ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGÍA AMBIENTAL

GRUPO

QU-301

MATERIA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

REPORTE DE DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO EN SITIO ALTERADO PRESA BLANCA PUENTE 1 DE ACUERDO A LA NMX-AA-042-SCFI1987 Y

PROY-NMX-AA-042-/1-SCFI-2008

PRESENTAN

BECERRA CALVILLO RUBÉN ISAÍAS

GONZÁLEZ DÍAZ JOSÉ LUIS

MARTÍNEZ SARABIA DIANA AURORA DEL ROCÍO

GENERACIÓN: 2014-2016

LEÓN, GUANAJUATO. JUNIO-2015

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ANTECEDENTES

La Presa Blanca es una población perteneciente al municipio de León, en el Estado de Guanajuato, se encuentra a 1784 metros sobre el nivel del mar. El punto asignado para realizar el muestreo para diagnostico microbiológico está ubicado a las orillas de la presa blanca en el rio el Mastranzo, que esta específicamente en las coordenadas 101° 42' 25.45" W, 21° 5' 36.13" N.

Se eligió este sitio como área de muestreo, debido a que se cree que hay un alto contenido de microorganismos como Coliformes totales y Escherichia coli como indicadores de contaminación fecal tanto en suelo como en agua. El 27 de Marzo del 2013 fue publicado un apartado en el que se da a conocer que:

La zona sur del municipio de León es la más contaminada debido a la quema de pastizales y a los tiraderos clandestinos de desechos industriales. La quema de 80 hectáreas en el vaso de la presa de El Mastranzo, o presa Blanca, ha puesto al descubierto que ahí se arrojan de forma clandestina toneladas de desechos industriales desde, lodos de tenerías, llantas y madera, por lo cual sumado a las toneladas de lirio seco, ha dificultado combatir el fuego. El coordinador de Protección Civil, Saúl Lozano Ontiveros, comentó, que mientras combatían el fuego, se percataron de que llegaron tres camionetas a la presa Blanca a tirar desechos. (Méndez J. Periódico A.M.); es por ello que se ha optado por evaluar la calidad microbiológica en suelo y agua de dicho lugar.

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Presa blanca

Bordo el Mastranzo

Presa blanca (INEGI)

NARRACIÓN DEL MUESTREO PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

La hora de partida de la Universidad Tecnológica de León hacia la zona de muestreo “La Presa Blanca” fue realizada a las 9:30 de la mañana, con un recorrido de 45 min. La llegada al sitio fue a las 10:15 am. En un lapso de tiempo que fue de las 10:30 hasta la 1:50 de la tarde se llevó a cabo la recolección y preservación de muestras que no son de interés microbiológico.

A la 1:50 de la tarde se llevó una “siembra microbiológica in situ” tanto de agua como de suelo. Las cuales consisten colocar una pequeña muestra de ambos sitios en una placa con medio de cultivo. La siembra “in situ” se realizó de la siguiente manera.

Suelo: Con un hisopo estéril, se tomó una pequeña cantidad de la superficie del suelo, posteriormente se colocó el suelo recolectado y se realizó un estriado por toda la caja de Petri, la cual contenía Agar Rojo Bilis Violeta, que es un medio de cultivo selectivo y se utiliza para la investigación presuntiva y el recuento de bacterias Coliformes, después se serró la caja de Petri ya identificada y se envolvió en papel aluminio para evitar que ésta se contaminara y ahí concluyó la siembra “in situ” de suelo para el análisis microbiológico.

Figura 1 Figura 2

Figuras 1 y 2. Siembra in situ de la matriz suelo.

Agua: La siembra “in situ” se realizó sumergiendo una jeringa estéril a aproximadamente 2 cm de profundidad en el agua del rio, posteriormente se tomó 1 mL de muestra de agua y se colocó en otra caja Petri que también contenía Agar Rojo Bilis Violeta, se distribuyó el agua en toda la caja ya identificada, se cerró y tapo con papel aluminio y con esto se concluyó la siembra “in situ” de las dos matrices ambientales deseadas.

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Figura 3 Figura 4

Figuras 3 y 4. Siembra in situ de la matriz agua.

Una vez concluida la siembra se almacenaron en una hielera a 4o C hasta la llegada al laboratorio para su posterior incubación.

Figura 5. Preservación a 4° C de las siembras in situ.

A las 2:04 de la tarde se realizó la recolección de muestra para su análisis microbiológico en el laboratorio, la cual consistió en llenar 2/3 partes de un recipiente de vidrio estéril, con muestra de suelo y la recolección de la muestra de agua consistió en tomar otro recipiente de vidrio esterilizado y sumergirlo a 15 cm de profundidad del río donde se tomó la muestra, una vez que el frasco estuvo dentro del agua, este se abrió en sentido opuesto de la corriente y se dejó llenar hasta 2/3 partes, dejando la otra parte libre, para permitir la presencia de oxígeno y poder mezclar la muestra al momento de hacer el análisis. Y con estas dos recolecciones de muestra, concluyó el muestreo microbiológico en La Presa Blanca.

Figura 6. Muestras de las matrices ambientales agua y suelo.

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El clima fue caluroso y estuvo soleado. El área específica del muestreo de suelo fue cerca de unos árboles frutales y el de agua fue a las orillas del río El Mastranzo, el cual es una de las principales fuentes de alimentación de agua de La Presa Blanca.

Figura 7 Figura 8Figuras 7 y 8. Vegetación presente en el área de muestreo y rio de la zona.

La llegada de regreso a la Universidad Tecnológica de León fue a las 3:00 de la tarde aproximadamente y en cuanto se llegó al laboratorio se prosiguió con la entrega de las muestras de agua y suelo y la incubación de las cajas de Petri ya sembradas.

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MUESTREO Y SIEMBRA IN SITU

FUNDAMENTO

El Agar Rojo Bilis Violeta es utilizado como uno de los procedimientos para llevar a cabo la detección, enumeración e identificación presuntiva de microorganismos Coliformes. En este medio las colonias de Coliformes presentan una morfología típica que permite su identificación presuntiva y que debe ser confirmada mediante reacciones bioquímicas.

En este medio la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes y la fuente de nitrógeno y carbono necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es la fuente de hidratos de carbono, y el rojo neutro actúa como indicador para evidenciar el cambio de pH como consecuencia de la fermentación de la lactosa ya que el medio es acidificado y se produce un viraje al color rojo intenso. El agar es el agente solidificante.

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS

- 2 Frascos de vidrio estériles- 3 Cajas Petri con Agar Rojo

Bilis Violeta- 1 Hisopos estériles - 1 Jeringa estéril sin aguja

- 1 Hielera - 2 bolas de hielo- 1 Termómetro- 1 Papel aluminio

PREPARACIÓN DEL AGAR ROJO BILIS VIOLETA

Suspender 41.5 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición por 1 minuto hasta disolución total (no esterilizar en autoclave). Enfriar un poco, distribuir en placas de Petri estériles, y dejar solidificar por completo.

PROCEDIMIENTO PARA MUESTREO

1.- Siempre que sea posible, llenar el frasco a 2/3 partes de su capacidad (el espacio de aire disponible provocando la perdida de microorganismos aerobios), con muestra de suelo o agua.

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2.- El frasco donde se colecta la muestra no se debe destapar sino hasta el momento del muestreo. Al muestrear, se debe evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material contaminante.

3.- El procedimiento de muestreo en agua es el siguiente:

3.1.- Sin quitar el papel aluminio del cuello del frasco estéril introducirlo aproximadamente de 15-30 cm3 bajo la superficie del agua.

3.2.- Destapar el frasco dentro del agua poniendo la boca del envase en sentido contrario al flujo de la corriente. Si no existe corriente, crearla empujando el frasco de forma en dirección opuesta al movimiento de la mano.

3.3.- Una vez que la muestra ocupe el volumen correspondiente del frasco (2/3

partes); tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella.

4.- El volumen de muestra suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, de preferencia debe ser de aproximadamente 100cm3.

5.- El mecanismo de muestreo superficial en suelo es el siguiente:

5.1.- Retirar todas las posibles hojas o desechos de plantas que se encuentren en la zona que se muestreará.

5.2.- Abrir el frasco estéril y llenarlo con suelo hasta 2/3 partes de su capacidad.

5.3.- Cerrar el frasco rápidamente, cuidando que el aluminio cubra nuevamente el cuello de éste.

** Las muestras tanto de agua como de suelo deben ser etiquetadas, selladas y guardadas inmediatamente después de su recolección, en una hielera a 4° C.

** El examen de la muestra debe realizarse lo más pronto posible, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser inciertos.

SIEMBRA IN SITU PARA SUELO

1. Con un hisopo esterilizado tomar un poco de suelo de la zona a muestrear.2. Abrir la caja Petri y colocar la muestra estriando con el hisopo en toda la

superficie del agar rojo bilis violeta.3. Cerrar la caja Petri y preservar.

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SIEMBRA IN SITU PARA AGUA

1. Tomar con una jeringa estéril un mililitro del agua residual.2. Colocar la muestra en una caja Petri con Agar Rojo Bilis Violeta.3. Tapar la caja Petri, homogeneizar la muestra uniformemente sobre el agar y

preservar.

PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO

El análisis bacteriológico de la muestra debe realizarse inmediatamente después de su recolección. Durante el período que transcurra del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 4° C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos.

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DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES - PRUEBA PRESUNTIVA

FUNDAMENTO

La prueba presuntiva consiste en inocular volúmenes determinados de la muestra (10; 1; 0.1 mL) en series de tres tubos de caldo Lactosado, que son incubados a 35 | C durante 24-48 horas. El medio de cultivo que se utiliza permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación e indica una prueba presuntiva positiva para Coliformes.

MATERIALES Y EQUIPO

1 Incubadora 1 Autoclave 1 Balanza analítica 4 Pipetas graduadas, con tapón de algodón 18 Tubos de cultivo con tapón de baquelita, aluminio o algodón 18 Campanas de fermentación (Durham) 2 Asas de inoculación 2 Matraces de vidrio de 250 ml con tapón de algodón 1 Gradilla. 1 Mechero bunsen Agua destilada 

MEDIOS DE CULTIVO Caldo Lactosado.

Ingredientes:- Extracto de carne 3.0 g- Peptona de gelatina 5.0 g- Lactosa 5.0 g

Preparación:

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Suspender 3.38 g del polvo en 130 mL de agua destilada. Calentar con agitación frecuente para disolución total. Distribuir en 6 tubos de cultivo un volumen de 10 ml de medio (concentración doble), en otros 6 tubos 5 mL del medio y 4 mL de agua destilada (concentración sencilla) y en 6 tubos más agregar 5 mL del medio y 5 mL de agua destilada (concentración sencilla), colocar una campana de Durham a cada tubo con medio de cultivo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1.0 ° C durante 15 minutos.  El aspecto del caldo es claro y de color beige. Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

PROCEDIMIENTO DE INOCULACIÓN

1. Diluir 5 mL de muestra de agua en 45 mL de agua estéril.2. Agitar la muestra diluida y transferir volúmenes de:

- 10 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentración doble.- 1 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentración sencilla

que contienen 5 mL de medio y 4 mL de agua. - 0.1 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentración sencilla

que contienen 5 mL de medio y 5 mL de agua. 3. Pesar 1 g de muestra de suelo en 50 mL de agua estéril y disolver

perfectamente.4. Agitar la muestra de suelo y transferir volúmenes los volúmenes como en el

punto 2.

5. Incubar los tubos a 35 ° C por 24 ± 2 h y observar si hay formación de gas (si la formación de gas no se observa, incubar por 48 ± 2 h).

6. La formación de gas en las campanas de Durham indica una prueba positiva para Coliformes.

DETERMIACIÓN DE COLIFORMES TOTALES - PRUEBA CONFIRMATIVA

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FUNDAMENTO

Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo Lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de Coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo Coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.

MATERIALES Y EQUIPO

1 Incubadora 1 Autoclave u olla de presión o con manómetro 1 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g 4 Pipetas bacteriológicas graduadas, con tapón de algodón 18 Tubos de cultivo con tapón de baquelita, aluminio o algodón 18 Tubos de fermentación (Durham) 2 Asas de inoculación 2 Matraces de vidrio de 250 ml con tapón de algodón Utensilios esterilizados para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas,

tijeras, cucharas, espátulas, etc. 1 Gradilla. 3 Soluciones buffer de 4, 7 y 10. 1 Mechero bunsen.

PREPARACIÓN DEL CALDO LACTOSADO BILIS VERDE BRILLANTE

Ingredientes:  

- Peptona 10.0 g- Lactosa 10.0 g- Sales biliares 20.0 g- Verde brillante 0.0133 g

Preparación:

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Suspender 7.6 g del polvo en 190 mL de agua destilada. Disolver y distribuir volúmenes de 10 ml en 18 tubos con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

PRUEBA CONFIRMATIVA

1. Transferir una asada de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tuvo con caldo bilis verde brillante, con campana de Durham.

2. Agitar ligeramente los tubos para su homogeneización.3. Incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 ± 2 horas (si la formación de gas no se

observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas).4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez

(crecimiento) y producción de gas.5. Consultar las tablas de NMP de la Norma Oficial Mexicana NOM-112-

SSA1-1994 para conocer el número más probable de organismos Coliformes totales/100 mL.

DETERMINACIÓN DE Escherichia coli PRUEBA CONFIRMATIVA PARA LA PRODUCCIÓN DE INDOL

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FUNDAMENTO

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovacs, para originar un compuesto de color rojo. Este método determina si la bacteria posee una enzima triptofanasa y la habilidad de romper el indol del aminoácido triptófano.

REACTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE INDOL

Reactivo de Kovacs para indol

Reactivos

- Para-dimetil-amino-benzaldehído ((CH3 )2NC6H4CHO) 5,0 g - Alcohol amílico (CH3 (CH2 ) 4 OH) (libre de bases orgánicas) 75 mL - Ácido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL - Ácido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL

Preparación

Disolver el para-dimetil-amino-benzaldehído en alcohol amílico. Añadir con cuidado el ácido concentrado. Conservar en un frasco ámbar con tapón de vidrio, en sitio oscuro y refrigerar. El reactivo debe tener una coloración amarillo claro o café claro.

MEDIO PARA PRODUCCIÓN DE INDOL

Agua de peptonada

Reactivos

- peptona 1.0 g - Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 g

Preparación

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Suspender 1.05 g de polvo en 70 mL de agua destilada. Mezclar bien y en 6 tubos de cultivo colocar 10 mL del agua. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE INDOL

6 tubos de cultivo con tapón de algodón gasa. 1 Asa de platino 1 Mechero bunsen 1 Gradilla 1 Gotero 1 Matraz Erlenmeyer con tapón Reactivo de Kovacs Autoclave Pipeta graduada Agua destilada Balanza analítica Incubadora

PROCEDIMIENTO

1. Tomar una asada de la suspensión bacteriana que se encuentra en el tubo con agar verde bilis brillante que dio positivo a la prueba confirmativa de Coliformes.

2. Inocular con la asada otro tubo contiene 10mL de caldo peptona.3. Incubar a 44 ± 1 °C por 24 ± 2 h.4. Finalizada la incubación, adicionar de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs.5. La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera

como prueba positiva para la presencia de indol.

PRUEBA CONFIRMANTIVA DE Escherichia coli PRUEBA DE OXIDASA

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FUNDAMENTO

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. La prueba de Oxidasa es importante y muy útil para diferenciar las Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como Pseudomonas  o Neisserias oxidasa positiva.

MATERIALES Y REACTIVOS

- 3 Caja Petri - 1 Varilla de Vidrio - 3 Papel Filtro- Reactivo oxidasa

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE OXIDASA

Reactivo

Solución al 1% de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada.

Preparación

El reactivo de oxidasa es bastante tóxico, manejar con precaución. Se altera por la luz y el oxígeno, por lo que debe ser de preparación extemporánea y protegerse envolviéndolo con papel negro

PROCEDIMIENTO

1. Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en un papel filtro colocado sobre una caja de Petri.

2. Con una varilla de vidrio o un palillo de madera, colocar una colonia aislada del cultivo puro en el papel filtro preparado.

3. Considerar la aparición de un color azul-purpúreo en un lapso de 10 segundos como una reacción positiva.

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