen en dos grupos:

Fiebre maculosa Tifus

Las enfermedades rickettsiales, exceptuando a la fiebre Q, presentan típicamente la siguiente sintomatología:

Fiebre Exantemas Vasculitis

Todas las Rickettsias son transmitidas por artrópodos


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MORFOLOGIA Y FISIOLOGIA

Pleomorfas Pueden aparecer como bacilos cortos, o como cocos; ya sea aislados, en pares,

en cadenas cortas o en filamentos Fáciles de teñir; con el colorante Giemsa se tiñen de rojo en marcado contraste

con el citoplasma, teñido de azul, en cuyo seno aparecen Crecen rápidamente en embrión de pollo, en el que el saco vitelino es el tejido

más infectado Su pared celular está constituida por peptidoglucanos, que contienen: Acido

murámico y diaminopimelico y esta se parece a la de las bacterias Gram negativas

Su cultivo tarda de 8 a 10 horas y se realiza a una temperatura de 34°C Oxidan metabolitos intermediarios similares a los ácidos pirúvico, succínico y

glutámico; pueden transformar el ácido glutámico en acido aspártico Pierden su actividad biológica a 0°C y a 36°C por la pérdida progresiva de NAD,

esto se puede revertir con una incubación subsecuente con NAD Se desarrollan en diferentes partes de la célula:

o Tifus: generalmente en el citoplasma o Fiebre manchada: en el núcleo

Su desarrollo se intensifica cuando la actividad metabólica del huésped es baja así como la presencia de sulfonamidas; por el contrario, las tetraciclinas o el cloranfenicol inhiben el desarrollo

Se destruyen por el calor, desecación y agentes químicos bactericida VIRULENCIA Las rickettsias se multiplican en las células endoteliales de los vasos sanguíneos

pequeños, produciendo vasculitis Dichas células se hinchan y posteriormente se necrosan, teniendo como

consecuencia trombosis del vaso y después su rotura, siguiendo la necrosis de este La vasculitis es la base de los trastornos hemostáticos El corazón presenta lesiones similares a las de los vasos sanguíneos Coagulación intravascular diseminada y oclusión vascular Las lesiones vasculares son prominentes en piel, pero también hay vasculitis en

múltiples órganos Las rickettsias se replican intracelularmente en el macrófago que las haya

fagocitado, aun con presencia de anticuerpos En el encéfalo se forman los nódulos del tifus: linfocitos, macrófagos y leucocitos

polimorfonucleares unidos con los vasos sanguíneos de la materia gris VIRUS

Los virus son microorganismos de una gran simplicidad estructural y funcional, por lo que se encuentran en la frontera entre lo vivo y lo inerte: no se nutren, no se relacionan, carecen de metabolismo propio; sólo son capaces de reproducirse, pero sólo pueden hacerlo en el interior de una célula viva, utilizando su maquinaria


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metabólica. Por ello los virus son parásitos celulares obligados, tanto de las bacterias como de las células animales y vegetales.

Un hecho a destacar es que cada tipo de virus sólo infecta a un determinado tipo de células: a aquellas que tienen en su superficie proteínas receptoras para el virus. Dentro de la célula hospedadora, la reproducción del virus acaba provocando la muerte celular.

Las repercusiones para el organismo de las infecciones víricas dependen de la importancia de las células lesionadas.

Así, el virus de la rabia destruye neuronas y su infección es mortal si alcanza los centros vitales del encéfalo; el virus del SIDA destruye el sistema inmunitario, por lo que el organismo queda sin defensas frente a todo tipo de infecciones que acaban causando la muerte.

Características morfológicas de los virus

- Tamaño. Aunque ya se tenían pruebas de su existencia, ésta no fue comprobada hasta que se descubrió el microscopio electrónico, pues debido a su tamaño no se ven con el microscopio óptico. Su diámetro oscila entre los 10 nanómetros (como en el virus de la poliomelitis) hasta los 300 nm en los virus más grandes (virus de la viruela, virus TMV, etc).

Estructura: Un virus está formado por:

ADN o ARN, nunca los dos juntos; el ADN puede ser bicatenario (p.e., en el fago T4),o monocatenario (en el fago i-X-174); el ARN también puede ser bicatenario (en los reovirus) o monocatenario ( en los retrovirus).

Una cápsula proteica o cápside que se halla constituida por el ensamblaje de varias subunidades peptídicas llamadas capsómeros. En su interior se halla contenida la molécula de ác. nucleico y, en algunos casos, también contiene enzimas víricas que facilitan la entrada y salida de los virus en las células que parasitan, o que son necesarias para la replicación del ácido nucleico.

Una envoltura membranosa: rodea exteriormente a la cápside y no existe en todos los virus. Esta presenta unas glucoproteínas, a modo de espículas, que constituyen el sistema de anclaje del virus a la célula que van a infectar.

Como veremos, esta envoltura se trata en realidad de un fragmento modificado de la membrana plasmática de la célula en la que se ha originado el virus.

Clasificación: Atendiendo al tipo de célula que parasitan, podemos distinguir entre los virus que infectan a las células eucarióticas (virus animales y vegetales), y los virus que infectan a las células procarióticas (bacteriófagos o fagos)

Los virus animales y vegetales, atendiendo a la forma geométrica de su cápside, se clasifican en:


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VIRUS HELICOIDALES. Los capsómeros se disponen helicoidalmente delimitando un cilindro hueco. El ác. nucleico no ocupa el interior de este cilindro sino que está inserto entre los capsómeros. Un ejemplo es el VTM (virus del mosaico del tabaco), llamado así por ser responsable de una enfermedad en las plantas de tabaco que se manifiesta por la aparición de manchas amarillas en las hojas; el virus de la gripe sería otro ejemplo, pero, en este caso, el cápside se encuentra flexionado dentro de una envoltura.

VIRUS ICOSAEDRICOS. La cápside tiene la forma de un icosaedro regular (poliedro de 20 caras triángulares). Como en el caso anterior, pueden ser desnudos (p.e., adenovirus) o con envoltura ( p.e., los herpesvirus)

Los BACTERIÓFAGOS o FAGOS presentan una combinación de las dos formas anteriores, ya que presentan una región icosaédrica, (la llamada cabeza), en cuyo interior se encuentra el ácido nucleico, y una región helicoidal (vaina), que está rodeando a un eje tubular hueco; el conjunto formado por este eje y la vaina que lo rodea constituye la cola. La cola termina en una placa provista de unos filamentos (las fibras caudales) y unas espículas (las espinas caudales). La placa caudal, con las espinas y fibras, representa el mecanismo de anclaje del virus a la bacteria. Debido a su forma, estos virus se denominan también VIRUS COMPLEJOS HONGOS:

Los hongos son células eucarióticas (con núcleo y demás orgánelos membranosos:

aparato de Golgi, mitocondrias, retículo endoplasmático, etc.), carecen de clorofila

(son aclorofílicos, no realizan la fotosíntesis, por lo que son heterótrofos y necesitan un

aporte de carbono y nitrógeno fijado orgánicamente), tienen una pared celular rígida

bien definida de quitina; normalmente son inmóviles, no presentan tallos, ni raíces, ni

hojas, ni vasos conductores como presentan las plantas. Pueden ser unicelulares o


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multicelulares y microscópicas o macroscópicas. Se reproducen asexual o sexualmente.

Al carecer de clorofila, deben nutrirse a expensas de materia orgánica.

En la industria farmacéutica cada vez tienen

más importancia, ya que a partir de los

hongos se fabrican antibióticos, drogas,

tonificantes, etc. Son responsables de la

desintegración de la materia orgánica, y en

simbiosis con determinados árboles

producen un mayor crecimiento de estos.

También son causantes de determinadas

enfermedades en las plantas, (con deterioro

de cosechas), en animales y humanos. Por consiguiente, los hongos están íntimamente

relacionados con el ser humano, resultando benefactores y perjudiciales para la vida.

Los hongos se nutren de materia vegetal viva o muerta. Según sea el substrato en el que se encuentren se dividen en: Micorrízicos, Parásitos y Saprófitos. Hongos Micorricicos: Define una relación simbiótica entre las hifas de ciertos

hongos y las raíces de las plantas. Hongos Saprófitos: Viven sobre materia orgánica en descomposición, es decir

sobre materia muerta, (restos orgánicos de la de plantas y animales que contiene el suelo, partes muertas de la madera de un árbol o excrementos de animales.)

Hongos Parásitos: Se alojan sobre algún ser vivo que los hospede, viviendo a expensas de éste sin ofrecerle ningún beneficio a cambio.

Los hongos tienen habitats muy diversos , algunos son acuáticos viviendo

principalmente en agua dulce , pero también se conocen unos cuantos marinos ; la

mayoría son terrestres y habitan en el suelo , sobre materia orgánica muerta

(saprofitos ) desempeñando una actividad crucial en la mineralización del carbono

orgánico , otros muchos son parásitos de vegetales , ocasionando la mayoría de las

enfermedades significativas económicamente de plantas cultivadas , algunos son

parasito de animales incluyendo el hombre.

Al cuerpo de los hongos se les denomina talo y este puede ser unicelular , de forma

amiboideo u ovoide , ejemplo , las levaduras , o bien pueden ser pluricelulares con

aspecto filamentoso , esponjoso o carnoso , a los filamentos se les conoce como

mohos como ejemplo de los carnosos se tiene a las setas y champiñones.

Algunos hongos presentan dimorfismo, es decir bajo ciertas circunstancias ambientales

se desarrollan como levaduras, en tanto que cuando se cambia la temperatura o la

concentración o tipo de algún nutriente, se desarrollan en forma filamentosa.

En las levaduras el talo unicelular desempeña las funciones vegetativas reproductivas,

estas se reproducen asexualmente por bipartición o por gemación y en la

reproducción sexual dos células levaduriformes se unen y como resultado forman


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ascosporas en algunas levaduras la gema o brote formado queda adherido a la célula

madre, los brotes sucesivos dan lugar a la formación de un talo de transición ( ni-

pluricelular ) denominado pseudomicelio.

La mayoría de los hongos tienen aspecto filamentoso, a los filamentosos individuales

se les denomina fías y al conjunto de hifas micelio, este por su posición puede ser

profundo y aéreo, el primero se encuentra sumergido en el sustrato desempeñando

las funciones de absorción y sostén , también se le conoce como micelio vegetativo . el

micelio aéreo emerge del sustrato donde se desarrolla , siendo este el que da lugar a

las hifas o cuerpos fructíferos formadoras de esporas por lo que también se le conoce

como micelio reproductivo en cada especie de hongo las hifas vegetativas , crecen , se

ramifican y entretejen en forma más o menos constante, lo que determina la

formación de colonias con características típicas de la especie , por otra parte algunos

hongos rizoides , haustorios , estolones y apresorios , en algunos otros hongos la hifas

se agrupan y retuercen formando fibras gruesas ( funículos y rizomorfos ) o un micelio

compacto y apretado ( plectenquima ) las hifas reproductivas pueden permanecer

diferenciadas ( esporiangoforos , conidioforos ) , al igual que las hifas vegetativas las

reproductivas se pueden agrupar en una estructura especializada llamada cuerpo

fructífero : en estos , la agrupación de hifas puede quedar directamente expuesta al

medio ( coremio ) o protegida dentro de un receptáculo o contenedor ( picnidos ,

esporodoquios ) o formar parte de un cuerpo altamente diferenciado ( ascocarpos y

basidiocarpos ).

Cuando se compara a los hongos con las bacterias , en general estos tienen

requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo es más lento , por lo que

requieren mayor tiempo de incubación para su cultivo , la diversidad más notable la

presentan en sus propiedades morfológicas y en sus ciclos sexuales siendo estas

características los criterios que se emplean en la identificación y clasificación de este

grupo las características estructurales incluyen : tipo de talo , morfología microscópica

del micelio tanto aéreo como profundo . tipo de hifas diferenciación y disposición o

agrupación de las mismas tipo de hifas reproductivas asexuales , estructura y modo de

formación del cuerpo fructífero sexual , tipo de espora ( forma , tamaño , aspecto

externo , agrupación , tabicacion , color , movilidad , tipo y numero de flagelos );

compocision de la pared celular , además , evaluar otras características fisiológicas y

reacciones metabólicas especialmente sobre azucares , de este modo , el estudio de

los hongos implica el examen microscópico , la observación del aspecto macroscopico

de sus colonias y la determinación de sus propiedades fisiológicas , especialmente su

actividad frente a sus diferentes azucares .


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1.5. CITOLOGÍA BACTERIANA: Cápsula, pared celular, membrana citoplasmática, mesosomas, citoplasma, inclusiones y vacuolas. Flagelos, pili-fimbrias. Esporas. Formas L.

Las bacterias pueden considerarse como los microorganismos de menor tamaño (1um

aprox.) que contiene la maquinaria necesaria para crecer y autorreplicarse a expensas

de los alimentos. Son morfológicamente más simples que las células de los organismos

superiores, pero analizando su superficie, resulta que éstas son más complejas. Las

bacterias carecen de núcleo organizado (por lo tanto, son procariontes).

Carecen de: Posee:

Mitocondrias y cloroplastos Sistema mitótico Membrana nuclear REL RER

Material nuclear Inclusiones Ribosomas Membrana células Pared celular

Material Nuclear:

El material nuclear procarionte está constituido por ADN bacteriano pero carece de

membrana nuclear y sistema mitótico, aunque si se puede observar una región de

concentración de ácido nucleico. El ADN bacteriano se encuentra naturalmente muy

enrollado y puede extraerse como una molécula continua, tiene un PM de 3 x 10⁹ y

mide aprox. 1mm de longitud, por lo tanto puede considerarse como un único

cromosoma.

El ADN aparece super enrollado en un centro de ARN que sirve para mantener al ADN

en su forma compacta. Tiene una estructura como de “cuentas de collar”, semejante al

del eucariota pero sin histonas básicas. Se encuentra insertado en una invaginación de

la membrana celular denominado mesosoma que forma tabique durante la división

celular y colabora en la separación de los cromosomas homólogos después se la

autorreplicación.

[El citoplasma bacteriano contiene ARN densamente agregado, por lo que, cuando se

utilizan colorantes, éste resulta ser basófilo como el núcleo].

Estructuras Citoplasmáticas:

Inclusiones:

Las bacterias almacenan materiales de reserva en forma de gránulos citoplasmáticos

insolubles (osmóticamente inertes) que constituyen la fuente de C para la síntesis de

proteínas y ácidos nucleicos.

También, muchas bacterias, acumulan fosfato inorgánico en forma de gránulos

metacromáticos, denominados gránulos de volutina.

Ribosomas:

El citoplasma bacteriano contiene numerosos ribosomas. Cada ribosoma compuestos

de 2 subunidades (50S y 30S), que en el proceso de síntesis proteica se agrupan en

cadenas formando polisomas.


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Estructuras Externas:

Las bacterias se pueden dividir en dos grupos de acuerdo a si retiene o no un colorante

(GRAM): las bacterias capaces de retener el colorante cristal violeta se denominan

“Gram +” y aquellas que no, “Gram -“.

GRAM - GRAM +

Presenta tres capas principales; - Una interna, la membrana

citoplasmática - Una capa delgada, correspondiente a

la pared celular - Una capa externa, que recibe el

nombre de membrana externa o “capa L”

Presenta dos capas; - Membrana citoplasmática - Pared celular (gruesa)

Membrana Celular:

Es una membrana unitaria típica, de fosfolípidos y proteínas. Se diferencia de la de

eucarionte por la ausencia de esteroles, (excepto Mycoplasma, que los incorpora en su

membrana si crece en medios que los contengan). El contenido de proteínas varia de

un 60-70%, y aparentan ser catalítica o de transporte, y no estructurales.

Ésta membrana también contiene enzimas con diferentes funciones, entre las más

importantes se destacan:

- Transporte de electrones

- Fosforilación oxidativa en las especies aerobias

- Síntesis lipídica

- Biosíntesis de la pared

- Replicación del ADN

Mesosoma: es una invaginación de la membrana plasmática (puede haber una o

más), presente generalmente en G+, irregular y de gran tamaño. Pueden ser de

tipo laminar o vesicular.

Los mesosomas laminares (de tabique) forman paredes transversas durante la división

celular, el cromosoma está fijado al mesosoma.

Los mesosomas vesiculares (laterales) intervienen en la función de secreción.

Pared Celular:

Se encuentra rodeando externamente a la membrana plasmática, gruesa en G+ y fina

en G-.

La presión osmótica de la mayoría de las bacterias es de 5 a 20 atmósferas, suficiente

presión para hacer explotar la célula si no fuese por la presencia de la pared celular. Su

fuerza se debe que está compuesta de mureína y peptidoglucano.


28

Componentes especiales de la pared celular:

- Gram +: contienen abundantes cantidades de ácido teicoico y polisacáridos.

- Gram -: contiene polímeros que se encuentran fuera de la envoltura del

peptidoglucano: lipoproteína, membrana exterior y lipopolisacárido.

- Bacterias ácido- alcohol resistentes: con respecto a su coloración; son ácido

alcohol resistentes. Poseen envolturas mucho más complejas. El ácido micólico (ác.

graso de cadena larga) se une covalentemente por medio de un polisacárido al

peptidoglucano, puede, además, contener otros compuestos y complejos lipídicos

formando una fina membrana cerosa por fuera de la pared del peptidoglucano. En

éste grupo se encuentran las micobacterias, nocardias y corinebacterias.

Protoplastos, esferoplastos y formas L:

Puede lograrse el crecimiento de cepas bacterianas carentes de pared celular

mediante hidrólisis con lisozima. Es necesario que crezcan en medio osmóticos

protectores, lo que hace que liberen protoplastos de las células G+ y esferoplastos

(que contiene la membrana exterior) de las células G-. Si las células con capaces de

crecer y dividirse, se las denomina formas L (Lister institute).

Cápsula:

Es un limo excretado, generalmente de polisacáridos. Las mutaciones celulares afectan

su producción y las células afectadas forman colonias lisas o mucoides, mientras que

las células no encapsuladas producen colonias rugosas.

La cápsula protege al patógeno de la fagocitosis de los fagocitos de la sangre o

protozoos y de los virus que deben fijarse a la pared celular, y por esto su papel es

crucial en la determinación de la virulencia de un germen.

Las capsulas verdaderas, en general, están compuestas por polisacáridos con mucina.

Son estructuras organizadas, firmemente ancladas a la pared celular, por lo que suele

ser difícil su eliminación completa mediante lavados in vitro, a diferencia de los “slime”

que se unen laxamente.

- Slime: trama densa de H. de C. complejos secretados por los microorganismos. Es

capaz de incluir a una comunidad de microorganismos dentro de sí, constituyendo

un biofilm

- Biofilm: estructura multilaminar compuesta de proteínas del hospedador,

plaquetas, agregados bacterianos y polisacáridos EC. No contribuyen a la

adherencia de las bacterias, pero favorecen su permanencia.

Los microorganismos contenidos dentro de un biofilm constituyen un foco de

resistencia a tratamientos ATB y al sistema inmunitario.

*Glicocalix: es el material dentro del biofilm que contiene polisacáridos y agregados

bacterianos.

Membrana externa de G -:

Bicapa lipídica intercalada con proteínas. La cara interna está formada por fosfolípidos

y la cara externa puede contener fosfolípidos, pero principalmente está compuesta por

una molécula anfipática compuesta de LPS. Las proteínas de la membrana externa


29

generalmente atraviesan la membrana y la fijan a la membrana de peptidoglucano

subyacente.

La molécula de LPS de la membrana exterior está compuesta por una región

hidrofóbica, llamada lípido A, que se une a una región hidrofílica de polisacáridos

lineales que consisten en el “core” polisacárido y el polisacárido O-específico.

El componente tóxico del LPS es el lípido A, y el polisacárido O puede cooperar con la

adhesión y ofrecerle algo de resistencia a la fagocitosis. Así, aunque el lípido A es el

encargado de la toxicidad, el polisacárido le confiere la virulencia.

Flagelo:

Estructura:

Son apéndices filiformes/filamentosos, finos,

ondulados y largos (3 a 12um), compuestos en su

totalidad por flagelina (proteína globular soluble), su

diámetro de 12-13nm y no pueden verse con MO a

menos que se empleen técnicas de coloración.

Son los responsables de la locomoción bacteriana y el

tipo de ondulación es exclusiva para cada cepa

bacteriana.

Se conocen distintos tipos de distribución:

Átricos: carecen de flagelo

Monótricos: un solo flagelo polar

Anfítricos: un flagelo en cada polo

Lofótricos: mecha de flagelos en un polo

Anfilofótricos: mecha de flagelos en ambos

polos

Perítricos: flagelos distribuidos en toda la superficie


30

La flagelina está compuesta por agregación de subunidades que originan una estructura

cilíndrica hueca. Los flagelos bacterianos, al ser mucho más delgados que los cilios de

vertebrados o flagelos de protozoos, no contienen las subfibrillas que se hallan en estas

estructuras, sino que se presentan en forma de cadenas íntimamente enrolladas, por lo

general como triple hélice. Si se produce la pérdida de los flagelos mecánicamente (agitación

por 6 minutos), se sintetiza uno nuevo.

El flagelo se inserta en el cuerpo de la célula bacteriana mediante una estructura compleja que

consiste en un gancho y un cuerpo basal. El cuerpo basal porta una serie de anillos (1 par en

G+, y 2 pares en G-).

Motilidad:

Los flagelos son rotores helicoidales semirrígidos a los cuales la célula les permite movimientos

de giro. Se supone que el anillo S está inserto en la pared celular, y el anillo M en la membrana.

La rotación del anillo S en relación con el anillo M fijo proporciona el movimiento de rotación.

La rotación puede producirse como respuesta al estímulo del ambiente.

Pili, pelos o fimbrias:

Apéndices superficiales rígidos presentes en muchas bacterias G- y en algunas G+.

Son estructuras más finas y cortas que los flagelos, compuestas de un solo tipo de proteína;

pilina. Se originan de los cuerpos basales de la membrana citoplásmica. En una misma célula

puede haber pilis de diferente grosor y longitud. Básicamente se clasifican en pilis sexuales


31

(involucrados en la conjugación bacteriana) y comunes o fimbrias (relacionados con la

adherencia).

Los estreptococos (bacterias G+), poseen una capa exterior de fimbrias llamada “proteína M”,

que es su principal Ag de superficie y es esencial para su establecimiento en el hospedador.

Endosporas:

Cuando las bacterias se hallan en condiciones desfavorables de nutrición comienzan a morir,

pero existe un grupo que en iguales condiciones sobrevive (aunque en estado de latencia),

debido a la formación en su interior de un organismo especial, el esporo. Los esporos o

endosporas son células muy deshidratadas, resistentes al calor, a situaciones ambientales

adversas y a agentes químicos.

Los tres géneros de bacterias son capases de formar endosporas.

Dentro de la célula bacteriana, el esporo puede hallarse en un extremo, subterminales o en el

centro de la misma. La espora puede modificar el cuerpo de la bacteria, si la bacteria es más

chica que ella z(deformantes o no deformantes).

Estos microorganismos sufren un ciclo de diferenciación en respuesta a condiciones

ambientales; bajo causas de deficiencias nutricionales, cada célula forma una única endospora.

La cual se libera cuando la célula progenitora sufre autólisis. Cuando regresan las condiciones

favorables y es activada, la espora germina para producir una célula vegetativa.

Algo característico de la endosporas es que poseen un enorme contenido de Ca++, el que es

acompañado por iguales cantidades de ác. dipicólinico, sustancia capaz de quelar el Ca++. La

resistencia el calor se debe en parte a su deshidratación y al dipiclolinato de Ca++.

Proceso de esporulación:

El proceso comienza cuando las condiciones nutricionales son desfavorables (N y C

especialmente), se activan los genes para la formación de espora y se desactivan los de las

funciones vegetativas.

La esporulación inicia con la migración de una región nuclear condensada hacia uno de los

extremos de la célula. Comienza a formarse un núcleo terminal mediante el crecimiento

invaginante de la membrana celular que produce y una estructura membranosa doble. Las dos

membranas de la espora constituirán capas especiales que formarán la envoltura celular, éstas

son; pared de la espora, corteza y capa o cubierta. El exosporio se encuentra por fuera de las

membranas.

Estructura de la endospora:

Núcleo: protoplasto de la espora., contiene un cromosoma, el aparato sintetizador de

proteínas y un sistema generador de energía basado en la degradación de glucosa.

Endosporio Centro

Envoltura Pared

Corteza

Capa o cubierta

Exosporio


32

Envoltura:

- Pared: en la capa más interna que rodea

a la membrana interna de la espora. Contiene

mureína y es transformada en la pared

celular de la célula vegetativa germinante.

- Corteza: entre la pared de la espora y la

capa o cubierta, se sintetiza la corteza,

formada por un tipo especial de

peptidoglucano laxo.

- Capa o cubierta: está compuesta de una

proteína semejante a la queratina que

contiene muchos enlaces disulfuro. . Debido

a su impermeabilidad es responsable de la

resistencia a los agentes químicos y

colorantes.

- Exosporio: proteína de la membrana que

contiene algo de glúcidos

Proceso de germinación: consta de tres etapas.

- Activación: aún cuando sean colocadas en ambientes ricos, las esporas no germina si no es

dañan su pared por algún medio (ác., calor, abrasión, lesión mecánica o química de la

corteza, o por acción enzimática), lo que permite que la célula capte agua y pierda su

elevado contenido de dipicolinato de Ca++.

- Iniciación: una vez activada, iniciará la germinación, si las condiciones ambientales son

favorables. Se capta agua, se libera dipicolinato de Ca++ y varios constituyentes de las

esporas son degradados por enzimas hidrolíticas.

- Excrecencia: la degradación de la corteza y de las capas exteriores resulta en la aparición

de una nueva célula vegetativa que consiste en el protoplasto de la espora con su pared

contigua.

MORFOLOGÍA Y AGRUPACIÓN BACTERIANA:

Teniendo en cuenta su morfología, las baterías pueden agruparse en 4 clases:

Cocos: bacterias esféricas que se presentan aisladas o reunidas en diferente disposición.

Pero no todos los cocos son perfectamente esféricos, alguno son ovales, lanceolados y

otros presentan escotaduras.

Reunidos de a pared son llamados diplococos, si forman cadenas (3 o más cocos) se

denominan estreptococos, si se agrupan irregularmente sobre un mismo plano forman los

llamados estafilococos, si forman grupos de 4 elementos se llaman tétradas o tetrágenos y,

finalmente, si se agrupan en 4 elementos y lo hacen en 2 planos se denominan sercina.

Bacilos: bacterias en forma de bastón, sus extremos pueden ser rectos, redondeados o

aguzados. Se presentan de forma aislada, reunidos por sus extremos formando

diplobacilos, o en cadenas largas formando estreptobacilos. Cuando se agrupan por sus

lados pueden dar una imagen similar a “letras chinas”.


33

Vibriones: bacilos retorcidos en su eje longitudinal. Normalmente no alcanzan a cumplir

una vuelta completa alrededor de su eje.

Espirilos: son bacilos retorcidos en su eje longitudinal, que cumplen varias vueltas

alrededor de su eje.

REPRODUCIÓN:

Reproducción asexual:

La mayoría de las bacterias se reproducen por un proceso simple de reproducción asexual

denominado “fisión binaria”, en el que cada célula incremente su tamaño y se divide en dos

células iguales. Durante la reproducción hay un incremento ordenado de estructuras y

componentes celulares, una replicación y segregación del ADN, y la formación de un septo que

atraviesa y divide la célula en dos. La división está coordinada por la membrana plasmática. El

ADN permanece unido a un punto de la membrana donde es replicado, y donde las dos

moléculas de ADN permanecerán juntas mientras un nuevo material de membrana es

sintetizado entre ambos ambas.

Cuando la formación del septo está completa, la célula se separa en dos células hijas. El tiempo

requerido para que la célula se divida es llamado “tiempo de generación” y puede variar desde

15min, a varios días dependiendo de la naturaleza de la bacteria.

Reproducción sexual:

Es menos frecuente, tarde de 15-20min. Algunas bacterias tiene un fragmento extra de ADN

circular denominado plásmido.

Conclusiones:

Las bacterias tiene miles de veces menos ADN que una célula eucarionte

Viven en un medio con una viscosidad igual a la del asfalto

Sólo se pueden movilizar en dos direcciones, lo hacen a 50km/hr. Y no pueden detenerse.

Una bacteria se puede relacionar sexualmente con un macho que posee un aparato sexual

para transferir información genética hembras receptivas (sin embargo es difícil que se

encuentren a esa velocidad).

Cada vez que una bacteria macho se aparean con una hembra, ésta se vuelve macho.

También, con mucha frecuencia, mutaciones espontánea causan que las bacterias cambien

se sexo.

El mal uso de las drogas ha resultado en la selección de bacterias resistentes a las mismas.


34

1.6.OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS: I.-Microscopía en fresco, con fondo oscuro, con luz transmitida, y con luz ultravioleta. Microscopía electrónica. II.-La preparación microscópica: materiales. Técnicas: extensión, secado, fijación y coloración. Coloración principal, mordiente, diferenciador, coloración por contraste. Métodos de coloración: Gram y Ziëhl Neelsen. Nociones sobre coloración de esporas, cilias, cápsulas y corpúsculos metacromáticos. Coloración de espiroquetas y de ric-kettsias. Observación y coloración de hongos.

Microscopio Simple o Lupa

Se llama microscopio simple o lupa a aquel formado por una lente positiva o

convergente, que colocada delante de un objeto determina la formación de una

imagen agrandada del mismo.

Microscopio Compuesto El microscopio compuesto está

formado primordialmente por dos

sistemas ópticos, objetivo y ocular;

ambos lentes positivos que se sitúan

en los extremos de un tubo con un

eje óptico común.

Microscopia en Fresco

Permite la observación de bacterias

vivas, su morfología verdadera, su

agrupación, motilidad y hasta

reproducción según la técnica empleada. No puede determinarse la estructura

bacteriana ni su constitución química.

Método Simple (entre porta y cubreobjetos)

En esta técnica se coloca una gota de cultivo (o se suspende una fracción de colonia en

una gota de agua destilada) en el portaobjetos y

luego se aplica sobre esta un cubreobjetos; este

último puede ser fijado al portaobjetos con parafina

para evita la rápida evaporación del liquido y además

evitar el desplazamiento al observar la inmersión

Gota Pendiente

En esta técnica, la gota de suspensión bacteriana se

coloca en el cubreobjetos; posteriormente, este se

coloca en posición invertida y con un rápido

movimiento sobre el portaobjetos, por lo que la gota

de liquido queda suspendida del cubreobjetos. Este


35

método permite eventualmente observar la reproducción de bacterias. El

portaobjetos aquí utilizado es un portaobjetos de Koch, el cual posee una depresión o

excavado central.

Célula de Boettcher: la depresión central tiene fondo plano y está rodeada

de un canal periférico más profundo que impide una posible fuga de

líquido.

Célula de Ranvier: consta de un cilindro o anillo de vidrio adherido a la

superficie del portaobjetos; sobre ella se coloca el cubreobjetos con el

material.

Negativa

Es un método simple y rápido para detectar bacterias encapsuladas y que puede

definirse como el FALSO Fondo Oscuro, la muestra se suspende en una gota de

colorante (ej. Nigrosina) el cual no llega a teñir las bacterias pero si el espacio

interbacteriano con lo que los microorganismos se destacan por contraste. La

nigrosina puede ser reemplazada por colargol o tinta china. La observación se debe

realizar de inmediato antes de que el material se seque.

Fondo Oscuro

Este método es utilizado para la observación de objetos por medio de su iluminación

periférica, lo cual permite detectar la presencia de elementos de soma (La noción

también sirve para hacer mención a la estructura corporal total de los organismos vivientes, a

excepción de los gametos.) muy delgado y con un índice de refracción muy cercano al del

agua, tal como sucede con algunas espiroquetas.

El fundamento de este método se basa en el principio Tyndall que consiste en el

empleo de condensadores especiales, los cuales solo permiten el paso de de los rayos

de luz periféricos, los cuales refractan o reflejan en la superficie espejada interior del

condensador e inciden de manera oblicua en el objeto. Tras chocar con el soma

bacteriano, el rayo luminoso se desvía de su curso original y penetra en la lente

objetivo, permitiendo de esta manera la visualización de las distintas morfologías

como partículas brillantes en su periferia sobre un fondo totalmente oscuro.

Microscopia de Fluorescencia

Los microscopios de fluorescencia utilizan la propiedad que poseen ciertas sustancias

de emitir bajo la acción de radiaciones de longitudes de onda corta, otras de

longitudes de onda más larga. Los primeros microscopios utilizaban un arco voltaico

de carbón p, como emisor de luz ultravioleta, esta una vez filtrada para seleccionar los

rayos de luz requeridos pasaba a través de un condensador de campo oscuro; así sobre

un fondo oscuro, la parte fluorescente de la muestra se observaba brillante.

Existen dos tipos básicos de equipos de fluorescencia: de luz transmitida y de luz

incidente, se diferencian en la manera en la cual los rayos de luz inciden en la muestra.


36

Microscopia Electrónica

Un microscopio electrónico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones

generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por

medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son

absorbidos por el aire). Un rayo de electrones atraviesa la muestra (debidamente

deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metálica para resaltar su

textura) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que

forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al

impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un

ordenador. Los microscopios electrónicos producen imágenes sin ninguna clase de

información de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una forma

posible de reproducir este fenómeno mediante los electrones; sin embargo, es posible

colorizar las imágenes posteriormente, aplicando técnicas de retoque digital a través

del ordenador. Las técnicas utilizadas pueden ser por Barrido o Transmición.

Coloración Simple

• Simple: es una técnica que emplea un solo colorante, de manera que todos los

elementos incluidos en la muestra toman el mismo color.

• Directa: en este caso, solamente el colorante actúa sobre la muestra.

• Progresiva: cuanto más tiempo se aplica el colorante sobre la muestra, más la tiñe.

Coloración Compuesta

• Compuesta: esta técnica se denomina así por emplear dos colorantes.

• Indirecta: incluye el uso de un mordiente que incrementa la fijación del colorante

principal al material (ej. lugol, ácido fénico, calor).

• Regresiva: se aplican decolorantes para eliminar el colorante principal. Así se

diferencian las bacterias positivas y negativas. Ejemplos de decolorantes son:

alcohol, alcohol acetona, alcohol ácido, etc.


37

Pasos previos a la tinción

1. Extendido: este paso implica la

colocación de la muestra sobre el

portaobjetos, siguiendo todas las

reglas de esterilidad y bioseguridad

correspondientes.

2. Secado: se lo aplica para eliminar el

exceso de líquido de la muestra pero

esto no produce la muerte de las

bacterias en ella contenidas. Debe

recordarse que una bacteria

deshidratada no es una bacteria

muerta.

3. Fijado: en este paso sí se produce la

muerte bacteriana por degradación de

sus proteínas somáticas por acción de

agentes químicos o del calor, según el

método utilizado. De todas formas hay

que considerar el tipo de muestra a

fijar debido a que en ciertas

oportunidades el vehículo en que se hallan las bacterias permiten su sobrevida aún

después de la fijación (ej. Mycobacterium tuberculosis en esputo).

Coloración

Colorante: Toda sustancia que es capaz de transmitir color a otro elemento.

Componentes:

A. Grupo Cromóforo: Transmite el color.

B. Grupo Auxócromo: Poder de combinarse.

• Colorantes Básicos: Tiñen la parte ácida de la bacteria como su ADN, ARN. Por

ejemplo Azul de metileno, violeta de metilo, fucsina básica, verde de malaquita,

cristal violeta, safranina.

• Colorantes Ácidos: Tiñen la parte básica como su citoplasma. Por ejemplo la

eosina o el rojo Congo. Son de carga neta negativa y se usan para teñir proteínas

de carga positiva.

Tipos de Coloración

• Coloración simple: Un solo colorante (azul de metileno) todo se tiñe igual.

• Coloración compuesta: Dos colorantes: Primario o Colorante Principal y

Secundario o Colorante de Contraste.

• Coloración diferencial: Coloraciones especiales que colorean una estructura en

particular de la bacteria:

Esporos

Flagelos


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Cápsula

Corpúsculos Metacromáticos

Colorante principal: Solución hidroalcohólica de Violeta de Genciana

Mordiente: Es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con

colorantes y determine su fijación a las bacterias. Se usa Solución de Lugol

Decolorante: Alcohol Acetona

Colorante de contraste: Solución madre de Safranina

Técnica de Coloración de Gram

1. Violeta de Genciana: 1 min.

2. Lavado con agua

3. Lugol: 1 min.

4. Lavado con agua

5. Alcohol acetona: 10 seg.

6. Lavado con agua

7. Safranina: 45 seg a 1 min.

8. Lavado con agua, secado y observación

Interpretación:

Positivos: VIOLETA

Negativos: ROJO

Fundamentos de la Coloración de Gram

• Las GRAM+, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de

peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que éste

actúa deshidratando los poros y cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el

complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

• En cambio, en la decoloración, la membrana externa de las GRAM- se disuelve, porque

la capa de peptidoglucano que posee es muy delgada como para poder retener el

complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, Por esto, al colocar el

colorante Secundario, toman su color.

Se tiñen con la técnica de Gram, todos los microorganismos que poseen pared celular

Coloración Compuesta de Zhiel Neelsen (Bacilo Acido Alcohol Resistente – BAAR)

• Colorante principal: Fucsina fenicada de Ziehl

• Decolorante: Alcohol ácido (solución de Alchohol Etilíco 96º, con Acetona en una

proporción de 1:1)

• Colorante de contraste: Solución acuosa de Azul de Metileno.


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Técnica de la Coloración

1. Fucsina fenicada de Ziehl (en caliente) 5 min

2. Lavado con agua

3. Alcohol ácido 2 min

4. Lavado con agua

5. Azul de metileno 1 min

6. Lavado con agua, secado y observación.

Interpretación:

Positivos: Rojo

Negativos: Azul

Fundamento de la Coloracion de Ziehl Neelsen

• Las Mycobacterias contienen ácidos micólicos que les confieren la propiedad de

resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos,

por esto se denominan ácido-alcohol resistentes

• El calentamiento permite que el colorante atraviese la pared bacteriana, ya que

aumenta la energía cinética de sus moléculas facilitándo su entrada a las bacterias.

Luego, al enfriar con agua, se provoca una solidificación de los ácidos grasos de modo

que el colorante ya no puede salir de las bacterias.

Se tiñen con la técnica de Ziehl Neelsen por ejemplos parásitos Coccideos como el

Cryptosporidium, microbacterias tales como la microbacteria de la tuberculosis

1.9. METABOLISMO: I.Nutrición: tipos. Elementos energéticos y morfogénicos. Factores accesorios. Mecanismo metabólico. Enzimas. Metabolismo gaseoso. Fermentación. Putrefacción. II.Actividad bioquímica sobre los glúcidos, lípidos y prótidos. Formación de ácidos y gases. Hidrógeno sulfurado, indol, acetil-metil-carbinol. Reducción de nitratos a nitritos. Catalasa, peroxidasa y ureasa.

Metabolismo Bacteriano

• Conjunto de reacciones bioquímicas catabólicas y anabólicas, que transforman

las sustancias nutritivas para obtener energía.

• Anabolismo: reacciones de síntesis.

• Catabolismo: degradación de compuestos orgánicos.

• Reacciones Endergonicas. Consumen Energía

• Reacciones Exergónicas. Liberación de Energía

Fases del metabolismo y producción de la Energía

La transformación de la energía, generación de ATP, puede ser mediante 3 vías

principales:

1. La respiración, que tiene lugar en presencia de O2 y da como resultado CO2 y

H2O, es un proceso de oxidación.

2. La fermentación: en condiciones sin oxigeno.

3. La fotosíntesis: que obtiene la energía por absorción de luz visible a través de la

clorofila.


40

Fuente de Energia

Puede ser la luz solar o artificial, o sustancias inorgánicas como el azufre, el CO, el

amonio o sustancias provenientes de la materia organica, como por ejemplo los

hidratos de carbono, las proteínas y los lípidos. Según los requerimientos energéticos

las bacterias se dividen en:

1. Fototrofas

2. Litotrofastrofas

3. Heterotrofas

4. Mixotrofas

Nutrición microbiana

Las células están compuestas de:

1. Macromoléculas: polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos y proteínas (Las

proteínas son las más abundantes).

2. Agua.

El agua es el solvente ideal para los organismos vivos debido a su polaridad y a su

cohesión.

Los microorganismos requieren para su desarrollo y actividad celular compuestos

químicos: denominados nutrientes.

Dependiendo de las cantidades que se requieran se habla de macronutrientes y

micronutrientes. Existen diferencias en cuanto a los requerimientos nutricionales de

cada microorganismo.

Macro Micro

• Carbono. • Nitrogeno. • Fosforo. • Azufre • Potasio • Magnesio • Sodio • Calcio • Hierro

• Cromo • Cobalto • Cobre • Manganeso • Molibdeno • Niquel • Selenio • Tungsteno • Vanadio y Zinc.

Todas las células utilizan oxígeno, gaseoso o encubierto, ya que para un determinado

grupo de bacterias puede ser mortal. De acuerdo a los requerimientos de oxígeno, las

bacterias se pueden clasificar en;

- Bacterias aerobias estrictas u obligadas: las que requiere O2 como aceptor terminal de

electrones y no proliferan en condiciones de anaerobiosis

- Bacterias anaerobios estrictas u obligadas: se desarrollan en total ausencia de O2, obtiene

su energía de la fermentación.

- Bacterias anaerobias facultativas: proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando O2

como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando la fermentación para

obtener energía. Por lo tanto sobreviven tanto en aerobiosis como en anaerobiosos


41

- Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de O2, pero obtienen la

energía de la fermentación.

- Microaerófilos: requieren del O2 como aceptor terminal de electrones, pero en una

tensión menor a la requerida por bacterias aerobias.

- Capnoicos: bacterias que se desarrollan mejor en presencia de anhídrido carbónico.

Tipos Nutricionales

Tipo Fuente de

energía

Fuente de carbono Ejemplos

Fotoautotrofas Luz CO2 Algas y cianobacterias

Fotoheterotrofas Luz Compuestos orgánicos Algas y bacterias

fotosintéticas

Quimioautotrofas o

Litotrofas

Química Compuesto inorgánicos:

H2, NH3, NO2, H2S, CO2

Pocas bacterias

Quimioheterotrofas o

Heterotrofas

Química Compuesto orgánicos:

glucosa

La mayoría de bacterias

Factores de Crecimiento

Se requieren en muy pocas cantidades y solo por algunas células:

• Vitaminas,

• Aminoácidos,

• purinas y

• pirimidinas.

La mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizarlos.

Enzimas

Catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Su accionar es esencial en el

metabolismo bacteriano. Actúan de manera específica a través de un sitio activo,

produciendo un efecto catalítico sobre las moléculas del sustrato, convirtiéndola en un

producto especifico.

Funcionan en forma secuencial: Lo que significa que el producto de una reacción

enzimática será a su vez degradado por la siguiente enzima de la cadena de reacciones

de alguna vía metabólica. Existen sistemas multienzimaticos organizados

espacialmente en la membrana celular; esto permite que las reacciones ocurran de

una manera organizada.


42

1.10. CULTIVO DE BACTERIAS: Marcha bacteriológica. Medios de cultivo: preparación. Medios comunes, mejorados, diferenciales y selectivos. Siembras. Desarrollo de las bacterias en los medios de cultivo líquidos y sólidos. Colonias: tipos. Marcha Bacteriologica

La expresión marcha bacteriológica designa la serie ordenada de pasos que se deben seguir

para identificar correctamente una bacteria responsable de infección.

Los pasos habituales de la marcha bacteriológica son:

1. Decisión de realizar el estudio bacteriológico

2. Recolección de la muestra y transporte

3. Observación microscópica

4. Observación en fresco

5. Coloración

6. Cultivo

7. Tipificación bioquímica

8. Serotipificacion

9. Estudios complementarios

10. Antibiograma

11. Serodiagnóstico

Medios de Cultivo

Los medios de cultivo pueden tener una composición química definida o no. Antiguamente se

utilizaban los extractos de carne o de otros tejidos que constituían una fuente de proteínas y

azucares.

Finalidad de un medio de cultivo:

- Aislamiento de microorganismos en colonias puras

- Estudio de características culturales

- Estudio de actividad metabólica

- Preparación de vacunas y Antígenos

- Conservación de gérmenes en colección

- Obtención de grandes masas microbianas para estudios físicos y químicos

- Obtención de gérmenes con fines industriales (preparación de productos lácteos,

vitivinícolas, enzimáticos y ensilajes)

Composición y propiedades:

En la actualidad se utilizan compuestos hidrolizados proteicos llamados PEPTONAS, obtenidos

por hidrólisis enzimática de leche, carne, levaduras, etc., que mantiene sus propiedades en

cuanto a aa y vitaminas.

El medio posee también cloruro de Na que tiene como función mantener la presión osmótica.

Si el medio a cultivar requiera sangre, ésta se hemoliza si no hay presión osmótica adecuada.

Un medio de cultivo, debe contener como mínimo; C, N, S, P y sales orgánicas. En muchos

casos, además, hacen falta vitaminas y sustancias inductoras del crecimiento. También los

medios pueden tener indicadores de cambios de pH en las reacciones metabólicas.


43

Para lograr que un medio de cultivo sea sólido de le agregan solidificantes. Éste puede ser agar

sílice, gelatina o gel poliacrílico. En la actualidad se usa el agar, que es un polisacárido derivado

de algas marinas.

La mayoría de los microorganismos crecen en un pH cercano a la neutralidad, por eso es

importante verificar el pH luego de la esterilización. Y antes de ser usados, los medios de

cultivos, deben ser controlarse para verificar su esterilidad incubándolos a 37°C durante 24

horas (salvo la de agar sangre, porque pierden calidad). Sólo algunas placas, representativas de

un lote, se incuban durante una semana y el resultado se extrapola al total del lote.

Clasificación de los medios de cultivo:

Por sus consistencia:

Líquido: también denominado caldo; posee elementos nutritivos disueltos en agua

destilada.

Semisólidos: también llamado agar blando; es de consistencia leve y gelatinosa, se

obtiene agregando agar al caldo. Se fracciona en tubo de hemólisis para siembra en

puntura.

Sólido: llamado agar estría o agar duro o placa; se obtiene esa consistencia agregando

mayor cantidad de agar al caldo. Se fracciona en placas de Petri o en tubo de ensayo,

los que se dejan solidificar inclinados para obtener “agar pico de flauta”.

Por su finalidad:

Medio de transporte: medo líquido o semilíquido. Permite el mantenimiento de la

muestra clínica sin modificaciones en calidad y cantidad de microorganismos

presentes. No posee nutrientes, sino agua, sales y amortiguadores de pH.

Medios de enriquecimiento: medio líquido selectivo que permite el crecimiento

preferencial de ciertas bacterias patógenas. Se utiliza cuando la muestra clínica tiene

muchos microorganismos y sólo favorece el crecimiento de las bacterias mejor

adaptadas.

Medio mínimo: contiene la cantidad mínima de nutrientes que un microorganismos

necesita para desarrollarse

Común o simple: es aquel que, reuniendo los elementos mínimos, permite el

desarrollo de la mayor parte de bacterias no exigentes.

Enriquecido: es un medio siempre con el agregado de sustancias que aumentan su

poder nutritivo (sangre, suero, extractos de levaduras, vitaminas). Éste medio se usa

para bacterias exigentes como estreptococos y mycoplasma)

Selectivo: permite seleccionar ciertos microorganismos, frenando el desarrollo de

otros. Esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como los ATB, ciertos

colorantes, sales biliares, etc. También la temperatura de incubación hace selectivo un

medio!!

Diferencial: es el medio que permite diferenciar bioquímicamente a las bacterias por

su actividad metabólica. Poseen un sustrato sobre el cual actúa o no la bacteria, y esa

actividad se revela por la aparición del pH del medio o por alguna actividad enzimática

que modifica el aspecto del medio de cultivo


44

Especial: las sustancias que lo integran cumplen con las exigencias vitales de

determinados microorganismos y únicamente ellos pueden desarrollar en forma

óptima.

Colonia

Las bacterias crecen sobre un medio de cultivo sólido, no pueden moverse y

al multiplicarse en forma geométrica, las sucesivas generaciones de bacterias

quedan ubicadas unas sobre otras hasta hacerse visibles macroscópicamente.

Población

Desarrollo bacteriano en medios de cultivo líquidos, en donde no pueden

diferenciarse entre sí los distintos microorganismos; las características más

importantes son: turbidez del medio; formación de velo superficial (su

consistencia, espesor y cantidad) y presencia de sedimento (aspecto, cantidad

y coloración).

1.11. CRECIMIENTO REPRODUCCIÓN Y MUERTE DE LAS BACTERIAS: Estudio cuantitativo del desarrollo: concentración celular; conteo total y conteo viable. Métodos. Factores que afectan el desarrollo. Curvas de crecimiento: significa-do de sus fases. DMM, DL50: fundamentos.

Cultivo de Microorganismos: Se denomina cultivo al proceso de propagar microorganismos brindándoles las condiciones

ambientales adecuadas. Para luego poder realizar un estudio cuantitativo del desarrollo

bacteriano.

Agar: Es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.

Se licúa a 97 ºC

Se solidifica a 40 ºC

Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es

atacado por ellas.

Aislamiento:

Proceso o conjunto de métodos que deben aplicarse para conseguir bacterias en cultivo puro,

separando las bacterias que se desea estudiar de los microorganismos contaminantes; se

realiza en medios sólidos.

Métodos generales de aislamiento:

- Diseminación en una placa:

El medio de cultivo elegido se funde a baño maría hirviente, se vuelca en una placa de Petri y

se deja solidificar. Para evaporar el exceso de humedad, se coloca la placa en una estufa de

cultivo a 37°C, boca abajo, por 24 horas.

Para realizar el aislamiento se realiza una “ansada” de la muestra en un punto periférico de la

placa, y con el ansa se traza una estría apretada de poca extensión, luego se debe quemar y

enfriar el ansa. Si la muestra es un hisopado, se coloca el hisopo en un punto periférico y se

hisopa apretadamente, luego se continúa con el ansa


45

Para realizar la primera siembra ciega, la placa se gira en el sentido contrario a las agujas del

reloj y se arrastra el material de la estría primaria al medio sin sembrar, en forma

perpendicular. Luego quemar y enfriar el ansa.

Seguido de una segunda siembra ciega, se gira nuevamente la placa arrastrando material de la

segunda estría al medio nuevo en forma perpendicular.

Girando finalmente por tercera vez la placa, sin esterilizar el ansa, se traza una estría final de

agotamiento en el medio de la siembra y se procede a incubar.

Al quemar el ansas el número de colonias disminuirá de la primera a la última estría, esto

permite obtener el aislamiento buscado.

- Diseminación en varias placas:

Se usan varias placas con medios sólidos. Se coloca en un extremo de la placa la muestra

clínica y, con espátula de Drigalsky previamente flameada y fría, se disemina la muestra en

toda la superficie de la placa. Luego se toma una segunda placa y se repite la diseminación con

la espátula sin flamear. Al repetir la operación con otras placas, la cantidad de bacterias irá

disminuyendo progresivamente, obteniéndose al final colonias aisladas.

- Dilución, método empleado para conteo viable o unidades formadoras de colonias:

Esta técnica se utiliza, fundamentalmente, para determinar la calidad higiénica de agua y

alimentos.

Se realizan diluciones de una muestra problema sobre la que se desea averiguar el número de

bacterias viables. Se efectúa la siembra de una alícuota de cada dilución sobre un medio

sólido. Luego de incubar cada dilución, se cuenta el número de colonias aisladas y se multiplica

por el factor de dilución, obteniendo el número de bacterias por millón de la muestra.

Morfología y aspecto de las colonias y poblaciones bacterianas:

Desarrollo del cultivo en medio líquido:

- Desarrollo superficial:

1) Formación de anillo: puede ser de tamaño y consistencia variada (película tenue,

grumosa, membranosa), puede estar adherido o no a la pared del tubo y ser de

aspecto diverso (seco, húmedo).

2) Formación de velo o película: puede ser de diferente consistencia, gruesa o fina, lisa o

rugosa, húmeda o seca, ascendente por el tubo, al agitar el tubo puede mantenerse en

la superficie o caer al fondo del tubo.

3) Formación de precipitado fluctuoso: al agitar el tubo el precipitado desciende

formando largos flóculos hasta el fondo del tubo (la floculación es la dispersión de

grumos sólidos en una solución coloidal (líquida)).

4) Formación de película membranosa: se forma una membrana más gruesa que el velo.

5) Desarrollo superficial ausente: cuando se trata de bacterias microaerófilas anaerobias

absolutas no se observa ningún desarrollo superficial, pero sí se advierte turbidez del

medio en la parte inferior.

- Turbidez del medio líquido: muchas bacterias desarrollan produciendo enturbiamiento del

medio debido a la abundante suspensión celular. Ésta turbidez tiene distintos grados y se


46

la clasifica según su mayor o menor intensidad en; leve, moderada y fuerte, y por su

duración en transitoria o persistente.

- Formación de sedimento: muchos cultivos presentan sedimentos de diferentes aspectos.

Se clasifican en; fluctuosos (cuando el aspecto es granuloso grueso), granular (cuando es

granuloso fino), escamoso y viscoso. A su vez, la cantidad de sedimento puede ser nula,

escasa o abundante.

Desarrollo del cultivo en medio sólido:

La morfología colonial en medio sólido es característico de cada tipo bacteriano. Es útil su

observación en un cultivo primario para definir si se trata de un cultivo puro o si la muestra

está contaminada. Las características más importantes son:, forma, dimensiones, elevación,

contorno y superficie.

- Pigmentada: depende de la presencia de pigmentos carotenoides.

- Superficie: puede ser lisa, rugosa, mucosa, anularconcéntrica o con surcos radiales.

Las superficies lisas se deben a la presencia de cápsulas o a las cadenas laterales de los

polisacáridos de la membrana externa de G- (generalmente asociadas a la virulencia de los

microorganismos). Las colonias rugosas tienen una superficie seca formada por células

que carecen de cápsula o que crecen en forma filamentosa. En algunos microorganismos

las cepas rugosas no poseen virulencia. Las superficies mucosas se observan en bacterias

altamente capsuladas.

Las formas son variadas; puntiformes, circular, filamentosa, rizoide o irregular.

El borde puede ser; entero, ondulado, lobulado, mellado, filamentoso o festonado.

La altura puede ser; elevada, plana, convexa o cóncava.

Otro rasgo son el olor y caracteres ópticos (como; opaco, translúcido, opalescente o

iridiscente).

Conteo Bacteriano

El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana

Conteo de células viables

La célula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de

cultivo.

Se basa en que cada colonia surge de una simple célula.

Cada colonia contiene una sola especie bacteriana.

El número de bacterias viables por muestra se expresa en:

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)

Representa cada colonia contada y su número total representa el número total de

bacterias viables en la muestra.


47

La determinación del numero UFC se puede obtener de dos maneras

Método de vertido en placa

Método de extensión en placa

Método de extendido en placa

Es el método de elección para anaerobios facultativos y cultivo de microaerófilos.

Método de Vertido en placa

Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

Dilución en tubos

Útil para la técnica de vertido

en placa o extensión en placa.

Se siembran volúmenes

conocidos de cada dilución

Luego se incuba a 35 – 37 0C

durante 24 – 48 horas.

Técnica de recuento

Finalizado el tiempo de

incubación, se realiza el recuento.

Se toman en cuenta

únicamente aquellas cajas Petri que

tengan entre 30 y 300 colonias.

Este número de colonias es estadísticamente representativo.

Aquellas placas que tengan más de 300 colonias se reportan como “INCONTABLES”.


48

Para realizar el conteo se puede utilizar un cuenta colonias, para realizar el conteo con est:

Puede ser contada toda la placa o por cuadrantes.

Cuando la carga bacteriana es alta, se toma en cuenta un cuadrante con carga alta, un

cuadrante con carga media y un cuadrante con carga baja.

Se realiza la sumatoria de los tres cuadrantes y se saca el promedio.

Finalmente el promedio se multiplica por 65

No. Colonias = (CA + CM + CB /3) * 65

Obtención de resultados

Terminado el conteo por cualquier método, se debe aplicar la siguiente fórmula para

obtener el No. de UFC/ ml o UFC/g.

UFC/ml ó UFC/g = No. de colonias por placa X el factor de dilución *

ml de la muestra sembrada

*Factor de dilución: inversa de la dilución.

Curva de crecimiento

Las bacterias se multiplican por fisión binaria.

Este proceso dura entre 10 min y 24 horas dependiendo del microorganismo, pero la

mayoría de las bacterias de importancia médica tiene un tiempo de generación de

entre 20 min y 2 horas.

En cada generación se duplica el número de individuos. Partiendo de un número inicial

de bacterias N0, al cabo de una generación tendremos 2 x N0, en la siguiente

generación, 2 x 2 x N0 y así sucesivamente la población aumenta con el exponente de

2, por lo que se expresa como “crecimiento exponencial”.

Primera generación: 2 x N0

Segunda generación: 2 x 2 x N0 = 22 x N0

Tercera generación: 2 x 2 x 2 N0 = 23 x N0


49

1.16.ACTIVIDAD PATÓGENA DE LAS BACTERIAS, HONGOS, RICKETTSIAS Y VIRUS: Parasitismo y enfermedad. Relaciones hospedador-parásito. Postulados de Koch. I.Condiciones que posibilitan la enfermedad: 1.Inherente a los microorganismos: patogenicidad y virulencia. Factores de virulencia. a)Bacterias: exo y endotoxinas, hemolisinas, leucocidinas, otras. b)Rickettsias y virus: toxinas y antígenos solubles. c)Hongos: Mecanismo directo, oportunistas y patógenos primitivos. Mecanismo indirecto, micotoxicosis. 2.Inherentes al organismo animal: la especie, raza, edad, estado sanitario, sexo, otras. 3.Otros factores: clima, estación, alojamiento, otras. Microorganismos nativos (Microbiota normal). Puerta de entrada. Infección local y general. Septicemia. Bacte-riemia. Viremia, etc. Infecciones latentes.

Relaciones hospedador-parasito

• Depende del estado inmune del hospedador

• De la naturaleza de la especie o cepa microbiana

• Del número de microorganismos de la exposición inicial

• De las condiciones del ambiente

Propiedades que confieren patogenecidad

• Toxigenicidad

• capacidad para producir toxinas

• invasividad (No confundir con invasividad intra celular)

• se refiere a la facultad para penetrar, establecerse, reproducirse y diseminarse

en los tejidos del hospedero

Factores que intervienen

Penetrabilidad

• Entrada

• Adherencia:

• Mucoplisacáridos: Cápsula que sirve para la adhesión

• Polímeros (glucanos, destranos) que son mucosos y sirven para la

adherencia en las caries (Streptococcus mutans)

• Pilis bacterianos: en mucosas. E.coli enteropatógenos del bovino y

cerdo (Plásmido K88 y K89)

• Multiplicación

• No se sabe si la multiplicación por si sola produce daño.

• Neutralización de defensas

• Proteína A de Staphylococcus aureus que inhibe la quimiotaxis y la fagocitosis

• El Ag K de E.coli, Vi de Salmonella y Ag O de enterobacterias: con capacidad

antifagocítica o resistentes a la acción del Complemento.

• Ácido micólico, LPS y cera M. tuberculosis.

• Cápsula del neumonoco y en Bacillus anthracis.

• Toxicidad

• Es la capacidad de un microroganismo de causar daño en determinado tejido

por sustancias tóxicas.


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• Endotoxinas (LPS)

• Lípido A

• Cadenas laterales específicas

• Exotoxinas (proteínas tóxicas)

• Tipo intracitoplasmáticas (ej. E.coli)

• Verdaderas (Diftérica, tetánica, Botulínica)

• Factores auxiliares de la virulencia

• Factores enzimáticos

• Hialuronidasa (Streptococcus grupo A, Staphylococcus, Clostridium)

• Estreptocinasa o fibrinolisina

• Coagulasa (estafilococo)

• Proteasas, colagenasas, DNAsas, RNAsas, etc.

• Factores inmunológicos

• Alergia e hipersensibilidad (Candida albicans)

• Glomérulo nefritis por sensibilización a

• Proteus, E.coli, o proteína M del

• Streptococcus beta hemolítico grupo A

• Eritema papular por Trichophyton.

Postulado de Koch

1. El micro organismo patógeno sospechoso debe estar presente en todos los caso de

enfermedad y ausente en animales sanos.

2. El micro organismo sospechoso debe cultivarse en cultivo axenico

3. La células de un cultivo axenico del microorg aislado deben causar enfermedad en

animales sanos.

4. El micro organismo debe ser re-aislado y debe ser idéntico al original.

Patógeno: Es un micro organismo capaz de producir enfermedad

Patogenicidad: Es un término absoluto. Es o No es patógeno

Virulencia: Determina los grados de patogenicidad.

1.18.ACCIÓN PATÓGENA EXPERIMENTAL: Animales de laboratorio. Especies más utilizadas. Estandarización animal, aspectos éticos. Clasificación de los animales de acuerdo con su condición microbiológica: convencionales, animales libres de patógenos específicos (SPF), gnotobiotes, animales libres de gérmenes (GFA). Rata y ratón: generalidades, sujeción, sexado, identificación, vías de inoculación. Toma de muestras. Eutanasia.

La Ciencia de los animales de laboratorio se puede definir como una rama multidisciplinaria

que contribuye con la investigación biomédica permitiendo la obtención de datos

reproducibles, confiables e informativos.

Incluye el estudio de la biología de los animales de laboratorio, su manejo y requerimientos

ambientales, los procedimientos de estandarización microbiológica y genética, la prevención y

tratamiento de enfermedades, la optimización de técnicas experimentales y de las técnicas de

anestesia, analgesia y eutanasia. Esta ciencia también incluye el estudio de los aspectos éticos


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de la experimentación animal junto con la búsqueda de procedimientos alternativos y

complementarios.

El término “experimento con animales” puede aplicarse a cualquier procedimiento científico

en el que se utilicen animales, con independencia de que sean vertebrados o invertebrados. El

objetivo principal de la ciencia de animales de laboratorio es lograr el equilibrio entre la

calidad de la experimentación animal y el bienestar de los animales.

Se define como animal de laboratorio a cualquier tipo de ser vivo, con independencia de su categoría filogenética o taxonómica, tanto vertebrados como invertebrados, que se utilice como instrumento de medida con fines científicos.

La ciencia en la que se utilizan fundamentalmente es la biología (biomedicina), dentro de las

siguientes áreas:

a) Estudios biológicos

b) Desarrollo y control de calidad de productos y aplicaciones para medicina humana

y veterinaria, fabricación de productos farmacéuticos o alimenticios y pruebas de

eficacia y/o seguridad.

c) Diagnóstico y prevención de enfermedades o alteraciones de la salud, prevención

de anomalías o sus efectos, diagnóstico y tratamiento de las mismas.

d) Valoración, detección, normalización o modificación de las condiciones fisiológicas

en el hombre, los animales vertebrados e invertebrados o las plantas. e.

Protección del hombre, los animales y el ambiente.

e) Educación y formación

f) Otros

El animal de laboratorio se considera como un “reactivo biológico”, que lo definimos como

aquel animal en experiencia, en función al tema en estudio, capaz de dar una respuesta

confiable y reproducible. Su pureza debe ser vigilada, controlada y evaluada lo mismo que otro

reactivo (químico o físico), sin olvidar su posible contaminación biótica o abiótica, que puede

producir alteraciones en los resultados esperados u observados en el proceso experimental.

El objetivo final es la obtención de animales biológicamente uniformes, desde el punto de vista

genético y microbiológico. Además se deben estandarizar las variables macro y

microambientales del espacio en el cual se encuentran los animales (ventilación, temperatura,

humedad, luz), como así también las de índole etológico o de comportamiento (territorialidad,

agresividad y hacinamiento).

Las unidades en donde se producen o mantienen bajo experiencia los animales de laboratorio

se denominan bioterios.

Tienen como función producir animales para ser utilizados como reactivos biológicos de alta

calidad y/o mantener especies o cepas bajo experiencia aplicando metodologías que estén de

acuerdo con las recomendaciones internacionales.

Bienestar Animal

La teoría de Russell y Burch tal como se elaboró a finales de los años cincuenta se ha

convertido en un tema central de la ciencia de animales de laboratorio. Se trata de cómo

instrumentar medidas para disminuir o eliminar los aspectos no humanitarios de la

experimentación animal, para ese fin se introdujo el “Concepto de las 3 Rs” (refinamiento,

reducción y reemplazo) como base fundamental para el empleo responsable de los animales

en los experimentos.


52

Refinamiento: Se refiere a las condiciones y calidad de vida que se le otorga al animal en

cautiverio.

Reducción: se refiere a una disminución del número de animales que se necesitan para un

experimento determinado.

Reemplazo: Se refiere a la sustitución del empleo de animales vivos por técnicas in vitro,

modelos normatizados, videos, etc.

Los animales pueden clasificarse por su calidad microbiológica

a) Convencionales: criados y mantenidos en condiciones ambientales no definidas,

eventualmente pueden ser portadores de infecciones, latentes o no, pero de ninguna

manera zoonosis.

b) Libres de patógenos específicos (S.P.F. Specific Pathogen Free): Se obtienen por

histerectomía aséptica y se crían y mantienen bajo barreras sanitarias. La técnica de

histerectomía se fundamenta en la capacidad que tiene la placenta para filtrar la

mayoría de los microorganismos, lo cual evita la transmisión vertical. Su microbiota

intestinal es normal y se controlan periódicamente.

c) Libres de gérmenes o axénicos (G.F.A. Germ Free Animals): Son animales en los

cuales no se pueden detectar ningún microorganismo, incluyendo los de la microbiota

normal por los métodoshasta ahora conocidos. Son criados y mantenidos en

ambientes totalmente estériles como por ejemplo: aisladores. También se obtienen

por métodos de histerectomía.

d) Gnotobiotes (Gnotos: conocido, Biote: vida): Son animales axénicos o libres de

gérmenes que se han puesto en contacto con uno o más cultivos puros de

microorganismos. Es decir que en estos animales conocemos totalmente la carga

microbiana presente. Para establecer la categoría microbiológica a la cual pertenecen

los animales se controla periódicamente el estado sanitario de las colonias aplicando

métodos y recomendaciones establecidos internacionalmente.

RATON El ratón es el animal más utilizado en las pruebas de diagnóstico e investigación. Su pequeño

tamaño, vida relativamente corta, alta eficiencia reproductiva, adaptación a la explotación en

grandes colonias, el conocimiento completo de su genoma, su amplia variabilidad genética y la

susceptibilidad a agentes químicos y microbianos, hacen de este animal un modelo apropiado

para investigación en diversas disciplinas, tales como embriología, etología, genética,

gerontología, microbiología, oncología, etc.

ORIGEN

El ratón doméstico (Mus musculus) tiene una amplia distribución mundial y como su nombre lo

indica se encuentra asociado al hábitat humano. Todas las cepas de ratones de laboratorio

existentes derivan de una cría selectiva del Mus musculus tipo salvaje.

TAXONOMÍA

Clase: Mamífero

Orden: Rodentia

Familia: Muridae

Género: Mus

Especie: musculus


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BIOLOGÍA GENERAL

El ratón doméstico es una especie cosmopolita, comensal del hombre. Se adapta ampliamente

a una gran variedad de condiciones ambientales, desde zonas muy frías hasta regiones

tropicales. En general las especies prefieren lugares más secos que húmedos.

Es de hábitos nocturnos. Posee un agudo sentido de la audición, y responde a un amplio rango

de secuencias ultrasónicas, por ejemplo cuando la hembra sale del nido sus crías emiten

sonidos ultrasónicos que inmediatamente son percibidos por la madre.

RATA ORIGEN

La rata de laboratorio es la variedad doméstica de la rata noruega marrón, la cual se encuentra

en climas fríos, templados y subtropicales de Europa y Norteamérica. En la actualidad es una

especie cosmopolita.

TAXONOMÍA

Clase: Mamífera

Orden: Rodentia

Familia: Muridae

Género: Rattus

Especie: norvegicus

Biologia General

La rata es un animal con una alta adaptabilidad, al igual que el ratón, es capaz de sobrevivir a

una amplia variedad de condiciones climáticas y de hábitats. Puede ser solitaria o vivir en

grandes grupos.

En la naturaleza compite con el hombre por el alimento. El hacinamiento combinado con la

escasez de alimento puede llevarlas a competir entre ellas sucumbiendo las más débiles.

En el laboratorio, el canibalismo se evita alimentándolas ad-libitum.

Eutanasia Bajo dicho término entendemos el sacrificio deliberado de un animal, siguiendo una técnica

indolora, rápida, que permita un tránsito tranquilo desde la plena conciencia hasta la muerte.

Entre los métodos más empleados se encuentra la administración intraperitoneal,

endovenosa, e intracardíaca de una sobredosis de un anestésico inyectable. Se calcula una

dosis 3 a 4 veces mayor que la normal.

Otro método de eutanasia se realiza mediante la dislocación cervical, sólo para un pequeño

número de animales.

Uno de los métodos más recomendados es el CO2. Para esto se debe contar con una cámara

que debe ser suficientemente grande como para permitir el ingreso de los animales dentro de

sus propias cajas, lo que disminuye el estrés. Los animales deben estar expuestos a este gas

luego de 3 a 5 min del cese de la respiración, los neonatos son resistentes por lo tanto se

requiere de un método alternativo o exponerlos por más de 15 min.

resumen gral micro i

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