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REPARACION DEL HUESO SUBCONDRAL FEMORAL ASOCIADO O NO A LA
APLICACIÓN INTRA-ARTICULAR DE CONCENTRAD AUTÒLOGO DE
PLAQUETAS: EVALUACION HISTOMOTFOMETRICA EN CONEJOS NUEVA
ZELANDA (Oryctolagus cuniculus)
MARÍA DE LOS ÁNGELES CEDANO USECHE
Trabajo de grado como requisito parcial para optar al título de
Médico Veterinario y Zootecnista
Directora
IRMA XIMENA BARBOSA SÁNCHEZ
Doctor en Patología
Codirector
OMAR LEONARDO ARISTIZABAL PAEZ
Doctor en Ciencia Animal
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IBAGUÉ - TOLIMA
2018
2
3
DEDICATORIA
A mis padres
A mi abuela
A mis hermanas
4
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y a mi abuela por todo su apoyo incondicional, persistencia, fortaleza,
confianza y amor que me han brindado siempre. A mis hermanas y a mis amigos que
me brindan siempre su apoyo.
A la oficina central de investigaciones de la Universidad del Tolima, por su apoyo
financiero.
Al laboratorio de diagnóstico veterinario (LADIVE), al laboratorio de servicios y
extensión (LASEREX) y al laboratorio de toxicología veterinaria de la Universidad del
Tolima.
A la clínica de pequeños animales de la Universidad del Tolima, por su colaboración
constante, préstamo de materiales y equipos necesarios para el desarrollo
experimental.
Al laboratorio de patología de la Universidad del Tolima y Julian Upegui por las
enseñanzas y la ayuda en el procesamiento de las muestras.
Al profesor Anilton Vasconcelos del departamento de patología general del instituto de
ciencias biológicas de la Universidad Federal de Minas Gerais, por su gran aporte,
enseñanzas y conocimientos durante este proceso.
Al laboratorio de microscopia del departamento de histopatología del hospital
veterinario de la Universidad Federal de Minas Gerais.
A mis orientadores Irma Ximena Barbosa y Omar Aristizabal, por su gran apoyo, guía,
enseñanzas, paciencia, infinidades de correcciones y la oportunidad de realizar este
trabajo.
5
Al grupo de investigación de medicina y cirugía de pequeños animales. Finalmente a
Otoniel Botero por su ayuda en la granja las Brisas, Ibagué.
6
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN 11
1. OBJETIVOS 13
1.1 OBJETIVO GENERAL 13
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 13
2. MARCO TEÓRICO 14
2.1 ESTRUCTURA Y COMPOSICIóN DE LOS HUESOS LARGOS. 14
2.2 REPARACIÓN ÓSEA. 17
2.3 ARTICULACIÓN. 18
2.4 PLAQUETAS. 20
2.5 FACTORES DE CRECIMIENTO. 20
2.6 CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS (CAP). 21
2.7 MODELO ANIMAL. 24
3. MATERIALES Y MÉTODOS 26
3.1 ANIMALES. 26
3.2 PREQÚIRURGICO. 26
3.3 TRATAMIENTOS. 27
3.4 OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS (CAP). 27
3.4.1 Venodisección. 27
3.4.2 Obtención del CAP 28
3.5 PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO. 29
3.6 ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO. 31
3.7 HISTOMORFOMETRÍA. 33
3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 34
4. RESULTADOS Y DISCUSION 35
7
4.1 ANÁLISIS HISTOLÓGICO. 36
4.2 DETERMINACIÓN DE TIPO DE COLÁGENO MEDIANTE LA TINCION DE 40
PICROSIRIUS ROJO.
5. CONCLUSIONES 43
RECOMENDACIONES 44
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de los huesos largos. ................................................................... 15
Figura 2. Sección histológica de la estructura normal de la articulación. ..................... 16
Figura 3. Reparación ósea. .......................................................................................... 18
Figura 4. Esquema de la muestra sanguínea después de centrifugar.......................... 23
Figura 5. Venodisección y colecta de sangre. .............................................................. 28
Figura 6. Abordaje quirúrgico. ...................................................................................... 30
Figura 7. Creación de la lesión experimental ............................................................... 30
Figura 8. Localización de las regiones de la articulación femoro-tibio-patelar. ............. 31
Figura 9. Muestra para procesamiento hispatológico. .................................................. 32
Figura 10. Determinación de la referencia numérica para cada color según el tipo de
colágeno (tipo I y III). Programa Image pro plus versión 4.5.0.29 ................................. 34
Figura 11. Evolución clínica prequirúrgico y posquirúrgico. .......................................... 35
Figura 12. Características histológicas del cóndilo medial del fémur de conejos en tres
tiempos de muestreo ..................................................................................................... 39
Figura 13. Característica histológica del cóndilo medial del fémur de conejo en tinción
H&E (20x). ..................................................................................................................... 40
Figura 14. Resultado de la prueba t pareada para la determinación de colágeno tipo I,
en miembros tratados con CAP y control a los 60 días posquirúrgico. ......................... 41
Figura 15. Secciones histológicas del cóndilo medial del fémur de conejo en picrosirius
rojo. ............................................................................................................................... 42
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RESUMEN
La osteoartritis es una patología que afecta frecuentemente las articulaciones
implicando daños en el hueso subcondral. El objetivo de este trabajo fue evaluar el
efecto de la aplicación del concentrado autólogo de plaquetas (CAP) en lesiones
experimentales a nivel del hueso subcondral en la articulación femoro-tibio-patelar en
conejos (Oryctolagus cuniculus). Se utilizaron 15 conejos machos, adultos jóvenes, de
raza Nueva Zelanda. Cada animal fue intervenido quirúrgicamente en ambas rodillas
bajo anestesia inhalatoria. Se efectuó una lesión experimental de 5 mm en el cóndilo
medial del fémur, a la rodilla derecha se le aplicó solución salina fisiológica y a la
contralateral se le aplicó CAP. La eutanasia de los animales se realizó en los tres
tiempos de evaluación así: a los 30, 60 y 90 días posquirúrgico y cada grupo contó con
cinco conejos respectivamente, a los que se les extrajo la región ósea donde se realizó
el defecto experimental. Para el estudio histopatológico las muestras fueron
descalcificadas en una solución comercial a base de ácido fórmico, luego fueron
procesadas de forma rutinaria. Se empleó la tinción de hematoxilina y eosina,
tricrómico de Masson y picrosirius rojo. Se realizó análisis histomorfométrico a todas las
muestras y los resultados fueron sometidos a pruebas estadísticas. El uso del CAP en
la reparación ósea no fue estadísticamente significativo. Aun así, los análisis
histológicos, sugieren que la precocidad en la proliferación y diferenciación de
condroblastos es influenciada por el CAP, lo que favorece la osificación.
Palabras Claves: concentrado autólogo de plaquetas, hueso subcondral, reparación
ósea.
10
ABSTRACT
Osteoarthritis is a pathology that frequently affects the joints, causing degeneration in
the subchondral bone. The aim of the following research was to evaluate the effect of
the application of Autologous Platelets Concentrate (APC) in experimental injuries at the
subchondral bone level in the femoro-tibio-patellar joint in rabbits (Oryctolagus
cuniculus). Fifteen young male adult New Zealand rabbits were used for the
experimental purpose. In each animal, both pelvic limbs were surgically intervened
under inhalation anesthesia. An experimental 5 mm injury was performed with a surgical
drill on the medial condyle of the femur; physiological saline was applied to the right
pelvic member and APC was applied to the contralateral limb. Euthanasia of the
animals was carried out in three groups: at 30, 60 and 90 days post-surgery and each
group had five rabbits respectively, from which the bone region, where the experimental
defect was made, was extracted. For the histopathological study, the samples were
decalcified in a commercial product based on formic acid to then be processed
routinely. Hematoxylin and eosin staining, Masson’s trichrome and red picrosirius were
used to color the tissues. Histomorphometric analysis was performed on all samples
and the results were subjected to statistical tests. The use of APC in bone repair was
not statistically significant. However, histological analyzes suggest that precocity in the
proliferation and differentiation of chondroblasts is influenced by APC, which favors the
early mineralization of the cartilaginous matrix.
Keywords: autologous platelets concentrate, bone repair, subchondral bone.
.
11
INTRODUCCIÓN
La degeneración articular es una patología frecuente en los animales de compañía,
principalmente en los caninos mayores de un año, en los que la osteoartritis tiene un
porcentaje de presentación cercano al 20% según el Simposio de la academia
americana de cirujanos ortopédicos (Johnston, 1997). La osteoartritis es el resultado de
eventos mecánicos y biológicos que desestabilizan al cartílago articular y al hueso
subcondral, lo cual implica cambios morfológicos, bioquímicos y biomecánicos;
causando desgaste y fisuras en el cartílago articular hasta exponer el hueso subcondral
(Budsberg & Bartges, 2006). La rodilla es un ejemplo de las articulaciones sinoviales,
que están compuestas por capsula articular, liquido sinovial, cartílago articular y hueso
subcondral. El hueso subcondral se encarga de absorber las cargas trasmitidas a la
articulación. En esta patología, se cree que puede ocurrir una excesiva remodelación
ósea y como respuesta hay un crecimiento desmesurado de tejido óseo que causa el
engrosamiento de la capa de hueso subcondral, evitando que se deforme y que pueda
absorber las cargas afectando el cartílago articular (DeCamp et al., 2016).
Estudios preliminares han informado el uso del concentrado autólogo de plaquetas
(CAP) como tratamiento para las enfermedades que alteran la articulación (Anitua et
al., 2007; Carmona et al., 2007; Carmona et al., 2009; Carneiro et al., 2013; Parra et al.,
2017; Silva et al., 2012). El CAP es una concentración autóloga de plaquetas mayor al
conteo basal, siendo la principal fuente de moléculas que modulan la inflamación y la
reparación ósea como son: factor de crecimiento transformante β (TGF-β), factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), entre otros (Marx et al., 1998; Marx, 2004; Sampson et al., 2008).
La influencia del CAP en la reparación ósea sigue siendo controversial. Varios estudios
infieren que el CAP parece no contribuir en la reparación ósea (Bonete et al., 2009; Eda
et al., 2017; Kanthan et al., 2011; Kazakos et al., 2011; Miloro et al., 2010).
12
Pocos trabajos han evaluado la reparación del hueso subcondral entre ellos Kuroki et
al. (2011), Tsuzuki, et al. (2014) y Zhang et al. (2017). Teniendo en cuenta lo anterior,
este estudio pretendió evaluar el efecto del CAP en lesiones experimentales a ese nivel
y su posible uso como una alternativa para su reparación.
13
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la aplicación de concentrado autólogo de plaquetas en lesiones
experimentales a nivel del hueso subcondral femoral en conejos (Oryctolagus
cuniculus).
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar el volumen de la articulación como respuesta de la inflamación local
originada por la lesión a nivel del hueso subcondral femoral en las articulaciones
tratadas con CAP y control.
Analizar los cambios histológicos durante el proceso de la reparación ósea
según los tiempos posquirúrgico en las articulaciones tratadas con CAP y
control.
Determinar histomorfométricamente la reparación ósea del defecto experimental
a nivel del hueso subcondral femoral tras la aplicación o no del CAP.
14
2. MARCO TEÓRICO
2.1 ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LOS HUESOS LARGOS.
El hueso es un tejido conectivo compuesto principalmente por: minerales en un 65%
(principalmente hidroxiapatita), matriz orgánica un 35% (del cual el 90% es constituido
por colágeno y 10% por proteínas no colágenas), células y agua. Existen otras
moléculas presentes en la matriz orgánica del hueso las cuales ejercen diferentes
efectos biológicos, como son: citoquinas (IL-1, IL-6), factores de crecimiento (factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF),
factor de crecimiento insulina (IGF)) (Webster, 2001). Entre las fibras de colágeno que
conforman el hueso se encuentra el tipo I, III, V y X, siendo predominante el tipo I
(Eurell & Sickle, 2006).
El grupo de colágenos fibrilares está conformado por los tipos I, II, III y XI. Se
caracterizan por poseer una resistencia muy alta, siendo clave para la estructura del
esqueleto, piel, vasos sanguíneos, cápsulas fibrosas, entre otros. El colágeno tipo I,
está presente en piel, tendones, ligamentos, huesos, entre otros. En la matriz ósea es
predominante el colágeno tipo I (Bou & Crombrugghe, 2008; Eurell & Sickle, 2006). El
colágeno tipo II es el componente principal del cartílago al igual que el colágeno tipo XI
(Bou & Crombrugghe, 2008). El colágeno tipo III es menos abundante que el colágeno
tipo I, está en los tejidos de forma similar que el colágeno tipo I excepto que no está
presente en los huesos y tendones (Bou & Crombrugghe, 2008) encontrándose solo
pequeñas trazas en la matriz ósea (Eurell & Sickle, 2006). El colágeno tipo V está
presente en los tejidos que contienen colágeno tipo I (Bou & Crombrugghe, 2008).
El hueso tiene como funciones proporcionar soporte interno, de inserciones musculares
y de tendones, protege el cerebro, órganos de la cavidad torácica y medula ósea y
apoya en el metabolismo proporcionando una fuente sérica de calcio cuando el
15
organismo lo requiera. El tejido óseo cambia constantemente a lo largo de la vida de
todos los mamíferos (Eurell & Sickle, 2006; Pelletier et al., 2007; Schett, 2013).
Figura 1. Estructura de los huesos largos.
Fuente: A, Adaptada de Marieb y Hoehn (2013); B, Adaptado de Eurell y Sickle (2006).
Los huesos largos constan de dos extremos anchos llamados epífisis, conectados por
un eje cilíndrico central denominado diáfisis. La diáfisis está compuesta principalmente
de hueso cortical (hueso compacto) (Fig. 1 A). En animales en crecimiento la epífisis
está separada de la diáfisis por una placa de crecimiento cartilaginoso, con la edad
estas células cartilaginosas dejan de proliferar, no obstante, el proceso óseo continúa
hasta consolidarse. Las epífisis están cubiertas por una capa fina de cartílago hialino
(cartílago articular) que reviste el hueso subcondral, mientras que el resto de las
superficies externas del hueso están cubiertas por un tipo de tejido conectivo o
periostio (Pelletier et al., 2007; Schett, 2013). Duncan et al. (1987) definen la placa
subcondral como la región que separa la zona calcificada del cartílago articular de la
cavidad medular. El hueso o placa subcondral (Fig. 2) está compuesto por una placa
ósea cortical y trabéculas (Madry et al., 2010).
A B
16
Figura 2. Sección histológica de la estructura normal de la articulación.
El cartílago articular (AC) está separado de la zona de cartílago calcificado (CC) por el interfaz
denominado tidermark (línea de marea) (flechas). Inmediatamente después de CC se continua con la
placa ósea subcondral (SCP) y el hueso trabecular subcondral (STB).
Fuente: Adaptado de Burr (2004).
En la cara interna de la diáfisis (médula ósea) el hueso está revestido por endostio
(Eurell & Sickle, 2006). Las capas del hueso largo están distribuidas en tres patrones
(Fig. 1B): circulares que rodean los canales vasculares (sistema haversiano u osteona),
laminillas circunferenciales externas y laminillas intersticiales las cuales llenan los
espacios entre los sistemas de Havers (Webster, 2001).
Las células que conforman el hueso son: las osteogénicas, los osteoblastos y los
osteoclastos. Las primeras se originan de las células madres mesenquimales, las
cuales se multiplican y se diferencian en osteblastos. Los osteoblastos sintetizan los
componentes de la matriz ósea (osteoide) y producen diversos factores de crecimiento
(FGF, PDGF y TGF-β) (Clarke, 2008; Eurell & Sickle, 2006). Una vez formada la matriz
ósea, varios osteoblastos quedan atrapados denominándose osteocitos, cuyas
prolongaciones establecen comunicación entre sí. Finalmente, los osteoclastos
17
proceden de precursores mononucleados provenientes de la médula ósea, los cuales
se encargan de reabsorber el hueso (Junqueira & Carneiro, 2015).
2.2 REPARACIÓN ÓSEA.
La injuria de un segmento óseo junto al tejido circundante desencadena una serie de
procesos celulares y bioquímicos que conducirán a su reparación. La extravasación
sanguínea da paso a la formación de un hematoma. Células de la inflamación
intervienen liberando citoquinas y factores de crecimiento favoreciendo la formación de
un trombo fibroso, que se convertirá en tejido de granulación (Bolander, 1992; Cross,
2012; Loi et al., 2016). Algunas citoquinas y factores de crecimientos apoyan la
reparación ósea como son: IL-1, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF) (Loi et al.,
2016), factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-
β), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), PDGF, FGF, IGF y proteínas
morfogenéticas óseas (BMPs); estas moléculas facilitan el reclutamiento de células
inflamatorias, migración de células madres mesenquimales multipotentes (Bolander,
1992). El TGF-β1 exógeno muestra un efecto positivo sobre la mineralización ósea en
el hueso recién formado durante la reparación (Ozkan et al., 2007).
El tejido de granulación es remplazado por matriz cartilaginosa producida por los
condrocitos que forman al callo blando. Con el tiempo, la producción de matriz
cartilaginosa disminuye, aumentando la producción de tejido fibroso convirtiéndose en
tejido fibrocartilaginoso. La siguiente etapa comprende la eliminación gradual del callo
blando para formar un callo duro. Los condrocitos se hipertrofian y se mineralizan, a su
vez los vasos sanguíneos y osteoblastos van dirigiéndose al callo blando, para la
formación ósea (Fig. 3). El callo duro es remodelado a tejido óseo por medio de los
osteoclastos (Bolander, 1992; Cross, 2012).
18
Figura 3. Reparación ósea.
Fuente: Adaptado de Cross, 2012.
2.3 ARTICULACIÓN.
Las articulaciones se pueden clasificar en diartrosis, las cuales facilitan grandes
movimientos y sinartrosis, en el cual el movimiento es limitado o inexistente. Las
diartrosis son articulaciones de gran movilidad, que unen los huesos largos. La
articulación está rodeada por la capsula articular, la cual en su interior contiene el
líquido sinovial que permite el deslizamiento entre las superficies articulares que están
cubiertas de cartílago hialino. A su vez el revestimiento de la capa sinovial está
constituido por dos tipos celulares. Uno es similar al fibroblasto (sinoviocito tipo B); el
otro parece y tiene actividad semejante a un macrófago (sinoviocitos tipo A) (Junqueira
& Carneiro, 2015). Los sinoviocitos tipo A tienen función fagocíitica y los sinoviocitos
tipo B producen colágenos, fibronectina y hialuronano para el líquido sinovial (Iwanaga
et al., 2000).
La cápsula articular está conformada por la membrana fibrosa (externa) y la membrana
sinovial (interna). La membrana sinovial forma pliegues y vellosidades que protruyen
hacia la cavidad articular y se divide en: íntima sinovial, donde se encuentran los
19
sinoviocitos, y subintimal (subsinovial), la cual tiene vasos sanguíneos y linfáticos que
nutren el cartílago articular (Welsch & Sobotta, 2008).
El líquido sinovial provee de lubricación y nutrición al cartílago articular, por medio del
bombeo que se origina al comprimir y relajar la articulación. Los sinoviocitos segregan
glucosaminoglucanos, los cuales reducen la fricción en la articulación. El principal
glucosaminoglicano es el hialuronano, el cual impide que proteínas séricas de alto peso
molecular entren al líquido sinovial. En condiciones inflamatorias se modifica el estado
polimerizado del hialuronano disminuyendo la viscosidad o aumentando la
permeabilidad capilar, llevando al derrame articular (DeCamp et al., 2016).
El cartílago hialino es una matriz avascular, que cubre al hueso subcondral. Tiene la
capacidad de distribuir las cargas resistiendo a la compresión (Schett, 2013). El
cartílago articular está compuesto por condrocitos que mantienen la matriz extracelular.
La matriz extracelular está compuesta por colágeno (10-20%) y agua (65-80%) (Linn &
Sokoloff, 1965; Pelletier et al., 2007). El tipo de colágeno que predomina es el tipo II en
90% a 95% (Pelletier et al., 2007).
En casos de osteoartritis, se cree que una de sus causas sucede cuando la capa de
hueso subcondral incrementa la remodelación ósea aumentando los espacios entre
trabéculas. Con el tiempo, en respuesta a la reabsorción ósea se desencadena el
crecimiento óseo, modificando la resistencia del hueso subcondral. De este modo
acrecienta la tensión en el cartílago articular provocando lesiones (Pelletier et al.,
2007). A su vez, la degeneración articular se asocia a traumas constantes iniciando con
un macro-trauma seguido de micro traumas repetitivos en una articulación (Weeren &
Grauw, 2010). Otros factores que pueden influir son: la edad, factores nutricionales, la
obesidad, factores genéticos y osificación anormal en la epífisis e isquemia al
interrumpirse el flujo sanguíneo de las arterias terminales del cóndilo femoral (Sellam &
Berenbaum, 2013).
20
Se sabe que en las enfermedades articulares se desarrollan cambios bioquímicos. La
membrana sinovial representa un papel importante en el desarrollo de la osteoartritis, a
través de la inducción de distintos agentes proinflamatorios que conlleva a la activación
de metaloproteinasas, resultando en la degradación del cartílago (Sutton et al., 2009).
2.4 PLAQUETAS.
Son pequeños fragmentos citoplasmáticos, se producen en la medula ósea por los
megacariocitos (Diaz & Ginseberg, 2013), tienen un diámetro aproximado de 2 a 5 µm
(Mitchell, 2014), carecen de núcleo y albergan alrededor de 1500 proteínas (Qureshi et
al., 2009). La membrana de las plaquetas contiene receptores de glucoproteína que
median la adhesión y estimulación de la liberación de los factores de la coagulación. En
el citoplasma contiene estructuras como mitocondrias, lisosomas, glucógeno y gránulos
de secreción densos y α (Diaz & Ginseberg, 2013). Los gránulos α son pequeños y
numerosos, almacenan y secretan diferentes proteínas como factores de coagulación,
factores fibrinolíticos, proteasas y antiproteasas, factores de crecimiento, citoquinas,
proteínas de adhesión, entre otras (Anitua et al., 2010). Las plaquetas viajan en la
circulación sanguínea, cuando ocurre una lesión, las plaquetas se adhieren al endotelio
contribuyendo a la formación del tapón hemostático, al mismo tiempo las plaquetas se
activan liberando factores de crecimiento y factores quimiotácticos (Diaz & Ginseberg,
2013).
2.5 FACTORES DE CRECIMIENTO.
Los factores de crecimiento (FC) son un grupo heterogéneo de proteínas, difusibles y
solubles que son secretada por diferentes células como fibroblastos, leucocitos, células
madres hematopoyéticas y plaquetas (Simental et al., 2015). Los FC ayudan en la
diferenciación, crecimiento, proliferación, migración y metabolismo celular (Barrientos et
al., 2008). En las plaquetas los FC y citoquinas se encuentran en los gránulos α que al
activarse libera, factores como: el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento endotelial
21
vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformador β1 (TGF- β1) y citoquinas
como: IL-1 y IL-6 (Anitua et al., 2010; Barrientos et al., 2008).
Los FC y citoquinas se unen a los respectivos receptores en la superficie de las células
diana, activando la cascada de señalización intracelular, cambiando la función celular
(proliferación, migración, diferenciación entre otras) (Hollinger et al., 2011).
Los principales factores de crecimiento que influyen en la reparación ósea, son: el TGF-
β, estimula la formación ósea ya que potencializa la diferenciación osteoblástica, la
síntesis de la matriz osteoide e inhibe la producción de proteasas como las
metaloproteinasas. Las proteínas morfogénicas óseas (BMPs), pertenecen a la familia
de los TGF- β, ayudan en la transformación del tejido conjuntivo a tejido óseo, la
diferenciación de las células pluripotenciales a diferentes líneas celulares (tejido
adiposo, cartílago y hueso) e inhibe la osteoclastogénesis. El VEGF, promueve la
proliferación y diferenciación angiogénica, produce vasodilatación e incremento de la
permeabilidad vascular (Tresguerres et al., 2005). Al inducir la angiogénesis, aumenta
la cantidad de oxígeno y nutrientes necesarios para la osteogénesis (Hollinger et al.,
2011). El PDGF, estimula la síntesis proteica llevada a cabo por los osteoblastos
(Canalis, 1981), favorece la diferenciación osteogénica (Nash et al., 1994), la
reabsorción ósea, la proliferación de fibroblastos, la neo-vascularización y la síntesis
de colágeno (Tresguerres et al., 2005). El FGF es mitógeno de los osteoblastos,
condrocitos (Simental et al., 2015) y de las células endoteliales vasculares, así como
de los fibroblastos (Tresguerres et al., 2005).
2.6 CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS (CAP).
Años atrás el papel de las plaquetas solo se relacionaba con la hemostasia. El plasma
contiene proteínas implicadas en los procesos de la coagulación, moléculas bioactivas
y plaquetas que al activarse liberan factores de crecimiento y citoquinas (Simental et
al., 2015). En 1974, Ross et al. observaron que el suero sanguíneo con mayor cantidad
de plaquetas promueve la proliferación de las células del musculo liso arterial in vitro.
22
Sin embargo, la noción de usar concentrados plaquetarios para terapia no hemostática
solo surgió hasta los noventas (Textor, 2014). En 1994 se empleó en el área de la
cirugía reconstructiva mandibular (Tayapongsak et al., 1994). En 1997, Whitman et al.
investigaron el gel de plaquetas como alternativa autóloga en la cirugía oral y
maxilofacial. Otros estudios han mostrado que el tratamiento con inyecciones intra-
articulares de CAP es seguro y que tiene un potencial para reducir el dolor y mejorar la
funcionalidad de la articulación femoro-tíbio-patelar lesionada, al igual que mejora la
calidad de vida en pacientes humanos con degeneración articular (Almasry et al.,
2015; Filardo et al., 2011).
El concentrado autólogo de plaquetas (CAP) es un volumen de plasma autólogo que
tiene un concentrado de plaquetas por encima del recuento basal, siendo una fuente
autóloga de FC (Marx, 2001). El proceso de preparación del CAP se basa en la ley de
Stokes, definida como la velocidad de sedimentación de las partículas en un medio
líquido en respuesta a las fuerzas gravitatorias siendo proporcional a su diámetro. Por
lo anterior, las plaquetas (de aproximadamente 2 µm de diámetro) se sedimentarán
más lento que los glóbulos rojos (de 7 µm de diámetro), quedando en suspensión en el
plasma, mientras las glóbulos rojos van cayendo al fondo rápidamente (Arnoczky et al.,
2010). La sangre debe ser colectada en un tubo con anticoagulante (citrato de sodio,
citrato dextrosa-A (ACD-A)), que evite el inicio de la cascada de coagulación y a su vez
apoye metabólicamente a las plaquetas (Marx, 2001).
La muestra sanguínea con anticoagulante es centrifugada con el fin de separar los
componentes sanguíneos. La mayor proporción de plaquetas se encuentra entre la
capa de glóbulos rojos y el plasma como se observa en la Fig. 4. Las plaquetas deben
activarse para que se degranulen y liberen los factores de crecimiento. Dicha activación
se logra empleando trombina, cloruro de calcio o gluconato de calcio (Simental et al.,
2015).
23
Figura 4. Esquema de la muestra sanguínea después de centrifugar.
Fuente: Carneiro et a., (2013).
Los protocolos para la producción del CAP varían según los requerimientos y
disponibilidad de materiales y equipos de cada estudio. Factores como el tiempo de
centrifugación, cantidad de revoluciones y el tipo de anticoagulante, comprometen la
integridad de las plaquetas (González et al., 2013). Según el protocolo estandarizado
por Bonilla et al. (2017), la obtención del CAP en conejos, mediante la centrifugación a
120g por 5 minutos, presenta una mayor concentración plaquetaria a la basal con
pocos niveles de leucocitos.
El CAP ha sido utilizado por la medicina humana para tratar los problemas de piel
como por ejemplo, en el tratamiento a fotodaños en la piel de las manos, reduciendo
los signos del envejecimiento cutáneo (Cabrera et al., 2017). También ha sido
empleado en intervenciones odontológicas, acelerando la regeneración ósea, como en
defectos periodontales después de la extracción quirúrgica de algún molar mandibular
(Sammartino et al., 2005). De igual forma se aprovecha en tratamientos a úlceras
corneales superficiales refractarias, proporcionando una mejoría en el dolor y en el
defecto epitelial (Wu et al., 2015). Finalmente, en ortopedia, es destinado como
tratamiento para la osteoartritis en la rodilla, reduciendo el dolor y mejorando la
funcionalidad (Filardo et al., 2011).
CAP
24
En la medicina veterinaria, reportan la aplicación intra-articular de CAP en equinos
como tratamiento para la osteoartritis, mostrando mejoría en la claudicación y
distensión articular (Carmona et al., 2007; Carmona et al., 2009) y en lesiones
experimentales en el cartílago articular en ovejas, estimulando la formación de tejido
fibrocartilaginoso siendo benéfico para la reparación de defectos osteocondrales
(Carneiro et al., 2013). En caninos el uso de CAP se ha utilizado como tratamiento
para la necrosis avascular de la cabeza del fémur con una aplicación intra-articular,
disminuyendo la claudicación y apoyo del miembro pélvico (Parra et al., 2017) y como
tratamiento posquirúrgico de la ruptura del ligamento cruzado craneal, evidenciando
disminución hasta ausencia de la claudicación (Silva et al., 2012).
El hecho de que las plaquetas liberen factores de crecimiento puede influir
positivamente en la reparación ósea y a su vez mejora las manifestaciones clínicas
como claudicación, inflamación y dolor (Simental et al., 2015).
2.7 MODELO ANIMAL.
Los conejos son pequeños mamíferos pertenecientes al orden Lagomorpha y la familia
Leporidae. Están clasificados en 8 diferentes géneros entre ellos el Oryctolagus.
Existen diversas razas del Oryctolagus cuniculus entre ellas el Nueva Zelanda
(Nowland et al., 2015).
El conejo Nueva Zelanda se ha usado como modelo experimental para investigaciones
del sistema musculoesquelético (Neyt et al., 1998). Siendo adecuado para el estudio de
la reparación de lesiones experimentales óseas (Batista et al, 2011; Oryan et al., 2014)
en mandíbula (Lundgren et al., 1997) y rodilla (Cook et al., 2014). A su vez es un
modelo de elección por sus ventajas, entre ellas la rápida maduración esquelética que
es alcanzada alrededor de los 8-9 meses de edad (Poole et al., 2010). Además, por su
pequeño tamaño facilita el manejo, la manipulación y minimiza los costos de
mantenimiento (Halabi et al., 2012; Li et al., 2015; Piel et al., 2014). El conejo comparte
25
con el humano semejanzas fisiológicas óseas por lo que permite extrapolar los
resultados experimentales (Norris et al., 2001).
26
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio fue aprobado por el comité de bioética de la Universidad del Tolima, acta
No. 31/2014.
3.1 ANIMALES.
Se utilizaron 15 conejos machos (Oryctolagus cuniculus) de raza Nueva Zelanda,
adultos jóvenes, con peso promedio de 2.5 a 3.3 kg, con buena condición clínica
adquiridos en la granja “Las Brisas” de la Universidad del Tolima localizada en el
municipio de Ibagué, departamento del Tolima, a una altura de 1285 msnm, con
precipitación anual de 1200 a 1400 y temperatura promedio de 24°C. Los animales se
evaluaron clínicamente por 15 días antes de las cirugías experimentales; fueron
mantenidos durante todo el tiempo en jaulas individuales, siendo alimentados con
concentrado comercial una vez al día y agua ‘ad libitum’.
3.2 PREQÚIRURGICO.
Se realizó la antisepsia de la piel en la región de la oreja con povidona yodada y
alcohol, posteriormente se cateterizó la vena marginal usando un catéter N° 22. Se
administró por vía intramuscular, 25 mg/kg de cefalexina (Rilexine® 150; Virbac,
Colombia) como antibioticoterapia y 2 mg/kg de clorhidrato de xilacina (Xilacina 2%®,
Laboratorios Erma Colombia) como sedación treinta minutos antes del procedimiento.
La inducción anestésica fue por vía intravenosa con 5 mg/kg de clorhidrato de ketamina
(Ketamina 50®, Holliday scott S.A, Argentina) y 5mg/kg de propofol (Lipuro® 1%, B.
Braun, Melsungen AG). El mantenimiento anestésico fue por vía inhalatoria 2% CAM
de isoflurano (Isoflurano USP®, Piramal Critical care, Inc, USA), los animales fueron
previamente entubados con tubo endotraqueal N° 2 sin balón. Una vez en el plano
anestésico, se posicionó el animal en decúbito dorsal, la antisepsia de la zona a ser
intervenida fue llevada a cabo con povidona yodada y alcohol, previa tricotomía del
27
área. La anestesia epidural se realizó en la región lumbosacra entre L7 y S1. El
volumen total aplicado en cada animal fue de 0.33 ml/kg, siendo el 30% clorhidrato de
lidocaina (Virbac®, Colombia) y el 70% clorhidrato de bupivacaína (Bupirop® 0.5%,
Ropsohn therapeutics LTDA).
3.3 TRATAMIENTOS.
La lesión se realizó a todos los animales del experimento en el cóndilo medial del fémur
de ambos miembros pélvicos. En el cóndilo derecho se aplicó 1 ml de solución de
cloruro de sodio 0.9% (miembro control) y en el cóndilo izquierdo 1 ml de CAP
(miembro tratado). Esta aplicación se realizó una vez cerrada la capsula articular,
tomando como referencia anatómica la palpación del defecto creado en la cara medial
del cóndilo femoral.
3.4 OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS (CAP).
Se implementó el protocolo estandarizado por Bonilla et al. (2017) para la obtención del
concentrado autólogo de plaquetas. Las muestras sanguíneas fueron colectadas por
venodisección de la vena yugular previo a las cirugías experimentales (Gonzalez et al.,
2013).
3.4.1 Venodisección. Los conejos fueron posicionados en decúbito dorsal. La tricotomía
se realizó en la zona media del cuello y la antisepsia fue con povidona yodada y
alcohol. Antes de la incisión, el tejido subcutáneo adyacente a la vena yugular fue
infiltrado con 2 ml de lidocaína, posteriormente se hizo una incisión longitudinal con una
cuchilla Nº 22 en la piel a nivel del surco yugular. El músculo cutáneo del cuello fue
incidido y desplazado lateralmente, permitiendo la visualización de la vena yugular
externa. Por medio de una aguja múltiple de 22G (BD Vacutainer, Estados Unidos) y
dos tubos vacutainer estériles con citrato de Sodio al 3,2% como anticoagulante
(Vacuette® Greiner-Bio-One, Austria) fueron colectados 7 ml de sangre.
28
Figura 5. Venodisección y colecta de sangre.
Fuente: Autor
3.4.2 Obtención del CAP. Se colectaron dos tubos de 3,5 ml de sangre con citrato de
sodio como anticoagulante, de los cuales uno fue empleado para la realización de un
hemograma automatizado mediante impedancia eléctrica (analizador automatizado de
hematología FC-620 Vet®). Posteriormente al hemograma, ambos tubos fueron
procesados de la siguiente forma: 1 ciclo de centrifugación a 120g durante 5 minutos,
empleando la centrifuga Z32HK (HERMLE Labortechnik GmnH, Alemania), con el fin
de separar los componentes sanguíneos. Una vez centrifugados, se extrajo 1 ml de la
fracción intermedia de cada tubo por medio de un catéter Nº 24. Nuevamente se realizó
el hemograma, con el fin de determinar el incremento del concentrado plaquetario. El
CAP fue preservado a temperatura ambiente hasta su activación (se utilizó una relación
10:1 CAP – gluconato de calcio, para la activación del CAP). Dicho procedimiento se
llevó a cabo unos minutos antes de su aplicación en el defecto.
29
3.5 PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO.
Los animales con previa tricotomía fueron posicionados en decúbito dorsal, la
antisepsia de las extremidades a intervenir se logró a través del uso de povidona
yodada y alcohol. El abordaje quirúrgico a la rodilla izquierda se elaboró mediante una
incisión parapatelar medial (Fig. 6) como lo describe Piermattei et al., 2006. Se realizó
una incisión cutánea y de tejido subcutáneo cráneo-medial desde el tercio distal del
fémur hasta la tuberosidad de la tibia (Fig. 6). Luego, se incidió la cápsula articular y se
luxó la patela hacia lateral. Posteriormente se exteriorizo el cóndilo femoral, en la cara
medial se realizó la lesión experimental de 5 mm de diámetro por medio de una fresa
trefina de con irrigación continua, teniendo en cuenta precaución de no lesionar al
ligamento colateral medial. La profundidad fue hasta exponer el hueso subcondral.
Realizada la lesión experimental se aplicó directamente en el defecto 1 ml del
concentrado autólogo de plaquetas previamente activado con gluconato de calcio
(Vicar®, Colombia) (en proporción 1:10 equivalente a 0,1 ml de gluconato por cada 1 ml
de CAP), una vez cerrada la capsula articular con poliglactina 3-0 en puntos simple
continuos (Vicryl® Ethicon, Johnson & Johnson, Brasil), siendo de referencia anatómica
la palpación del defecto creado en la cara medial del cóndilo femoral para su
aplicación. Este abordaje fue empleado en el miembro contralateral (miembro control),
con la diferencia a que a esta se le aplicó solución salina 0,9% a razón de un 1ml. Por
último se procedió a suturar con poliglactina 3-0 la capa muscular y el tejido
subcutáneo en puntos simples continuos y la piel en puntos simples separados.
30
Figura 6. Abordaje quirúrgico.
Articulación femoro-tibio-patelar en conejo. Parte inicial de la cirugía, animal posicionado en decúbito
dorsal con abordaje parapatelar medial, incisión cráneo medial desde el tercio distal del fémur hasta la
tuberosidad de la tibia.
Fuente: Autor
Figura 7. Creación de la lesión experimental
Articulación femoro-tibio-patelar de conejo. A, creación de la lesión experimental, ** trefina quirúrgica 5
mm. B, * tróclea femoral, (flecha negra) lesión experimental con exposición del hueso subcondral.
Fuente: Autor
31
Como posquirúrgico se aplicó vía intramuscular 1.5 mg/kg de clorhidrato de morfina
(Laboratorios RYAN®, Colombia) cada 4 horas los 3 primeros días y 25 mg/kg de
cefalexina por 7 días
La evaluación clínica se realizó el día antes de la cirugía, posteriormente se evaluó
diariamente durante los primeros 8 días. Luego se realizó la valoración clínica a los 30,
60 y 90 pos cirugía. Se midió el perímetro de la circunferencia de la articulación
(centímetros) con una cinta métrica, diferenciándose 3 regiones: distal del fémur (DF),
patela (P) y tuberosidad de la tibia (TT) (Fig. 8).
Figura 8. Localización de las regiones de la articulación femoro-tibio-patelar.
Articulación femoro-tibio-patelar. Representación de las tres regiones: distal del fémur (DF), patela (P) y
tuberosidad de la tibia (TT).
Fuente: Autor
3.6 ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO.
Para el análisis histopatológico, miembros tratados con CAP y control fueron
subdivididos en tres grupos con cinco animales cada uno, teniendo en cuenta el tiempo
posquirúrgico (30, 60 y 90 días). Fue realizada eutanasia de todos los animales
32
mediante inyección intracardiaca de 0.25 mg/kg de pentobarbital sódico y
difenilhidantoína sódica (Euthanex®, INVET S.A., Colombia), previa sedación del
paciente mediante administración de 2 mg/kg/IM de xilacina, veinte minutos antes del
procedimiento. Posteriormente se extrajo el cóndilo medial del fémur de cada rodilla
(Fig. 9) y se sumergió inmediatamente en formalina bufferada al 10%. Para la
descalcificación se usó un producto comercial a base de ácido fórmico (Shadon TBD-2
decalcifier™, Thermo Fisher scientific) por 8 días. Las muestras fueron lavadas en
agua corriente y procesadas de forma rutinaria, en un procesador automático de tejidos
(Leica® TP1020, Leica Biosystems, Alemania), a seguir fueron incluidas en Paraplast®
(Leica® Biosystems Richmond Inc, USA). Los cortes se realizaron en secciones
secuenciales de 5 micras de grosor en un micrótomo (HM 310 Microm) y montados en
láminas portaobjetos. El procesamiento se realizó en el Laboratorio de Patología
Veterinaria de la Universidad del Tolima.
Figura 9. Muestra para procesamiento hispatológico.
Cóndilo medial del fémur del miembro pélvico izquierdo con posquirúrgico de 30 días. *zona de la lesión
experimental.
Fuente: Autor
*
33
Se realizó tinción de Hematoxilina y eosina (H&E), tricrómico de Masson (Kit de tinción
de Masson-Golder 100485, Alemania) y picrosirius Red Stain (Connective Tissue Stain
ab 150681, abcam® USA) para determinar el tipo de colágeno en el tejido.
3.7 HISTOMORFOMETRÍA.
Se tomaron imágenes de las placas teñidas en H&E en microscopio trinocular invertido
modular (IX73P2F, Japón, cámara Olympus® XC50). Las fotografías fueron
visualizadas en el programa CellSens Estándar 1.12 (Olympus®, Japón). Para la
histomorfometria se usaron las placas teñidas con tricromico de Masson en
microscopio (BX-640, Olympus®) y cámara JVC TK-1270/JGB, las imágenes fueron
digitalizadas en image analyzer software (Kontron Electronic, Carl Zeiss – KS300). Se
analizó una imagen por cada miembro tratado dando un total de 30 imágenes, se
delimito la zona cartilaginosa y la zona fibrosa con el fin de determinar el área (µm2).
Para la tinción de picrosirius rojo analizaron 30 imágenes (una imagen por cada
miembro tratado), las imágenes fueron digitalizadas en el microscopio de luz polarizada
(Leica® DM 4000B, cámara Leica® DFC 500), visualizadas en el programa Leica
versión 4.2. La determinación de las fibras se determinó según el color expresado en el
microscopio de luz polarizada (tipo I color rojo y tipo III color verde). Las imágenes
fueron analizadas con el programa Image pro plus versión 4.5.0.29, se seleccionó un
pixel para cada color con el fin de establecer una referencia numérica que identificara
cada uno (Fig. 10). En cada imagen se empleó la referencia numérica para determinar
el área (µm2) que representaba el colágeno tipo I y tipo III.
34
Figura 10. Determinación de la referencia numérica para cada color según el tipo de
colágeno (tipo I y III). Programa Image pro plus versión 4.5.0.29
Fuente: Autor.
3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Los resultados fueron presentados como media ± desviación estándar (DE). Se
determinó la normalidad de los datos histomorfomètricos (área de la zona cartílaginosa
y fibrosa, área de las fibras de colágeno tipo I y III) y perímetro de la circunferencia de
las articulaciones a través de la prueba Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre los
grupos se analizaron mediante la prueba t pareada para datos con distribución normal y
la prueba de Wilcoxon para datos no paramétricos. Se consideró una diferencia
estadísticamente significativa si el valor de p <0.05. Se utilizó el programa estadístico
GraphPad 5 versión 5.01 Software, San Diego, CA, USA.
35
4. RESULTADOS Y DISCUSION
En esta investigación se evaluó el efecto del CAP en lesiones experimentales en el
cóndilo medial del fémur del conejo. Durante la evaluación clínica del posquirúrgico, no
se observaron cambios relevantes en la articulación femoro-tibio-patelar donde se
realizaron las lesiones experimentales ni alteraciones relacionadas a contaminación, la
evolución de los animales intervenidos fue favorable (Fig. 11).
Figura 11. Evolución clínica prequirúrgico y posquirúrgico.
Día 0: prequirúrgico, Día 1, 2, 3, 4: posquirúrgico; Miembro pélvico derecho: control; Miembro pélvico
izquierdo: tratado con CAP.
Fuente: Autor.
36
Al comparar el perímetro de las articulaciones intervenidas quirúrgicamente, no se
evidenciaron diferencias estadísticamente significativas entre el miembro tratado con
CAP y el control en los diferentes tiempos de observación posquirúrgicos excepto al día
5 posquirúrgico, donde los miembros tratados con CAP presentaron aumento de
volumen en la región de la tuberosidad de la tibia con respecto a los controles, con
diferencia estadísticamente significativa (p=0.0232). Por lo tanto el empleo del CAP
como coadyuvante en la reparación de las lesiones experimentales del hueso
subcondral en la articulación femoro-tibio-patelar, no presentó un efecto significativo en
los signos de la inflamación. Lo anterior puede ser explicado por lo hallado por Eda et
al. (2017), quienes consideraron que el CAP inducia reacciones inflamatorias
basándose en el efecto pro-inflamatorio de las plaquetas..
4.1 ANÁLISIS HISTOLÓGICO.
En el análisis histológico en tinción de H&E (Fig. 13) y tricrómico de Masson a los 30
días posquirúrgico, en ambos miembros se evidenció activa reacción de proliferación
en el área cartilaginosa con mayor número de condroblástos y menor diferenciación de
condrocitos, existiendo un mayor porcentaje de condroblastos en los miembros tratados
con CAP. En la tinción de tricrómico de Masson, las trabéculas cartilaginosas
mostraron un proceso inicial de osificación en ambos miembros, con
mineralización/calcificación (color rojo) centrípeta, manteniéndose en muchas de ellas
un núcleo cartilaginoso. Las trabéculas óseas son más numerosas y profundas en los
miembros tratados con CAP, siendo que en los miembros control se evidenció mayor
tejido medular. Estos hallazgos histológicos se asemejan a lo encontrado en otros
estudios, los cuales han demostrado que el uso del CAP puede tener efectos positivos
en la proliferación de osteoblastos y condroblastos debido a las altas concentraciones
de PDGF y TGF-β que puede presentar (Akeda et al., 2006; Okuda et al., 2003). De
acuerdo con Bolander (1992), las plaquetas son la principal fuente de factores de
crecimiento durante el inicio de la reparación ósea, probablemente la proliferación y
diferenciación de las células mesenquimatosas sea modificado por los factores de
crecimiento que son liberados por la degranulación de las plaquetas durante la
37
formación del hematoma, lo cual se correlaciona con lo observado en el análisis
histológico del presente estudio.
A los 60 días posquirúrgico, los dos miembros mostraron trabéculas cartilaginosas en
proceso de osificación e intensa proliferación condroblástica y diferenciación de
condrocitos con avanzada mineralización de cartílago. Las trabéculas cartilaginosas en
los miembros tratados con CAP mostraron un proceso de osificación más avanzado
semejándose al hueso compacto en franco proceso de reparación. En los miembros
control se observaron trabéculas en mineralización con un núcleo aún cartilaginoso.
Las trabéculas óseas de los miembros tratados con CAP presentaron un aspecto rojizo
más intenso (tricrómico de Masson). Concorde a Carneiro et al. (2013), el CAP
contribuye a la formación temprana de tejido fibrocartilaginoso estimulando el proceso
de reparación ósea, en este estudio se evidenció una rápida diferenciación del tejido
cartilaginoso por lo que se cree ayudo en la mineralización del miembro tratado con
CAP.
A los 90 días, hubo mineralización progresiva en la matriz cartilaginosa en los dos
miembros siendo más evidente en el miembro tratado con CAP. La tinción de tricrómico
de Masson mostró que en los miembros tratados con CAP las trabéculas presentaron
mayor grado de mineralización (enrojecimiento) y en los miembros control aún se
encontraron áreas de color azul verdoso, lo que representa núcleos cartilaginosos que
aún no presentaron mineralización, sugiriendo que el uso del CAP estimuló el proceso
de reparación ósea. Al realizar la evaluación histomorfometrica del área cartilaginosa y
fibrosa no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Malhotra et al.
(2014), evaluaron el uso del CAP en lesiones experimentales en la región del cóndilo
medial del fémur en ovejas, y demostraron que los miembro tratados con CAP
presentaron mayor crecimiento óseo. De forma similar en el presente estudio, se
evidenció que a pesar de que los datos histomorfometricos no arrojaron diferencias
estadísticamente significativas, los cambios histológicos sugieren que la osificación fue
mejor en los miembros tratados con CAP. Ensayos in vitro confirman que el CAP tiene
un efecto quimiotáctico sobre las células endoteliales y osteoprogenitoras (Backly et al.,
38
2014), potencializando la angiogénesis y acelerando el proceso de reparación (Kim et
al., 2014; Lyras et al., 2010; Takamura et al., 2017).
Por otra parte, se debe tener en cuenta que varios estudios que evaluaron el efecto del
CAP en la reparación ósea no obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en
la histomorfometria, concluyendo que los cambios histológicos son muy pocos e
insuficientes para inferir sobre el efecto del CAP en la reparación ósea (Bonete et al.,
2009; Kanthan et al., 2011; Kazakos et al., 2011; Miloro et al., 2010). Por lo que es
necesario realizar estudios simultáneos donde se pueda comparar el efecto in vitro e in
situ controlando variables que permitan concluir a partir de los resultados obtenidos de
forma más específica sobre el uso del CAP en la reparación ósea.
Tabla 1. Resultados de la prueba t pareada y Wilcoxon para análisis histomorfométrico** por tiempo y tratamiento (área total/micrometros 2 (µm 2)).
Área
cartilaginosa
Valor
de p
Prueba
t
pareada
Área fibrosa Valor
de p
Prueba
t
pareada
Prueba
wilcoxon
30 CAP (336130±204509) 0.3632 NS (1717000±1035000) 0.8125 NS
CONTROL (757819±943327) (794100±1949000)
60 CAP (147580±91515) 0.3146 NS (1098000±432400) 0.7081 NS
CONTROL (255480±175198) (1198000±573800)
90 CAP (130235±126012) 0.4721 NS (1932000±1095000) 0,3125 NS
CONTROL (290358±360670) (1145000±1464000)
Los valores indican la media (Prueba t pareada) o mediana (Prueba de Wilcoxon) ± Desviación estándar,
NS: No significativo, * Diferencia significativa (p<0,05).
**Histomorfometria del área cartilaginosa y fibrosa de las secciones del cóndilo medial del fémur
izquierdo (CAP) y derecho (Control) en objetivo de 10x, microscopio trinocular invertido modular.
(IX73P2F, Japón, cámara Olympus XC50) Coloración tricrómico de Masson.
39
Figura 12. Características histológicas del cóndilo medial del fémur de conejos en tres
tiempos de muestreo
Secciones histológicas representativas marcadas con tricrómico de Masson (20x), provenientes del
miembro control (A, C, E) y miembro tratado con CAP (B, D, F). En A y B el área cartilaginosa muestra
activa reacción de proliferación con intenso aumento condroblástico (C) y menor diferenciación de
condrocitos (Co). En C y D se observan trabéculas cartilaginosas (L) en proceso de osificación e intensa
proliferación condroblástica y diferenciación de condrocitos con avanzada mineralización (m) de
cartílago. En D se observa osificación más avanzada. En F las trabéculas óseas presentan mayor
mineralización (enrojecimiento). En E se encuentran núcleos cartilaginosos que aún no presentaron
mineralización (nc). Medula ósea (Mo).
Fuente: Autor.
40
Figura 13. Característica histológica del cóndilo medial del fémur de conejo en tinción
H&E (20x).
Sección histológica proveniente de miembro control (A) y miembro tratado con CAP (B) a los 90 días
pos-quirúrgico. En ambas microfotografías se evidencian osteonas (Ot), indicando reparación ósea
completa. Medula ósea (Mo).
Fuente: Autor.
4.2 DETERMINACIÓN DE TIPO DE COLÁGENO MEDIANTE LA TINCION DE
PICROSIRIUS ROJO.
La tinción picrosirius rojo permitió distinguir entre las fibras de colágeno tipo I de color
rojizo o amarillento y tipo III de color verde. Según Ranjan et al., 2015, la intensidad de
la birrefringencia de las fibras de colágeno dependen del grosor de las fibras lo que
facilita la distinción entre fibras de colágeno maduras e inmaduras. El análisis
histológico realizado a las muestras del cóndilo medial del fémur teñidos con picrosirius
rojo (Fig. 15), en los diferentes tiempos de muestreo, mostraron que al día 30
posquirúrgico tanto los miembros tratados con CAP como los miembros control
presentaron distribución homogénea de colágeno tipo III (birrefringencia verde), a los
60 días los miembros control presentó mayor marcación de colágeno tipo I
(birrefringencia naranja y rojiza). Y los 90 días posquirúrgico la presencia de colágeno
tipo I fue predominante en los dos miembros, pero la marcación del colágeno tipo III
persistió en mayor proporción en los miembros tratados con CAP.
41
La histomorfometria de las fibras de colágeno tipo I y III a los 30 y 90 días en los dos
miembros, no mostró diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, a los 60
días posquirúrgico, hubo diferencia estadísticamente significativa (p=0.0198) en la
presencia de fibras de colágeno tipo I, representando mayor proporción en los
miembros control (367099 ± 90380) que en los miembros tratado con CAP (294534 ±
63381) (Fig. 14). Distintas citoquinas y factores de crecimiento pueden tener un efecto
sobre la síntesis de colágeno tipo I, como el TGF-β derivado de las plaquetas el cual
contribuye al aumento de la síntesis de colágeno tipo I por parte de los osteoblastos y
fibroblastos (Noda & Camilliere, 1989; Roberts et al., 1986); por el contrario en este
estudio, a los 60 días posquirúrgico los miembros control presentaron mayor proporción
de fibras de colágeno tipo I que en los miembros tratado con CAP, sugiriendo poca
síntesis o un periodo prolongado de maduración de las fibras de colágeno para los
miembros tratados con CAP, posiblemente asociado a un gasto de los factores de
crecimiento que se orientaron a la proliferación y maduración de las células
involucradas en la reparación ósea. Por lo tanto, los autores sugieren un estudio
enfocado a la determinación de fibras de colágeno tipo I y tipo III con técnicas
complementarias a la coloración de picrosirius rojo.
Figura 14. Resultado de la prueba t pareada para la determinación de colágeno tipo I,
en miembros tratados con CAP y control a los 60 días posquirúrgico.
Fibras de colágeno tipo I y III de las secciones del cóndilo medial del fémur izquierdo (CAP) y derecho
(control) en objetivo de 20x, microscopio de luz polarizada (Leica DM 4000B, cámara Leica DFC 500).
Coloración picrosirius Rojo.
Fuente: Autor.
42
Figura 15. Secciones histológicas del cóndilo medial del fémur de conejo en picrosirius
rojo.
Secciones histológicas representativas examinadas en microscopio de luz polarizada (20x). A, C, E
(miembros control), B, D, F (miembros tratados con CAP) a los 30, 60 y 90 días respectivamente. En A y
B se observa distribución homogénea de colágeno tipo III (birrefringencia verde). En C se destaca la
marcación de colágeno tipo I (birrefringencia naranja y rojiza) cuando comparado con D. la presencia de
colágeno tipo III en E y F es casi imperceptible.
Fuente: Autor.
43
5. CONCLUSIONES
Los análisis histológicos, sugieren que la precocidad en la proliferación y diferenciación
de condroblastos es influenciada por el concentrado autólogo de plaquetas, lo que
favorece la osificación.
El uso del concentrado autologo de plaquetas en lesiones experimentales del cóndilo
medial del fémur en el conejo no represento diferencias en el aumento del volumen
articular como respuesta inflamatoria local.
44
RECOMENDACIONES
Es necesario realizar estudios que manejen un mayor tamaño de muestra, lo que
permitirá minimizar el error estadístico y obtener datos más representativos sobre el
efecto del CAP en la reparación ósea.
El efecto del CAP sobre la síntesis de colágeno tipo I no fue claro en este estudio. Por
lo tanto, se sugieren estudios enfocados a la determinación inmunohistoquímica de
fibras de colágeno tipo I y tipo III en la reparación ósea usando CAP.
Realizar evaluaciones de los factores de crecimiento para evaluar la concentración de
los mismos en cada uno de los CAP que se obtenga.
Realización de estudios de imagenología que permitan evaluar cronológicamente la
evolución de la lesión quirúrgica hasta su cura total.
45
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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plasma enhances the immunohistochemical expression of platelet derived growth
factor and vascular endotelial growth factor in the synovium of the
meniscectomies rat models of osteoarthritis. Annals of anatomy, 197, 38-49.
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