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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor

actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y

Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la Universidad

Central del Ecuador.

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de:

Química Farmacéutica

AUTOR: Verónica Estefanía Suquillo Lugmaña

TUTOR: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

DMQ, junio, 2017

iii

Suquillo Lugmaña, Verónica Estefanía (2016). Elaboración de una

forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor

actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum,

Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento de

los libros del Área Histórica de la Universidad Central del

Ecuador. Trabajo de investigación presentado como requisito

previo para la obtención del título de Química Farmacéutica.

Carrera de Química Farmacéutica. Quito: UCE. 81 p.

iv

DEDICATORIA

A Dios y mi madre

v

AGRADECIMIENTO

A Dios, por ser mi apoyo incondicional en todo este tiempo.

A mi madre por su invaluable apoyo y por su confianza en mí.

A mi hermano y su familia porque de una u otra forma estuvieron a mi lado durante esta

etapa de mi vida.

También deseo expresar mi agradecimiento a mi tutora, MSc. Dayana Borja por toda su

ayuda y paciencia.

A mis grandes amigas y amigos, Dianita, David, Paúl, Marcos, Germania, Jairo, Alejandro,

Luis por su amistad y apoyo en la etapa universitaria.

x

Índice de Contenidos

INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1

Capítulo I ................................................................................................................................... 2

1. El problema ............................................................................................................................ 2

1.1. Planteamiento del problema ............................................................................................ 2

1.2. Formulación del problema .............................................................................................. 3

1.3. Objetivos ......................................................................................................................... 3

1.3.1. Objetivo general. ...................................................................................................... 3

1.3.2. Objetivos específicos. ............................................................................................... 3

1.4. Importancia y justificación .............................................................................................. 3

Capítulo II .................................................................................................................................. 5

2. Marco teórico ......................................................................................................................... 5

2.1. Antecedentes de la investigación .................................................................................... 5

2.2. Fundamento teórico ......................................................................................................... 6

2.2.1. Hongos. ..................................................................................................................... 6

2.2.2. Estructura de los hongos filamentosos ..................................................................... 6

2.2.3. Clasificación de los hongos. ..................................................................................... 6

2.2.4. Aspergillus spp. ........................................................................................................ 7

2.2.5. Penicillium spp. ........................................................................................................ 8

2.2.6. Condiciones de crecimiento de los hongos. .............................................................. 8

2.2.7. Los hongos como factores de degradación de documentos bibliográficos. ............. 8

2.2.8. Agentes antifúngicos o antimicóticos. ...................................................................... 9

2.2.9. Aceites esenciales y su actividad antifúngica. .......................................................... 9

2.2.10. Obtención de los aceites esenciales. ....................................................................... 9

2.2.11. Destilación por arrastre de vapor. ......................................................................... 10

2.2.12. Descripción botánica del anís. .............................................................................. 10

2.2.13. Descripción botánica del clavo de olor. ................................................................ 11

2.2.14. Descripción botánica del jengibre. ....................................................................... 11

2.2.15. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ............................................................ 12

2.2.16. Concentración Fungicida Mínima (CFM) ............................................................ 12

2.2.17. Dilución en caldo. ................................................................................................. 12

2.2.18. Formas farmacéuticas ........................................................................................... 12

2.2.19. Emulsiones............................................................................................................ 13

2.2.20. Tipos de emulsiones ............................................................................................. 13

xi

2.2.21. Agentes surfactantes ............................................................................................. 14

2.2.22. Balance Hidrofílico-Lipofílico (BHL) .................................................................. 15

2.2.23. Formulación de emulsiones por el método BHL .................................................. 16

2.3. Fundamento legal. ......................................................................................................... 16

2.4. Hipótesis ........................................................................................................................ 17

2.4.1. Hipótesis alternativa ............................................................................................... 17

2.4.2. Hipótesis nula ......................................................................................................... 17

2.5. Sistema de variables ...................................................................................................... 17

2.5.1. Variables dependientes. .......................................................................................... 18

2.5.2. Variables independientes. ....................................................................................... 18

Capítulo III ............................................................................................................................... 19

3. Metodología de la investigación .......................................................................................... 19

3.1. Diseño de la investigación ............................................................................................ 19

3.2. Metodología .................................................................................................................. 19

3.3. Materiales y reactivos.................................................................................................... 19

3.3.1. Materiales. .............................................................................................................. 19

3.3.2. Equipos. .................................................................................................................. 20

3.3.3. Reactivos. ............................................................................................................... 20

3.4. Procedimientos .............................................................................................................. 21

3.4.1. Extracción de los aceites esenciales. ...................................................................... 21

3.4.2. Activación de las cepas ATCC de hongos.............................................................. 22

3.4.3. Preparación del inóculo. ......................................................................................... 23

3.4.4. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). ............................................................. 25

3.4.5. Concentración Fungicida Mínima (CFM). ............................................................. 26

3.4.6. Formulación de la emulsión ................................................................................... 27

3.4.7. Proceso de manufactura de la emulsión. ................................................................ 27

3.4.8. Proceso de aplicación de la emulsión en los libros. ............................................... 27

3.4.9. Análisis de superficies no planas (libros) por hisopado. ........................................ 28

3.5. Diseño experimental ...................................................................................................... 29

3.5.1. Diseño factorial A x B. ........................................................................................... 29

3.5.2. Etapa 1. ................................................................................................................... 29

3.5.3. Etapa 2. ................................................................................................................... 30

3.6. Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico) ............................................ 32

3.7. Matriz de operacionalización de las variables ............................................................... 32

xii

Capítulo IV............................................................................................................................... 33

4. Análisis y discusión de resultados ....................................................................................... 33

4.1. Extracción de los aceites esenciales .............................................................................. 33

4.1.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Pimpinella

anisum (anís)..................................................................................................................... 33

4.1.2. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Syzygium

aromaticum (clavo de olor). ............................................................................................. 34

4.1.3. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Zingiber

officinale (jengibre). ......................................................................................................... 34

4.1.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales. ........... 34

4.2. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ..................................................................... 35

4.2.1. Preparación del inóculo. ......................................................................................... 35

4.3. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ................................... 36

4.4. Concentración Fungicida Mínima (CFM) ..................................................................... 37

4.5. Manufactura de la forma farmacéutica a base del aceite esencial que presentó la mejor

actividad antifúngica ............................................................................................................ 38

4.5.1. Formulación de la emulsión. .................................................................................. 38

4.6. Condiciones para la aplicación de la emulsión ............................................................. 45

4.7. Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica ...................................................... 45

4.8. Análisis estadístico de la Eficacia de las emulsiones .................................................... 49

Capítulo V ................................................................................................................................ 53

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................................ 53

5.1. Conclusiones ................................................................................................................. 53

5.2. Recomendaciones .......................................................................................................... 55

Bibliografía: ............................................................................................................................. 56

6. ANEXOS ............................................................................................................................. 58

6.1. Anexo 1: Esquema causa - efecto ................................................................................. 58

6.2. Anexo 2: Diagrama de flujo para la extracción de los aceites esenciales ..................... 59

6.3. Anexo 3: Diagrama de flujo para la aplicación de la emulsión en los libros ................ 59

6.4. Anexo 4: Fotografías ..................................................................................................... 60

xiii

Índice de ecuaciones

Ecuación 3.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial ....................... 22

Ecuación 3.2. Número de esporas ........................................................................................... 23

Ecuación 3.3. Número de esporas por mililitro ...................................................................... 24

Ecuación 3.4. Calculo del factor de dilución .......................................................................... 28

Ecuación 3.5. Unidades formadoras de colonia por cm2 ........................................................ 28

Ecuación 3.6. Porcentaje no reducido de unidades formadoras de colonia ............................ 29

Ecuación 3.7. Porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonias ......................... 29

Ecuación 4.1. BHL total .......................................................................................................... 38

xiv

Índice de gráficos

Gráfico 4.1.Contribución de cada factor en la separación de fases ........................................ 41

Gráfico 4.2.Contribución de cada factor en la redispersión de la emulsión ........................... 43

Gráfico 4.3 Influencia de cada factor sobre la separación de las fases y redispersión. .......... 44

Gráfico 4.4. Influencia de cada factor en el porcentaje de reducción de las unidades

formadoras de colonia (ufc) ..................................................................................................... 51

Gráfico 4.5. Comparación del porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonia

(ufc) con cada formulación ...................................................................................................... 52

xv

Índice de ilustraciones

Ilustración 2.1. Estructura de un hongo filamentoso ................................................................ 6

Ilustración 2.2. Morfología de A. fumigatus ............................................................................. 7

Ilustración 2.3. Morfología de Penicillium spp. ....................................................................... 8

Ilustración 2.4. Semillas de anís ............................................................................................. 10

Ilustración 2.5. Clavo de olor ................................................................................................. 11

Ilustración 2.6. Jengibre ......................................................................................................... 11

Ilustración 2.7. Tipos de emulsiones .................................................................................... 13

Ilustración 2.8. Función del agente surfactante ...................................................................... 14

Ilustración 2.9. Estructura de los emulsificantes .................................................................... 15

Ilustración 2.10. Valores de BHL y su función ...................................................................... 15

Ilustración 3.1. Equipo Clevenger .......................................................................................... 22

Ilustración 3.2. Presentación Kwik Stik ................................................................................. 23

Ilustración 3.3. Cámara de Neubauer ..................................................................................... 24

Ilustración 3.4. Recuento de microorganismos en la cámara de Neubauer ............................ 25

Ilustración 3.5. Distribución de la placa de microdilución..................................................... 26

Ilustración 3.6. Concentraciones de los aceites esenciales en cada pocillo de la placa de

microdilución ........................................................................................................................... 26

xvi

Índice de Tablas

Tabla 2.1. Valores de BHL de algunos agentes surfactantes .................................................. 16

Tabla 3.1. Diseño factorial.. .................................................................................................... 30

Tabla 3.2. Tabla de ANOVA para un diseño factorial a x b con n réplicas............................ 32

Tabla 3.3. Matriz de Operacionalización de variables ............................................................ 32

Tabla 4.1. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Pimpinella anisum (anís) ......... 33

Tabla 4.2. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Syzygium aromaticum (clavo de

olor) .......................................................................................................................................... 34

Tabla 4.3. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Zingiber officinale (jengibre) ... 34

Tabla 4.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de cada aceite esencial. ............. 34

Tabla 4.5. Porcentaje de rendimiento en la extracción de los aceites esenciales .................... 35

Tabla 4.6. Número de esporas por mililitro ............................................................................ 36

Tabla 4.7. Concentración Inhibitoria Mínima, expresada en porcentaje v/v .......................... 36

Tabla 4.8. Concentración Inhibitoria Mínima a intervalos más cortos % v/v ........................ 37

Tabla 4.9. Concentración Fungicida Mínima en porcentaje v/v ............................................. 37

Tabla 4.10. Parámetros que se evaluaron en la formulación de las emulsiones. .................... 38

Tabla 4.11. Porcentajes de Tween 80 y Span 60 para obtener 3 valores de BHL diferentes . 39

Tabla 4.12. Formulaciones evaluadas ..................................................................................... 39

Tabla 4.13. Resultados obtenidos al evaluar la redispersión y la separación de fases de las

emulsiones................................................................................................................................ 40

Tabla 4.14. Análisis de Varianza para la separación de fases ................................................. 40

Tabla 4.15. Contribución de cada factor en la separación de fases ........................................ 41

Tabla 4.16. Análisis de varianza para la redispersión ............................................................. 42

Tabla 4.17.Contribución de cada factor en la redispersión ..................................................... 42

Tabla 4.18. Mejores condiciones en las formulaciones analizadas......................................... 44

Tabla 4.19. Números de experimentos con las mejores condiciones ...................................... 44

Tabla 4.20. Emulsión A, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 46

Tabla 4.21. Emulsión A, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 47

Tabla 4.22. Emulsión B, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 47

Tabla 4.23. Emulsión B, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 48

Tabla 4.24. Emulsión C, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 48

xvii

Tabla 4.25. Emulsión C, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 49

Tabla 4.26. Factores y niveles para el análisis de varianza..................................................... 49

Tabla 4.27. Promedio del porcentaje de reducción de ufc en cada tratamiento estadístico .... 50

Tabla 4.28. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades formadoras

de colonia (ufc) ........................................................................................................................ 50

Tabla 4.29. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades formadoras

de colonia (ufc) ........................................................................................................................ 51

xviii


actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y

Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la Universidad

Central del Ecuador.

Autor: Verónica Suquillo

Tutor: MSc. Dayana Borja

RESUMEN

Entre las plagas que amenazan a diario las colecciones de bibliotecas y archivos, los hongos

son los más significativos. Estos microorganismos son perjudiciales para los documentos en

papel ya que provocan extensas manchas, afectan las tintas, degradan del papel ocasionando

pérdida de información. El objetivo de ésta investigación fue, elaborar una forma

farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor actividad antifúngica de entre las

especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento

de los libros del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador.

En primer lugar, se extrajo el aceite esencial de las tres especies vegetales mediante arrastre

de vapor. Luego se identificó la concentración mínima inhibitoria, la concentración mínima

fungicida de cada aceite esencial utilizando el método de dilución en caldo y siembra por

extensión en agar, respectivamente. Con los resultados obtenidos de las pruebas anteriores, se

determinó que el aceite esencial de jengibre (Zingiber officinale) presenta la mejor actividad

antifúngica, con una concentración fungicida mínima de 25% v/v sobre la cepa de Aspergillus

niger y de 30% v/v sobre la cepa de Penicillium chrysogenum.

Posteriormente, con el aceite esencial de jengibre (Zingiber officinale) se elaboraron varias

emulsiones o/w, con las que se estudió el efecto de tres factores: el valor del BHL, porcentaje

de tensoactivo y el tiempo de agitación en la estabilidad de la emulsión. Con las 3 emulsiones

que se obtuvieron los mejores parámetros de estabilidad se realizó la aplicación en los libros

para determinar reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia. El análisis de

los datos se realizó mediante un diseño experimental factorial. Se obtuvieron los mejores

resultados en la reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia con la

formulación A (tiempo de agitación de 5 minutos, concentración de tensoactivo del 5% y un

BHL de 12) y un tiempo de aplicación de 40 segundos por cada zona de aplicación a través

de un aerógrafo.

Palabras claves:

ACEITES ESENCIALES HONGOS DOCUMENTOS BIBLIOGRÁFICOS

xix

Develop a pharmaceutical form with the essential oil that present the best antifungal

activity of between species Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, and Zingiber

officinale for the treatment of the books of the Historical Area of the Central University

of Ecuador.

Author: Verónica Suquillo

Tutor: MSc. Dayana Borja

ABSTRACT

Pests that threaten daily holdings of libraries and archives, fungi are the most significant.

These microorganisms are harmful to paper documents as they cause extensive, affect the

inks, degrade the paper causing loss of information. The objective of this research was to

develop a pharmaceutical form with the essential oil that present the best antifungal activity

of between species Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, and Zingiber officinale for the

treatment of the books of the Historical Area of the Central University of Ecuador.

In the first place, we extracted the essential oil of the three plant species through steam. Then

identified 4the minimum inhibitory concentration, the minimum concentration fungicide of

each essential oil using the broth dilution method and by extension in agar, respectively. With

the results of previous tests, it was determined that the essential oil of ginger (Zingiber

officinale) presents the best antifungal activity, with a minimum fungicide of 25% v/v on the

strain of Aspergillus niger and 30% v/v on the strain of Penicillium chrysogenum.

Subsequently, with the essential oil of ginger (Zingiber officinale) has developed a number of

o/w emulsions, which study the effect of three factors: the value of the BHL, percentage of

surfactant and the time of upheaval in the stability of the emulsion. With the 3 emulsions

obtained the best parameters of stability of the application in the books to determine

percentage reduction in colony forming units. The analysis of the data was conducted by

means of a factorial experimental design. The best results were obtained in the percentage

reduction in colony forming units with the formulation A (time of upheaval of 5 minutes, 5%

surfactant concentration and a BHL of 12) and a time of 40 seconds for each application area

through an airbrush.

Keywords:

ESSENTIAL OILS FUNGUS BIBLIOGRAPHIC DOCUMENTS

1

INTRODUCCIÓN

Gran parte de nuestra historia que constituye el patrimonio cultural está registrado en

documentos o diversos trabajos de arte hechos en papel y al estar expuestos constantemente a

las influencias del medio ambiente, como son las condiciones físicas, químicas y biológicas,

sufren procesos de degradación. Entre los más comunes que afectan a los documentos

bibliográficos se encuentran los factores biológicos, por ejemplo, los hongos. Por éste motivo

es importante la conservación y preservación de los documentos.

En la búsqueda de nuevos productos y métodos que sean efectivos en la conservación

documental, se han tomado en cuenta a los aceites esenciales, que desde la antigüedad han

sido reconocidos por tener actividades biológicas.

La investigación se llevará a cabo con los documentos bibliográficos del Área Histórica de la

Universidad Central del Ecuador que actualmente cuenta con un área de cuarentena en la cual

se encuentran 190 libros contaminados con hongos.

En el presente trabajo de investigación en el capítulo I se describe el planteamiento y

formulación del problema, el objetivo planteado fue “Elaborar una forma farmacéutica con el

aceite esencial que presente la mejor actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella

anisum, Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área

Histórica de la Universidad Central del Ecuador”, además se especifica la importancia y

justificación para el desarrollo de la investigación.

Todo lo referente a los antecedentes investigativos, marco teórico y legal que sustentan el

desarrollo de la investigación, las hipótesis planteadas y el sistema de variables, se

encuentran detalladas en el capítulo II. En cuanto a la metodología de la investigación, que

incluye el diseño de la investigación, métodos y materiales, el diseño experimental junto con

el análisis estadístico que se utilizó se encuentra explicado en el capítulo III. El análisis y

discusión de los resultados se explica en el capítulo IV. Finalmente, las conclusiones y

recomendaciones se describen en el capítulo V.

2

Capítulo I

1. El problema

1.1. Planteamiento del problema

Las bibliotecas clásicas, principalmente las antiguas y con obras incunables son depósitos

de una gran riqueza de colecciones organizadas de libros, publicaciones impresas en

papel y otros tipos de documentos gráficos, con un gran significado cultural e histórico

para un determinado pueblo o nación, y que varias obras no se encuentran en otro lugar

del mundo. Constituyendo escenarios de importancia que proporcionan herramientas

para conocer e interpretar de mejor manera el desarrollo de nuestro entorno social al

considerar a los libros como vínculos de la cultura.

La conservación de los libros y documentos en general, ha sido el punto que se le ha

prestado la menor atención a lo largo de los años y ahora está tomando fuerza. Debido al

uso, el tiempo y las condiciones desfavorables de almacenamiento que han estado

sometidos, los documentos patrimoniales han envejecido y sufrido deterioro en sus

estructuras a lo largo de su vida útil en beneficio de la sociedad.

Por los motivos antes descritos, en la actualidad se están implementando actividades de

conservación y restauración documental, ya que los principales problemas que se han

presentado en los libros, son los agentes fúngicos, que causan daños importantes como

manchas obscuras y hojas quebradizas, ocasionando la pérdida de la información.

En el Área Histórica del Centro de Información Integral de la Universidad Central del

Ecuador se encuentra un repositorio bibliográfico de alrededor 40000 libros, los mismos

que formaban parte del fondo de la Biblioteca General y de las diferentes redes de

bibliotecas que constituyen parte del Campus Universitario. Estos bienes documentales y

bibliográficos están comprendidos entre los años 1845 y 1960, abarcando un período de

once décadas. Algunos de los ejemplares se encuentran afectados principalmente con

Penicillium y Aspergillus, hongos potencialmente patógenos que además de causar

problemas con los libros, también son un peligro potencial para las personas que trabajan

en el Área Histórica en las actividades de conservación y restauración documental.

.

3

1.2. Formulación del problema

Debido a la problemática generada por la contaminación de los documentos

bibliográficos del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador, con hongos,

principalmente Aspergillus spp., Penicillium spp. y a la búsqueda de nuevas alternativas

de control de la contaminación. Se plantea la siguiente interrogante:

¿El uso de una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor

actividad antifúngica, podrá eliminar los hongos presentes en los libros del Área Histórica

de la Universidad Central del Ecuador?

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo general.

Elaborar una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor actividad

antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y

Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la

Universidad Central del Ecuador.

1.3.2. Objetivos específicos.

Extraer el aceite esencial de las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y

Zingiber officinale por arrastre de vapor.

Determinar la concentración mínima inhibitoria (CIM) de los aceites esenciales de

tres especies vegetales Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum y Zingiber officinale

frente a los hongos, Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.

Determinar la concentración mínima fungicida (CFM) de los aceites esenciales de tres

especies vegetales, Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum y Zingiber officinale

frente a las cepas Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.

Elegir el aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica para la elaboración

de una forma farmacéutica.

Evaluar la eficacia de la forma farmacéutica en el tratamiento de los libros

contaminados con hongos.

1.4. Importancia y justificación

A lo largo de la historia el ser humano ha utilizado la escritura en papel para manifestar

los conocimientos adquiridos sobre la realidad y sus vivencias, como constancia para la

posteridad. Para el caso del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador estos

documentos bibliográficos están citados desde la expulsión de los jesuitas a mediados del

siglo XVIII.

4

Por lo tanto, los documentos bibliográficos son la evidencia de la historia, por lo que es

importante la conservación, entre las actividades que podemos describir se encuentran:

proteger de contaminantes ambientales, fluctuaciones tanto en temperatura y humedad,

evitar la proliferación de hongos que son los principales agentes contaminantes de los

libros.

Los métodos tradicionalmente utilizados, presentan algunos inconvenientes, como son, el

elevado costo de los agentes antifúngicos, uso de solventes tóxicos que representan un

riesgo potencial para la salud del personal que realizan las actividades de conservación y

restauración documental.

Por la elevada contaminación que presentan los documentos del Área Histórica,

principalmente con hongos, además el uso de métodos y técnicas con escasos resultados

positivos, confiere importancia a ésta investigación, que busca reducir o eliminar la

contaminación por hongos en los documentos bibliográficos. Además, el presente estudio

se enfoca en la utilización de productos naturales, como son los aceites esenciales,

productos amigables con el medio ambiente, y que representan un bajo riesgo de

toxicidad para el personal que labora en el Área Histórica de la Universidad Central del

Ecuador.

5

Capítulo II

2. Marco teórico

2.1. Antecedentes de la investigación

El trabajo titulado: Formulación de una solución antifúngica para el tratamiento de libros

del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador. Realizado por David Campués,

es el primer trabajo realizado en el campo de la restauración documental en la

Universidad Central del Ecuador. En esta investigación se identificó a los géneros

Aspergillus spp y Penicillium spp como los principales contaminantes de los documentos

bibliográficos; además se elaboró una solución utilizando fluconazol y una mezcla de tres

solventes en diferentes proporciones metanol: etanol: agua. (Campues, 2016)

Existen artículos científicos relacionados al presente tema, como se cita a continuación:

El trabajo titulado: Essential Oils of Plants as Biocides against Microorganisms Isolated

from Cuban and Argentine Documentary Heritage (Aceites esenciales de plantas como

biocidas contra microorganismos aislados del Patrimonio Documental de Cuba y

Argentina). Realizado por: Sofia Borrego y colaboradores. Publicado el 23 agosto de

2012. En este trabajo se obtuvieron los siguientes resultados:

Los aceites esenciales de anís y ajo mostraron la mejor actividad antifúngica en

todas las concentraciones estudiadas, mientras que el aceite de orégano logró prevenir

la esporulación.

Los aceites esenciales de naranja dulce y laurel tuvieron una actividad negativa contra

las cepas fúngicas. (Borrego, 2012)

La investigación titulada: Antifungals on paper conservation (Antifúngicos para la

conservación del papel). Realizado por: S. Sequeira y colaboradores. Publicado el 14 de

agosto de 2012. Realizado en el Departamento de Conservación y Restauración,

Universidad de Nova de Lisboa, Portugal. En esta investigación se llegaron a las

siguientes conclusiones:

Se encontró que la eficacia de un compuesto o método antifúngico puede cambiar con

varios factores, por ejemplo, su mecanismo de acción, la concentración o intensidad

utilizada, y el período de contacto o acción.

La susceptibilidad de los hongos a un compuesto antifúngico en particular o método

puede depender de la cepa fúngica, su etapa de desarrollo, o si es o no parte de una

biopelícula.

En relación con los compuestos químicos antifúngico (fungistáticos o fungicidas), el

propionato de calcio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico (parabenos) y etanol, son los

que combinan menores efectos secundarios para la salud y un menor impacto negativo

en las propiedades del papel. (Sequeira, 2012)

6

2.2. Fundamento teórico

2.2.1. Hongos.

Son un grupo muy diverso de seres vivos, diferentes de las plantas y de los animales.

Pertenecen al reino Fungi. Son organismos eucariotas, heterótrofos, pueden ser

unicelulares o pluricelulares. (Casal, 2012). Su membrana citoplasmática está

constituida por proteínas y esteroles, principalmente el ergosterol. Por el exterior de la

membrana citoplasmática se encuentra la pared celular que contiene polisacáridos y

proteínas. Los polisacáridos más importantes son la quitina, el manano y el glucano.

(Aristegui, 2002).

2.2.2. Estructura de los hongos filamentosos

Son hongos formados por filamentos llamados hifas, el conjunto de las cuales forman

el micelio. Las hifas aéreas constituyen el micelio aéreo y forman las esporas. Las

hifas subterráneas originan el micelio subterráneo, que es el encargado de la nutrición.

Las esporas pueden ser pigmentadas y le dan el color al hongo. En el centro de la

colonia se ubican las hifas fértiles que dan origen a las esporas. (Sánchez, 2014)

Ilustración 2.1. Estructura de un hongo filamentoso (Sánchez, 2014)

2.2.3. Clasificación de los hongos.

Los hongos presentan los siguientes estados morfológicos:

Levaduras: Son unicelulares, redondos o elipsoides. Se reproducen por gemación o

fisión binaria. Dan lugar a colonias lisas. Ejemplo: Saccharomyces cerevisiae.

(Aristegui, 2002)

Mohos: También llamados filamentosos, micelares. Son multicelulares. La hifa es el

elemento tubular que emerge, el cual crece y se ramifica, formando un conjunto,

denominado micelio. Parte de las hifas se introducen en el sustrato para obtener

7

nutrientes, formando el micelio vegetativo; las hifas que se proyectan hacia el exterior

constituyen el micelio aéreo, donde se produce los elementos de propagación que

pueden ser esporas, conidios, etc. Producen colonias algodonosas o pulverulentas.

Ejemplo: Penicillium, Aspergillus. (Uribarren, 2015)

Setas: Son basidiomicetos filamentosos que forman cuerpos fructíferos, que

constituyen la parte comestible llamada seta. Durante la mayor parte de su existencia

viven en forma de micelio creciendo en el suelo, en los desechos de las hojas y los

troncos. Cuando las condiciones del medio son favorables, principalmente en períodos

húmedos y fríos, se desarrolla primero como un pequeño botón y luego como seta

madura. (Madigan, 2008)

Algunos hongos presentan dimorfismo, ya que tienen la capacidad de adoptar la forma de

levadura o producir la forma filamentosa, según ciertas condiciones ambientales o de

nutrientes. Uno de los factores ambientales más importantes para el crecimiento de una u

otra forma es la temperatura, a 25-28 °C crecen en forma de hongos filamentosos y a 35-

37 °C crecen en forma de levaduras. Ejemplos: Histoplasma capsulatum,

Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis. (Giusiano, 2012)

2.2.4. Aspergillus spp.

Pertenece al filo Ascomycota. Es un hongo filamentoso, saprofito que se encuentra en

el suelo, restos vegetales y el aire ambiental. Está formado por hifas hialinas septadas

y puede tener reproducción sexual (con formación de ascosporas) y asexual (con

formación de conidios).

Existen características para cada especie, entre las que podemos nombrar el tamaño,

textura que puede ser aterciopelada, granular y algodonosa; tasa de crecimiento y

color de la colonia, por ejemplo, verde-amarillento en A. flavus, negro para A. niger,

marrón para A. terreus. La coloración aparece en todas las estructuras aéreas.

(Higiene, 2012)

Macroscópico Microscópico

Ilustración 2.2. Morfología de A. fumigatus (Mendez, 2015)

8

2.2.5. Penicillium spp.

Son hongos filamentosos, que se encuentran en suelo, en el aire. La mayoría de

especies son considerados contaminantes. Su reproducción es asexual y sexual.

Las colonias pueden ser blancas, aplanadas, de superficie lisa y aterciopelada, cuando

esporula su centro es de color verde. Con el tiempo la superficie de las colonias se

torna radiada. (Higiene, 2012)

2.2.6. Condiciones de crecimiento de los hongos.

Temperatura: El rango de crecimiento óptimo es de 20 °C a 30 °C, aunque algunos

hongos crecen entre 0 °C a 35 °C.

Humedad: El rango de crecimiento óptimo es de 70% a 93% de humedad relativa.

Sin embargo, una humedad superior al 40% permite la germinación y el crecimiento.

Oxígeno: Son organismos aeróbicos, que requieren oxígeno para el crecimiento.

Luz: No es necesaria. El crecimiento del hongo puede continuar indefinidamente sin

luz. (Peart, 2001).

2.2.7. Los hongos como factores de degradación de documentos bibliográficos.

Los hongos se reproducen por esporulación. Para su desarrollo, necesitan de

materiales orgánicos tales como papel, cuero, fibras naturales, debido a que se

alimentan de la glucosa obtenida por la alteración de la molécula de celulosa. (Arce,

2000)

Macroscópico Microscópico

Ilustración 2.3. Morfología de Penicillium spp. (Mendez, 2015)

9

La presencia de hongos es notoria debido a que provocan perforaciones, moteado o

foxing y pigmentaciones amarillentas. Se han identificado más de 200 especies de

hongos que afectan a los archivos y bibliotecas, entre los más conocidos están:

Aspergillus y el Penicillium que producen manchas redondas de coloración amarilla o

pardo obscura que se extienden y contagian los archivos. (Briand, 2011)

2.2.8. Agentes antifúngicos o antimicóticos.

Engloba a las sustancias que son capaces de producir una alteración en las estructuras

de un hongo o célula fúngica, alterar su capacidad de supervivencia o viabilidad, que

consiga inhibir su desarrollo de forma directa o indirecta. (Gregori, 2005)

2.2.9. Aceites esenciales y su actividad antifúngica.

Los productos de origen vegetal han sido estudiados en su parte química, con énfasis

en los metabolitos secundarios, los cuales están implicados en el control biológico

contra patógenos o plagas.

Los aceites esenciales son la principal fuente natural de monoterpenos, encontrándose

también en menor cantidad otros terpenos como sesquiterpenos, diterpenos y

compuestos fenólicos como fenilpropenoides. Su efecto antimicrobiano y antifúngico

es atribuido a la presencia de monoterpenos y compuestos fenólicos que los

componen. (Lizcano, 2007)

Los aceites esenciales se componen principalmente de terpenoides, que son

hidrocarburos aromáticos cíclicos, debido a su carácter hidrófobo se acumulan en la

bicapa lipídica de la membrana celular de los microorganismos de acuerdo con un

coeficiente de partición que es específico para cada compuesto. Esta acumulación

conduce a la alteración de la estructura y función de la membrana, es decir, ejercer

efectos negativos sobre la fuerza motriz de los protones. (Borrego, 2012)

2.2.10. Obtención de los aceites esenciales.

Los aceites esenciales fueron extraídos a partir del material vegetal fresco, mediante

destilación por arrastre con vapor de agua, en un aparato tipo clevenger durante 3h.

Posteriormente, los aceites obtenidos fueron separados del agua mediante un embudo

de separación y fueron almacenados en oscuridad a 8ºC. (Dambolena, 2011).

Los aceites esenciales de las tres especies vegetales fueron obtenidos mediante

arrastre de vapor para evitar el consumo de solventes orgánicos y mantener el enfoque

de la investigación en productos amigables con el medio ambiente.

10

2.2.11. Destilación por arrastre de vapor.

Se lleva a cabo con la vaporización selectiva del componente volátil que se encuentra

en una mezcla. Se logra a través de la inyección de vapor de agua directamente en la

mezcla, denominándose, vapor de arrastre. En realidad, el componente volátil se

condensa en el matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la

mezcla a destilar para lograr su evaporación.

La condición más importante en este tipo de destilación es que el componente volátil

sea insoluble en agua ya que el producto destilado formará dos capas al condensarse

(orgánica y acuosa), lo cual permitirá la separación del producto y del agua

fácilmente. (Neumayer, 2004)

2.2.12. Descripción botánica del anís.

Ilustración 2.4. Semillas de anís (Shojaii, 2012)

Nombre científico: Pimpinella anisum

Nombre vulgar: Anís, anís verde

Familia botánica: Apiaceae.

Origen: Mediterráneo

Características del fruto: Los frutos son de color gris verdoso o verde

amarillento, ovoides y oblongos, con pelos cortos, sedosos y curvados sobre su

cara dorsal convexa.

Propiedades medicinales: Las semillas o frutos de anís se utilizan principalmente

para tratar malestares digestivos (indigestión, gases); son también la materia prima

para la obtención del aceite esencial.

Principios activos: En el aceite esencial se encuentra el anetol, estragol,

limoneno, timol, eugenol, terpenos, flavonoides. (Shojaii, 2012)

https://es.wikipedia.org/wiki/Evaporaci%C3%B3n_%28f%C3%ADsica%29

11

2.2.13. Descripción botánica del clavo de olor.

Ilustración 2.5. Clavo de olor (Aguilar, 2012)

Nombre científico: Syzygium aromaticum, Eugenia caryophyllata

Nombre vulgar: Clavo de olor

Familia botánica: Myrtaceae

Origen: Indonesia

Características del fruto: Los clavos de olor, son los capullos sin abrir

Propiedades medicinales: En trastornos digestivos y diarrea. Posee muy variados

efectos dentro de las que destacan el antiséptico, analgésico, antibacteriano,

antifúngico, anestésico, como diurético. En odontología como antiséptico.

Principios activos: El aceite esencial es rico principalmente en eugenol,

cariofileno y acetato de eugenilo. (Aguilar, 2012)

2.2.14. Descripción botánica del jengibre.

Ilustración 2.6. Jengibre (Ceballos, 2016)

Nombre científico: Zingiber officinale

Nombre vulgar: Jengibre, Gengibre

Familia botánica: Zingiberaceae.

Origen: De las zonas tropicales del sureste asiático

12

Características de la raíz o rizoma: Forma nudosa, dura, de dos centímetros de

diámetro.

Propiedades medicinales: Ayuda a aliviar la sensación de mareo, náuseas y

vómitos para tratar el mal del viajero. Es expectorante, antitusiva, laxante e

hipoglucemiante. También se utiliza como antiséptica, antiinflamatoria y

analgésica. Reduce los niveles de colesterol.

Principios activos: En el aceite esencial se encuentra principalmente el

zingibereno, en un 60% del total del aceite y resinas que son responsable de su

sabor picante y amargo debido al gingerol, shogaol y zingerona. (Ceballos, 2016)

2.2.15. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

Es la concentración más baja que inhibe el crecimiento fúngico en un período

determinado de tiempo.

2.2.16. Concentración Fungicida Mínima (CFM)

Es la concentración que ha inhibido como mínimo el 99.99% del crecimiento fúngico.

2.2.17. Dilución en caldo.

Es una técnica en la cual se realizan diluciones seriadas del antifúngico en un medio

líquido el cual se inocula con un número estandarizado de microorganismos y se

incuba durante un periodo de tiempo determinado. Mediante ésta técnica se determina

la concentración inhibitoria mínima. (Rodriguez, 2012)

2.2.18. Formas farmacéuticas

Las formas farmacéuticas son preparados que se elaboran con uno o más principios

activos y excipientes (materia farmacológicamente inactiva) para constituir un

medicamento.

Existen tres tipos de formas farmacéuticas:

Sólidas:

Polvos, comprimidos, tabletas, supositorios, óvulos.

Semi-sólidas:

Pomadas, pastas, cremas, geles.

Líquidas:

Soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, lociones. (Aulton, 2004)

13

2.2.19. Emulsiones

Es un sistema de dos fases, constituido por la combinación de dos líquidos

inmiscibles, donde un líquido es dispersado uniformemente en otro líquido en forma

de pequeñas gotas, el líquido dispersado se llama fase discontinua o interna. Y el otro

líquido es el medio de dispersión, fase externa o fase continua. La mayoría de

emulsiones incorpora una fase acuosa dentro de una fase no acuosa, o viceversa. Para

estabilizar la emulsión se requiere de un componente denominado, agente

emulsificante o tensoactivo. (Remington, 2001)

Un requisito esencial para la formación y estabilidad de las emulsiones es obtener una

tensión de superficie de contacto baja.

Los surfactantes no iónicos se usan para fabricar emulsiones estables y tienen la

ventaja de que son menos sensibles a los electrolitos, a los cambios de pH, y menos

tóxicos. Estos emulsificantes no poseen carga, por lo que ninguna fuerza de repulsión

eléctrica contribuye a la estabilidad. (Aulton, 2004)

2.2.20. Tipos de emulsiones

Emulsión aceite en agua: Cuando una sustancia oleosa es dispersada en una fase

acuosa, el sistema se denomina (O/W).

Emulsión agua en aceite: Cuando el agua o una solución acuosa es dispersado en

un material oleoso, el sistema se llama (W/O).

Se puede mencionar en términos generes que el predominio de las características

polares o no polares del agente emulsificante, lo cual es función de la solubilidad

relativa del agente emulsificante (la fase en la cual el emulsificante es más soluble)

será la fase continua, es lo que contribuye al tipo de emulsión que se forma. Además,

la fase presente en mayor cantidad se convierte finalmente en la fase continua. (Oliva,

2012)

Ilustración 2.7. Tipos de emulsiones (Aulton, 2004)

14

2.2.21. Agentes surfactantes

Ciertos compuesto, debido a su estructura química, tienden a acumularse en el límite

entre dos fases, son los compuestos anfifílicos o surfactantes.

• La adsorción de esta substancia en sólidos, líquidos o gases, cambia la naturaleza de

la interface, lo cual tiene considerable importancia.

• Posibilitan la formación de una emulsión, disminuyendo la tensión interfacial entre la

fase acuosa y oleosa. (Remington, 2001)

Ilustración 2.8. Función del agente surfactante (Oliva, 2012)

Características de los agentes surfactantes:

Tienen dos regiones de distinta estructura química:

• Hidrofílica

• Hidrofóbica

Son moléculas anfipáticas

Las porciones hidrofóbicas son usualmente:

• Cadenas hidrocarbonadas saturadas

• Cadenas hicrocarbonadas no saturadas

• Anillos heterocíclicos

• Anillos aromáticos

Las porciones hidrofílicas pueden ser:

• Aniónicas

• Catiónicas

• No iónicas (Aulton, 2004)

15

2.2.22. Balance Hidrofílico-Lipofílico (BHL)

En este sistema, un número HLB se asigna a un surfactante dependiendo de su

polaridad relativa. El concepto BHL se basa en un método experimental que consiste

en atribuir un cierto número BHL a los agentes emulsionantes a partir de datos

relativos a la estabilidad de una emulsión.

El hecho de que las películas interfaciales hidrofílicas favorezcan las emulsiones

O/W; y las películas no polares favorezcan las emulsiones W/O, hace posible el

sistema HLB.

Por medio de este número se establece un rango de eficiencia para cada surfactante:

(Aulton, 2004)

Ilustración 2.10. Valores de BHL y su función (Aulton, 2004)

Ilustración 2.9. Estructura de los emulsificantes (Remington, 2001)

16

• Altos números de HLB (máximo teórico de 20) indican que el surfactante exhibe

principalmente características hidrofílicas o polares.

• Bajos números de HLB significa que el en el surfactante predominan las propiedades

lipofílicas o no polares. (Aulton, 2004)

Tabla 2.1. Valores de BHL de algunos agentes surfactantes

(Oliva, 2012)

2.2.23. Formulación de emulsiones por el método BHL

En la práctica es necesario preparar una serie de emulsiones usando una mezcla de un

par dado de emulgentes no iónicos que cubran un amplio rango de valores HLB.

El valor HLB de la mezcla emulgente que genere la emulsión más estable es el

valor requerido para esa fase oleosa.

La estabilidad de la emulsión puede evaluarse por observación de la separación de

fases luego de la centrifugación. (Remington, 2001)

2.3. Fundamento legal.

Constitución de la República del Ecuador

Expedida por la Asamblea Constituyente-Montecristi 2008

Publicada: Registro Oficial No. 440

Fecha de publicación 20-oct-2008

Artículo 379.- Son parte del patrimonio cultural tangible e intangible relevante para la

memoria e identidad de las personas y colectivos, y objeto de salvaguarda del Estado,

17

entre otros: …3. Los documentos, objetos, colecciones, archivos, bibliotecas y museos

que tengan valor histórico, artístico, arqueológico, etnográfico o paleontológico.

Objetivos del plan nacional del buen vivir

Objetivo 8.5.- Prevé para el fortalecimiento de la identidad nacional y de su

diversidad, como país plurinacional e intercultural, la promoción y el apoyo a los “…

procesos de preservación, valoración, fortalecimiento, control y difusión de la

memoria colectiva e individual y del patrimonio cultural y natural del país, en toda su

riqueza y diversidad”, para lo cual la meta trazada es la de “aumentar al 30% los

bienes patrimoniales con acceso a la ciudadanía al 2013.

Ley de patrimonio cultural. Registro Oficial Suplemento 465 de 19 de noviembre

de 2004

Art 7.- Declárense bienes pertenecientes al Patrimonio Cultural del Estados, los

comprendidos en las siguientes categorías: c) Los manuscritos antiguos e incunables,

ediciones raras de libros, mapas y otros documentos importantes.

2.4. Hipótesis

2.4.1. Hipótesis alternativa:

Una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor actividad

antifúngica, puede constituirse como una alternativa para el tratamiento de

contaminaciones fúngicas presentes en los documentos bibliográficos.

2.4.2. Hipótesis nula:

Una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor actividad

antifúngica, no pueden constituirse como una alternativa para el tratamiento de

contaminaciones fúngicas presentes en los documentos bibliográficos.

2.5. Sistema de variables

El presente proyecto de investigación consta de dos etapas:

ETAPA 1:

Evaluación de la actividad antifúngica de los aceites esenciales de tres especies vegetales,

anís (Pimpinella anisum), clavo de olor (Syzygium aromaticum) y jengibre (Zingiber

officinale), frente a los hongos Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum; y elección

del aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica frente a las cepas de hongos

evaluadas.

18

2.5.1. Variables dependientes.

Efecto antifúngico sobre las cepas de hongos.

2.5.2. Variables independientes.

El tipo de aceite esencial.

La concentración de los aceites esenciales.

ETAPA 2:


actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los documentos

bibliográficos contaminados con hongos.

2.5.3. Variables dependientes.

Reducción Porcentual de las unidades formadoras de colonias (Porcentaje de

Eficiencia).

2.5.4. Variables independientes.

Formulaciones.

Tiempo de aplicación.

19

Capítulo III

3. Metodología de la investigación

3.1. Diseño de la investigación

En el presente trabajo investigativo se hará referencia a un enfoque científico

experimental conocido como paradigma cuantitativo o positivista. Porque representa un

conjunto de procesos que son secuenciales. Las hipótesis y las variables se establecen de

las preguntas de la investigación; se establece un diseño para probarlas; se miden las

variables; y analizan las mediciones obtenidas utilizando métodos estadísticos, para

establecer una serie de conclusiones respecto de las hipótesis.

El nivel de investigación definido será el nivel correlacional, ya que la finalidad es

conocer la relación o asociación que existe entre dos o más variables en un problema en

particular y miden cada una de las variables, cuantifican y analizan la relación.

Los tipos de investigación que se utilizaron fueron:

Investigación bibliográfica o documental: que estudia los problemas con el propósito

de profundizar y ampliar el conocimiento sobre un tema en particular con el apoyo de

trabajos previos e información de medios electrónicos o impresos.

Investigación de laboratorio: se desarrolla en un lugar que puede controlar las variables

de forma artificial. (Sampieri, 2010).

3.2. Metodología

El trabajo de investigación está dividido en dos etapas:

Etapa 1: Evaluación de la actividad antifúngica de los aceites esenciales de tres especies

vegetales, anís (Pimpinella anisum), clavo de olor (Syzygium aromaticum) y jengibre

(Zingiber officinale), frente a los hongos Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum; y

elección del aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica frente a las cepas de

hongos evaluadas.

Etapa 2: Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la

mejor actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los

documentos bibliográficos contaminados con hongos.

3.3. Materiales y reactivos

3.3.1. Materiales.

Vasos de precipitación de 250, 100 ml.

Matraces erlenmeyer de 1000, 500, 250, 150 ml.

20

Pipeta graduada de 10, 5, 1 ml.

Papel aluminio.

Probeta de 100 ml.

Cajas petri de vidrio.

Tubos de ensayo pequeños y grandes.

Mechero bunsen.

Gradillas.

Micropipetas de 200, 100, 50, 20 μL.

Soportes universales.

Frascos ámbar de 50 ml.

Pera de succión.

Papel empaque.

Asa de digralsky.

Placas de microdilución.

Hisopos estériles.

Para la extracción de los aceites esenciales

Semillas de anís.

Botones sin abrir de clavo de olor.

Rizomas de jengibre.

Material Biológico:

Cepa ATCC de Aspergillus niger (10106).

Cepa ATCC de Penicillium chrysogenum (16888).

3.3.2. Equipos.

Balanza analítica.

Equipo clevenger.

Incubadora microbiológica.

Cabina de flujo laminar.

Autoclave.

Cocinetas.

Vórtex.

3.3.3. Reactivos.

Etanol 96% .

Alcohol Antiséptico.

Agua destilada.

Medios de cultivo para hongos:

o Sabouraud dextrosa agar.

o Sabouraud dextrosa caldo.

https://www.google.com.ec/search?q=asa+de+digralsky&sa=X&biw=1366&bih=657&tbm=isch&tbo=u&source=univ&ved=0ahUKEwjI-tCekfnPAhUHFz4KHVhfASAQsAQIGQ

21

3.4. Procedimientos

3.4.1. Extracción de los aceites esenciales.

Se utilizó como materia prima las semillas de anís (Pimpinella anisum), botones sin

abrir de clavo de olor (Syzygium aromaticum) y rizomas de jengibre (Zingiber

officinale), adquiridos en el mercado de la ciudad de Sangolquí.

El material vegetal no se secó para su extracción, y se sometió al siguiente proceso:

Se eliminó cuidadosamente y de forma manual materias extrañas en el caso del anís y

clavo de olor, mientras que en los rizomas de jengibre se eliminó la tierra adherida y

las raíces utilizando un cuchillo de acero inoxidable.

Se lavó el material vegetal utilizando un colador y mediante un flujo continuo de agua

potable a temperatura ambiente para eliminar los vestigios de polvo o tierra.

Se desinfectó las muestras vegetales con alcohol al 70%.

Luego se deja escurrir el exceso de agua por 15 minutos.

Se pesó por separado cada material vegetal como se detalla en la tabla 4.1, 4.2, 4.3.

Se disminuyó el tamaño de partícula del material vegetal fresco, previo al proceso de

extracción, se trituró ligeramente el anís y el clavo de olor, respectivamente,

utilizando un mortero y un pistón de porcelana; en el caso de los rizomas de jengibre

se fragmentó utilizando una licuadora.

Se colocó 4 núcleos de ebullición junto con 400 ml agua destilada y el material

vegetal correspondiente en un balón de 1 litro.

Se armó el equipo clevenger como se ilustra en la ilustración 3.1.

Se procedió a extraer el aceite esencial por arrastre de vapor con el equipo clevenger

durante 3 horas, cuando se mantiene constante el volumen de aceite esencial, se llega

al punto final de la extracción.

Posteriormente se separó el aceite esencial del agua en un embudo de separación, por

la diferencia de densidades fue posible separar la mayor parte del agua. El agua

remanente se separó mediante congelación, para lo que se utilizó un congelador

doméstico.

Finalmente, el aceite esencial obtenido de cada material vegetal se almacenó a 8°C en

frascos color ámbar con tapa rosca.

22

Ilustración 3.1. Equipo Clevenger (Aguilar, 2012)

Se determinó el porcentaje de rendimiento (%R) mediante la ecuación 3.1. Se tomó en

cuenta el volumen de aceite esencial extraído hasta agotamiento de la muestra y se

relacionó con la cantidad de muestra vegetal inicial.

Ecuación 3.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial.

%𝑅 =𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100

3.4.2. Activación de las cepas ATCC de hongos.

Preparación del medio de cultivo SAB (Sabourand dextrosa agar).

o Se pesó 65 g de del medio de cultivo.

o Se dispersó en 1 litro de agua destilada.

o Se calentó en una plancha de calentamiento hasta su total disolución.

o Se esterilizó en autoclave. (121 ºC, 20 minutos).

o Se distribuyó el medio de cultivo en cajas Petri a una temperatura

aproximadamente de 45ºC.

Se utilizaron cepas ATCC en la presentación Kwik Stik.

Se colocó durante 1 hora las cepas a temperatura ambiente.

Se presionó en la parte superior del dispositivo Kwik Stik de tal manera que se rompa

la ampolla que contiene el líquido de hidratación y el pellet que contiene los hongos

se hidrate.

Se homogenizó.

Se sembró cada cepa por hisopado en cajas petri que contenían sabourand dextrosa

agar.

23

Ilustración 3.2. Presentación Kwik Stik (Casal, 2012)

3.4.3. Preparación del inóculo.

El inóculo se preparó a partir de un cultivo de 7 días de crecimiento a 35 ºC en

sabourand dextrosa agar.

Se introdujo el asa de cultivo en Tween 20 y se pasó por la superficie del hongo,

después se suspendió en solución salina previamente esterilizada.

Se dejó sedimentar las partículas durante 3-5 minutos, luego se transferió el

sobrenadante a otro tubo de ensayo con solución salina estéril y se agitó

vigorosamente durante 15 segundos.

Las esporas de los hongos fueron cuantificadas mediante recuento en la cámara de

neubauer, para lo cual se colocó 20 uL de la solución de esporas en la rejilla de la

cámara. Luego se observó en el microscopio con el objetivo 40x examinando los

diferentes campos.

De la zona central se escogieron 5 cuadrantes, se contabilizó el número de esporas

utilizando un orden de conteo en forma de zigzag. Existe una convención por la cual,

si las esporas tocan el límite superior o el límite izquierdo del cuadro, deben

contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el límite inferior o el límite derecho.

(Bastidas, 2014)

Se aplicó la ecuación 3.2 para determinar el número de esporas por mililitro.

Ecuación 3.2. Número de esporas

⋕ 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠

𝑚𝑙=

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒

De esta forma se determinó el volumen de cada cuadrante de la zona central en el que

se realizó el conteo del número de esporas:

24

Á𝑟𝑒𝑎 = 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑙𝑎𝑑𝑜 1 ∗ 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑙𝑎𝑑𝑜 2

Á𝑟𝑒𝑎 = 0,2 𝑚𝑚 ∗ 0,2𝑚𝑚

Á𝑟𝑒𝑎 = 0,04 𝑚𝑚2

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = Á𝑟𝑒𝑎 ∗ 𝑃𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 0,04 𝑚𝑚2 ∗ 0,1 𝑚𝑚

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 4𝑥10−3 𝑚𝑚3

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 4𝑥10−6 𝑚𝑙

Por lo tanto, la ecuación 3.2 se expresa de la siguiente forma:

Ecuación 3.3. Número de esporas por mililitro.

⋕ 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠

𝑚𝑙=


4𝑥10−6 𝑚𝑙

Luego que se determinó el número de esporas en la solución se realizó una dilución

1:100 en el medio líquido sabourand dextrosa. (añadiendo 100 uL de la solución de

esporas en 10 ml de medio líquido sabourand dextrosa). Para obtener

aproximadamente 1-5x104 ufc/ml en los pocillos ya inoculados.

Ilustración 3.3. Cámara de Neubauer (Madigan, 2008)

25

Ilustración 3.4. Recuento de microorganismos en la cámara de Neubauer

(Casal, 2012)

3.4.4. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).

Se realizó mediante el método de dilución en caldo.

La evaluación de la concentración inhibitoria mínima de cada uno de los aceites

esenciales fue desarrollada de acuerdo con algunos lineamientos descritos por el CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute), método M38-A para hongos

filamentosos:

Se preparó 10 diluciones seriadas de cada aceite esencial en las placas de

microtitulación. La distribución de los pocillos en la placa de microtitulación se

muestran en la ilustración 3.5.

Desde el pocillo 2 hasta el 10 se colocó 100 uL de medio líquido sabourand dextrosa

previamente esterilizado y en el pocillo 1 se puso 200 uL del aceite esencial.

Con la ayuda de una micropipeta se cogió 100 uL del pocillo 1 y se añadió al pocillo

2, luego se tomó 100 uL del pocillo 2 y se colocó en el pocillo 3, se repetió este

procedimiento hasta llegar al pocillo 10.

Se colocó 200 uL y 100 uL el medio líquido sabourand dextrosa en los pocillos 11 y

12 respectivamente.

Se inoculó los todos los pocillos, excepto los controles de esterilidad con 100 uL de la

solución de esporas 1:100.

Se cubrió la placa de microtitulación con papel film para evitar la evaporación del

medio de cultivo y del aceite esencial.

Se incubó la placa de microtitulación hasta que se observó crecimiento en el pocillo

control de crecimiento a 30 °C por 3 días.

Se determinó la concentración inhibitoria mínima como la concentración más baja

que produce una inhibición visual del crecimiento.

Los ensayos fueron realizados por triplicado para cada uno de los aceites esenciales y

los microorganismos correspondientes.

https://en.wikipedia.org/wiki/Clinical_and_Laboratory_Standards_Institute

26

Ilustración 3.5. Distribución de la placa de microdilución

En las columnas 1 a la 10 se realizó la microdilución de los aceites esenciales, en tres

filas consecutivas. La columna 11 se reservó para el control de esterilidad del medio,

y en la columna 12 se realizó el control de crecimiento del inóculo.

Ilustración 3.6. Concentraciones de los aceites esenciales en cada pocillo de la placa de

microdilución

3.4.5. Concentración Fungicida Mínima (CFM).

Con el asa de digralsky se sembró por extensión 100 uL del pocillo al que se ha

asignado la concentración inhibitoria mínima (CIM) y también los tres pocillos

que correspondían a las tres concentraciones superiores en cajas petri con el medio

sabourand dextrosa agar.

https://www.google.com.ec/search?q=asa+de+digralsky&sa=X&biw=1366&bih=657&tbm=isch&tbo=u&source=univ&ved=0ahUKEwjI-tCekfnPAhUHFz4KHVhfASAQsAQIGQ

27

Se incubó las cajas petri a 30 °C por 3 días.

Se realizó la lectura de ufc en cada caja petri.

Se determinó la concentración fungicida mínima (CFM) como la concentración más

baja que no permitió el crecimiento de los hongos. (Soto, 2009)

Con los resultados obtenidos se eligió el aceite esencial que presentó la mejor

actividad antifúngica. El parámetro que permitió realizar esta selección fue que el

efecto antifúngico se obtenga a la más baja concentración de aceite esencial.

3.4.6. Formulación de la emulsión

Tomando en cuenta la concentración fungicida mínima (CFM) del aceite esencial

elegido se procedió a formular una emulsión o/w.

Dentro de la formulación se consideraron las materias primas más importantes: fase

acuosa (se utilizó una mezcla de etanol-agua 80:20), agentes tensoactivos y el aceite

esencial. Las concentraciones utilizadas de cada materia prima están dentro de los

rangos sugeridos por la bibliografía.

3.4.7. Proceso de manufactura de la emulsión.

Inicialmente, se procedió a medir los volúmenes necesarios de cada componente de la

formulación.

Luego en un vaso de precipitación se mezcló el agua, etanol. (Fase acuosa).

En otro vaso de precipitación se colocó el aceite esencial y se añadió la mezcla de

surfactantes. (Fase oleosa).

La fase acuosa y la fase oleosa se calentaron hasta 30 ºC.

Posteriormente, se colocó la fase acuosa sobre la fase oleosa y se agitó.

3.4.8. Proceso de aplicación de la emulsión en los libros.

Inicialmente los libros se limpiaron manualmente con una brocha para eliminar el

polvo, en cabinas apropiadas para esta actividad.

Para la aplicación de la emulsión se utilizó un aerógrafo y dentro de una cabina de

flujo laminar.

En primer lugar, se conectó el compresor con el aerógrafo.

Se ubicó el libro con un ángulo de inclinación 80º, respecto a la superficie de la

cabina y a una distancia de 20 cm del aerógrafo.

Se colocó la emulsión en el aerógrafo.

Se procedió a esparcir la emulsión, desde el lado izquierdo hacia el lado derecho y de

arriba hacia abajo, (la zona de aplicación de la emulsión fue de dos páginas continuas

del libro, con un área de aplicación de aproximadamente 1243 cm2).

28

3.4.9. Análisis de superficies no planas (libros) por hisopado.

Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica

Se colocó la plantilla de aluminio de 5cm x 5cm sobre la superficie a muestrear.

Se frotó 4 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección

opuesta a la anterior con un hisopo estéril inclinado en un ángulo de 30º.

Se colocó el hisopo en un tubo que contiene 10 ml de solución salina estéril,

eliminando la parte del hisopo que estuvo en contacto con los dedos del muestreador.

Se tapó el tubo de ensayo y se dejó reposar de 15 a 30 minutos.

Se agitó enérgicamente el tubo que contiene el hisopo (muestra).

Se sembró por extensión 100 ul de la muestra en cajas petri con el medio de cultivo

sabouraud dextrosa agar.

Se incubó las cajas petri a 25 °C por 7 días.

Se registró el número de ufc por caja. (Terán, 2015)

Nota: realizó este procedimiento antes y después de la aplicación de la emulsión para

calcular la eficacia de la forma farmacéutica.

Después de la aplicación de la forma farmacéutica, inicialmente se tomaron muestras

a diferentes tiempos: 1 hora, 2 horas, 4 horas, 10 horas, 24 horas para determinar el

tiempo en el que la emulsión ejerce efecto sobre los hongos. Con este experimento se

determinó que a partir de las 2 horas la emulsión ejerce efecto sobre las cepas de

hongos, y que se observa disminución en el número de unidades formadoras de

colonias y a partir de las 4 horas en adelante se mantiene constante el número de

unidades formadoras de colonias. Por lo tanto, se estableció que las muestras se

tomarán luego de 4 horas de la aplicación de la emulsión sobre los libros.

Para calcular el factor de dilución se aplicó la siguiente ecuación:

Ecuación 3.4. Cálculo del factor de dilución

𝐹𝐷 = 𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑙 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛

Para el cálculo de las unidades formadoras de colonia por centímetro cuadrado de

hoja antes y después de la aplicación de la forma farmacéutica se aplicó la siguiente

ecuación:

Ecuación 3.5. Unidades formadoras de colonia por cm2

𝑢𝑓𝑐

𝑐𝑚2=

⋕ 𝑢𝑓𝑐 𝑥 𝐹𝐷

Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑜

Para calcular la eficacia de cada formulación al ser aplicadas en los libros se aplicó la

ecuación 3.6 y 3.7.

29

Ecuación 3.6. Porcentaje no reducido de unidades formadoras de colonia.

% 𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =

𝑢𝑓𝑐 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2

𝑢𝑓𝑐 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2

𝑥100

Ecuación 3.7. Porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonias.

% 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 = 100% − %𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜

3.5. Diseño experimental

3.5.1. Diseño factorial A x B.

Es el conjunto de puntos experimentales o tratamientos que pueden formarse

considerando todas las posibles combinaciones de los niveles de los factores. Permite

el estudio de la interacción entre los factores, es decir, estudiar el grado y forma en la

cual se modifica el efecto de un factor por los niveles de los otros factores. (Salazar,

2013).

3.5.2. Etapa 1.

3.6.2.1. Variables

Independientes:

El tipo de aceite esencial

La concentración de los aceites esenciales

Dependientes:

Efecto fungicida sobre las cepas de hongos.

3.6.2.2. Hipótesis:

𝐻0: Los aceites esenciales no poseen actividad antifúngica.

𝐻1: Los aceites esenciales poseen actividad antifúngica.

En la etapa 1 del presente proyecto de investigación no se realizó un diseño

experimental, ya que el método que se utilizó para evaluar la actividad antifúngica, es

el método de dilución en caldo con diluciones seriadas. Por lo que los resultados son

reportados únicamente como positivos y negativos, para indicar si hubo o no

crecimiento fúngico. Cada concentración seriada se analizó por triplicado. Con los

resultados obtenidos se eligió el aceite esencial que presentó la mejor actividad

antifúngica, es decir que ejerza su acción antifúngica a una concentración baja, en

comparación con los otros aceites esenciales.

30

3.5.3. Etapa 2.

3.6.3.1. Variables

Independientes:

Formulaciones.

Tiempo de aplicación.

Dependientes:

Reducción porcentual de las unidades formadoras de colonias (Porcentaje de

eficiencia).

El diseño experimental que se aplicará en ésta etapa de la investigación, es un diseño

factorial A x B, se estudiarán 6 tratamientos y con 3 repeticiones cada uno.

El análisis estadístico que se empleará será un análisis de varianza (ANOVA).

Factores

Los factores para el presente estudio son de 2 tipos:

Factor A: Las formulaciones.

Factor B: Tiempo de aplicación.

Niveles

Para el factor A se analizarán 3 niveles.

Para el factor B se analizarán 2 niveles.

Tabla 3.1. Diseño factorial. Etapa 2

FACTOR B

Tiempo de aplicación

FA

CT

OR

A

Formulaciones Tiempo 1 Tiempo 2

Formulación 1 A1B1r1 A1B2r1

A1B1r2 A1B2r2

A1B1r3 A1B2r2


A2B1r2 A2B2r2

A2B1r3 A2B2r3


A3B2r2 A3B2r2

A3B2r3 A3B2r3

r1: repetición 1 r2: repetición 2 r3: repetición 3

31

Actualmente el área de cuarentena del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador

cuenta con 150 libros contaminados con hongos.

Para el presente estudio se tomó una muestra de 13 libros, según la Tabla Militar Estándar y

el nivel de inspección general 1. Para evaluar la eficacia de cada una de las formulaciones

con sus diferentes tiempos de aplicación se utilizaron 12 ejemplares, y en 1 ejemplar se

evaluaron los blancos de cada formulación.

Los libros seleccionados poseen 100 páginas, y en cada libro se evaluaron los 6 tratamientos,

cada tratamiento se evaluó con 8 zonas de aplicación. Posteriormente se calculó el promedio

de cada tratamiento evaluado por libro.

3.6.3.2. Hipótesis para el diseño factorial A x B

Para el factor A (Las formulaciones):

𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 = 0

𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 ≠ 0

𝐻0: Las formulaciones no ejercen ningún efecto en la reducción porcentual de las unidades

formadoras de colonia.

𝐻1: Las formulaciones ejercen efecto significativo en la reducción porcentual de las unidades


Para el factor B (El tiempo de aplicación)

𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 = 0

𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 ≠ 0

𝐻0: El tiempo de aplicación de las formulaciones no ejercen ningún efecto en la reducción

porcentual de las unidades formadoras de colonia.

𝐻1: El tiempo de aplicación de las formulaciones ejercen efecto significativo en la

reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia.

Para la interacción AB (Formulaciones- El tiempo de aplicación):

𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 = 0

𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 ≠ 0

𝐻0: No hay interacción entre los factores A y B.

𝐻1: Hay interacción entre los factores A y B.

32

3.6. Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico)

El análisis estadístico que se empleará para el diseño factorial A x B, es un análisis de

varianza (ANOVA).

Tabla 3.2. Tabla de ANOVA para un diseño factorial a x b con n réplicas

(Romero, 2012)

3.7. Matriz de operacionalización de las variables

Tabla 3.3. Matriz de Operacionalización de variables

Variable Dimensiones Indicadores

Aceite esencial Actividad antifúngica

Unidades formadoras

de colonia por mililitro.

Concentración del

aceite esencial

Concentración Inhibitoria

Mínima (CIM).

Concentración Fungicida

Mínima (CFM).

Unidades formadoras

de colonia por mililitro.

Formulación

Efecto que ejerce sobre los

hongos.

Efecto que ejerce sobre los

libros.

Unidades formadoras

de colonia por cm2.

Si hay o no afectación

en la estructura del

libro.

La cantidad aplicada

Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Estadístico

Variación cuadrados libertad medios F

Efecto A SSA a-1 CMA=SSA/(a-1) CMA/CME

Efecto B SSB b-1 CMB=SSB/(b-1) CMB/CME

Efecto AB SSAB (a-1)(b-1) CMAB=SSAB/((a-1)(b-1)) CMAB/CME

Error SSE ab(n-1) CME=SSE/(ab(n-1))

Total SST abn-1

33

Capítulo IV

4. Análisis y discusión de resultados

4.1. Extracción de los aceites esenciales

La extracción del aceite esencial de las tres especies vegetales se realizó utilizando el

material vegetal fresco para evitar la pérdida de compuestos volátiles, mediante arrastre

de vapor.

El porcentaje de rendimiento de los aceites esenciales se calculó mediante la relación de

ml/g de material vegetal aplicando la ecuación 3.1.



4.1.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de

Pimpinella anisum (anís).



%𝑅 =3,40 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙

500𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙∗ 100

%𝑅 = 0,68

Tabla 4.1. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Pimpinella anisum (anís):

N. 𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂

𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍

(g)

𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆

𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒅𝒐

(ml)

Rendimiento

(%)

1 100 0,70 0,70

2 100 0,70 0,70

3 100 0,60 0,60

4 100 0,80 0,80

5 100 0,60 0,70

Total 500 3,40 0,68

Para la especie Pimpinella anisum se obtuvo el 0,68% de rendimiento en la extracción

del aceite esencial.

34

4.1.2. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Syzygium

aromaticum (clavo de olor).

Tabla 4.2. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Syzygium aromaticum

(clavo de olor):



(g)



(ml)

Rendimiento

(%)

1 150 1,10 0,73

2 150 1,10 0,73

3 200 1,50 0,75

Total 500 3,70 0,74

Se obtuvo un 0,74% de rendimiento con la especie Syzygium aromaticum.

4.1.3. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Zingiber

officinale (jengibre).

Tabla 4.3. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Zingiber officinale

(jengibre):



(g)



(ml)

Rendimiento

(%)

1 100 1,00 1,00

2 100 1,00 1,00

3 100 1,00 1,00

4 100 1,10 1,10

5 100 1,00 1,00

Total 500 5,10 1,02

Con la especie Zingiber officinale se obtuvo el 1,02% de rendimiento. Siendo este

valor el más alto en relación a los rendimientos obtenidos con las dos especies

anteriores.

4.1.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales.

Tabla 4.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de cada aceite esencial.

Nombre

común

Especie

vegetal

𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂


(g)



(ml)

Rendimiento

(%)

Anís Pimpinella

anisum

500 3,40 0,68

Clavo de

olor

Syzygium

aromaticum

500 3,70 0,74

Jengibre Zingiber

officinale

500 5,10 1,02

35

Tabla 4.5. Porcentaje de rendimiento en la extracción de los aceites esenciales

Interpretación:

Como se puede observar en la tabla 4.4 y en el gráfico 4.1 la especie Zingiber

officinale (jengibre) presenta el mayor porcentaje de rendimiento en la extracción del

aceite esencial con el 1,02%. Syzygium aromaticum (clavo de olor) tuvo un porcentaje

de rendimiento del 0,74% y Pimpinella anisum (anís) el 0,68%.

Etapa 1: Evaluación de la actividad antifúngica

4.2. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

4.2.1. Preparación del inóculo.

Para determinar la concentración inhibitoria mínima de cada aceite esencial en primer

lugar se preparó el inóculo por medio del recuento de esporas en la cámara de

neubauer, aplicando la ecuación 3.3 se obtuvo el número de esporas por mililitro:

⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔

𝒎𝒍=


4𝑥10−6 𝑚𝑙


𝒎𝒍=

26 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠

4𝑥10−6 𝑚𝑙


𝒎𝒍= 6,50 𝑥 106

Luego se realizó una dilución 1:100 en el medio líquido sabourand dextrosa,

añadiendo 100 ul de la solución de esporas en 10 ml de medio líquido.

0,68 0,74

1,02

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Pimpinellaanisum(Anís)

Syzygiumaromaticum

(Clavo de olor)

Zingiber officinale(Jengibre)

% Rendimiento en la extracción de los aceites esenciales

36

Tabla 4.6. Número de esporas por mililitro

Cuadrantes ⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔 𝑷𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐 ⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔

⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔/𝒎𝒍 Dilución

1:100

Aspergillus

niger

1 30

26

6,50 𝑥 106

6,50 𝑥 104

2 25

3 20

4 25

5 30

Penicillium

chrysogenum

1 28

24

6,00 𝑥 106

6,0 𝑥 104

2 22

3 20

4 24

5 26

Posteriormente se realizó la determinación de la concentración inhibitoria mínima.

4.3. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

Cada uno de los aceites esenciales fueron evaluados en un rango de concentraciones

desde 50% v/v hasta 0,1% v/v. La evaluación de la actividad antifúngica se realizó

visualmente, reportándose como crecimiento positivo o negativo según corresponda.

En cada pocillo se colocó 100 ul de la dilución de cada aceite esencial y se inoculó con

100 µl de la suspensión de esporas. En este paso, tanto la concentración del aceite

esencial como el inóculo se diluyen a la mitad.

A continuación, se presentan los resultados obtenidos:

Tabla 4.7. Concentración Inhibitoria Mínima, expresada en porcentaje v/v

Especie vegetal CIM

Aspergillus niger Penicillium chrysogenum.

Pimpinella anisum 50% ---

Syzygium aromaticum 50% 50%

Zingiber officinale 25% 25%

Debido a que el ensayo se realizó con diluciones seriadas, el intervalo entre una

concentración y otra es amplio. Por lo que se procedió a realizar un segundo ensayo

para determinar la CIM a intervalos de concentración más cortos (con un intervalo del

5%). Se evaluó entre el último pocillo que registro el crecimiento fúngico y el pocillo

al que se le asignó la CIM.

37

Tabla 4.8. Concentración Inhibitoria Mínima a intervalos más cortos % v/v

Especie vegetal CIM


Pimpinella anisum 45% ---



4.4. Concentración Fungicida Mínima (CFM)

Una vez determinada la CIM para cada aceite esencial se procedió a evaluar la CFM. Se

sembró por la técnica de extensión en caja 100 ul del pocillo al cual se le asignó la CIM,

además se sembró las dos concentraciones superiores. Todos los ensayos se realizaron por

triplicado.

Tabla 4.9. Concentración Mínima Fungicida en porcentaje v/v

Especie vegetal CFM


Pimpinella anisum --- ---



En la tabla 4.8 se detalla los resultados de la concentración fungicida mínima de cada

aceite esencial. Se puede observar que el aceite esencial de anís no presentó un efecto

fungicida, únicamente tuvo un efecto inhibitorio sobre la cepa de Aspergillus niger.

Sin embargo, los aceites esenciales de clavo de olor y jengibre si mostraron un efecto

fungicida frente a las cepas de Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.

El resultado de mayor relevancia es que el aceite esencial de jengibre presentó un

efecto fungicida a concentraciones bajas en relación al aceite esencial de clavo de

olor, a un 25% v/v y 30%v/v presentó una actividad fungicida frente a las cepas de

Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum, respectivamente. Por lo que se eligió

este aceite esencial para elaborar una forma farmacéutica que aplicada en los

documentos bibliográficos constituya una alternativa para el tratamiento de

contaminaciones fúngicas.

En esta primera etapa de la investigación se aceptó la hipótesis alternativa que los

aceites esenciales poseen actividad antifúngica. Y se eligió al aceite esencial de

jengibre para elaborar una forma farmacéutica.

38

Etapa 2: Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente

la mejor actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los

documentos bibliográficos contaminados con hongos.

4.5. Manufactura de la forma farmacéutica a base del aceite esencial que presentó la

mejor actividad antifúngica.

4.5.1. Formulación de la emulsión.

Una vez que se eligió el aceite esencial de jengibre, se procedió a elaborar una forma

farmacéutica que cumpla con algunos requisitos, por ejemplo, que sea de fácil

aplicación, que no provoque un daño físico en los libros, de baja toxicidad y que tenga

un efecto positivo en las contaminaciones provocadas por hongos.

Luego de algunas pruebas preliminares se determinó que la forma farmacéutica más

adecuada para la aplicación en los documentos bibliográficos es una emulsión que

pueda ser aplicada a través de un aerógrafo.

En primer lugar, se procedió a evaluar una serie de formulaciones que nos permita

elegir las condiciones más adecuadas para la elaboración de la emulsión. Se evaluó el

efecto que provoca la concentración del emulsificante, el número de BHL y el tiempo

de agitación en la separación de las fases y en la redipersabilidad de la emulsión.

Como se observa en la tabla 4.9 se analizaron tres concentraciones de emulsificante,

tres números de BHL y dos tiempos de agitación.

Tabla 4.10. Parámetros que se evaluaron en la formulación de las emulsiones.

Parámetros Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

Concentración del

emulsificante (%v/v)

2,5 5,0 7,5

BHL 9 12 15

Tiempo de agitación

(min)

5 10 ---

Para obtener los tres niveles en el número de BHL se utilizó una mezcla de

tensoactivos, para lo cual se aplicó la ecuación 4.1. Las diferentes proporciones se

pueden apreciar en la tabla 4.11. Se utilizaron tensoactivos no iónicos para evitar

inconvenientes con el pH.

Ecuación 4.1. BHL total

𝐵𝐻𝐿𝑇 =𝑚𝐴𝐵𝐻𝐿𝐴 + 𝑚𝐵𝐵𝐻𝐿𝐵

𝑚𝐴 + 𝑚𝐵

𝑚𝐴 + 𝑚𝐵 = 100

39

Tabla 4.11. Porcentajes de Tween 80 y Span 60 para obtener tres BHL diferentes

𝑩𝑯𝑳𝑴𝑬𝒁𝑪𝑳𝑨

9 12 15

𝑩𝑯𝑳𝑨 𝑻𝑾𝑬𝑬𝑵 𝟖𝟎 = 𝟏𝟓 41,7% 70,9% 100%

𝑩𝑯𝑳𝑩 𝑺𝑷𝑨𝑵 𝟔𝟎 = 𝟒, 𝟕 58,3% 29,1% 0,0%

En la tabla 4.12 se puede apreciar las 18 formulaciones que se analizaron y las

diferentes condiciones.

Cada formulación se analizó por triplicado y la agitación fue manual (en forma

circular).

Tabla 4.12. Formulaciones evaluadas

Nº Tiempo de

agitación

(min)

BHL Concentración del

emulsificante

(%v/v)

1 5 9 2,5

2 5 9 5,0

3 5 9 7,5

4 5 12 2,5

5 5 12 5,0

6 5 12 7,5

7 5 15 2,5

8 5 15 5,0

9 5 15 7,5

10 10 9 2,5

11 10 9 5,0

12 10 9 7,5

13 10 12 2,5

14 10 12 5,0

15 10 12 7,5

16 10 15 2,5

17 10 15 5,0

18 10 15 7,5

Cada una de las formulaciones anteriores fueron analizadas en relación a dos

parámetros:

Separación de las fases de la emulsión luego de someterla a 40 ºC por 40 minutos y 10

minutos de centrifugación a 1000 rpm.

Redispersión en el caso de que las fases de la emulsión se separen y se obtenga como

máximo 2 mm de interfase.

En la tabla 4.13 se presenta el promedio de los resultados obtenidos con cada

formulación.

40

Tabla 4.13. Resultados obtenidos al evaluar la redispersión y la separación de fases

de las emulsiones.

Respuesta

Nº Separación de

las fases

(mm)

Fácil

redispersión

1 8 No

2 6 No

3 10 No

4 7 Si

5 1 Si

6 2 Si

7 3 Si

8 2 Si

9 4 Si

10 10 No

11 7 No

12 5 No

13 6 No

14 2 Si

15 2 Si

16 4 No

17 7 No

18 3 No

Para apreciar de mejor manera los resultados obtenidos se realizó análisis de varianza

para identificar la contribución de cada factor en los dos parámetros analizados: la

separación de fases y la redispersabilidad.

PARÁMETRO 1: Separación de las fases de la emulsión

Tabla 4.14. Análisis de Varianza para separación de fases

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Efectos principales

A: Tiempo agitación 0,5 1 0,5 0,19 0,6827

B: BHL 67,4444 2 33,7222 13,05 0,0177

C: Conc. Tensoactivo 17,4444 2 8,72222 3,38 0,0384

Interacciones

AB 4,33333 2 2,16667 0,84 0,4964

AC 14,3333 2 7,16667 2,77 0,1755

BC 20,5556 4 5,13889 1,99 0,2609

Residuos 10,3333 4 2,58333

Total (corregido) 134,944 17

41

Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto

que dos valores P son menores que 0,05 con un 95,0% de nivel de confianza. Se

establece que el número de BHL y la concentración del tensoactivo tiene un efecto

estadísticamente significativo sobre el parámetro separación fases.

Al realizar un análisis de los factores que ejercen un efecto estadísticamente

significativo sobre el parámetro separación fases se puede evidenciar que el factor que

más contribuye a la varianza es la concentración de tensoactivo, su contribución

representa el 55,1859% de la variación total. El número de BHL contribuye con un

44,81% y el tiempo de agitación no ejerce ningún efecto sobre el parámetro

separación de fases.

Análisis de Componentes de Varianza en el parámetro separación de fases

Tabla 4.15. Contribución de cada factor en la separación de fases

Fuente Suma de

Cuadrados Gl Cuadrado

Medio Comp. Var. Porciento


Tiempo agitación 0,5 1 0,5 0,0 0,00

BHL 71,7778 4 17,9444 4,24074 44,81

Concentración

Tensoactivo 62,6667 12 5,22222 5,22222 55,19

El gráfico 4.3 permite visualizar la contribución que tiene cada factor sobre el parámetro

separación de fases.

Gráfico 4.1.Contribución de cada factor en la separación de fases

Tiempo agitación

510

Gráfica Multi-Vari para Separación fases

BHL=9,12,15

0

2

4

6

8

10

Sep

ara

ció

n f

ases

Concentración Tensoactivo

2,5 5 7,5

42

En el gráfico 4.1 se puede observar que a una concentración de tensoactivo del 5%, el

BHL de 9 o 12 se son las mejores condiciones para obtener una emulsión en la cual

sus fases no se separen. En estas condiciones el tiempo de agitación no ejerce ningún

efecto.

Este gráfico muestra los diferentes valores que adopta el parámetro separación de

fases en las diferentes combinaciones de los tres factores analizados.

PARÁMETRO 2: Redispersión

Análisis de Varianza para: Redispersión

Tabla 4.16. Análisis de varianza para redispersión

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Efectos principales

A: Tiempo agitación 0,8889 1 0,8889 16,00 0,1161

B: BHL 2,1111 2 1,0555 19,00 0,0091

C: Concen. Tensoactivo 0,1111 2 0,0555 1,00 0,0444

Interacciones

AB 0,7778 2 0,3888 7,00 0,1494

AC 0,1111 2 0,0555 1,00 0,4444

BC 0,2222 4 0,0555 1,00 0,0150

RESIDUOS 0,2222 4 0,0555


Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto

que tres valores P son menores que 0,05 con un 95,0% de nivel de confianza. Se

establece que el número de BHL, la concentración del tensoactivo y la interacción

entre concentración de tensoactivo y el número de BHL tiene un efecto

estadísticamente significativo sobre el parámetro redispersión.

Análisis de componentes de varianza para el parámetro redispersión

Tabla 4.17.Contribución de cada factor en la redispersión.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl Cuadrado

Medio Comp. Var. Porciento


Tiempo agitación 0,88889 1 0,8889 0,018518 6,25

BHL 2,88889 4 0,7222 0,222222 75,00

Concen. Tensoactivo 0,66667 12 0,05555 0,055555 18,75

43

Al realizar un análisis de los factores que ejercen un efecto estadísticamente

significativo sobre la redispersión se puede evidenciar que el factor que más

contribuye a la varianza es el número de BHL con un 75,00% de la variación total. La

concentración de tensoactivo contribuye con un 18,75% y el tiempo de agitación

ejerce un efecto menor, con el 6,25 % sobre el parámetro redispersión.

El gráfico 4.3 permite visualizar la contribución que tiene cada factor sobre el

parámetro redispersión.

Gráfico 4.2. Contribución de cada factor en la redispersión de la emulsión.

Este gráfico muestra los diferentes valores que adopta el parámetro redispersión en las

diferentes combinaciones de los tres factores analizados.

Se puede evidenciar que las mejores condiciones para que la emulsión elaborada sea

rápidamente redispersable es con una concentración de tensoactivo del 5%, un BHL

de 12 y el tiempo de agitación no marca la diferencia a estas condiciones.

En el gráfico 4.3 se observa en forma resumida la influencia de cada factor sobre los

parámetros separación de fases y redispersión.

44

Gráfico 4.3 Influencia de cada factor sobre los parámetros separación de fases y

redispersión.

El tiempo de agitación no ejerce un efecto considerable en este experimento, pero el

BHL y la concentración de tensoactivo son los factores que mayor influencia ejercen.

En base a los resultados anteriores se estableció que las condiciones óptimas de la

formulación son las siguientes:

Tabla 4.18. Mejores condiciones en las formulaciones analizadas.

Separación de fases Redispersión

Nivel Descripción Nivel Descripción

Tiempo de agitación 1 5 min 1 5 min

BHL 2 12 2 12

3 15 3 15

Concentración de

tensoactivo

2 5% 2 5%

3 7,5% 3 7,5%

Y corresponde a los siguientes números de experimento.

Tabla 4.19. Números de experimentos con las mejores condiciones

Número de

experimento

Tiempo de

agitación (min)

BHL Concentración del

emulsificante (%v/v)

Separación Redispersión

5 5 12 5,0 1 Si

6 5 12 7,5 2 Si

8 5 15 5,0 2 Si

Con las tres formulaciones que se muestran en la tabla 4.21 se realizaron las pruebas

para evaluar la eficacia de la forma farmacéutica.

0 6,25

44,81

75

55,19

18,75

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Separación de fases Redispersión

Co

ntr

ibu

ció

n (

%)

Contribución de cada factor

Tiempo de agitación

BHL

Concentración de tensoactivo

45

A las tres formulaciones se les asignó las letras A, B y C respectivamente.

Y el tiempo de aplicación se definió de la siguiente manera:

Tiempo 1: 20 segundos por zona de aplicación.

Tiempo 2: 40 segundos por zona de aplicación.

4.6. Condiciones para la aplicación de la emulsión

Las emulsiones se aplicaron a través de un aerógrafo. En las siguientes condiciones:

A una distancia de 20 cm entre el aerógrafo y el libro, para evitar que las hojas se

mojen.

La aplicación se la realizó desde el lado izquierdo hacia el derecho y de arriba hacia

abajo, para asegurar que se toda el área se cubra.

Se requiere el uso de un compresor, con una potencia del motor de 186W, una presión

máxima de 2,8 bar.

4.7. Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica

Cálculo del factor de dilución:

𝐹𝐷 = 𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑙 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛

𝐹𝐷 = 10 𝑚𝑙

0,1 𝑚𝑙

𝐹𝐷 = 100

Cálculo de las unidades formadoras de colonia por centímetro cuadrado de zona de

aplicación:

𝑢𝑓𝑐

𝑐𝑚2=


Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑜

𝑢𝑓𝑐

𝑐𝑚2=


25 𝑐𝑚2

𝑢𝑓𝑐

𝑐𝑚2= 2222

La ecuación 3.5 se aplicó para calcular las ufc inicial (antes de la aplicación de la

emulsión) y las ufc final (después de la aplicación de la emulsión).

46

Para calcular el porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc)

que posee cada una de las tres formulaciones al ser aplicadas en los libros se utilizó la

ecuación 3.6 y 3.7.

% 𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =

𝑢𝑓𝑐 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2

𝑢𝑓𝑐 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2

𝑥100

% 𝑹𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐 = 𝟏𝟎𝟎% − %𝑵𝒐 𝒓𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐

% 𝑁𝑜 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =20

48𝑥100 = 41,66%

% 𝑹𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐 = 𝟏𝟎𝟎% − 𝟒𝟏, 𝟔𝟔% = 𝟓𝟖, 𝟑𝟑%

Desde la tabla 4.20 hasta la tabla 4.25 se muestra las ufc de hongos antes y después de

la aplicación de la emulsión sobre los libros y el porcentaje de reducción de las

unidades formadoras de colonia (ufc) de cada una de las emulsiones en sus diferentes

tiempos de aplicación.

En cada tabla de visualiza el promedio obtenido para cada tratamiento en cada libro,

expresado como Porcentaje de Reducción (%).

Tabla 4.20. Emulsión A, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales

ufc iniciales ufc finales

N.

repetición

𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄

𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄



Porcentaje

Reducción

(%)

1 12 48 5 20 58,33

2 13 52 5 20 61,54

3 8 32 3 12 62,50

4 8 32 4 16 50,00

5 12 48 5 20 58,33

6 9 36 4 16 55,56

7 9 36 5 20 44,44

8 11 44 4 16 63,64

9 8 32 3 12 62,50

10 12 48 6 24 50,00

11 5 20 2 8 60,00

12 8 32 3 12 62,50

47

Tabla 4.21. Emulsión A, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales


N.

repetición





Porcentaje

Reducción

(%)

1 10 40 2 8 80,00

2 9 36 2 8 77,78

3 10 40 3 12 70,00

4 9 36 2 8 77,78

5 12 48 3 12 75,00

6 8 32 2 8 75,00

7 12 48 3 12 75,00

8 8 32 1 4 87,50

9 8 32 2 8 75,00

10 8 32 2 8 75,00

11 12 48 2 8 83,33

12 10 40 2 8 80,00

Tabla 4.22. Emulsión B, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales


N.

repetición





Porcentaje

Reducción

(%)

1 15 60 9 36 40,00

2 9 36 5 20 44,44

3 12 48 7 28 41,67

4 10 40 4 16 60,00

5 9 36 4 16 55,56

6 8 32 5 20 37,50

7 13 52 7 28 46,15

8 9 36 5 20 44,44

9 6 24 2 8 66,67

10 8 32 6 24 25,00

11 6 24 3 12 50,00

12 7 28 4 16 42,86

48

Tabla 4.23. Emulsión B, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales


N.

repetición





Porcentaje

Reducción

(%)

1 9 36 6 24 33,33

2 8 32 5 20 37,50

3 9 36 7 28 22,22

4 7 28 5 20 28,57

5 3 12 2 8 33,33

6 9 36 6 24 33,33

7 16 64 10 40 37,50

8 9 36 6 24 33,33

9 11 44 7 28 36,36

10 8 32 5 20 37,50

11 7 28 5 20 28,57

12 5 20 4 16 20,00

Tabla 4.24. Emulsión C, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales


N.

repetición





Porcentaje

Reducción

(%)

1 50 14 56 10 28,57

2 51 8 32 7 12,50

3 52 3 12 2 33,33

4 53 10 40 7 30,00

5 54 7 28 5 28,57

6 55 9 36 7 22,22

7 56 12 48 9 25,00

8 57 4 16 3 25,00

9 58 8 32 6 25,00

10 59 5 20 4 20,00

11 61 10 40 7 30,00

12 62 4 16 3 25,00

49

Tabla 4.25. Emulsión C, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales


N.

repetición





Porcentaje

Reducción

(%)

1 63 6 24 4 33,33

2 64 8 32 5 37,50

3 65 5 20 3 40,00

4 66 9 36 7 22,22

5 67 9 36 6 33,33

6 68 7 28 5 28,57

7 69 8 32 4 50,00

8 70 10 40 9 10,00

9 71 9 36 7 22,22

10 72 10 40 6 40,00

11 74 9 36 7 22,22

12 75 7 28 5 28,57

Nota: Las pruebas realizadas con los blancos no ocasionaron reducción de las unidades


4.8. Análisis estadístico de la Eficacia de las emulsiones

El diseño estadístico usado fue un diseño factorial multivariable. Midiendo como variable

respuesta la reducción porcentual de ufc (unidades formadoras de colonia) de hongos. Los

resultados fueron evaluados mediante un análisis de varianza con 2 Factores: el tipo de

formulación y el tiempo de aplicación; con 3 y 2 niveles respectivamente. Se realizó tres

repeticiones por cada ensayo, con un total de 18 tratamientos realizados.

Tabla 4.26. Factores y niveles para el análisis de varianza

Factores Niveles Nomenclatura

Factorial

Tipo de

formulación

Formulación A -1

Formulación B 0

Formulación C +1

Tiempo de

aplicación

20 segundos -1

40 segundos 0

50

Tabla 4.27. Promedio del porcentaje de reducción de ufc en cada tratamiento estadístico.

Factor 2

Factor 1 Tiempo 1 Tiempo 2

Formulación A

58,09 76,39

55,49 78,13

58,75 78,33

Formulación B

46,53 33,53

45,91 34,38

46,13 31,73

Formulación C

26,10 33,26

25,20 30,48

25,00 28,25

Análisis de varianza:

Tabla 4.28. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades

formadoras de colonia (ufc)

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Efectos principales

A: Formulaciones 4938,08 2 2469,04 1168,16 0,0000

B: Tiempos 77,1573 1 77,1573 36,51 0,0001

Interacciones

AB 826,887 2 413,443 195,61 0,0000

Residuos 25,3633 12 2,11361


El análisis de varianza descompone la variabilidad del porcentaje de reducción de las

unidades formadoras de colonia (ufc) en contribuciones debidas a varios factores. Los

valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que

3 valores-P, el tipo de formulación, el tiempo de aplicación y la interacción entre los

factores antes mencionados, son menores que 0,05, significa que estos factores tienen

un efecto estadísticamente significativo sobre el porcentaje de reducción de las

unidades formadoras de colonia (ufc) con un 95,0% de nivel de confianza.

51

Análisis de Componentes de Varianza

Tabla 4.29. Análisis de los componentes de la varianza para el porcentaje de

reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc)

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Comp. Var. Porciento


Formulaciones 4938,08 2 2469,04 361,282 78,01

Tiempos 904,044 3 301,348 99,7448 21,54

Error 25,3633 12 2,11361 2,11361 0,46

La tabla de análisis de varianza divide la varianza del porcentaje de reducción de las

unidades formadoras de colonia (ufc) en 2 componentes, uno para cada factor. El

objetivo de este análisis normalmente es comparar la cantidad de variabilidad con la

que contribuye cada uno de los factores, llamados los componentes de varianza. En

este caso, el factor que más contribuye a la varianza es el tipo de formulación. Su

contribución representa el 78,007% de la variación total en el porcentaje de reducción

de las unidades formadoras de colonia (ufc).

Gráfico 4.4. Influencia de cada factor en el porcentaje de reducción de las unidades

formadoras de colonia (ufc).

En el gráfico 4.4 se puede apreciar que en el tiempo 0 (40 segundo) y con la

formulación A se obtienen los mejores resultados en función del mayor porcentaje de

reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc).

Formulaciones

-10

1

Gráfica Multi-Vari para % Eficacia

25

35

45

55

65

75

85

% E

ficac

ia

Tiempos

-1 0

52

Gráfico 4.5. Comparación del porcentaje de reducción de las unidades formadoras de

colonia (ufc) con cada formulación.

En el gráfico 4.5 se puede observar que con la formulación A y el tiempo de

aplicación de 40 segundos por cada zona de aplicación se obtienen los mejores

resultados en la reducción de las unidades formadoras de colonia.

En la segunda etapa de la investigación se aceptaron las hipótesis alternativas en las

que se menciona lo siguiente:

Las formulaciones y tiempo de aplicación ejercen efecto significativo en la reducción

porcentual de las unidades formadoras de colonia.

57,44

46,19

25,43

77,2

32,21 30,66

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Formulación 1 Formulación 2 Formulación 3

% d

e R

edu

cció

n d

e u

fc

Porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc) de cada formulación

Tiempo de aplicación 20seg.

Tiempo de aplicación 40seg.

53

Capítulo V

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1. Conclusiones

Se extrajo el aceite esencial de las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum,

y Zingiber officinale por arrastre de vapor, obteniéndose los siguientes porcentajes de

rendimiento: Pimpinella anisum 0,68%, Syzygium aromaticum 0,74%, y Zingiber

officinale 1,02%.

La concentración mínima inhibitoria frente a las cepas de Aspergillus niger fue de 45

% v/v para Pimpinella anisum, 35% v/v para Syzygium aromaticum y 20% v/v para

Zingiber officinale.

La concentración inhibitoria mínima frente a las cepas de Penicillium chrysogenum

fue 40% v/v para Syzygium aromaticum, 20% v/v para Zingiber officinale, mientras

que la especie Pimpinella anisum no presentó concentración inhibitoria mínima.

La concentración fungicida mínima frente a las cepas de Aspergillus niger fue de 40%

v/v para Syzygium aromaticum, 25% v/v para Zingiber officinale y la especie

Pimpinella anisum no tuvo efecto fungicida.

La concentración fungicida mínima frente a las cepas de Penicillium chrysogenum fue

45% v/v para Syzygium aromaticum, 30% v/v para Zingiber officinale, mientras que la

especie Pimpinella anisum no presentó efecto fungicida.

Para la elaboración de la forma farmacéutica se eligió el aceite esencial de la especie

Zingiber officinale (jengibre), debido a que su efecto inhibitorio y fungicida se obtuvo

a concentraciones bajas en comparación a las otras dos especies estudiadas.

Se elaboró una forma farmacéutica líquida, una emulsión de tipo o/w, con la siguiente

formulación:

Aceite esencial de la especie Zingiber officinale (jengibre)………....30%

Span 60 …………………………………………………………..….1,5%

Tween 80…………………………………………………………….3,5%

Etanol absoluto………………………………………………………52%

Agua destilada…………………..……………………………….......13%

En la evaluación de la estabilidad de las diferentes emulsiones elaboradas se tomó en

cuenta dos parámetros: la separación de las fases de la emulsión luego de someterlas a

40 ºC por 40 minutos seguido de 10 minutos de centrifugación a 1000 rpm; y el

54

segundo parámetro fue la capacidad de la emulsión para redispersarse en el caso de

que la interfase sea de máximo 2 mm.

La mejor formulación en cuanto a parámetros de estabilidad y el porcentaje de

reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc), se obtuvo con la formulación

A (tiempo de agitación de 5 minutos, concentración de tensoactivo del 5% y un BHL

de 12) y el tiempo de aplicación 2 (40 segundos por cada zona de aplicación, con un

área aproximada de 1243 cm2).

El porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc) obtenido con

la formulación A y el tiempo de aplicación 2, fue de 77,62%.

El estado de las hojas y la tinta de los libros no se afectaron con la aplicación de la

emulsión a través del aerógrafo y a una distancia de 20 cm entre el libro y el

aerógrafo.

55

5.2. Recomendaciones

Se recomienda analizar una mezcla de aceites esenciales en diferentes proporciones.

Evaluar otras formas farmacéuticas para la aplicación en documentos bibliográficos.

Evaluar el nivel de toxicidad al que se expondría el personal que labora en áreas de

restauración documental al emplear la emulsión a base del aceite esencial de jengibre.

Buscar otra alternativa para aplicar la forma farmacéutica propuesta en este trabajo de

investigación, de tal forma que se realice en menor tiempo.

Realizar estudios comparativos con otras formulaciones antifúngicas.

56

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58

6. ANEXOS

6.1. Anexo 1: Esquema causa - efecto

Contaminación Fúngica de

los documentos bibliográficos

del Área Histórica

Pocos estudios

Tratamientos

deficientes Condiciones de

Almacenamiento

Humedad no

Controlada

Poca revisión

rutinaria

No hay procesos

de desinfección

Métodos utilizados no

han sido probados

Tóxicos para el

personal

Afectan el papel

Falta de interés en el tema

Falta de financiamiento

59

6.2. Anexo 2: Diagrama de flujo para la extracción de los aceites esenciales

Materia prima Limpiar / Lavar

Orear

Envasar

Purificar

Extraer

Armar el equipo

clevenger

Triturar/Licuar

Colocar

Decantar, congelar

y filtrar

Mortero/Licuadora

Materia prima

Agua destilada

Núcleos de ebullición

3 horas Aceite esencial +

vapor de agua

Aceite esencial

Balón de 1 litro

60

6.3 Anexo 3: Aplicación en los libros:

Libros Seleccionar

Limpiar

Tomar las muestras

por hisopado

Cerrar el libro

Esparcir en cada

zona de aplicación

Ubicar a 20 cm de

distancia

Conectar al

compresor

Colocar en el

aerógrafo

Cubrir con papel

film

Brocha (cada hoja)

Aerógrafo

40 segundos

Aproximadamente

10 mL Emulsión

Conectar a 110 V

Luego de 4h de la

aplicación

61

6.4 Anexo 4: Fotografías

Extracción de los aceites esenciales por arrastre de vapor:

Cultivo de las cepas ATCC de hongos:

Aspergillus niger Penicillium chrysogenum

62

Conteo de esporas en la cámara de Neubauer:

Aspergillus niger Penicillium chrysogenum

Cultivo en la placa de microdilución

63

Elaboración de la emulsión:

Limpieza de los libros

Aplicación de la emulsión en los libros

repositorio digital: página de inicio - universidad ......v agradecimiento a dios, por ser mi apoyo...

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