reconocimiento unidad 3 el codigo genetico

Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fs.Nat. (Esp)Vol. 102, N. 1, pp 201-213, 2008IX Programa de Promocin de la Cultura Cientfica y Tecnolgica

EL CDIGO GENTICO CUMPLE 40 AOS

LUIS FRANCO VERA *

* Real Academia de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales. Universidad de Valencia. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. 46100 Burjassot, Valencia. [email protected]

INTRODUCCIN

En 1799, durante la campaa de Napolen enEgipto, las tropas francesas descubrieron una estela depoco ms de 1 m de alta, con inscripciones en dos sis-temas egipcios de escritura, caracteres jeroglficos ydemtico y en griego clsico. Debido al lugar en quese encontr, la estela, que se conserva actualmente enel British Museum, se conoce hoy da con el nombre depiedra de Rosetta. La comparacin del texto undecreto de Ptolomeo V en los diferentes idiomas fuedeterminante para que los especialistas, entre los quedestac el egiptlogo francs Jean-Franois Champo-llion, consiguieran descifrar los caracteres jeroglficosen 1822.

Si el desciframiento de la piedra de Rosetta fuedecisivo para la Egiptologa, en la Biologa Molecularse dio un acontecimiento de similar importancia.Haba que descifrar el cdigo gentico, algo necesariopara conocer como las clulas son capaces de traducirun lenguaje de cidos nucleicos a otro de protenas. Enlas lneas que siguen se intenta poner de manifiestocmo el desciframiento del cdigo gentico result sertan apasionante como el de los caracteres jeroglficos,con la diferencia de que en vez de durar 23 aos, eltrabajo se termin en poco ms de 5. La competenciaentre los diversos laboratorios implicados en la ingentetarea fue, posiblemente, uno de los factores que permi-tieron culminar la investigacin en un tiempo rcord,ya que todos trabajaron contra reloj en su afn dealcanzar la solucin asegurando la prioridad de susdescubrimientos.

EL PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En 1866, Gregor Mendel emple por primera vez eltrmino gen. Aunque haba de pasar mucho tiempohasta que se perfilara su concepto se puede decir quean no se ha terminado de perfilar y se conocieraque el DNA es el componente de los genes, las investi-gaciones del fraile agustino echaron los cimientos de laGentica moderna. Casi un siglo ms tarde, en 1958,Francis Crick, que 5 aos antes haba propuesto conJames Watson la estructura de doble hlice para elDNA, postul el dogma central, segn el cual, el flujode informacin gentica desde el DNA hasta las pro-tenas las destinatarias de esa informacin pasapor el RNA (1). Aunque la publicacin formal deldogma central tuvo lugar en 1958, la idea de que elRNA serva de intermediario estaba en la mente deCrick y en la de otros investigadores desde unos aosantes, como veremos enseguida. En lneas generales,los procesos implicados en ese flujo se han revisado enotro lugar (2) y all se han comentado las razones porlas que se denomina transcripcin al paso de la infor-macin desde el DNA hasta el RNA y traduccin altrnsito de esa informacin desde el RNA hasta lasprotenas. Baste ahora con recordar que, aunque hayvarios tipos de RNA, slo uno, el RNA mensajero,abreviado como mRNA, desempea ese papel de inter-mediario informativo entre el DNA y las protenas.

En 1955 Paul Zamecnik haba descubierto que latraduccin, o biosntesis de protenas, tiene lugar enlos ribosomas (3), unos pequeos orgnulos presentesen todas las clulas. Los ribosomas de las clulas pro-

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cariticas tienen un coeficiente de sedimentacin1 de70S y estn formados por dos subunidades de 50 y30S. Los ribosomas eucariticos son algo mayores, de80S, y tambin poseen dos subunidades, en este casode 60 y 40S. En todos los casos, las subunidades ribo-somales estn constituidas por protenas y RNA. EsteRNA ribosomal, del que existen varias molculas dediverso tamao, se abrevia como rRNA. Aunque en unprincipio se pens que el rRNA desempeaba el papelde mensajero, Jacob y Monod, en 1961, postularon laexistencia del mRNA como molcula independiente(4) y ese mismo ao se demostr su presencia tanto enprocariotas como en eucariotas.

Dejando aparte los problemas mecansticos, tancomplejos que siguen siendo objeto de una activainvestigacin, la transcripcin es conceptualmentefcil. Es bien sabido que la informacin contenida enuna molcula de DNA depende de su secuencia, delorden en que se encuentran encadenados los nucle-tidos que lo componen, de la misma manera que elsentido de una frase escrita depende del orden en quese hayan colocado las letras que la forman. Los nu-cletidos que constituyen el DNA difieren en susbases, que pueden ser 4: adenina, guanina, timina ycitosina, que en lo sucesivo designaremos de ordinarioslo con sus iniciales, A, G, T y C. El RNA es tambinun polmero lineal formado por 4 nucletidos, pero eneste caso T est reemplazada por el uracilo, U, unabase de rasgos estructurales muy similares. Teniendoen cuenta estos datos y la conocida propiedad de lasbases de aparearse especficamente, G con C y A con T(o U), es fcil comprender que si una cadena de DNAtiene, por ejemplo, la secuencia ...ATTGGCTACGAT-TACGGTA... cuando se transcriba su hebra comple-mentaria, el mRNA resultante se leer: ...AUUGGCU-ACGAUUACGGUA... Pero las cadenas polipep-tdicas que forman las protenas estn constituidas por20 aminocidos, por lo que la traduccin presenta unproblema conceptual ms serio: cmo pasar de unalfabeto de 4 nucletidos a otro de 20 aminocidos?Otro problema aadido, y no pequeo, es la falta decomplementariedad entre bases y aminocidos. Si bienexiste un apareamiento especfico entre las bases queforman los nucletidos, examinando las estructuras de

bases y de aminocidos, no se ve ninguna relacinestructural entre ambos grupos de compuestos.

Pero vayamos por partes. En primer lugar, cuntosnucletidos del RNA mensajero son necesarios paradeterminar la colocacin de un aminocido? Es evi-dente que, habiendo slo 4 nucletidos, la respuesta nopuede ser uno. Si as fuera, slo se podran determinar4 aminocidos. Y si fueran 2? Entonces, la combina-toria nos dice que cabran 42 16 posibilidades: AA,AG, AU, AC, etc. Siguen siendo insuficientes para los20 aminocidos. Si fueran 3, es decir, si cada tripletede nucletidos (o de bases, que es la parte variable deun nucletido a otro) determinara la colocacin de unaminocido, las posibilidades seran 43 64. Ahorasobran posibilidades, pero esto no constituye unproblema si hay algunos tripletes que no correspondena ningn aminocido o si cada aminocido vienedeterminado por ms de un triplete. Es esencial com-prender que en el flujo direccional de informacin, queva del mRNA a las protenas, lo problemtico seraque una combinacin de bases pudiera corresponder ams de un aminocido. Esa ambigedad dara al trastecon la fidelidad con que debe producirse la traduccin,ya que la maquinaria traduccional se encontrara conindeterminaciones que no se podran resolver fcil-mente. Por el contrario si, como veremos que sucede,los tripletes UUA y CUG corresponden al aminocidoleucina, no hay problemas. Tanto cuando aparezca unocomo otro en el mRNA, la maquinaria de traduccincolocar leucina en el lugar correspondiente de lacadena polipeptdica y, como nunca hay un flujo deinformacin desde protenas hacia RNA, las clulas nose encontrarn con situaciones ambiguas.

El primer investigador que lleg a la conclusin deque cada unidad de codificacin, que pronto comenza designarse codn, estaba constituida por un tripletede nucletidos fue el fsico ruso Georgii Gamov (5).Lo hizo por un simple razonamiento matemtico,como se ha expuesto ms arriba, ya que la formacinde Gamov no era biolgica ni qumica. Pero ello nofue obstculo para que, tras el descubrimiento de ladoble hlice, se interesara profundamente por losproblemas planteados por la transmisin del mensaje

=

=

1 El coeficiente de sedimentacin es un parmetro relacionado con la velocidad a la que sedimenta una partcula en un campo centrfugo. Semide en unidades Svedberg (S), denominadas as en honor de Theodor Svedberg, pionero de la ultracentrifugacin aplicada a la bioqumica.

gentico. Comprendi que la solucin llegara a travsde un esfuerzo multidisciplinar y en 1954, con uninnegable toque de buen humor, fund el RNA TieClub, llamado as porque sus 24 miembros 20 porel nmero de los aminocidos y 4 por el de los nucle-tidos llevaban una corbata con una hlice bordada,que dise el propio Gamov. La finalidad del club eraresolver el enigma de la estructura del RNA y com-prender cmo construye las protenas. Francis Crickera, por derecho propio, uno de los miembros del club;le corresponda el apelativo de Tyr, por elaminocido tirosina.

Centremos ahora la atencin en el segundo de losproblemas enunciados anteriormente, es decir, en elmodo por el que puede cada aminocido reconocer sutriplete especfico. Las actividades del RNA TieClub fueron decisivas al respecto. Francis Crickpropuso en 1955 la hiptesis del adaptador segn lacual alguna estructura, hasta ahora desconocida,transporta los aminocidos y los coloca en el ordencorrespondiente a la secuencia sobre una hebra decido nucleico. La hiptesis no lleg a publicarse enuna autntica revista cientfica, aunque como diraCrick ms tarde, fue su artculo no publicado msinfluyente. Pero dejemos que explique l mismo lahiptesis:

La idea fundamental era que resulta muy difcilconsiderar cmo el DNA o el RNA en cualquierposible estructura pueden constituir un moldeinmediato para las cadenas laterales de los veinteaminocidos. Lo que se esperara de cualquierestructura posible es una distribucin especfica degrupos atmicos que puedan formar enlaces dehidrgeno. Por lo tanto, propuse una teora segn lacual existiran veinte adaptadores (uno para cadaaminocido), junto con veinte enzimas especiales.Cada enzima sera capaz de unir un aminocido con-creto a su propio adaptador especfico. Estos com-plejos se trasladaran por difusin al molde de RNA.Una molcula de adaptador podra encajar slo enaquellos lugares del molde de cido nucleico en losque pudiera formar los enlaces de hidrgeno nece-sarios para manenerlo en su lugar. Al hacer eso, eladaptador habra llevado a su aminocido precisa-mente al lugar correcto en que haca falta (6)

No hubo que esperar mucho para confirmar lahiptesis del adaptador. En 1958 el grupo deZamecnik, el descubridor del papel del ribosoma en lasntesis de protenas, describi la existencia de unasmolculas pequeas de RNA que desempeaban elpapel sugerido por Crick (7). Habida cuenta de supapel, esa nueva especie de RNA pas a denominarseRNA de transferencia, tRNA. Cada aminocidoreconoce y se une a un tRNA especfico, gracias a laaccin de la correspondiente aminoacil-tRNA sin-tetasa. Y la presencia en el tRNA de un triplete com-plementario al codn, que llamaremos a partir de ahorael anticodn, permite que encajen los diversosaminoacil-tRNAs sobre el mRNA en un orden correc-to. Todo este conjunto de interacciones tiene lugarsobre el ribosoma, que se encarga de separar de sustRNAs los aminocidos, ya ordenados, y de enca-denarlos entre s mediante la formacin de los enlacespeptdicos2.

HACIA EL DESCIFRAMIENTO DELCDIGO

En este momento puede proponerse ya el temacentral de este artculo. La existencia de 64 posiblestripletes de nucletidos plantea inmediatamente lacuestin: qu aminocido codifica cada uno de los 64codones? Descubrir este cdigo, el cdigo genticocomo se comenz a llamar desde el principio, atrajo laatencin de varios laboratorios en los inicios de ladcada de 1960, cuando ya se estaba en posesin de losconocimientos que se han recogido ms arriba.

Pero los antecedentes de la historia hay que bus-carlos en 1955. En ese ao, en el laboratorio de SeveroOchoa se realiz un descubrimiento de crucial impor-tancia. Consiguieron caracterizar la polinucletido fos-forilasa, enzima que cataliza la reaccin reversible:

en la que XMP es uno cualquiera de los 4 nucletidosque componen el RNA. Hay que caer en la cuenta deque el producto, que en el esquema se ha representado

( ) [ ]innXDP XMP nP I ,+U

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2 El lector interesado puede encontrar los detalles de este proceso, que caen fuera del alcance de este captulo, en cualquier texto actual deBioqumica o Biologa Molecular.

como (XMP)n, es un polmero de ribonucletidos, esdecir un RNA. Lo que haban hecho Ochoa y suscolaboradores era sintetizar in vitro, por primera vez,un RNA, un cido nucleico (8). Puede comprenderse laemocin del Profesor Severo Ochoa cuando realizeste descubrimiento. Muchos aos ms tarde, en 1989,lo recordaba en una conferencia pronunciada enValencia, que comenz con las palabras:

Quisiera hoy discurrir sobre la satisfaccin quepuede producir el dedicar la vida a la investigacincientfica. Pocas veces he sentido emocin msintensa que cuando cre haber hecho descubrimientosde alguna trascendencia (9).

La polinucletido fosforilasa no tiene in vivo lafuncin de catalizar la sntesis de RNA. A la vista deldogma central, la transcripcin traslada al RNA lainformacin contenida en el DNA. Es necesaria lapresencia de un DNA que acte como molde para quela transcripcin tenga lugar y la polinucletido fosfo-rilasa ni requiere DNA, ni une los nucletidos en unorden determinado, sino que lo hace al azar. De hecho,in vivo la enzima funciona segn el esquema [I], perode derecha a izquierda, es decir, destruyendo el RNA.El que la enzima no se encargara in vivo de sintetizar elRNA no quit valor al hecho de haber conseguido sin-tetizar un RNA, al contrario, la investigacin supuso elpremio Nobel para Ochoa. Pero, para el fin que per-

sigue el presente artculo, el inters del descubrimientoradica en que hizo que Ochoa se interesara por eldesciframiento del cdigo gentico.

Gracias a los trabajos de los grupos de Zamecnik yde Nirenberg, se conocan los requisitos necesariospara llevar a cabo la biosntesis de protenas en sis-temas acelulares, es decir, in vitro. Esencialmente, sonnecesarios, adems de los ribosomas y del mRNA, unextracto que contenga todas las enzimas, tRNAs y fac-tores precisos, una fuente de energa que proporcionela necesaria para la formacin del enlace peptdico y,por descontado, los aminocidos que se polimerizarnal formar la cadena polipeptdica. La fig. 1 esquema-tiza un experimento de traduccin in vitro y en l seaprecia cmo el sedimento final, que contiene lospolipptidos sintetizados, ser radiactivo siempre queel aminocido marcado isotpicamente se haya incor-porado. El grupo de Ochoa comenz a utilizar lareaccin catalizada por la polinucletido fosforilasapara sintetizar polinucletidos artificiales, con la ideade utilizarlos en una reaccin como la esquematizadaen la fig. 1 en sustitucin del mRNA. Pero cuandoestaban comenzando ese trabajo, en el V CongresoInternacional de Bioqumica celebrado en Mosc seenteraron de que otro grupo, el de Marshall Nirenbergse les haba adelantado. As lo narra Carlos Basilio, uncolaborador de Ochoa, testigo del histrico momento:

Cuando acabbamos de iniciar nuestro trabajo,Marshall Nirenberg comunic en el CongresoInternacional de Bioqumica de Mosc que el cidopoliuridlico promova la sntesis de polifenilalanina.

Algunos cientficos asistentes al Congreso con-taron que los oyentes quedaron electrizados por lanoticia. Cuando volvi de Mosc un miembro denuestro Departamento y nos comunic la novedad,quedamos literalmente petrificados (10).

El experimento de Nirenberg, que se public pocoms tarde (11), haba seguido el protocolo esquema-tizado en la fig. 1. Y para preparar un polinucletidoque hiciera las veces de mensajero haban empleado lareaccin de la polinucletido fosforilasa, partiendoexclusivamente de UDP. Evidentemente, en estascondiciones slo se poda obtener un homopolmero,el cido poliuridlico, poli(U). Usando ste como men-sajero, nicamente se consegua que apareciera radiac-tividad en el sedimento cuando el aminocidoradiactivo era la fenilalanina. Y entonces, en el sedi-


Figura 1. Esquema de un experimento de traduccin in vitro.Tras la incubacin de una mezcla de todos los componentesindicados, se aade cido tricloroactico, que precipita las pro-tenas y cidos nucleicos. Evidentemente, si el aminocidomarcado isotpicamente se ha incorporado a una cadenapolipeptdica naciente, aparecer radiactividad en el sedimen-to.

mento apareca un homopolipptido, la polifeni-lalanina, poli(Phe). El experimento fue especialmenterelevante por varias razones. La primera de ellas, eraque se demostraba sin lugar a dudas el papel delmRNA en la sntesis de protenas: en el poli(U) sloexisten los codones UUU y, por tanto, slo puedeesperarse la sntesis de un polipptido repetitivo. Peroen segundo lugar, el experimento signific el inicio deldesciframiento del cdigo gentico: el codn UUUcodifica la fenilalanina.

Es fcil imaginar la decepcin de los miembros dellaboratorio de Ochoa; otro grupo se haba adelantado asu investigacin utilizando sus mismas armas. Perolejos de desanimarse, la reaccin de Ochoa y suscolaboradores fue lanzarse a una frentica carrera paraconseguir descifrar el significado de los 63 codonesrestantes. Por supuesto el equipo de Nirenberg noabandon el trabajo y en los dos aos siguientes elgrupo de Ochoa public 14 artculos sobre el cdigogentico y el de Nirenberg 12. Con homopolinucle-tidos se consigui demostrar que el codn AAA corres-ponde a la lisina y el CCC a la prolina. Los resultadoscon poli(G) no fueron concluyentes y entoncescomenz el trabajo con polinucletidos mixtos. Elequipo de Ochoa consigui una ligera ventaja sobre elde Nirenberg, al ser el primero en comprobar que lospolinucletidos que contenan dos bases diferenteseran capaces de dirigir la sntesis de polipptidos queincluan diferentes aminocidos. Por ejemplo, el pro-ducto formado por la reaccin de la polinucletido fos-forilasa usando como sustratos UDP y CDP a unarelacin molar 5:1 promova la incorporacin mayori-taria de fenilalanina, pero tambin se incorporabanserina y leucina y, en menor proporcin, prolina (12).Aos despus, Ochoa mantena vivo el recuerdo delmomento en que obtuvieron los primeros resultados desu experimento:

Cuando, en nuestro primer experimento,Lengyel, Speyer y yo observamos ansiosamente elcontador de radiactividad y vimos que los polinu-cletidos que contenan dos bases diferentes pro-movan la incorporacin de diversos aminocidos,nuestro entusiasmo no tuvo lmites. (...) Siemprerecordar aquel momento como uno de los ms emo-cionantes de mi vida (9).

Como la polinucletido fosforilasa produce polinu-cletidos de secuencia al azar, el producto obtenidopor polimerizacin de U y C, puede contener codones

de composicin U3, U2C, UC2 o C3. A su vez, loscodones U2C pueden tener la secuencia UUC, UCU oCUU, mientras que los UC2 pueden ser UCC, CUC oCCU. Con la salvedad de los codones UUU y CCC,que ya estaban asignados por los experimentos conhomopolinucletidos, quedaba la ingente tarea decomprobar cul o cules de los otros 6 codones corres-pondan a los aminocidos incorporados. Para abordaresta cuestin, tanto el grupo de Ochoa como el deNirenberg utilizaron una estrategia similar: analizar laproporcin de los aminocidos incorporados enfuncin de la proporcin de U y C en la mezcla depolimerizacin. Los resultados experimentales paraserina y leucina se recogen en la figura 2. Hay quetener en cuenta que, estadsticamente, la frecuenciacon la que aparecern en el producto de reaccin loscodones que contengan ms U disminuir a medidaque disminuya la relacin U:C. Por ejemplo, se puedecalcular esta frecuencia para los codones de com-posicin UC2 y U2C, con los resultados que se recogenen las curvas de la figura 2. A primera vista puedeparecer sorprendente que los puntos experimentales nose ajusten a ninguna de la curvas, pero hay que tener encuenta que, como el nmero de tripletes posibles essuperior al de aminocidos, el cdigo gentico puedeestar degenerado, es decir, a cada aminocido puedencorresponder varios tripletes, una posibilidad que se haapuntado antes y que hizo notar por primera vez


Figura 2. Resultados experimentales de la incorporacin deserina y leucina dirigida por polinucleotidos formados por U yC en funcin de la fraccin molar de este ltimo nucletido.Las curvas representan la probabilidad de encontrar tripletesde composicin U2C o UC2.

Gamov (5). Por eso, en la figura 3 se aade la suma delas dos curvas, es decir la frecuencia de UC2 U2C enfuncin de la proporcin de C. Puede verse que todoslos puntos experimentales se ajustan ahora razonable-mente bien a la curva resultante, lo que indica que a losaminocidos serina y leucina les corresponden mas deuno de los tripletes UUC, UCU, CUU, UCC, CUC oCCU. Pero, en buena lgica, teniendo en cuenta ladegeneracin del cdigo, alguno o algunos de estoscodones podra tambin corresponder a fenilalanina(adems del ya conocido UUU) o a prolina (ademsdel CCC). Para aclarar esta cuestin, se analiz, por unprocedimiento similar, la frecuencia de aparicin deestos dos ltimos aminocidos, con los resultados de lafigura 4. Analizando estos resultados con los criteriosmencionados antes, se puede concluir que para la feni-lalanina, adems del codn UUU, existe uno U2C ypara la prolina, adems del CCC existe otro UC2.

De esta forma se fueron dando pasos entre 1962 y1964. Por supuesto, los grupos de Ochoa y deNirenberg analizaron todas las posibles combinacionesde nucletidos en la mezcla de polimerizacin, con loque obtuvieron resultados con poliUA, poli UG, etc.

En el transcurso de estos experimentos se obtuvo,adems, la comprobacin experimental de algo que sevena dando por supuesto, pero que no estaba andemostrado de modo fehaciente: que los codones eranrealmente tripletes (13). Pero el rompecabezas queimplicaba el desciframiento total del cdigo genticoera demasiado complejo para que se pudiera resolverslo con esa aproximacin y hubo que esperar a queaparecieran nuevas tcnicas.

LA SOLUCIN

El apartado anterior terminaba anunciando lanecesidad de una metodologa nueva para despejar lasnumerosas incertidumbres que se presentaban en eldesciframiento del cdigo gentico. En este momentohizo su aparicin en escena Gobind Khorana, quedescribi un procedimiento para la sntesis de polinu-cletidos de secuencia alternante. El mtodo daba unpequeo rodeo: se sintetizaba primero un DNA arti-ficial de secuencia alternante y, mediante transcrip-cin in vitro se lograba despus el polirribonucletidoalternante (14). As, el polirribonucletido que sedesigna como poli(UC) tiene la secuencia ...UCUCU-CUCUCUC... y, evidentemente, contiene una sucesinde dos tripletes: UCU y CUC. El producto obtenido enun sistema de traduccin in vitro como el de la fig. 1,es un polipptido de secuencia alternante, que puedeser Leu-Ser-Leu-Ser... o bien Ser-Leu-Ser-Leu..., yaque la traduccin puede empezar por cualquier punto3.La conclusin de este experimento es que UCU y CUCcorresponden a leucina o serina. An no se puedeasignar cada triplete a uno de esos dos aminocidos,pero por exclusin se obtiene otra conclusin. Si antesse haba concluido que un triplete de composicin U2Cperteneca a la fenilalanina, ahora se puede descartarque sea UCU. De la misma manera se puede descartarque CUC corresponda a prolina. El mtodo deKhorana permite tambin la sntesis de polinucletidoscon repeticin de tres bases.

Con todas esas aproximaciones experimentales, sedio un paso de gigante en la dilucidacin del cdigogentico, pero an faltaban otras aportaciones deci-sivas. La primera de ellas vino otra vez de la mano del

+


Figura 3. Se muestran los mismos resultados experimentalesde la figura 2, pero se ha aadido la suma de las probabili-dades de encontrar tripletes de composicin U2C o UC2. Losresultados muestran que a los aminocidos serina y leucina lescorresponden al menos dos de los tripletes UUC, UCU, CUU,UCC, CUC o CCU.

3 Es evidente que, in vivo, la traduccin no puede empezar por cualquier lugar del mRNA. Pero los sistemas acelulares que se emplean invitro, aunque son vlidos para estudios relacionados con el cdigo gentico, no garantizan un inicio correcto de la traduccin.

grupo de Nirenberg. En 1964 comprobaron que losribosomas son capaces de unir un tRNA especfico enpresencia de un trinucletido cuya secuencia sea la delcodn correspondiente. La unin puede medirse fcil-mente, porque los ribosomas se retienen en filtros denitrocelulosa (15). As pues, se incuba una mezcla deribosomas, un aminoacil-tRNA marcado isotpica-mente y un trinucletido, se filtra la mezcla y luego semide la radiactividad retenida en el filtro. Si noaparece radiactividad en el filtro, es porque no se haretenido el aminoacil-tRNA, o lo que es lo mismo,porque el trinucletido no es el codn correspondienteal aminocido cargado en el tRNA. Por el contrario, siel filtro aparece radiactivo, la conclusin es que el tri-nucletido empleado es un codn perteneciente alaminocido. El primer codn que se asign de estemodo fue GUU, como correspondiente a valina (16). Aesta asignacin siguieron otras llevadas a cabo por elmismo mtodo.

La segunda aportacin fue la de Holley. Este inves-tigador haba perfeccionado los mtodos de secuen-ciacin de RNA y consigui llevar a cabo la primeradeterminacin de la estructura primaria de un tRNA de

levadura especfico de alanina, abreviadamente,tRNAAla. Evidentemente, la secuencia del anticodnpermite, por complementariedad, deducir la del codn.Con este mtodo indirecto se llegaron a descifrar trescodones.

En las lneas precedentes se han resumido las apa-sionantes investigaciones que, comenzadas con elexperimento fundacional de Nirenberg con la asig-nacin del codn UUU a la fenilalanina en 1961, per-mitieron en poco ms de 5 aos llegar a asignar concerteza 59 de los 63 tripletes restantes. A dos de ellos,UAA y UAG, se les adjudic el papel de terminadoresde la cadena polipeptdica, basndose en datosgenticos (para una revisin contempornea a la inves-tigacin, ver la ref. 18). Como se ha apuntado, loslogros fueron fundamentalmente de los laboratorios deNirenberg, Ochoa, Khorana y Holley, aunque partici-paron otros muchos. La figura 5 recoge las aporta-ciones de los diferentes grupos al desciframiento delcdigo. Como resultado de estas brillantes contribu-ciones a la Biologa Molecular, Nirenberg, Khorana yHolley recibieron en 1968 el premio Nobel deFisiologa o Medicina por su interpretacin delcdigo gentico y su funcin en la sntesis de pro-tenas. Ochoa, como se ha comentado, lo habarecibido en 1959 por la sntesis enzimtica de polirri-bonucletidos.


Figura 4. Resultados experimentales de la incorporacin defenilalanina y prolina dirigida por polinucletidos formadospor U y C en funcin de la fraccin molar de este ltimo nu-cletido. Las curvas representan la probabilidad de encontrartripletes formados homogneamente por U o por C, as comola suma de estas probabilidades y las de encontrar, respectiva-mente, tripletes de composicin U2C o UC2. Los resultadosmuestran que a la fenilalanina, adems del codn UUU lecorresponde otro de la serie UUC, UCU, CUU, UCC, CUC o CCUy la prolina, adems de CCC, posee algn codn de esa serie.

Figura 5. Nmero de codones asignados por los diversos gru-pos de trabajo. En amarillo se representa el total de codonesasignados en cada laboratorio, mientras que las barras rojasindican los descubiertos exclusivamente por el grupo indicado.

Quedaban, pues, 4 tripletes dudosos, UGA, AGG,AGC y CUG. Para el primero se dudaba si era tambinun codn de terminacin o si perteneca a la cistena.Poco despus se demostr que la primera opcin era lavlida. Los otros tres se asignaron provisionalmente aarginina, serina y leucina, respectivamente. El tiempodemostr que esas asignaciones provisionales eranvlidas. De esta manera, se lleg a construir la tablaque resume el cdigo gentico (Fig. 6) y que resultatan familiar a cualquier estudiante de Biologa.

En 1966 todava quedaban algunos flecos sueltosen el estudio del cdigo gentico. Como se ha comen-tado antes (vase la nota 3), es evidente que la tra-duccin del mRNA no puede empezar por cualquierlugar si ha de producir una protena especfica.Tngase en cuenta que, al estar constituido el cdigogentico por tripletes, el desplazamiento de uno o dosnucletidos en la pauta de traduccin significara cons-

truir un polipptido de estructura primaria totalmentediferente4. En 1966 se obtuvieron los primeros datosexperimentales sobre la iniciacin de la traduccin enprocariotas y en los siguientes aos el problema quedcentrado. El triplete AUG sirve no slo para codificarla metionina, sino tambin como seal de iniciacin.De hecho, las cadenas polipeptdicas nacientes, tantoen procariotas como en eucariotas, comienzan con elaminocido metionina5. En procariotas existen dostRNAs especficos de metionina, el tRNAf

Met y eltRNAm

Met. El primero se emplea para la iniciacin dela traduccin y la metionina que transporta seencuentra N-formilada. As pues, las cadenas polipep-tdicas nacientes, estrictamente hablando, en proca-riotas comienzan por N-formil-metionina (fMet). Paraque se inicie la traduccin, se ha de formar un com-plejo de preiniciacin entre fMet-tRNAf

Met, la sub-unidad 30 S del ribosoma y el mRNA. Se requiere paraello la participacin de dos protenas no presentes en el


Figura 6. El cdigo gentico. La tabla es de triple entrada: en la primera columna se indica la primera base del codn (extremo 5');la segunda base se lee en las columnas centrales (coloreadas en amarillo) y la tercera (extremo 3') aparece en la ltima columna.

4 En este sentido, se llama cambio de fase a ese desplazamiento de la pauta de lectura que ocurre en la naturaleza, por ejemplo, cuando seproduce una delecin o insercin de uno o dos nucletidos.5 El que la traduccin comience por metionina no significa estrictamente que todas las cadenas polipeptdicas maduras posean este amino-cido como residuo N-terminal. La mayora de las protenas se sintetizan en forma de precursores y, muy frecuentemente, en la maduracin sepierden aminocidos del extremo N-terminal, incluida la metionina con la que comienza la traduccin.

ribosoma, los denominados factores de iniciacin IF-1e IF-3, as como de un tercer factor de iniciacin, IF-2,que liga GTP. Cerca del codn de iniciacin, AUG, seencuentra en todos los mRNAs una secuencia debases, conocida como secuencia Shine-Dalgarno enhonor de sus descubridores, que interacciona con lasubunidad pequea del ribosoma y ayuda a que elfMet-tRNAf

Met se site con su anticodn interaccio-nando con el codn AUG. En este momento, seensambla la subunidad 50S del ribosoma para formarel complejo de iniciacin, con el aporte energticoprocedente de la hidrlisis del GTP, efectuada por elpropio IF-2, que tiene actividad de GTPasa.

El segundo tRNA especfico de metionina,tRNAm

Met, se ocupa de posicionar al aminocido en loslugares determinados por los codones AUG internosdurante la fase de elongacin de la cadena polipep-tdica. La subunidad mayor del ribosoma tiene treslocalizaciones, denominadas E, P y A. El complejo deiniciacin tiene situado el fMet-tRNAf

Met sobre el sitioP. A continuacin, un nuevo aminoacil-tRNA, aqulcuyo anticodn sea complementario del codn si-guiente al de iniciacin, se coloca sobre la localizacinA. Entonces, la peptidil transferasa, una actividad en-zimtica que reside en una de las molculas de rRNAde la subunidad 50S concretamente en el rRNA23S6 cataliza la formacin del enlace peptdico entreel grupo amino libre del aminocido recin ensam-blado y el carboxilo de la formil-metionina, que estabaunido al extremo 3' de su tRNA. Tras la formacin delenlace peptdico, tiene lugar la fase de translocacin,en la que el peptidil-tRNA resultante se sita sobre lalocalizacin P, el tRNAf

Met vaco pasa a la localizacinE antes de abandonar el ribosoma y el sitio A quedalibre y enfrentado al siguiente codn, listo para recibiral siguiente aminoacil-tRNA. Para esta fase de elon-gacin, se requiere nuevamente GTP como sumi-nistrador de energa (tanto para el ensamblamiento delaminoacil-tRNA sobre el sitio A, como para el cambiode conformacin del ribosoma requerido para latranslocacin), as como de otros tres factores pro-teicos de elongacin, EF-Tu, EF-Ts y EF-G.

La elongacin de la cadena polipeptdica continahasta que en el mRNA se encuentra un codn de termi-nacin. Cuando ste se enfrenta a la localizacin A,sta permanece libre, ya que no existe ningn tRNAque pueda complementar los codones de terminacin.Esto sirve de seal para que la peptidil transferasa selimite a catalizar la hidrlisis del enlace ster que uneel polipptido formado al ltimo tRNA, con lo que lacadena se libera, el ribosoma se desensambla y elmRNA se libera. Tambin para esta fase de termi-nacin se requiere energa aportada por el GTP y lapresencia de factores de terminacin o de liberacin(RF1, RF2 y RF3).

En eucariotas los procesos de iniciacin, elon-gacin y terminacin son muy similares a los que seacaban de apuntar. Tambin existen dos tRNAs para lametionina, pero en este caso, la metionina iniciadorano est formilada. Otra diferencia se encuentra en losfactores de iniciacin, elongacin y liberacin.

El examen de la Fig. 6 permite concluir que, comoera de esperar, no hay ambigedades en el cdigogentico. De hecho, el que el triplete AUG signifiquemetionina tanto para la iniciacin de la cadena comopara las posiciones internas del aminocido no cons-tituye ambigedad alguna, pues la existencia de dostRNAMet, como se acaba de mencionar, salva lasposibles dificultades. Lo que s existe es degeneracin,una degeneracin que se da en grado variable. As,mientras que para algunos aminocidos, como el trip-tfano, slo existe un triplete, para otros, como laleucina, existen 6. El nmero de tripletes no est rela-cionado con la abundancia de cada aminocido en lasprotenas. Por ejemplo, por trmino medio, la lisina esmucho ms abundante que la histidina en las protenasy, sin embargo, ambos poseen el mismo nmero decodones.

Adems de las cuestiones relativas a la iniciacin,elongacin y terminacin de la traduccin, que se hanmencionado ms arriba7, en 1966 quedaba an otrofleco suelto en el estudio del cdigo gentico. Cuando


6 Se trata, pues, de una ribozima, como se denominan las enzimas que, en vez de ser de naturaleza proteica, estn constituidas por RNA. Lasribozimas son muy raras en los organismos actuales, aunque parece que tuvieron un protagonismo importante en los primeros tiempos de lavida en nuestro planeta.7 Por caer fuera del alcance de este artculo, estas cuestiones se han tratado aqu de una forma sucinta. El lector interesado puede encontrarms detalles en cualquier texto actual de Bioqumica y Biologa Molecular.

se comenz a fraccionar la mezcla de los tRNAs, seobserv que, como era de esperar por la degeneracindel cdigo, se podan encontrar varios tRNAs para unmismo aminocido, pero el nmero total de especiesdistintas de tRNA no llega a ser 61, el nmero decodones que codifican aminocidos8. Eso quiere decirque un anticodn puede interaccionar con ms de uncodn. Este sorprendente hallazgo, junto con el nomenos sorprendente de que al secuenciar el tRNAAla seencontr como anticodn una secuencia, IGC, quecontena una base anmala, la inosina (17). Un aoms tarde, al secuenciar el tRNASer de levadura, seencontr el anticodn IGA (19). Teniendo en cuentaque, como en todos los casos de apareamiento de basesen cidos nucleicos, el apareamiento codn-anticodnimplica que cada cadena tiene una orientacin distinta,la base rara inosina debe aparear con la tercera base delcodn, precisamente la variable entre los 4 codones dela alanina y entre 4 de los 6 de la serina (Fig. 6). Apartir de estos datos, y tras un profundo examen delcdigo gentico, Crick elabor la hiptesis del balan-ceo, segn la cual el apareamiento de las dos primerasbases del codn con las correspondientes del anti-codn es estricto, pero el de la tercera base presentauna mayor flexibilidad (20). Crick lleg incluso a pro-poner unas reglas para el apareamiento de esa tercerabase del codn que las investigaciones posterioresdemostraron ser ciertas. La figura 7 muestra de modo

esquemtico la hiptesis del balanceo. Ms reciente-mente se han formulado algunas precisiones a lahiptesis elaborada por Crick (21).

La historia del desciframiento del cdigo genticocomenz, pues, en 1961 con el trascendental des-cubrimiento de que el triplete UUU codifica a la feni-lalanina y prcticamente culmin cinco aos ms tardecon el establecimiento de la hiptesis del balanceo. Escierto que algunos detalles particulares tardaron un parde aos en aclararse totalmente, pero en esencia, elingente trabajo de descifrar los 64 codones se realizen tan slo 5 aos, constituyendo una de las pginasms brillantes de la investigacin biolgica.

CUL ES LA SITUACIN 40 AOSDESPUS?

Han transcurrido 40 aos desde que se termin eldesciframiento del cdigo gentico. Qu nuevas pers-pectivas ha introducido la investigacin en esteperiodo? La primera concierne a la universalidad delcdigo gentico. El problema, una vez ms, fue yaplanteado por Crick en su discurso al recibir el premioNobel en 1962. En esa memorable ocasin, deca:

Hay una cuestin general adicional acerca delcdigo gentico que nos podemos formular en estemomento. El cdigo, es universal, es decir, elmismo en todos los organismos? Los datos prelimi-nares sugieren que muy bien podra ser (22).

Efectivamente, en lneas generales se puede decirque el cdigo gentico es universal. Pero algunasexcepciones a esa regla general se han ido acumulandoen los aos posteriores. La primera se observ en1979, cuando se descifr el cdigo gentico mitocon-drial9. En las mitocondrias de vertebrados, AGA yAGG son codones de terminacin, en vez de codificararginina, mientras que UGA codifica triptfano en vezde ser un codn de terminacin. Adems, AUA codi-fica a la metionina. El cdigo gentico mitocondrial delevadura presenta alguna semejanza con el de mitocon-drias de vertebrados, pero tiene tambin otras variantes


8 Aunque el nmero de especies de tRNA vara de unos organismos a otros, por trmino medio se puede estimar en 40.9 Las mitocondrias son unos orgnulos subcelulares presentes en clulas eucariticas, que poseen su propio DNA y contienen las maquina-rias necesarias para realizar la transcipcin y la traduccin. Gozan, por tanto, de una cierta autonoma gentica.

Figura 7. Hiptesis del balanceo. La figura recoge de un modoesquemtico la hiptesis formulada por Crick. Se representa lainteraccin codn-anticodn, indicando las diversas posibili-dades de apareamiento que existen para la tercera base delcodn (izquierda) o para la primera del anticodn (derecha).

con respecto al cdigo estndar recogido en la figura 6.Tambin se han observado algunas pequeas varia-ciones en bacterias, en las que es frecuente encontrarGUG y UUG como codones de iniciacin10.

Un caso aparte lo constituyen la selenocistena y lapirrolisina. Se trata de aminocidos naturales reciente-mente descubiertos. Aunque su presencia se encuentralimitada a algunos casos concretos, su incorporacin alas protenas exige codones propios. En arquebacteriasmetanognicas la pirrolisina est codificada por UAG,que acta de ordinario como un codn de parada (Fig.6), mientras que la selenocistena est codificada porUGA, otro codn normal de parada, tanto en proca-riotas como en eucariotas. Pero el mecanismo de codi-ficacin es en este caso muy particular. La maquinariade biosntesis de protenas inserta selenocistena alencontrar el codn UGA slo cuando se encuentra pre-sente en el mRNA una secuencia auxiliar, denominadaelemento SECIS (de selenocysteine insertion sequen-ce), que se caracteriza por poseer estructuras primariay secundaria caractersticas (23). Los elementosSECIS se pueden localizar en diversas posiciones rela-tivas al codn UGA dependiendo de si el organismo esprocaritico o eucaritico.

La degeneracin del cdigo conlleva, como se haindicado, que para muchos aminocidos exista ms deun codn. En estos casos se plantea una cuestininteresante: se usan indistintamente todos los codonesposibles o hay alguna preferencia entre ellos? Laingente acumulacin de datos de secuencia degenomas que se ha producido en los ltimos aospermite asegurar que no hay una utilizacin indistintade los diversos codones y que cada organismo tieneunas determinadas preferencias, que estn rela-cionadas con los niveles de cada uno de los tRNAs(24). El conocimiento de la utilizacin de los diversoscodones es no slo de inters acadmico, sino que setrata, por ejemplo, de un factor a tener en cuenta aldisear estrategias experimentales para la produccinde protenas recombinantes (25).

En resumen, aunque se han observado algunasexcepciones al cdigo gentico descrito en la dcadade 1960, sorprende que en la inmensa mayora de loscasos, todos los organismos, tanto procariotas como

eucariotas, utilicen el mismo sistema de codificacin.La conservacin de los mecanismos moleculares entreorganismos muy distantes en la escala evolutiva es as,tambin en este caso, una caracterstica constante delos seres vivos.

CONCLUSIONES

Como se ha comentado antes, todo estudiante deBiologa e, incluso, toda persona culta ha visto algunavez una representacin del cdigo gentico similar a larecogida en la figura 6. Pero al observarla, se corre elriesgo de pasar por alto el inmenso trabajo que cost eldesciframiento del cdigo y contemplar la figura comosi hubiera llovido del cielo sin esfuerzo alguno porparte de los investigadores. Esta breve revisin tenapor objeto principal hacer patente ese trabajo a cuyaculminacin concurrieron muchos factores. De unaparte, la innegable vala cientfica de los protagonistasde la aventura que, con las forzosas omisiones, hanquedado reseados en las pginas precedentes. Pero nomenos importancia tuvo el clima de competitividadque surgi entre los diferentes laboratorios implicados.Esa competitividad y el propio afn de superacin hancatalizado numerosos avances de la ciencia, de lamisma manera que favorecen la obtencin de buenasmarcas en una competicin deportiva.

Estamos acostumbrados a ver cmo son muchos losatletas que empiezan una competicin, cmo los msvan cayendo eliminados en las rondas de clasificacin,cmo en la final van quedando algunos descolgados ycmo, al terminar, slo uno se ha alzado con la vic-toria. Y tambin estamos habituados a contemplarcmo numerosos grupos de investigacin se embarcanen un determinado tema, cmo algunos slo consiguenresultados triviales o poco significativos, cmo otrosmuchos, an con buenos resultados, no llegan a dar unsalto cualitativo en el avance cientfico.

Pero la analoga puede ir ms all de considerar lainvestigacin como una excitante aventura o delsimple afrontarla con nimo deportivo. Tambin lasclebres palabras del barn de Coubertin valen paraquienes se aplican al deporte de la investigacin. Hay


10 Estas y otras variantes del cdigo gentico estndar se pueden encontrar navegando en la pgina web del National Center for BiotechnologyInformation (National Institutes of Health, U.S.A.) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/) para buscar el apartado Genetic codes.

que tener en cuenta que, ciertamente, cientficos quehayan protagonizado grandes revoluciones ha habidopocos, pero que los buenos cientficos, los que realizansu trabajo con honestidad, preparacin, dedicacin ycompetencia, son muy numerosos. Y que, posible-mente, sin su esfuerzo y sin sus resultados, muchasveces pequeos, no se habran podido dar los des-cubrimientos definitivos. Pretender que slo losgrandes genios sean capaces de hacer ciencia equivalea firmar la partida de defuncin del desarrollo cien-tfico, cuyos grandes avances suelen ir precedidos pornumerosos hallazgos ms modestos que, adems, con-tribuyen a crear una atmsfera adecuada para laaparicin de los genios.

Pero, sigamos ms all con la analoga deportiva.Poner el acento en la participacin ms que en la vic-toria es compatible con el lema olmpico: citius, altius,fortior. Dicho de otro modo, hacer nfasis en la impor-tancia de la participacin no significa que haya queerradicar la competencia. Antes al contrario, sin unasana competitividad seguramente no sera posiblellegar ms arriba o hacerlo ms rpidamente. Y en lainvestigacin cientfica, el deseo de profundizar en elconocimiento, y an el de quemar etapas en eseempeo, ha de presidir el afn del investigador.

Si se admiten las premisas anteriores, se puedenestablecer varias conclusiones, pero dos parecen lasfundamentales. En primer lugar, que no vencer en esacompetencia no significa conformarse con la medio-cridad. El investigador debe tender a que su trabajo seasiempre de excelencia. Por otro lado, es evidente quela competencia que favorece el desarrollo y avance dela investigacin debe ser respetuosa con las normasticas: no puede significar, de ninguna manera, undeseo de triunfar a costa de no se sabe qu conce-siones. Es esta ltima la actitud que, por mantener laanaloga que se viene empleando, bien podramosllamar deportividad, que se resume en el empleoexclusivo de medios lcitos, en el saber ganar ytambin, por qu no?, en el saber perder. Excelenciay deportividad son, pues, dos de los pilares en que sedebera apoyar toda investigacin.

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reconocimiento unidad 3 el codigo genetico

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