I

RAFAELA RODRIGUES MARTINS

ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO DE ICAM-1, TGF-β1 E ki-67 EM CISTOS

PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E CISTOS RESIDUAIS

2014

ii

RAFAELA RODRIGUES MARTINS

ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO DE ICAM-1, TGF-β1 E ki-67 EM CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E CISTOS RESIDUAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).

ORIENTADOR: Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

RIO DE JANEIRO 2014

iii

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

M379a MARTINS, Rafaela Rodrigues.

Análise comparativa da expressão de ICAM-1, TGF-β1 e ki-67 em cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais/ Rafaela Rodrigues Martins - Rio de Janeiro, 2014.

56f; 30cm. Dissertação (Mestrado em Endodontia) - Universidade Estácio

de Sá, 2014.

Bibliografia: f.45 Orientador (a): Prof. Dr.Fábio Ramôa Pires.

1. Cisto perirradicular inflamatório 2. Cisto residual 3. Fator de crescimento transformante beta 1 (TGF-β1) 4. Molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1); ki-67.

Capacidade respiratória

CDD 617.643

iv

“O SONHO É VER AS FORMAS INVISÍVEIS

DA DISTÂNCIA IMPRECISA, E, COM SENSÍVEIS MOVIMENTOS DA ESPERANÇA E DA VONTADE,

BUSCAR NA LINHA FRIA DO HORIZONTE A ÁRVORE, A PRAIA, A FLOR, A AVE, A FONTE,

OS BEIJOS MERECIDOS DA VERDADE".

(Fernando Pessoa)

v

AGRADECIMENTOS

Ao meu noivo e em breve, meu marido André Dias, por me apoiar de todas as

maneiras para que esse sonho se realizasse. Sem você ao meu lado tenho

certeza que essa caminhada seria muito mais complicada. Nunca vou

conseguir agradecer por tudo que você faz por mim. Obrigada pelo amor,

companheirismo e dedicação.

Aos meus pais Vanda e Geraldo (in memorian) por toda a educação e apoio.

Serei eternamente grata por tudo que fizeram e abdicaram para que eu

pudesse ter um futuro melhor. Amo vocês incondicionalmente.

Às minhas irmãs Juliana e Daniela, pelo amor, apoio e conselhos.

Ao Professor Fábio Ramôa Pires, por toda a atenção dedicada para que esse

trabalho fosse realizado da melhor maneira possível. Suas orientações,

conselhos e apoio foram de suma importância para a realização desse estudo.

Ao Professor José Freitas Siqueira Júnior por ser um exemplo de profissional

dedicado e referência na Endodontia mundial.

À Angélica, por ser uma pessoa maravilhosa e prestativa, nos ajudando de

todas as formas possíveis.

Aos meus colegas de Mestrado, que alegraram meus dias no PPGO e fizeram

deles muito mais agradáveis.

vi

ÍNDICE

RESUMO vii

ABSTRACT ix

LISTA DE FIGURAS x

LISTA DE TABELAS xii

LISTA DE ABREVIATURAS xiii

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 5

3 JUSTIFICATIVA 25

4 HIPÓTESE 26

5 PROPOSIÇÃO 27

6 MATERIAIS E MÉTODOS 28

7 RESULTADOS 32

8 DISCUSSÃO 39

9 CONCLUSÃO 44

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

11 ANEXOS 55

vii

RESUMO

Objetivo: Comparar a expressão imunoistoquímica da proteína ki-67, do fator

de crescimento transformante beta 1 (TGF-β1) e da molécula de adesão

intercelular 1 (ICAM-1) em cistos perirradiculares inflamatórios e cistos

residuais.

Materiais e Métodos: A partir da amostra composta de 25 cistos

perirradiculares inflamatórios e 25 cistos residuais, foram realizadas reações

imunoistoquímicas utilizando anticorpos anti-ICAM-1, TGF-β1 e ki-67. Ao final,

as informações clínicas, radiográficas, macroscópicas, histológicas e

imunoistoquímicas foram tabuladas em uma planilha para análise descritiva e

comparativa entre os parâmetros. Os dados foram analisados por meio do

programa SPSS e as diferenças foram consideradas estatisticamente

significativas quando p < 0.05%.

Resultados: Os resultados da imunoistoquímica mostraram que não ocorreram

diferenças entre os grupos dos cistos perirradiculares inflamatórios e dos cistos

residuais quando comparados à expressão de ICAM-1 (p=0,239) e TGF-β1

(p=0,258). Em relação ao ki-67, ocorreu uma marcação maior nos cistos

residuais quando comparados aos cistos perirradiculares (p=0,017).

Conclusão: Os resultados do presente estudo sugerem que os estímulos

inflamatórios específicos dos cistos residuais possam modular seus

mecanismos de etiopatogênese, crescimento e reparo.

viii

Palavras-chave: Cisto perirradicular inflamatório; cisto residual; fator de

crescimento transformante beta 1 (TGF-β1); molécula de adesão intercelular 1

(ICAM-1); ki-67.

ix

ABSTRACT

Aim: To compare the immunohistochemical expression of ki-67, transforming

growth factor beta 1 (TGF-β1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)

in inflammatory perirradicular cysts and residual cysts.

Materials and Methods: From the study sample composed by 25 perirradicular

cysts and 25 residual cysts, immunohistochemical reactions were carried out

using antibodies directed against ICAM-1, TGF-β1 and ki-67. Clinical,

radiological, gross, histological and immunohistochemical data were tabulated

for descriptive and comparative analysis of the parameters. Data were analyzed

using the SPSS and differences were considered statistically significant with p

<0.05%.

Results: The results of the immunohistochemical analysis showed that there

were no differences between the expression of ICAM-1 (p = 0.239) and TGF-β1

(p = 0.258) when comparing both groups. ki-67 labeling index was higher in

residual cysts when comparing with perirradicular cysts (p = 0.017).

Conclusion: Results from the present study suggest that some specific

inflammatory stimuli on residual cysts would modulate their mechanisms of

etiopathogenesis, growing and repair.

Key Words: Perirradicular cyst; residual cyst; transforming growth factor beta 1

(TGF-β1); intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1); ki-67.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. A. Presença de parúlide na mucosa alveolar vestibular na altura dos

dentes 21 e 22. B. Cisto perirradicular inflamatório apresentando-se como área

radiolúcida unilocular de contornos mal definidos associada a região periapical

dos dentes 21 e 22 (mesmo caso que A). C. Cisto perirradicular inflamatório de

grandes dimensões associado aos restos radiculares do dente 46. D. Cisto

residual na região do dente 43 caracterizado por área radiolúcida unilocular

bem delimitada. 34

Figura 2. A. Expressão de ICAM-1 no epitélio e nas células inflamatórias em

um cisto residual (Imunoperoxidase, 10x). B. Detalhe do epitélio expressando

ICAM-1 em um cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). C. Células inflamatórias

e células endoteliais expressando ICAM-1 em um cisto perirradicular

inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). D. Plasmócitos expressando ICAM-1 em

um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão de

ICAM-1 no infiltrado inflamatório contendo macrófagos xantomatosos em um

cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de ICAM-1 em células

gigantes multinucleadas circundando fendas de cristais de colesterol em um

cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). 36

Figura 3. A e B. Expressão de TGF beta 1 especialmente em fibroblastos na

cápsula de tecido conjuntivo fibroso de Cistos residuais (A e B -

Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de TGF beta 1 em fibroblastos,

células endoteliais e em algumas células inflamatórias na cápsula de tecido

xi

conjuntivo fibroso de Cistos residuais (C e D - Imunoperoxidase, 40x). E.

Expressão de TGF beta 1 em macrófagos próximos a fendas de cristais de

colesterol em um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de TGF

beta 1 em fibroblastos e em células compatíveis com mastócitos na cápsula de

tecido conjuntivo fibroso de um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). 37

Figura 4. A e B. Expressão de ki-67 no núcleo das células epiteliais das

camadas basal e suprabasal em dois cistos perirradiculares inflamatórios

mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (A e B

- Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de ki-67 no núcleo das células

epiteliais das camadas basal e suprabasal em dois cistos residuais, um deles

mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (C -

Imunoperoxidase, 40x) e outro mostrando inflamação mais evidente associada

a exocitose (D - Imunoperoxidase, 40x). 38

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Anticorpos primários que foram utilizados na avaliação dos cistos

perirradiculares inflamatórios e cistos residuais, com seus respectivos clones,

fabricantes e diluições. 30

Tabela 2. Distribuição comparativa dos parâmetros clínicos e demográficos dos

cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais. 32

Tabela 3. Distribuição dos parâmetros histológicos e de imunoistoquímica nos

cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais. 35

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ICAM-1

TGF-β1

CP

CR

IL

TNF-α

Células NK

IFN-γ

ELAM-1

EGF

FoxP3

SPSS

Molécula de Adesão Intercelular 1

Fator de Crescimento Transformante Beta 1

Cisto Perirradicular Inflamatório

Cisto Residual

Interleucina

Fator de Necrose Tumoral Alfa

Células Natural Killer

Interferon Gama

Molécula de Adesão de Leucócitos 1

Fator de Crescimento Epidérmico

Forkhead Box P3

Statistical Program for Social Sciences

1

1 INTRODUÇÃO

Uma parte especialmente complexa da patologia cirúrgica oral e

maxilofacial é aquela que se refere a lesões císticas e tumorais. São os

profissionais de saúde oral que têm o papel mais importante no diagnóstico

destas lesões. Os cistos odontogênicos representam um grupo diverso e

extenso de patologias que afetam os maxilares e a mucosa oral. Têm sido

extensivamente estudados e relatados ao longo dos anos na literatura

científica.

Os cistos odontogênicos são as lesões osteodestrutivas mais comuns no

esqueleto humano, com origem a partir de remanescentes do epitélio

odontogênico, mas com comportamentos clínicos diferentes. O mecanismo de

crescimento dessas lesões ainda é controverso. Alguns autores relatam que

sua expansão e seu crescimento envolvem a invasão e a destruição da matriz

extracelular e da membrana basal, que é influenciada tanto pela proliferação do

epitélio cístico como pela velocidade de destruição do tecido ósseo subjacente

(SILVEIRA et al., 2007). Um estudo retrospectivo com 9.723 casos de lesões

radiolúcidas na maxila e mandíbula revelou que granulomas e cistos

radiculares ocorrem a taxas semelhantes e juntos somaram 73% de todas as

lesões. Por outro lado, os cistos residuais somaram aproximadamente apenas

2% de todas as lesões radiolúcidas (KOIVISTO et al., 2012).

As lesões periapicais crônicas do tipo granuloma e cisto perirradicular

inflamatório (CP) representam entidades comuns na clínica odontológica, tendo

a cárie dentária como principal fator etiológico. As endotoxinas bacterianas,

bem como as citocinas originadas do processo imunoinflamatório parecem ter

2

influência no desenvolvimento de tais lesões, contribuindo para a reabsorção

do osso alveolar ao redor do ápice do dente envolvido. Os CPs originam-se da

indução dos restos epiteliais de Malassez, surgindo a partir de granulomas

perirradiculares, e são caracterizados por uma cavidade patológica revestida

internamente por epitélio pavimentoso estratificado não queratinizado contendo

material fluido ou semi-fluido, sendo circundada externamente por um tecido

fibroso (SANTOS et al., 2007; FUKADA et al., 2009).

O cisto residual (CR) é uma lesão cística que é originada de um CP,

persistente após a exodontia do dente envolvido. Sua patogenia, etiologia e

forma de tratamento são muito discutidas na literatura. O seu diagnóstico é

dado entre a correlação entre os exames clínico, radiográfico e histopatológico.

É mais comumente encontrado em pacientes do sexo masculino, sem

predileção quanto à localização (DIMITROULIS & CURTIN, 1998; JAMDADE et

al., 2012).

O papel da resposta imune e da reabsorção óssea na formação das

lesões perirradiculares tem sido extensivamente estudado. No entanto, pouco

se sabe sobre como o conjunto de citocinas envolvidas no desenvolvimento e

na manutenção dos processos inflamatórios crônicos é regulado e como o perfil

destas citocinas é correlacionado com a composição do infiltrado inflamatório e

a apresentação clínica destas lesões (ČOLIŠ et al., 2007).

A migração de vários tipos de leucócitos a partir da circulação para

locais de infecção é mediada não só por receptores de quimiocinas específicas,

mas também por moléculas de adesão. A molécula de adesão intercelular-1

(ICAM-1) é expressa por vários tipos de células, incluindo leucócitos e células

3

endoteliais. ICAM-1 no endotélio desempenha um papel importante na

migração de leucócitos ativados para os locais de inflamação e é também

importante na imunidade adaptativa. Algumas moléculas de adesão e

receptores de quimiocinas já foram encontrados em tecidos periapicais doentes

(DE ROSSI et al., 2008).

O Fator de crescimento transformante beta-1 (TGF-β1) regula uma

grande quantidade de processos biológicos como proliferação, sobrevivência,

diferenciação, reconhecimento, apoptose e migração celular, e produção de

matriz extracelular, apresentando assim funções importantes nas respostas

imunológicas, angiogênese, cicatrização de lesões, desenvolvimento do

organismo e metabolismo ósseo. Sendo assim, devido à grande diversidade de

processos nos quais TGF-β1 está envolvido, fica clara a grande importância

desta citocina durante a embriogênese e na manutenção da homeostase de

tecidos durante a vida (JANSSENS et al., 2005; EHNERT et al., 2010). No caso

de lesões inflamatórias periapicais, o TGF-β1 tem sido relacionado a

modulação da resposta inflamatória e ao processo de reparo das mesmas

(TYLER et al., 1999; DANIN et al., 2000).

O antígeno ki-67 é uma proteína humana localizada no núcleo com

expressão associada a células em proliferação, ou seja, ausente em células

quiescentes (GERDES et al., 1984). O ki-67 é amplamente utilizado para

avaliar o potencial proliferativo de células saudáveis, assim como de lesões

pré-neoplásicas e neoplásicas (GÜLER et al., 2012). Alguns trabalhos

indicaram a superioridade do ki-67 sobre outros marcadores de proliferação

4

celular, por este não receber tantas influências de fatores externos e internos

ao ciclo celular (ARISAWA et al., 1999).

O CR é uma entidade pouco conhecida e um número limitado de

estudos tem direcionado seus objetivos à avaliação comparativa entre os

fenômenos biológicos que modulam o comportamento biológico e a

patogênese desta entidade com o CP.

5

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Cistos perirradiculares inflamatórios

Cistos perirradiculares inflamatórios (CP) são cistos inflamatórios

localizados nos ápices ou na porção lateral das raízes de dentes infectados

com polpas necróticas. O termo cisto é derivado da palavra grega Kystis e

significa bexiga (NAIR, 1998). A iniciação da lesão exige que micro-organismos

estejam presentes nos sistemas de canais radiculares (infecção intra-radicular)

dos dentes afetados (KAKEHASHI et al., 1965; NAIR et al., 1996).

Segundo LIN et al. (2007) existem três teorias que explicam a formação

dos CP: a primeira é a teoria da deficiência nutricional, na qual por meio de um

estímulo inflamatório, ocorre uma proliferação epitelial na região, e as células

mais centrais sofrem necrose, formando a cavidade cística. Outra teoria

defende que a proliferação celular é consequência da formação de um

abscesso, formando cordões que o revestem. A terceira teoria afirma que a

formação de cordões de tecido epitelial ocorre devido a proliferação dos restos

epiteliais de Malassez, que se fusionam, originando a cavidade cística. A

descamação de restos celulares conduz a um aumento do conteúdo proteico

no interior da cavidade, levando a entrada de líquido e consequente expansão

da lesão.

Quanto à etiopatogênese, a teoria mais aceita é de que o CP seja

sempre originado de um granuloma perirradicular, muito embora seja consenso

que nem todo granuloma necessariamente progrida para um CP. A origem do

epitélio que reveste internamente o CP são remanescentes embrionários da

bainha epitelial radicular de Hertwig, conhecidos como restos epiteliais de

6

Malassez (BINNIE, 1999; SIQUEIRA et al., 2010). Acredita-se que estes restos

celulares iniciem sua proliferação em resposta aos estímulos inflamatórios

derivados da infecção situada no interior do sistema de canais radiculares

(NAIR, 1998). Mantida a causa, a proliferação epitelial progride e há a

formação de áreas centrais de degeneração no interior das ilhas de células

epiteliais, as quais dão origem à cavidade central que caracteriza os CP. Tal

mecanismo reforça a ideia de que estas lesões são resultado de uma infecção

endodôntica de longa duração (NAIR, 1998; LIN et al., 2007; SIQUEIRA et al.,

2010).

Diversos tipos celulares e mediadores inflamatórios estão envolvidos na

patogênese e na formação e desenvolvimento dos CP. Tanto as defesas

humoral e celular, quanto os eventos bioquímicos e celulares da inflamação,

assim como os moduladores da deposição e reabsorção da matriz extracelular

contribuem para o desenvolvimento de lesões crônicas como os granulomas e

CP (SANTOS et al., 2009). Várias teorias tentam explicar a formação da loja

cística, sendo a mais plausível a que sugere o envolvimento do sistema imune,

baseando-se na presença de elementos da resposta imunológica adaptativa na

lesão, como linfócitos T e B, plasmócitos, macrófagos, células natural killer

(NK), anticorpos e componentes do sistema complemento (SIQUEIRA et al.,

2010).

Histologicamente, o CP consiste em uma cavidade patológica contendo

material fluido ou semissólido no seu interior, composto principalmente por

células epiteliais degeneradas, células e produtos inflamatórios e hemorragia.

Essa loja é revestida por epitélio pavimentoso estratificado de espessura

7

variável, podendo apresentar áreas de hiperplasia e áreas de atrofia (VIER &

FIGUEIREDO, 2002; SIQUEIRA et al., 2010). O CP pode ser classificado em

dois subtipos (“verdadeiro” e “em bolsa”), dependendo da relação da loja cística

com o canal radicular via forame apical ou lateral (NAIR, 1998; SIQUEIRA et

al., 2010). No primeiro, o cisto apresenta-se como uma cavidade fechada

separada do ápice radicular associado e no segundo há uma abertura na

parede cística por meio da qual há comunicação direta do ápice radicular com

a cavidade cística. Além do componente epitelial, os CP possuem uma cápsula

de tecido conjuntivo fibroso permeado por um tecido de granulação que, à

semelhança do que é evidenciado nos granulomas perirradiculares, é

constituído de macrófagos, linfócitos, plasmócitos, neutrófilos, fibroblastos e

vasos neoformados. Mais externamente nesta cápsula encontra-se um tecido

conjuntivo fibroso denso composto basicamente de fibras colágenas com

presença menos abundante de componentes inflamatórios, e que separa o CP

do osso alveolar adjacente (SANTOS et al., 2006; SIQUEIRA et al., 2010).

Corpos hialinos de formas e tamanhos variados e eventualmente calcificados

(chamados de corpúsculos de Rushton) podem ser observados no epitélio e na

cápsula fibrosa dos CP, assim como é frequente a presença de grande número

de macrófagos espumosos. Em virtude da degeneração celular que ocorre

durante o desenvolvimento dos CP, podem ser observadas fendas negativas

de cristais de colesterol, as quais estão frequentemente associadas a uma

reação de corpo estranho com a presença de células gigantes multinucleadas.

Em virtude do grande número de plasmócitos que caracteriza o infiltrado

inflamatório nos CP, é comum a observação de depósitos eosinofílicos de

8

imunoglobulinas no tecido conjuntivo, chamados de corpúsculos de Russel

(BINNIE, 1999; SIQUEIRA et al., 2010).

Os CP são geralmente assintomáticos, o que faz com que a maioria dos

casos seja descoberta em radiografias de rotina. CP grandes ou

secundariamente traumatizados ou infectados podem produzir alterações locais

como abaulamento e ruptura de corticais, drenagem purulenta e dor

(KOSEOGLU et al., 2004; VARINAUSKAS et al., 2006). Mostram predileção

por pacientes do sexo masculino, pela terceira década de vida e pela maxila

(JONES et al., 2006; GROSSMAN et al., 2007; OCHSENIUS et al., 2007).

Radiograficamente, os achados associados aos CP podem ser

indistinguíveis daqueles observados em granulomas perirradiculares

(SIQUEIRA et al., 2010). A imagem radiográfica parece ter valor apenas

sugestivo no diagnóstico diferencial entre CP e granulomas perirradiculares e

seu diagnóstico preciso somente é obtido com o exame histopatológico (VIER

& FIGUEIREDO, 2002). Como a teoria mais aceita para sua patogênese

envolve a presença de um granuloma prévio, é natural considerar que os CP

habitualmente apresentem tamanho médio maior que os granulomas. Os CP

apresentam-se como áreas radiolúcidas uniloculares, habitualmente com forma

redonda ou ovoide, localizados em associação com a porção radicular de um

dente desvitalizado. Podem ser limitados por uma borda esclerótica radiopaca

fina e ininterrupta de osso cortical ou podem apresentar limites pouco definidos

e apresentam tamanho variável, podendo oscilar de alguns milímetros a vários

centímetros. Em virtude de sua associação com a infecção no sistema de

canais radiculares, observa-se um abaulamento do espaço correspondente ao

9

ligamento periodontal no local da saída do canal radicular associado. Na

maioria dos casos estão associados a um dente com uma restauração

profunda ou grande lesão de cárie ou a um remanescente radicular (SCHOLL

et al., 1999).

CP são entidades frequentes e estudos analisando a frequência e a

distribuição epidemiológica de cistos dos maxilares (odontogênicos e não

odontogênicos) têm mostrado que estes cistos representam 60% dos cistos

diagnosticados (GROSSMAN et al., 2007). Dentro do grupo dos cistos

odontogênicos, estima-se que CP representem cerca de 50% dos cistos

diagnosticados (JONES et al., 2006; OCHSENIUS et al., 2007). Acredita-se

que estes percentuais são subestimados visto que não contemplam os CP que

não são tratados cirurgicamente e que respondem ao tratamento endodôntico

isolado. Dentro das lesões perirradiculares inflamatórias crônicas, os CP

apresentam frequências variáveis, podendo oscilar de 6 a 55% (NAIR, 1998).

SIMON (1980) estudando 35 lesões perirradiculares, observou 27 (77%)

granulomas perirradiculares, 6 (17%) CP (incluindo 3 “verdadeiros” e 3 “em

bolsa”) e 2 (6%) abscessos. NAIR et al. (1996) analisaram 256 lesões

perirradiculares inflamatórias e observaram que 127 (50%) eram granulomas

(55% não epiteliados e 45% epiteliados), 90 (35%) eram abscessos

perirradiculares e 39 (15%) eram CP, incluindo 24 (61%) cistos “verdadeiros” e

15 (39%) cistos “em bolsa”. Cabe ressaltar que as discrepâncias entre as

frequências encontradas podem ser motivadas por vários fatores, em especial:

o fato de que a correta diferenciação entre granulomas e CP só pode ser

conseguida com a análise histológica das lesões, restringindo a avaliação às

10

lesões tratadas cirurgicamente; à fragmentação dos espécimes submetidos à

avaliação histológica; e às diferenças na interpretação microscópica por parte

dos patologistas responsáveis.

O tratamento dos CP inclui obrigatoriamente a remoção do agente

causador, ou seja, o tecido pulpar necrótico. Para isso, habitualmente indica-se

o tratamento endodôntico convencional, por vezes associado à cirurgia

perirradicular (SIQUEIRA et al., 2010). Nos casos onde há indicação de

remoção do dente associado (restos radiculares, fraturas dentárias, etc.),

habitualmente realiza-se a exodontia e a remoção conservadora do CP no

mesmo tempo cirúrgico.

2.2 Cisto Residual

Cisto residual (CR) é a denominação utilizada para caracterizar um CP

que permaneceu no local após a remoção do dente associado ou a esfoliação

espontânea da raiz residual associada à lesão, sem os cuidados necessários

de curetagem e enucleação da lesão subjacente. Trata-se, portanto, da

persistência de um CP (DIMITROULIS & CURTIN, 1998; BINNIE, 1999;

NEVILLE et al., 2009). Como tal, a etiopatogenia do CP é a mesma do CR, e

as duas entidades são distinguidas apenas pela presença ou não do dente ou

da raiz associada ao cisto no momento do diagnóstico. No CP, acredita-se que

o crescimento da lesão possa ocorrer por dois mecanismos: estímulo

inflamatório pela persistência do dente com necrose pulpar e a extensão do

processo ao periápice e diferença de pressão osmótica entre o líquido

intersticial e o líquido cístico (atraindo fluido para o interior da cavidade). Não

11

se sabe ao certo se no CR o processo de crescimento da lesão é mantido,

estabiliza ou regride. Acredita-se que, embora não exista mais o estímulo da

persistência do dente no CR, o processo de crescimento cístico continue por

osmose, pelo desequilíbrio de pressões entre o meio interno e o externo

(OEHLERS, 1970, NEVILLE et al., 2009). OEHLERS (1970) cita que a maioria

dos CR mantém-se intactos e estáveis durante anos, mas aqueles que estão

localizados mais superficialmente e que estão expostos a fatores tais como

trauma e infecção secundária, poderiam estar submetidos a maior diferença de

pressão osmótica, culminando em progressão do seu tamanho.

Com relação à frequência, estudos analisando a epidemiologia de cistos

odontogênicos e não odontogênicos dos maxilares têm mostrado que os CR

representam entre 4% e 11% de todos os cistos diagnosticados (JONES et al.,

2006; OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al., 2008). KHOSRAVI et al.

(2013) determinaram a prevalência de cistos odontogênicos de acordo com

idade, sexo e área afetada no Irã durante um período de 23 anos. De um total

de 7.412 lesões diagnosticadas entre 1988 e 2010, 21,6% eram cistos

odontogênicos, dos quais 48,7% eram inflamatórios e 51,3% eram cistos de

desenvolvimento. Os quatro cistos odontogênicos mais frequentes foram CP

(35,1%), cistos dentígeros (25,8%), queratocistos odontogênicos (22,6%) e CR

(13%). A taxa de CR nesse estudo foi maior comparada a outros estudos

(OCHSENIUS et al., 2007; NUNEZ-URRUTIA et al., 2010), mas menor que um

estudo realizado na Malásia, no qual a porcentagem de CR foi de 21,4%

(RENGASWAMY, 1977), mostrando a heterogeneidade da frequência mundial

desta entidade.

12

Segundo a maioria dos autores os CR ocorrem, sobretudo, em pacientes

do sexo masculino (HIGH & HIRSCHMANN, 1988; DIMITROULIS & CURTIN,

1998; BATAINEH et al., 2004; JONES et al., 2006; MENINGAUD et al., 2006;

OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al., 2008). As faixas etárias mais

frequentes no momento do diagnóstico dos CR envolvem pacientes entre a

quarta e a oitava décadas de vida (PROCKT et al., 2008). Por definição, o CR

ocorre em uma região onde previamente existia um dente que foi extraído e

considera-se que o epicentro da lesão seja posicionado numa localização

periapical. Sua localização mais frequente pode ser variável quando se

comparam os estudos publicados na literatura, incluindo a maxila

(OCHSENIUS et al. 2007), a mandíbula (BATAINEH et al., 2004) ou uma

frequência equivalente entre ambas (MENINGAUD et al., 2006). Considera-se

a região anterior dos maxilares como o sítio de predileção para o CR.

Os CR são geralmente assintomáticos e diagnosticados através de um

exame radiográfico de rotina. No entanto, quando atingem tamanhos maiores,

podem provocar tumefação e ruptura das corticais ósseas, e nesses casos a

presença de infecção secundária e de dor é comum (HIGH & HIRSCHMANN,

1986; DIMITROULIS & CURTIN, 1998; NEVILLE et al., 2009; JAMDADE et al.,

2012).

Radiograficamente apresentam-se como área radiolúcida unilocular, de

formato oval ou arredondado, de tamanho variável, circunscrita por uma borda

esclerótica radiopaca. Embora a estrutura interna seja tipicamente radiolúcida,

pequenos focos de calcificação distrófica podem ser visualizados em CR com

longo tempo de evolução (JAMDADE et al., 2012). Podem causar

13

deslocamento e reabsorção radicular dos dentes adjacentes e, em casos

isolados e extensos, podem projetar-se para o antro maxilar ou causar

afastamento do canal alveolar inferior (JAMDADE et al., 2012). Para realizar o

diagnóstico diferencial de um CR é particularmente relevante conhecer a

história clínica e observar radiografias anteriores, sem os quais é difícil a

diferenciação entre os CR e outros cistos e pseudocistos dos maxilares

(COURTEN et al., 2002; BOEDDINGHAUS & WHYTE, 2008).

Os critérios histológicos de diagnóstico do CR são idênticos aos que são

utilizados para o CP (HIGH & HIRSCHMANN, 1986). O epitélio de revestimento

dos CR tende a ser mais regular e uniforme pelo fato de estar menos exposto

aos efeitos do processo inflamatório, visto que este apresenta usualmente

intensidade menor que a encontrada nos CP. A cápsula de tecido conjuntivo

fibroso tende a ser mais espessa e densa, podendo inclusive ser observados

focos de mineralização (HIGH & HIRSCHMANN, 1986; BINNIE, 1999;

JAMDADE et al., 2012). Há autores que sugerem que os CR possam diminuir

de tamanho com sua evolução e outros que podem ainda mostrar remissão

completa (OEHLERS, 1970; HIGH & HIRSCHMANN, 1986; BINNIE, 1999),

mas evidências conclusivas sobre estas suposições ainda não foram

demonstradas.

O tratamento do CR é realizado por meio da enucleação cirúrgica da

lesão, respeitando as limitações e adequações da técnica de acordo com o

tamanho e a localização da lesão (NEVILLE et al., 2009).

MUGLALI et al. (2008) avaliaram o nível das citocinas e quimiocinas no

fluido dos CP e CR, constatando que o fluido dos CP possui uma maior

14

concentração de interleucina 1α (IL-1α), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e

proteína quimiotática para monócitos-1 quando comparado com os CR. Estas

citocinas estão envolvidas na expansão cística e, face a estes resultados,

sugeriu-se que apesar de possuírem origens semelhantes, os CP possuem

uma maior capacidade de expansão que os CR e que se o CP for

inadvertidamente deixado após uma extração, certo grau de inflamação pode

permanecer e desta forma contribuir para a expansão cística.

2.3 Molécula de adesão intercelular 1

A molécula de adesão intercelular (ICAM-1 ou CD54) é uma proteína da

superfície celular, com cinco domínios do tipo imunoglobulina que é expressa

nas células vasculares endoteliais, linfócitos e monócitos. Possui um segmento

transmembrana e uma cauda citoplasmática de aminoácidos. Devido a uma

curva fixa de 90 graus entre os domínios três e quatro, os monômeros de

ICAM-1 são em forma de L (LEBEDEVA et al., 2005).

ICAM-1 participa na adesão de células inflamatórias ao endotélio antes

de ocorrer a diapedese e também está relacionada com as funções efetoras de

leucócitos e apresentação de antígenos. A estimulação de uma variedade de

células, tais como as células endoteliais, células mesangiais e células epiteliais

dos brônquios, com citocinas inflamatórias, como a IL-1, o TNF-α e o interferon

gama (IFN-y), aumenta a expressão de ICAM-1 (LEBEDEVA et al., 2005).

A migração de vários tipos de linfócitos a partir da circulação para locais

de infecção não é mediada somente por receptores específicos de quimiocinas,

mas também por moléculas de adesão (HREN et al., 1999; KABASHIMA et al.,

2002). Algumas destas moléculas e receptores de quimiocinas já foram

15

encontrados em tecidos perirradiculares doentes, mas o seu papel na

patogênese destas lesões ainda permanece desconhecido (DE ROSSI et al.,

2008).

Citocinas com conhecida atividade inflamatória e osteolítica, tais como

IL-1, TNF-α, IL-6 e a IL-8 já foram localizadas por meio de imunoistoquímica

em CP. Os receptores de adesão celular ICAM-1 e a molécula de adesão de

leucócitos 1 (ELAM-1) também já foram encontrados. No mesmo estudo, todas

as amostras de CP mostraram marcação para ICAM-1 em células do epitélio,

endotélio e células mononucleares, fornecendo evidências de que os CP

contêm vasos sanguíneos ativados cujas células endoteliais expressam

receptores de adesão celular como ICAM-1 e ELAM-1 (BANDO et al., 1993).

SAWA et al. (1998) avaliaram a expressão de moléculas de adesão

sobre a polpa dentária saudável e inflamada por imunoistoquímica. Na polpa

dentária saudável nenhum vaso reagiu com ICAM-1, enquanto na polpa

inflamada um grande número de vasos reagiu fortemente ao ICAM-1. Isto

indica que o endotélio vascular da polpa dentária humana inflamada expressa

diversas moléculas de adesão para a migração de leucócitos dos vasos

sanguíneos para o tecido. A polpa dentária é rodeada pela dentina, como um

sistema in vitro, de modo que se torna um modelo atraente para o estudo das

moléculas de adesão no endotélio vascular na migração transendotelial de

leucócitos.

HREN et al. (1999) demonstraram um aumento significativo da

expressão de ICAM-1 em células T isoladas do granuloma periapical, em

comparação com os linfócitos do sangue periférico, reforçando as evidências

16

do seu papel na promoção do tráfego de linfócitos ativados a partir do sangue

para os tecidos inflamados. TAŞMAN et al. (1999) examinaram a expressão de

uma variedade de moléculas de adesão em células endoteliais da polpa

dentária humana, para obter evidências sobre a sua distribuição e função

nestes tecidos. Compararam amostras de dentes extraídos por indicação

ortodôntica com dentes extraídos devido à periodontite crônica e identificaram

a presença de ICAM-1 expressa tanto no controle quanto na periodontite

crônica. DE ROSSI et al. (2008) mostraram evidências que a deficiência de

ICAM-1 resulta em resposta imune comprometida refletindo uma maior

inflamação periapical e reabsorção óssea.

MOREIRA et al. (2006) demonstraram que ICAM-1 é efetivamente

envolvida na formação precoce de granuloma e participa na resistência à

infecção de ratos com o fungo Paracoccidioides brasiliensis. A ausência da

expressão de ICAM-1 resultou na diminuição do número de células T CD4 e

CD8 e um aumento da produção de IL-4 no local da inflamação.

2.4 Fator de crescimento transformante beta 1

A família dos fatores de crescimento transformante beta (TGF-β) faz

parte de uma superfamília de proteínas e pode existir em pelo menos três

isoformas chamadas TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3 (SHI et al., 2011). As três

isoformas apresentam grande similaridade no domínio C-terminal, com nove

resíduos de cisteína conservados. Porém, apesar dessa alta homologia de

sequência, estudos in vivo das funções dessas três isoformas, através de

genes knockout, revelaram diferenças impressionantes, demonstrando

17

ausência de redundância das suas funções, sendo que de modo geral, TGF-β1

é a isoforma mais abundante (JANSSENS et al., 2005).

São citocinas que controlam a proliferação e a diferenciação celular,

funcionando como agentes de crescimento e de diferenciação de células

imunes e inflamatórias e atuando na formação da estrutura óssea. Interferem

na fisiopatologia do reparo tecidual favorecendo a expressão do gene de

colágeno tipo 1, fundamental para a manutenção da integridade tecidual

(SANTOS et al., 2009). O TGF-β é produzido por linfócitos T, macrófagos,

plaquetas e outros tipos celulares. Encontrado em grandes quantidades no

tecido ósseo, ele é um potente estimulador do crescimento e diferenciação de

osteoblastos. O TGF-β inibe tanto a proliferação dos precursores de

osteoclasto, quanto a função das células maduras. Ele inibe também a fusão

dos precursores mononucleares, necessária para a formação de osteoclastos

(SIQUEIRA, 2000b).

TGF-β1 é importante na regulação da inflamação e tem efeitos que são

principalmente imunossupressores. As substâncias microbianas e a resposta

do hospedeiro frente aos antígenos estimulam a produção dessa citocina. Nas

fases iniciais de inflamação, o TGF-β1 atua como um quimioatraente para

monócitos e linfócitos. No entanto, posteriormente exerce um potente efeito

supressor sobre a proliferação e diferenciação de linfócitos T e B. Além disso,

inibe a produção de IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α e IFN-γ. TGF-β1 também antagoniza

com as atividades biológicas dessas citocinas (WAHL, 1994; DANIN et al.,

2000).

18

LI et al. (1997) determinaram o padrão de expressão do TGF-α e TGF-β

e do fator de crescimento epidérmico (EGF) nos três tipos mais comuns de

cistos odontogênicos (queratocistos, cistos dentígeros e CP). TGF-β foi

encontrado tanto nas células (fibroblastos, células endoteliais e células

inflamatórias) quanto na matriz intercelular (matriz e espaço intravascular) na

parede do tecido conjuntivo fibroso em todos os tipos de cistos.

TYLER et al. (1999) identificaram que a grande maioria dos eosinófilos

presentes nos granulomas periapicais e CP demonstraram expressão de TGF-

β e que outras células, incluindo linfócitos, fibroblastos, e monócitos também

produziram esta citocina. A presença de citocinas de reparo, tais como TGF-α e

TGF-β, sugere o mecanismo pelo qual a resposta inflamatória pode participar

na reparação e remodelação dos tecidos perirradiculares.

Estudos imunoistoquímicos mostraram que o TGF-β associado a

macrófagos é encontrado na proximidade do ápice radicular e em áreas com

reabsorção óssea durante as lesões ativas, ao passo que o TGF-β associado a

osteoblastos é detectado durante as fases crônicas da lesão perirradicular (30,

60 e 80 dias após a exposição pulpar em ratos). Estes resultados sugerem que

os macrófagos podem desempenhar papel importante na iniciação e

desenvolvimento de lesões periapicais e que o TGF-β pode desempenhar um

papel duplo, modulando tanto a reabsorção quanto a deposição óssea em

lesões perirradiculares (LIN et al., 2000).

PIATTELLI et al. (2004) avaliando a possibilidade da influência dessa

citocina no desenvolvimento de cistos odontogênicos, realizaram uma análise

imunoistoquímica da expressão de TGF-β1 em vasos sanguíneos, fibroblastos

19

e no epitélio pavimentoso estratificado destas lesões. Os autores encontraram

presença estatisticamente significante dessa proteína na camada suprabasal e

superficial do epitélio, bem como no estroma celular, de queratocistos

ortoqueratinizados e paraqueratinizados, em comparação com os CP e cistos

dentígeros.

GARLET et al. (2012) analisaram a expressão de genes associados ao

processo de cicatrização em granulomas perirradiculares de natureza

progressiva e estável, identificando que a expressão de TGF-β1 era cinco

vezes maior nos granulomas quando comparados ao grupo controle e maior

nos granulomas inativos comparados aos ativos.

ANDRADE et al. (2013) avaliaram a imunoexpressão de IL-17, TGF-β1 e

da proteína Forkhead Box P3 (FoxP3) em granulomas perirradiculares, CP e

CR e demonstraram que a expressão de TGF-β1 estava aumentada nas lesões

com maior infiltrado inflamatório, sendo mais comumente encontrado em

granulomas, seguidos de CP e por último CR. A razão pela qual os níveis de

TGF-β são elevados nas lesões periapicais ainda não está claro, mas parece

estar relacionada com a presença de grande número de células que produzem

esta citocina, incluindo macrófagos, fibroblastos, eosinófilos, osteoclastos,

osteoblastos e células Treg (DANIN et al., 2000).

TGF-β tem sido sugerido como sendo importante para cura periapical,

porque esta citocina é conhecida por inibir a atividade de reabsorção óssea e

promover a remodelação e reparo tecidual. Neste sentido, estudos indicaram

que o TGF-β estimula a síntese de colágeno, neovascularização e proliferação

de fibroblastos (TYLER et al.,1999).

20

EDWARDS et al. (2010) relataram que apesar da grande quantidade de

trabalhos que descrevem os efeitos do TGF-β no tecido ósseo, um consenso

sobre a verdadeira função dessa proteína na biologia das células ósseas e

remodelação do tecido ósseo ainda necessita ser estabelecido.

2.5 Antígeno ki-67

O antígeno ki-67 é uma proteína originalmente definida pelo protótipo do

anticorpo monoclonal ki-67 e que detecta um antígeno nuclear que está

presente apenas em células em proliferação (GERDES et al., 1984). É um

antígeno nuclear do tipo não histona que faz parte da estrutura proteica

conhecida como suporte cromossômico. A análise detalhada do ciclo celular

revelou que este antígeno estava presente no núcleo das células nas fases G1,

S e G2 do ciclo de divisão celular, como também na mitose. Células

quiescentes ou na fase G0 não expressam o antígeno ki-67 (GERDES et al.,

1984; SCHOLZEN & GERDES, 2000; GÜLER et al., 2012).

É uma proteína grande, com aproximadamente 395 kDa, codificada por

quase 30.000 pares de base dentro do genoma humano. A estrutura primária

de ki-67 já foi estabelecida. A proteína sofre fosforilação e desfosforilação

durante a mitose, é suscetível à proteases e sua estrutura indica que a sua

expressão é regulada por vias proteolíticas (BROWN & GATTER, 2002).

Sua utilização em técnicas imunoistoquímicas, aliando simplicidade,

facilidade de manuseio pelos patologistas e amplo uso para diagnóstico,

favorece a realização de estudos correlacionando os resultados obtidos à

gradação e ao prognóstico de neoplasias (YOSHIDA et al., 2001). Diversos

estudos já indicaram a superioridade do ki-67 como marcador de proliferação

21

celular, por não receber tantas influências de fatores externos e internos.

(ARISAWA et al., 1999).

Em virtude da observação do antígeno ki-67 em todas as células

proliferativas (saudáveis e tumorais), logo se tornou evidente que a presença

desta proteína é um excelente indicador para determinar a fração de

crescimento de uma dada população de células. Por esta razão, os anticorpos

contra a proteína ki-67 foram cada vez mais utilizados como ferramentas de

diagnóstico e de prognóstico em diferentes tipos de tumores (SCHOLZEN &

GERDES, 2000).

Vários fatores de ordem prática podem limitar a efetividade do ki-67

como indicador de prognóstico, particularmente em pequenas biópsias, tais

como: a expressão do ki-67 parece ser influenciada pelo suprimento nutricional,

portanto uma amostra retirada próxima à área central da neoplasia poderia

fornecer um valor, para o fator de crescimento, inferior incorreto. Outro fator é

que a maior parte das neoplasias apresenta linhagens de células heterogêneas

e com diferentes taxas de proliferação. Nesta circunstância, o índice do ki-67

não refletiria a taxa predominante de proliferação da neoplasia (ARISAWA et

al., 1999).

Cistos odontogênicos calcificantes foram histologicamente examinados

para delinear as características e subtipos destas lesões, incluindo a expressão

de ki-67 para avaliar sua atividade celular proliferativa. O índice de marcação

para ki-67 foi ligeiramente maior em cistos odontogênicos calcificantes com o

epitélio de revestimento proliferativo (nos quais haviam áreas com

22

características de ameloblastoma) quando comparados com os cistos que não

tinham essas características histológicas (YOSHIDA et al., 2001).

SUZUKI et al. (2005) investigaram o possível papel da morte celular por

apoptose nas lesões inflamatórias periapicais mediante a análise

imunoistoquímica de fatores relacionados à apoptose e através da utilização de

um marcador de proliferação celular. Os autores utilizaram dezenove CP, cinco

CR e, como controle, espécimes de gengiva saudável excisada de sete

cadáveres. Foram analisados por imunoistoquímica com a utilização de

anticorpos monoclonais ou policlonais contra antígenos nucleares e do DNA e

ki-67. Os três tipos de amostra foram reativos para ki-67 nas células basais e

parabasais. A expressão de ki-67 em CP e CR foi um pouco maior do que na

gengiva. O ki-67 foi bem mais reativo em CP com intensa reação inflamatória

ou com epitélio de revestimento espesso, quando comparados aqueles com

menor intensidade inflamatória ou com epitélio de revestimento fino e aos CR.

ROSENSTEIN et al. (2001) estudaram uma série de ameloblastomas

císticos que apresentavam uma inesperada capacidade para destruição óssea

e recorrência. Foram avaliadas as taxas de proliferação, utilizando anticorpos

ki-67 para analisar se não havia qualquer correlação com o comportamento

biológico dessas lesões. Eles mostraram que a taxa de proliferação dos

ameloblastomas císticos foi de 4,3%, em comparação com tumores sólidos

(2,8%) e cistos dentígeros (6,6%), sugerindo que a agressividade dos

ameloblastomas císticos está mais relacionada a outros fatores do que com o

aumento da proliferação celular.

23

MEER et al. (2003), determinaram a atividade proliferativa in situ de

ameloblastomas sólidos e multicísticos e de ameloblastomas unicísticos

utilizando o PCNA e ki-67 para fornecer uma base científica para quaisquer

diferenças de comportamento biológico que pudessem existir entre estes dois

grupos de lesões. Os autores não encontraram uma correlação entre a

atividade proliferativa dessas proteínas e o comportamento biológico desses

dois tipos de lesões.

AYOUB et al. (2011) verificaram a imunoexpressão de ki-67 em CP e

queratocistos odontogênicos, concluindo que a natureza benigna dos CP e o

comportamento agressivo dos queratocistos poderiam ser explicados por meio

da expressão de ki-67 e que ele pode ser um marcador de proliferação celular

valioso para o melhor entendimento do comportamento biológico das lesões

císticas dos maxilares.

MARTINS et al. (2011), embora não tenham observado diferença

estatisticamente significativa na positividade para ki-67 entre CP e cistos

dentígeros, evidenciaram que a proteína foi encontrada em maior quantidade

em cistos associados à presença de infiltrado inflamatório intenso, sustentando

que o processo inflamatório pode influenciar no potencial proliferativo de

epitélios císticos.

TEKKEŞİN et al. (2012), analisaram as características de apoptose e o

potencial de proliferação dos queratocistos odontogênicos comparados com

ameloblastomas e CP, incluindo ki-67. Foi evidenciado que o epitélio de

revestimento do queratocisto odontogênico mostrou uma forte marcação para

ki-67, comparado ao ameloblastoma e ao CP. A alta expressão de ki-67 em

24

queratocistos odontogênicos conferem seu comportamento clínico agressivo e

uma alta taxa de recidiva.

GÜLER et al. (2012), investigaram a existência da associação entre o

processo inflamatório e a expressão de marcadores, incluindo ki-67, em

folículos dentários de dentes inclusos assintomáticos e cistos odontogênicos

(CP, cistos dentígeros queratocistos odontogênicos). Através de reações

imunoistoquímicas, os autores identificaram uma maior expressão de ki-67 em

queratocistos odontogênicos, seguido pelos CP, evidenciando a relação dessa

proteína com a intensidade do infiltrado inflamatório.

25

3 JUSTIFICATIVA

Muito embora o número de estudos buscando esclarecer a influência de

mediadores inflamatórios e de reparo tecidual na patogênese dos CP tenha

sofrido grande incremento nos últimos anos, diversos pontos ainda

permanecem controversos e desconhecidos. Um destes temas é a relação

existente entre a expressão imunoistoquímica de ICAM-1, TGF-β1 e ki-67 nos

CP e nos CR e sua associação com as diferenças morfológicas e estruturais

destas duas entidades. Biologicamente, acredita-se que a influência

inflamatória menos evidente no CR possa justificar o aumento dos mecanismos

de reparo tecidual e a diminuição do potencial proliferativo do epitélio de

revestimento cístico. No entanto, não existem estudos na literatura que tenham

objetivado avaliar estas três moléculas de forma comparativa nestes dois tipos

de cistos.

26

4 HIPÓTESE

A expressão imunoistoquímica da proteína ki-67 e da ICAM-1 é menor

em CR quando comparada com a expressão em CP; de forma contrária, a

imunoexpressão de TGFβ-1 é maior em CR quando comparada a expressão

em CP.

27

5 PROPOSIÇÃO

Comparar a expressão imunoistoquímica da proteína ki-67, de TGFβ-1 e

de ICAM-1 em cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.

28

6 MATERIAIS E MÉTODOS

A amostra foi composta de 25 CP e 25 CR selecionados dos arquivos

dos laboratórios de Patologia Bucal da Universidade Estácio de Sá (localizado

na Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580 cobertura, Recreio dos Bandeirantes,

Rio de Janeiro/RJ, Brasil) e da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

(situado no Boulevard 28 de setembro, 157 sala 503, Vila Isabel, Rio de

Janeiro/RJ, Brasil). As informações clínicas, radiográficas e macroscópicas de

cada caso foram obtidas por meio da revisão dos formulários de requisição

laboratorial em cada serviço específico.

Lâminas histológicas com cortes de 5µm coradas em hematoxilina e

eosina de cada um dos 50 casos que compuseram a amostra estudada foram

avaliadas em detalhe em microscópio óptico de luz acoplado a câmera digital

(Microscópico Leica, modelo DM500, Alemanha). As características

histológicas avaliadas incluíram: espessura do epitélio (atrófico ou

hiperplásico), espessura da cápsula do tecido conjuntivo (fina ou espessa),

intensidade do infiltrado inflamatório (focal/leve ou moderado/intenso),

presença ou não de fendas de cristais de colesterol, tipo de infiltrado

inflamatório (crônico ou misto) e tipos celulares predominantes (linfócitos,

plasmócitos, macrófagos e neutrófilos). Estas observações foram feitas

simultaneamente pelos dois observadores e as avaliações finais foram obtidas

por consenso.

Adicionalmente foram feitos cortes histológicos de 3µm, a partir dos

blocos de parafina de todos os casos selecionados, em lâminas previamente

silanizadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma, ST. Louis, MO, EUA).

29

Para as reações imunoistoquímicas, os cortes foram desparafinizados por meio

de duas trocas de xilol por 10 minutos cada em temperatura ambiente,

seguidas de hidratação em soluções com concentrações decrescentes de

etanol (100%, 90%, 70% e 50%), e posterior lavagem em água corrente. A

recuperação antigênica foi feita por meio da imersão das lâminas em berços de

vidro em um recipiente contendo uma solução de tampão citrato a 10 mM (pH

6,0) levado ao forno de micro-ondas (Panasonic modelo NN7809BH, 850W) em

potência máxima durante um ciclo de 12 minutos. Após resfriamento das

lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente, a atividade da peroxidase

endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% em 5 banhos

consecutivos de 5 minutos, após os quais os cortes foram lavados em água

corrente e submetidos à incubação com leite desnatado por 5 minutos. As

lâminas foram então lavadas em água corrente e incubadas em solução salina

tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS: phosphate-buffered saline).

Os anticorpos primários utilizados foram então diluídos em PBS

contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA, Sigma, ST. Louis, MO, EUA) e

os cortes foram incubados com os anticorpos primários, de acordo com suas

respectivas diluições, em câmara úmida por um período de 16 horas a 4°C.

Controles positivos (de acordo com a sugestão dos fabricantes) e negativos

(omissão do anticorpo primário) foram utilizados para todas as reações com

todos os anticorpos. A Tabela 1 mostra os anticorpos primários utilizados, com

seus respectivos clones, fabricantes e diluições.

30

Tabela 1. Anticorpos primários que foram utilizados na avaliação dos cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais, com seus respectivos clones, fabricantes e diluições.

Anticorpos primários Clone Fabricante Diluição (µL)

ICAM-1 G-5 Santa Cruz Biotechnology 1:1000

TGF-β1 V Santa Cruz Biotechnology 1:200

ki-67 MIB-1 DAKO 1:100

Após as 16 horas, os cortes foram lavados com três banhos de PBS e o

anticorpo secundário conjugado foi adicionado (LSAB, Dako, Carpinteria, CA,

EUA), durante trinta minutos a 37°C. Posteriormente os cortes foram

novamente lavados em PBS (3 trocas) e expostos ao sistema estreptavidina-

biotina-peroxidase (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por mais 30 minutos.

Em seguida, após três lavagens com PBS, as reações foram evidenciadas com

solução de tetracloreto de 3,3’ diaminobenzidina por 5 minutos a temperatura

ambiente. Os cortes foram posteriormente lavados em água corrente e contra-

corados com hematoxilina de Carazzi por 2 minutos, seguindo-se nova

lavagem com água corrente para eliminar os excessos do corante,

desidratação em três banhos de álcool absoluto, diafanização em xilol e

montagem com Entelan.

A análise da positividade de cada caso e cada área tecidual para cada

marcador imunoistoquímico levou em conta a localização da marcação

reconhecida como positividade para cada antígeno. Para todos os anticorpos

foi feita a avaliação individual de cada marcador sob microscopia ótica para

cada caso e o padrão de marcação e a localização tecidual da marcação foi

tabulada em planilha específica para a análise dos dados. A quantificação das

células com positividade nuclear para ki-67 foi feita pelo índice de positividade,

que foi obtido por meio da leitura de 4 campos de grande aumento (40x) em

31

cada lâmina, sendo que a escolha da região foi determinada pela integridade

estrutural do tecido e positividade mais evidente. As células positivas e

negativas foram contadas e os resultados expressos em porcentagem de

células positivas por campo (índice de positividade).

Ao final, as informações clínicas, radiográficas, macroscópicas,

histológicas e imunoistoquímicas foram tabuladas em uma planilha para análise

descritiva e comparativa entre os parâmetros e os grupos. Os dados foram

analisados no Statistical Program for Social Sciences (SPSS, versão 20) e as

diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05.

Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Estácio de Sá e aprovado com o parecer de número 650.018 (Anexos).

32

7 RESULTADOS

A análise demográfica, clínica e radiográfica dos 50 casos incluídos no

estudo (25 CP e 25 CR) mostraram que a média de idade dos pacientes do

grupo CP foi de 40,5 anos, variando dos 9 aos 67 anos de idade. Nos CR a

média de idade foi de 58,4 anos, variando de 31 aos 82 anos de idade,

havendo diferença significante entre os dois grupos (p≤ 0,0001). No grupo CP

12 casos (48%) foram diagnosticados em homens e 13 casos (52%) em

mulheres, e no grupo CR, 16 casos (64%) acometeram homens e 9 (36%)

mulheres (Tabela 2). Não houve diferença estatisticamente significativa quando

foram comparadas a presença de aumento de volume local e de sintomas entre

os grupos CP e CR (Tabela 2).

Tabela 2. Distribuição comparativa dos parâmetros clínicos e demográficos dos cistos

perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.

Parâmetros Cistos Perirradiculares

Cistos Residuais

Valor de p

Sexo

Masculino 12 (48%) 16 (64%)

0,254

Feminino 13 (52%) 9 (36%)

Aumento de volume

Não 6 (43%) 11 (44%)

0,945

Sim 8 (57%) 14 (56%)

Sintomas

Não 9 (60%) 19 (79%)

0,196

Sim 6 (40%) 5 (21%)

33

Em relação à região acometida, no grupo CP, 14 casos (56%) foram

diagnosticados na maxila anterior, 7 casos (28%) na mandíbula posterior, 2

casos (8%) na maxila posterior e 2 casos (8%) na mandíbula anterior. No grupo

CR, 12 casos (48%) foram diagnosticados na maxila anterior, 9 casos (36%) na

mandíbula posterior, 3 casos (12%) na maxila posterior e 1 caso (4%) na

mandíbula anterior. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a

distribuição anatômica das lesões nos dois grupos. O volume médio dos

espécimes recebidos no laboratório, calculado após sua análise macroscópica,

foi de 1984,5 mm3 (variando de 24 a 21000 mm3) no grupo CP e 1882,5 mm3

(variando de 108 a 12600 mm3) no grupo CR (p=0,919). Em relação ao maior

tamanho radiográfico das lesões, no grupo CP o tamanho médio foi de 26,1

mm (variando de 10 a 50 mm) e no grupo CR o tamanho médio foi de 21 mm

(variando de 10 a 45 mm) (p=0,107). No grupo CR, o intervalo de tempo médio

entre a exodontia e o diagnóstico do CR foi de 266 meses, variando de 36 a

504 meses. Quando comparados os tempos de evolução das lesões relatados

pelos pacientes, observou-se no grupo CP uma média de 21,3 meses (variando

de 4 a 60 meses) e no grupo CR uma média de 47,8 meses (variando de 1 a

204 meses) (p=0,397). A figura 1 mostra exemplos de imagens clínicas e

radiográficas dos CP e CR incluídos no estudo.

34

A

B

C

D

Figura 1. A. Presença de parúlide na mucosa alveolar vestibular na altura dos dentes 21 e 22. B. Cisto perirradicular inflamatório apresentando-se como área radiolúcida unilocular associada ao periápice dos dentes 21 e 22 (mesmo caso que A). C. Cisto perirradicular inflamatório de grandes dimensões associado aos restos radiculares do dente 46. D. Cisto residual na região do dente 43 caracterizado por área radiolúcida unilocular bem delimitada.

A análise dos parâmetros histológicos (intensidade do infiltrado

inflamatório e presença ou não de fendas de cristais de colesterol) e

imunoistoquímicos (expressão de ICAM-1 e TGFβ-1) mostraram que não foram

observadas diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos

(Tabela 3). O índice médio de proliferação celular, medido pela expressão

imunoistoquímica de ki-67, foi de 1.25% nos CP (variação de 0% a 5.31%), em

comparação com a média de 3.51% encontrada no grupo CR (variação de 0%

a 16.3%) (p=0,017).

35

Tabela 3. Distribuição dos parâmetros histológicos e de imunoistoquímica nos cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.

Parâmetros Cistos Perirradiculares

Cistos Residuais

Valor de p

Intensidade do

infiltrado Inflamatório

Focal / leve 8 (32%) 12 (48%)

0,248

Moderado / Intenso

17 (68%) 13 (52%)

Fendas de cristais de colesterol

Não 19 (76%) 16 (64%)

0,355

Sim 6 (24%) 9 (36%)

ICAM-1

Focal / leve 7 (28%) 11 (44%)

0,239

Moderado / Intenso

18 (72%) 14 (56%)

TGF-1

Focal / leve 14 (56%) 10 (40%)

0,258

Moderado / Intenso

11 (44%) 15 (60%)

As figuras 2, 3 e 4 mostram, respectivamente, imagens histológicas da

expressão de ICAM-1, TGFβ-1 e ki-67 nos componentes teciduais dos CP e

CR incluídos no estudo.

36

A B

C D

E F

Figura 2. A. Expressão de ICAM-1 no epitélio e nas células inflamatórias em um cisto residual (Imunoperoxidase, 10x). B. Detalhe do epitélio expressando ICAM-1 em um cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). C. Células inflamatórias e células endoteliais expressando ICAM-1 em um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). D. Plasmócitos expressando ICAM-1 em um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão de ICAM-1 no infiltrado inflamatório contendo macrófagos xantomatosos em um cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de ICAM-1 em células gigantes multinucleadas circundando fendas de cristais de colesterol em um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x).

37

A

B

C

D

E

F

Figura 3. A e B. Expressão de TGF beta 1 especialmente em fibroblastos na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de Cistos residuais (A e B - Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de TGF beta 1 em fibroblastos, células endoteliais e em algumas células inflamatórias na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de Cistos residuais (C e D - Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão de TGF beta 1 em macrófagos próximos a fendas de cristais de colesterol em um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de TGF beta 1 em fibroblastos e em células compatíveis com mastócitos na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x).

38

A

B

C

D

Figura 4. A e B. Expressão de ki-67 no núcleo das células epiteliais das camadas basal e suprabasal em dois cistos perirradiculares inflamatórios mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (A e B - Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de ki-67 no núcleo das células epiteliais das camadas basal e suprabasal em dois cistos residuais, um deles mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (C - Imunoperoxidase, 40x) e outro mostrando inflamação mais evidente associada a exocitose (D - Imunoperoxidase, 40x).

39

8 DISCUSSÃO

No que se refere aos CP, em nosso estudo, a prevalência do sexo

feminino (52%) foi ligeiramente maior do que o sexo masculino (48%), estando

em acordo com outros autores (OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al.,

2008), mas diferindo de outros estudos (KOSEOGLU et al., 2004; JONES et al.,

2006; MENINGAUD et al., 2006). A maior prevalência do sexo masculino

encontrada em vários trabalhos pode ser explicada pelo fato de que os homens

geralmente têm hábitos de higiene e cuidados orais mais pobres em

comparação às mulheres sendo mais suscetíveis a traumas e a cáries. De

acordo com a literatura, a região mais acometida é a maxila anterior

(LEDESMA-MONTES et al., 2000; JONES et al., 2006; OCHSENIUS et al.,

2007), em concordância com nossos resultados, que mostraram 56% dos CP

na maxila anterior. Segundo OCHSENIUS et al. (2007) o fato da maxila anterior

ser mais frequentemente afetada pode ser explicada por fatores estéticos, pois

os pacientes preservam seus dentes anteriores por mais tempo, ficando mais

suscetíveis a processos inflamatórios crônicos se não houver o tratamento

endodôntico adequado. Em relação à idade, a média encontrada para os CP foi

de 40.5 anos. Uma média parecida (37.3 anos) foi identificada no estudo de

JONES et al. (2006). No estudo de LEDESMA-MONTES et al. (2000), a

segunda e terceira década de vida foram mais prevalentes.

LEDESMA-MONTES et al. (2000) identificaram que os CR ocorreram

em mulheres com maior frequência, o que difere dos nossos resultados e de

outros estudos (BATAINEH et al., 2004; JONES et al., 2006; MENINGAUD et

al., 2006). Em relação à região mais acometida nos CR, nosso estudo mostrou

40

a maxila anterior como região mais prevalente (12 casos, 48%). JONES et al.

(2006) e OCHSENIUS et al. (2007) também identificaram que os CR foram

mais frequentemente encontrados na maxila anterior. A mandíbula foi

ligeiramente mais prevalente do que outras regiões no estudo de PROCKT et

al. (2008), mas sem localização anatômica específica determinada. O

diagnóstico dos CR foi mais prevalente em pacientes com mais de 80 anos de

idade no trabalho de PROCKT et al. (2008), enquanto que a terceira, quinta e

sexta décadas de vida foram mais frequentes nos estudos de LEDESMA-

MONTES et al. (2000), BATAINEH et al. (2004) e OCHSENIUS et al. (2007).

No presente estudo identificamos que uma média de 58,4 anos para o grupo

CR e de 40,5 anos no grupo CP, o que pode ser explicado pelo fato de que as

lesões císticas localizadas dentro da maxila, não causam nenhum sintoma

clínico após a extração do dente, sendo detectadas somente meses ou anos

mais tarde por causa de infecção secundária ou por tomada radiográfica

acidental.

Nossos resultados não mostraram diferença estatisticamente

significativa entre os CP e CR com relação a expressão de ICAM-1. TAŞMAN

et al. (1999) compararam amostras de dentes extraídos por indicação

ortodôntica com dentes extraídos devido à periodontite crônica e identificaram

uma distribuição similar nos tecidos de ICAM-1 expressa tanto no controle

quanto na periodontite crônica. O estudo de SAWA et al. (1998), encontrou

resultados diferentes, pois na polpa dentária saudável, nenhum vaso reagiu ao

ICAM-1, enquanto na polpa inflamada um grande número de vasos reagiu

fortemente ao ICAM-1. Nossos resultados mostraram que, ao compararmos CP

41

e CR que apresentaram semelhante componente inflamatório, a expressão de

ICAM-1 foi semelhante sugerindo que esta molécula associa-se a presença ou

não de inflamação e não a características biológicas intrínsecas destes cistos.

ANDRADE et al. (2013) demonstraram que a expressão de TGF-β1

estava aumentada nas lesões perirradiculares com maior infiltrado inflamatório,

sendo mais comumente encontrado em granulomas, seguidos de CP e por

último CR, diferente dos resultados do presente estudo. TYLER et al. (1999)

encontraram TGF-β1 em cistos e granulomas periapicais e atribuíram a ele um

papel no processo de reparo da destruição periapical nas duas lesões. Por sua

vez, PIATTELLI et al. (2004) observaram maior expressão de TGF-β1 em

queratocistos odontogênicos do que em CP e cistos dentígeros, e associaram

esse fato ao maior potencial de crescimento dos queratocistos através da

intensa proliferação celular, que seria regulada pelo TGF-β1.

Nossos resultados não mostraram diferenças estatisticamente

significativas entre os CP e CR com relação à expressão de TGFβ-1,

possivelmente pela presença semelhante do componente inflamatório nos

cistos estudados em ambos os grupos. Uma expressão similar de TGF-β1 em

granulomas e CP tem sido relatada em outros estudos (TYLER et al.,1999;

FUKADA et al., 2009; MARÇAL et al., 2010; SALUM et al., 2010). TGF-β1 tem

sido sugerido como importante fator para a cura periapical, pois esta citocina é

conhecida por inibir a atividade de reabsorção óssea e promover a

remodelação óssea e reparo tecidual. Neste sentido, estudos indicam que o

TGF-β1 estimula a síntese de colágeno, neovascularização, e proliferação de

fibroblastos (TYLER et al.,1999). Segundo SANTOS et al. (2007), a intensidade

42

do infiltrado inflamatório, não só está relacionada com um aumento na

quantidade de estímulos antigênicos, mas também a uma resposta exacerbada

de mecanismos de defesa do organismo, fato que pode justificar os resultados

encontrados em nossa amostra. No entanto, os resultados de ANDRADE et al.

(2013) confirmaram o possível papel de TGF-β1 na estabilização de lesões

periapicais através de sua imunossupressão e efeitos reguladores sobre a

inflamação, sendo observado uma maior imunomarcação para essa citocina

em lesões mais inflamadas.

SALUM et al. (2010), avaliando os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF-β

em CP e granulomas periapicais, observaram que os CP apresentaram

maiores níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas

expressaram maiores níveis de TGF-β e menores de citocinas pró-

inflamatórias. Os autores sugerem que os CP apresentaram reações

imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões

positivas para IL-4 eram negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas,

devido ao seu alto nível de TGF-β, consistiam em um ambiente com atividades

regulatórias, portanto com um maior potencial reparador.

Os resultados de AYOUB et al. (2011) avaliando a proliferação celular

no epitélio de revestimento de CP e cistos dentígeros demonstraram que a

expressão de ki-67 no epitélio cístico foi maior na presença de intenso infiltrado

inflamatório, sugerindo que o aumento da atividade proliferativa destes cistos

seria influenciado diretamente pela presença da inflamação. Nossos resultados

reforçam parcialmente esta possibilidade, visto que CR que apresentaram em

média a mesma intensidade de inflamação que CP apresentaram índices de

43

proliferação superiores a estes últimos. Estes dados reforçam a possibilidade

de que outros estímulos inflamatórios diferentes da inflamação pulpar tais como

superficialização do cisto por rompimento das corticais ou infecção secundária,

podem perpetuar o estímulo inflamatório nestas lesões, com potencial de

manter ou mesmo aumentar os índices de proliferação do epitélio cístico. No

estudo de MARTINS et al. (2011), o antígeno ki-67 foi detectado na camada

basal de CP e sua expressão foi significativamente mais elevada no epitélio

hiperplásico em comparação com o epitélio atrófico, similar aos achados de

SUZUKI et al. (2005). Os resultados do presente estudo sugerem que outros

fatores, a parte dos estímulos inflamatórios pulpares, devem ser estudados no

que diz respeito às características proliferativas dos CR, quando comparados

aos CP.

44

9 CONCLUSÃO

Os resultados do presente estudo não mostraram diferenças

estatisticamente significativas na expressão imunoistoquímica de ICAM-1 e

TGF-β1 entre cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais e o índice

de proliferação das células epiteliais (expressão de Ki-67) foi maior nos cistos

residuais em comparação com os perirradiculares inflamatórios. Estes achados

permitem supor que os estímulos inflamatórios específicos dos cistos residuais

possam modular seus mecanismos de etiopatogênese, crescimento e reparo.

45

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