Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Departamento de Química Cátedra de Química Analítica I Ciudad Universitaria - CC 242- (3000) Santa Fe Argentina - Teléfono: (0342) - 4575205

Química Bioanalítica

La Química Analítica en la era de la genómica, proteómica y celómica

TRABAJO PRÁCTICO Objetivos: ● Construir y caracterizar sensores GEC (composites grafito-epoxi) m-GEC (magneto composites grafito-epoxi) y CP (pasta de carbono). ● Comparar las propiedades electroquímicas de los sensores fabricados con sensores convencionales de carbono vitrificado. Caracterizarlos electroquímicamente. ● Modificar partículas magnéticas con una enzima a través del enlace avidina/biotina. ● Capturar las partículas magnéticas modificadas con la enzima con el sensor m-GEC. ● Evaluar la respuesta electroquímica de los magneto sensores. ● Inmovilizar una enzima por adsorción sobre el sensor GEC. Evaluar la respuesta electroquímica y compararla con la de los m-GEC. ● Inmovilizar una enzima por adsorción sobre el sensor GEC. Evaluar la respuesta electroquímica y compararla con la de los m-GEC. ● Inmovilizar una enzima biotinilada a través del enlace avidina/biotina sobre sensores Av-GEB (biocompósitos de avidina). Evaluar la respuesta electroquímica y compararla con la de los m-GEC. Fundamentos teóricos:

LOS SENSORES QUÍMICOS Un sensor químico es un dispositivo que transforma información química a una señal analíticamente útil 1 y es capaz de dar la concentración de un componente específico de una muestra. Un sensor se caracteriza por sus dimensiones reducidas, robustez, facilidad de utilizar y capacidad de suministrar información analítica fiable de manera continua. Los sensores químicos usualmente contienen dos componentes básicos conectados en serie: un sistema de reconocimiento molecular –el receptor–, y un transductor físico-químico2,3. El receptor es capaz de reconocer selectivamente un determinado analito. Fruto de este reconocimiento se produce una señal primaria de tipo eléctrico, óptico, térmico o másico. El transductor es el responsable de transformar dicha señal en otra de tipo eléctrico, la cual es más fácilmente cuantificable, medible y manipulable. La señal eléctrica producida aporta información analítica sobre la muestra, el proceso o el sistema que se está investigando 4. Los sensores químicos también se denominan quimiosensores si el elemento de reconocimiento es de naturaleza sintética y biosensores si el sistema de reconocimiento utiliza un mecanismo bioquímico 1. En la actualidad se encuentra en desarrollo un nuevo tipo de reconocimiento: el biomimético 5. Se basa en la tecnología de grabado molecular sobre polímeros sintéticos altamente estables, los cuales poseen propiedades de reconocimiento molecular selectivo. Este reconocimiento se fundamenta en que los sitios de la matriz polimérica son complementarios al analito en forma y grupos funcionales. Los sensores químicos se pueden clasificar en función de la propiedad física que mida el transductor 3,6,7. Así, se pueden clasificar en:

Universidad Nacional del Litoral

Curso 2008 Química Bioanalítica Doctorado en Ciencias Biológicas María Isabel Pividori http://einstein.uab.es/ipividori/

• Sensores basados en transductores ópticos 8: dispositivos basados en fibras ópticas 7,9, resonancia de plasmones superficiales 7,9-11 y sensores de onda evanescente 9. • Sensores basados en transductores piezoeléctricos 7,9,10,12-14: dispositivos basados en onda acústica de volumen y dispositivos basados en onda acústica superficial. • Sensores basados en transductores electroquímicos y eléctricos 1: sensores amperométricos 15,16, sensores potenciométricos 7,17, conductimétricos o impedimétricos 7 y de carga iónica o efecto de campo (ISFET) 7. Los sensores electroquímicos más ampliamente utilizados se basan en la amperometría y en la potenciometría. Las dos técnicas se diferencian en que, en el caso de los sensores amperométricos, se debe aplicar un potencial externo que provoque la reacción que tiene lugar en el electrodo, mientras que en los potenciométricos se provoca un equilibrio local en la superficie sensora, sin que sea necesario ninguna fuerza externa. En estos últimos se mide el potencial generado entre el electrodo y la solución denominado potencial de membrana en los electrodos selectivos a iones. En el próximo apartado, se desarrollarán con mayor detalle las técnicas que son utilizadas en este trabajo práctico para realizar las mediciones analíticas: amperometría y voltamperometría cíclica.

TÉCNICA AMPEROMÉTRICA Los sensores amperométricos se basan en la medida de la intensidad de corriente resultante de la oxidación o reducción de la superficie electroactiva de un electrodo al que se lo ha sometido a un potencial constante 1,7,18. La elección adecuada de este potencial aporta cierta selectividad electroquímica, ya que produce descarga de unas u otras especies químicas. A menudo, esta selectividad es insuficiente, por lo cual se debe modificar la superficie de los electrodos (química o biológicamente), para aumentar la selectividad y la sensibilidad de la detección. Para realizar medidas de señal amperométrica se utilizan sistemas de tres electrodos 1. El electrodo de trabajo es aquel sobre el cual se mide el paso de corriente una vez se ha fijado una diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar, actuando este último como un contraelectrodo para cerrar el circuito eléctrico. Se necesita también un potenciostato el cual, mediante el electrodo de referencia, mantiene constante el potencial aplicado sobre el electrodo de trabajo. El electrodo de referencia acostumbra ser de Ag/AgCl, mientras que el de trabajo y auxiliar son de materiales conductores e inertes, como metales nobles, derivados de carbono y polímeros conductores. La intensidad de corriente es una medida directa de la velocidad de la reacción electroquímica (velocidad de reducción u oxidación del analito en el electrodo) descripta por la ley de Faraday (en su forma diferencial) como:

dtdcnFI =

donde dc/dt es la velocidad de oxidación o de reducción del analito, en mol/s, y n es el número de electrones por molécula implicados en la reacción. Como se deriva de la ecuación, la corriente es directamente proporcional a la velocidad de transformación del analito en la superficie del electrodo. Sin embargo, una vez que las moléculas en la superficie se han electrolizado, se transfieren nuevas moléculas desde la solución a la superficie del electrodo. Así, la corriente también depende de manera crítica de la velocidad del transporte de masa del analito desde la solución a la superficie del electrodo 19. Este último parámetro depende de la concentración del analito en la solución, del área del electrodo y de las condiciones de migración, convección y de difusión 20. La migración, que se debe al transporte del analito por un gradiente eléctrico, generalmente se elimina adicionando un electrolito soporte en la celda. La convección, que se debe al transporte del analito impulsada por un movimiento de la solución –por ejemplo, mediante agitación–, puede controlarse simplemente si no se aplica agitación a la solución o si se aplica una agitación constante. La difusión, que se debe al transporte del analito debido al gradiente de concentración del mismo, depende del tiempo, hecho que limita este tipo de experimentos. Si la respuesta de los electrodos se mide en una solución estática, la corriente I decrece con el tiempo, según la ecuación descripta por Cottrell 19:

CπtD

nFA=I

en donde C es la concentración de la especie electroactiva en la solución, A el área del electrodo y D el coeficiente de difusión de la especie electroactiva en la solución. Debido a la dependencia del tiempo como se evidencia en la ecuación de Cottrell, en estas condiciones la corriente debería de disminuir hasta cero después de un período de tiempo, pero en realidad se obtienen intensidades de corrientes bajas 20. Una posibilidad es utilizar técnicas hidrodinámicas en las cuales se fuerza la convección, por ejemplo, agitando la solución o utilizando un electrodo de trabajo de disco rotatorio. El transporte de masa en estos experimentos –que es más rápido– es una combinación de la convección y la difusión. De esta manera, se forma una capa de difusión estática en la superficie del electrodo de un grosor L que depende de la velocidad de agitación 21. Así se consigue que el transporte de masa a la superficie del electrodo nada más esté determinado por la difusión en esta capa. Se obtiene entonces un estado estacionario en un tiempo relativamente breve, en el que el transporte de masa es estable y el valor final de la intensidad depende de la concentración del analito. Esta relación puede expresarse mediante la ecuación:

SCLD

nFA=I

donde CS es la concentración del analito en solución. Esta ecuación puede simplificarse como:

SKC=I donde K es la constante que incluye la constante de Faraday, el área del electrodo y el coeficiente de difusión, entre otros. Para la utilización de esta ecuación se asume que la distribución del analito en la solución es uniforme hasta la capa de difusión, y que en la superficie del electrodo la concentración del analito es cero.

Caracterización de los transductores amperométricos. Voltamperometría cíclica. La caracterización básica de las especies redox y de los transductores electroquímicos puede llevarse a cabo mediante la técnica electroquímica de voltamperometría cíclica 22. Esta técnica permite conocer de manera rápida el comportamiento redox de las especies químicas en un amplio rango de potenciales 23. La voltamperometría cíclica consiste en variar linealmente con el tiempo el potencial aplicado al electrodo de trabajo, realizando un barrido desde un potencial inicial hasta un potencial determinado, y seguidamente invertir la dirección de barrido en el sentido contrario hasta llegar al potencial de partida. Se consiguen así voltamperogramas cíclicos característicos para cada sistema redox. En los voltamperogramas se observa en la abscisa potenciales aplicados y en la ordenada la intensidad de corriente medida en el electrodo de trabajo. La corriente puede considerarse como la respuesta experimentada por el sistema de electrodos frente a los cambios de potencial aplicados externamente. Así la fuerza reductora u oxidante del electrodo se controla mediante el potencial aplicado: si el barrido se realiza hacia potenciales negativos se convierte en un reductor fuerte, mientras que si se realiza hacia potenciales positivos, se convierte en un fuerte oxidante 23. La información obtenida mediante voltamperometría cíclica es de carácter cualitativo, y pueden sacarse conclusiones respecto a parámetros como potenciales de oxidación y reducción, los aspectos cinéticos de transferencia electrónica sobre la superficie del transductor, la evaluación de la evolución de ésta respecto a una señal de excitación como es el potencial, y aspectos interfaciales como la adsorción de sustancias electroactivas.

Materiales utilizados como transductores amperométricos. Composites. Una de las ventajas de la amperometría es que los materiales utilizados en su construcción son simples y accesibles. Su principal requerimiento es que sean materiales conductores. Pueden utilizarse materiales simples 24 (metales como platino y oro o derivados del grafito como carbono vitrificado o grafito pirolítico), o materiales compuestos (los denominados composites). Un composite resulta de la combinación de diferentes componentes que confieren sus cualidades básicas, pero generando un material con características propias. Consisten en una dispersión de un material sólido conductor en una matriz polimérica de características aislantes.

Los composites conductores se pueden clasificar según la distribución de las partículas conductoras en el material aislante 25,26:

a) composites ordenados: presentan un cierto grado de ordenación de los componentes que lo forman;

b) composites aleatorios: las partículas se encuentran distribuídas de manera aleatoria en el material. Se pueden a su vez clasificar en:

• dispersos, si la distribución del conductor es totalmente aleatoria; • consolidados, si una de las fases predomina de forma aleatoria en algunas áreas de la matriz.

Se puede emplear una gran diversidad de materiales conductores (platino, oro, grafito), así como también una gran cantidad de polímeros. Su elección depende de la posterior aplicación del sensor. Los primeros transductores electroquímicos basados en composites descriptos en la bibliografía fueron los de pasta de carbono 27,28. Están formados por partículas de polvo de grafito (fase conductora), y un líquido aislante viscoso (aceite mineral). Debido a inconvenientes de tipo físico-mecánico 25 (resistencia del material), se han desarrollado composites rígidos 29. Algunas ventajas de estos composites rígidos es su facilidad de mecanización y regeneración mediante un simple pulido. En los laboratorios donde se ha realizado el presente trabajo se ha desarrollado este tipo de material y se lo ha aplicado al diseño de sensores potenciométricos y biosensores amperométricos en distintas conformaciones y para diferentes determinaciones analíticas 25,29-52. Además, se ha incorporado en este tipo de matrices el material biológico (biocomposites), con las ventajas que esto supone 53-60.

Ventajas y desventajas de la técnica amperométrica La técnica amperométrica presenta numerosas ventajas que la hacen adecuada para su

implementación en el campo de los biosensores. Entre ellas se puede citar 61: • Relación directa entre la concentración y la intensidad de corriente (señal analítica): es la causa de la mayor sensibilidad de amperometría respecto a potenciometría, en la cual la señal analítica (potencial) depende del logaritmo de la concentración. En amperometría se consiguen, por lo general, mejores límites de detección. • Se basa en reacciones que tienen lugar en la superficie del electrodo, por lo que no depende del volumen de la muestra o solución que se esté midiendo. • Es una técnica analítica simple, robusta y económica. • La señal analítica obtenida es fácilmente procesable. • Rango dinámico amplio (de 4 o 5 décadas de concentración). Esto favorece su posibilidad de aplicación en control de procesos y de automatización. • No es susceptible de interferencias de tipo físico (color, turbidez, viscosidad). Evita la necesidad de tratamiento de muestra. • Los materiales que constituyen los transductores pueden ser simples y accesibles (tal como el grafito).

Su principal desventaja es que todas las especies que tengan comportamiento redox similar al analito o a la molécula responsable de otorgar la información analítica (es decir, que se reduzcan u oxiden a potenciales similares), interferirán en las medidas. Este hecho puede solventarse utilizando mediadores químicos y selectivizando la membrana, mediante un reconocimiento bioespecífico, como puede ser una interacción DNA/DNA, enzima/sustrato o antígeno/anticuerpo.

BIOSENSORES Se define como biosensor al dispositivo analítico que incorpora un elemento biológico de reconocimiento selectivo (o específico de clase) –denominado biorreceptor–, en íntimo contacto con un transductor capaz de detectar el evento de reconocimiento molecular entre el analito y la biomolécula y transformarlo en una señal analítica, usualmente eléctrica 4,62,63. Con la aparición de los biosensores a principios de los años 60, se generó una nueva dimensión en los sensores químicos en cuanto al reconocimiento molecular de un analito: el biorreconocimiento 64. Esto implica una selectividad similar a lo que ocurre in vivo, que es la máxima que se puede obtener 65. La posibilidad de transformar este biorreconocimiento en una señal mensurable en el mismo dispositivo es otro concepto muy atractivo desde el punto de vista analítico.

El material biológico es el que otorga, por lo tanto, la selectividad del biosensor, mientras que el transductor es el que da la sensibilidad. De ahí la importancia de seleccionar un transductor adecuado. Las etapas básicas de funcionamiento de un biosensor son las siguientes (Figura 1):

1. interacción específica del analito de la muestra con el material biológico inmovilizado sobre el transductor de manera directa o sobre un soporte en contacto íntimo;

2. detección, por parte del transductor, de la variación de alguna propiedad física o química del sistema, provocada por la reacción de reconocimiento selectivo;

3. procesamiento de la señal y obtención de resultados. El material biológico que se puede utilizar es muy variado: enzimas, células 66, tejidos, cofactores, orgánulos, receptores, anticuerpos, microorganismos, agentes inmunológicos, DNA. Los transductores más ampliamente utilizados son ópticos, electroquímicos y piezoeléctricos. Los biosensores más desarrollados en la bibliografía y de mayor aplicación en la industria son aquellos que utilizan como material biológico una enzima. Como ejemplo se puede citar los biosensores de glucosa oxidasa, que se venden en las farmacias para medir los niveles de glucosa en sangre en diabéticos 67 (Yellow Springs Instruments, Inc.; MediSense, Inc.) 68. Los más novedosos son los inmunosensores y genosensores, que aún se encuentran en fase de desarrollo para su aplicación masiva.

Figura 1. Principio de funcionamiento de un biosensor

El material biológico puede inmovilizarse sobre el transductor de las siguientes maneras 1,3,15: • inmovilización superficial:

- retención en una membrana inerte o retención física; - adsorción física sobre el transductor; - entrecruzamiento mediante agentes bifuncionales; - enlace covalente con un soporte funcionalizado; - atrapamiento en matrices poliméricas.

• inmovilización en una matriz: biocomposites. Preparación de sensores basados en un composite grafito-epoxy (GEC) y de pasta de carbono

Mediocomplejo

Reconocimientodel analito

Sensibilidad a uncambio físico o

químicoTransducción Obtención de

señal mensurableObtención de

resultados

BIOSENSOR

Analito Biorreceptor Transductor Captura de datos Procesador

Figura 2 Etapas de la construcción del cuerpo del transductor amperométrico. Al conector hembra de 2 mm de diámetro (ii), se le coloca una rosca metálica (ii). Luego, se le suelda una lámina de cobre circular (iii). Posteriormente, se le coloca el tubo de PVC (iv). En la cavidad virtual se introduce el composite preparado (v). Procedimiento de adsorción en el sensor GEC (vi). Procedimiento de modificación del sensor y de lavados (vii)

Construcción del cuerpo del sensor amperométrico Para la construcción del cuerpo del transductor se utiliza una conexión hembra de 2 mm de diámetro. En su extremo se suelda una lámina de cobre circular, de la cual se elimina mediante HNO3 o etanol la capa de óxido que podría tener. Esta capa de óxido, de no eliminarse, podría aumentar la resistencia al paso de la corriente y, por lo tanto, disminuir la sensibilidad del sensor. Esta conexión se introduce en un tubo cilíndrico de PVC de 6 mm de diámetro interno, de 8 mm de diámetro externo y de 18 mm de longitud. La rosca metálica que posee la conexión permite que esta última quede bien fijada en un extremo del tubo de PVC, mientras que en el otro extremo queda una cavidad virtual de 3 mm de profundidad. En esta cavidad posteriormente se introduce el composite preparado, tal como se puede observar en la Figura 2. Preparación de la pasta del composite grafito-epoxi Los composites se preparan con grafito en polvo de tamaño de partícula de 50 μm (BDH) y resina epoxi Epo-Tek H77 (Epoxy Technology, USA). El composite se prepara mezclando grafito en polvo y resina Epo-Tek H77 en una relación 1:4 partes en peso (20 % grafito, 80 % de resina). Esta resina epoxi está constituida por dos componentes: la resina propiamente dicha y el endurecedor, que se combinaron en una proporción de 20:3 partes en peso, respectivamente (87 % de resina, 13 % de endurecedor).

Por cada electrodo se preparan 500 mg de pasta. En primer lugar se pesan aproximadamente 348 mg de resina propiamente dicha (teniendo la precaución de homogeinizarla previamente) y 52 mg de endurecedor (con una pipeta de punta pequeña). En caso de no haber pesado exactamente la cantidad de resina, se recalcula la cantidad de endurecedor para mantener la proporción. Se mezclan con una espátula, cuidando de no perder material. Una vez homogeneizado, se agregan los 100 mg de grafito, y se homogeiniza con la misma espátula nuevamente. La homogeinización del material es el paso crítico para la obtención de un transductor con propiedades electroquímicas óptimas. Finalmente, el material resultante se incorpora en el cuerpo del transductor amperométrico, con ayuda de la espátula y un portaobjeto para asegurar la compactación del mismo. Los sensores pueden curarse, por ejemplo, una semana a una temperatura entre 25 a 40 ºC o 3 días a 80 º C, obteniéndose un material rígido. Una vez curados, los electrodos se pulen siguiendo la siguiente secuencia: a) papel de vidrio (N ° 600). b) papel de vidrio (N ° 800). c) papel de alúmina de 3 μm Luego del pulido, la superficie se limpia con ultrasonidos 2 minutos para eliminar los restos de material mal adherido. Los electrodos se conservan en lugar seco y limpio, a temperatura ambiente. Preparación de la pasta de carbono y de los sensores de pasta de carbono La pasta de carbono se prepara con grafito en polvo de tamaño de partícula de 50 μm (BDH) y aceite mineral (Aldrich). La pasta de carbono se prepara mezclando grafito en polvo y aceite mineral en una relación 70:30 partes en peso respectivamente. Por cada electrodo se deben preparan 500 mg de pasta. En primer lugar se pesan aproximadamente 350 mg de polvo de grafito y luego se adicionan 150 mg de aceite mineral (con una pipeta de punta pequeña). En caso de no haber pesado exactamente la cantidad de aceite mineral, se recalcula la cantidad de grafito para mantener la proporción. Se mezclan ambos componentes con la espátula, cuidando de no perder material. La homogeinización del material es el paso crítico para la obtención de un transductor con propiedades electroquímicas óptimas. Finalmente, el material resultante se incorpora en el cuerpo del transductor amperométrico, con ayuda de la espátula y un portaobjeto para asegurar la compactación del mismo. A diferencia del composite grafito-epoxi, este material no se cura, y su consistencia es blanda. Los electrodos deben pulirse con mucho cuidado por la consistencia del material debido a que el material es más sensible (desde el punto de vista mecánico), siguiendo la siguiente secuencia: a) papel de vidrio (N ° 800). b) papel de alúmina de 3 μm Los electrodos se conservan en lugar seco y limpio, a temperatura ambiente. Renovación de la superficie de los sensores Todos los sensores (GEC, pasta de carbono, carbono vitrificado) deben pulirse luego de utilizados con el objeto de renovar la superficie de los mismos. En el caso de los sensores GEC (composite grafito-epoxi) y de pasta de carbono, se sigue la secuencia que se explicara con anterioridad. Para el caso de los electrodos de carbono vitrificado, el pulido se realiza con polvos de alúmina. Caracterización microscópica de las superficies Las superficies de los electrodos de grafito-epoxi así como el de carbono vitrificado pueden observarse por microscopía óptica y electrónica de barrido luego del pulido. La superficie del transductor grafito-epoxi parece tener grupos de material acumulados en áreas aleatorias. Desde el punto de vista topográfico, parecerían tener distintas alturas debido a sus profundidades aparentes. Sin embargo, la superficie del transductor de carbono vitrificado se caracteriza por su aspecto pulido y por la ausencia de grupos de material. La presencia de estos acúmulos de material en el transductor grafito-epoxi resulta en un aumento en su área superficial comparado con el carbono vitrificado. Este hecho implica una mayor capacidad de adsorción física de materiales sobre su superficie. Estos grupos de material podrían explicar también su comportamiento como arreglos de microelectrodos. Preparación de sensores magnéticos basados en un composite grafito-epoxy (m-GEC)

Figura 3 (A) Etapas de la construcción del cuerpo del transductor amperométrico para un sensor m-GEC. Al conector hembra de 2 mm de diámetro, se le coloca una rosca metálica. Luego, se le suelda una lámina de cobre circular. Posteriormente, se le coloca el tubo de PVC. En la cavidad virtual se introduce una capa del composite preparado, un pequeño imán de neodimio de 3 mm de diámetro y se completa el rellenado con la pasta del composite. (B) Procedimiento de modificación de las partículas magnéticas y de captura de las mismas por el m-GEC.

Evaluación de los electrodos GEC, m-GEC, de pasta de carbono y carbono vitrificado mediante voltamperometría cíclica La caracterización básica de las especies redox y de los transductores electroquímicos puede llevarse a cabo mediante la técnica electroquímica de voltamperometría cíclica. Esta técnica permite conocer de manera rápida el comportamiento redox de las especies químicas en un amplio rango de potenciales. La voltamperometría cíclica consiste en variar linealmente con el tiempo el potencial aplicado al electrodo de trabajo, realizando un barrido desde un potencial inicial hasta un potencial determinado, y seguidamente invertir la dirección de barrido en el sentido contrario hasta llegar al potencial de partida. Se consiguen así voltamperogramas cíclicos característicos para cada sistema redox para un electrodo de trabajo en concreto. En los voltamperogramas se observa en la abscisa potenciales aplicados y en la ordenada la intensidad de corriente medida en el electrodo de trabajo. La corriente puede considerarse como la respuesta experimentada por el sistema de electrodos frente a los cambios de potencial aplicados externamente. Así la fuerza reductora u oxidante del electrodo se controla mediante el potencial aplicado: si el barrido se realiza hacia potenciales negativos se convierte en un reductor fuerte, mientras que si se realiza hacia potenciales positivos, se convierte en un fuerte oxidante. La información obtenida mediante voltamperometría cíclica es de carácter cualitativo, y pueden sacarse conclusiones respecto a parámetros como potenciales de oxidación y reducción, los aspectos cinéticos de transferencia electrónica sobre la superficie del transductor, la evaluación de la evolución de ésta respecto a una señal de excitación como es el potencial, y aspectos interfaciales como la adsorción de sustancias electroactivas. Las caracterizaciones por voltamperometría cíclica se realizan en una celda de medida donde se disponen tres electrodos: un electrodo de referencia de doble unión Ag/AgCl, un electrodo auxiliar de hilo de platino y el electrodo de trabajo a caracterizar, que en este caso serán los sensores construidos: los sensores GEC, o los sensores de pasta de carbono, o los de carbono vitrificado. Como los sensores GEC construidos son de una longitud reducida (18 mm, véase Figura 2), es necesario acoplarlos a un soporte extensor de una longitud aproximada de 10 cm, construido con el mismo tubo de PVC utilizado para el cuerpo de los sensores. En uno se los extremos se coloca un conector hembra idéntico al que se utiliza anteriormente, y en el otro extremo un conector macho adherido con pegamento instantáneo. Estos dos conectores se sueldan con estaño a los extremos de un cable conductor que une ambas conexiones.

La celda de medida contiene 20 ml de solución tamponada de fosfato 0.1 M, KCl 0.1 M a pH 7.0, en la cual se adicionará ferrocianuro o hidroquinona 5 mM, que constituirán los pares redox (Fe2+//Fe3+, e hidroquinona//benzoquinona, respectivamente) que servirán para caracterizar los electrodos. Procedimiento a) Preparación del buffer fosfato 0.1 M, KCl 0.1 M a pH 7.0. b) Preparación de solución de una solución de ferrocianuro (hexacianoferrato(II) de potasio –K4[Fe(CN)6]. 3 H2O– ,

5 mM. c) Preparación de una solución de hidroquinona 5 mM. Una vez preparada y disuelta, la solución se recubre con

parafilm y se le hace burbujear nitrógeno. d) Armar la celda electroquímica y conectar los electrodos correctamente al analizador voltamétrico BAS: i)

electrodo de trabajo (GEC o pasta de carbono o carbono vitrificado) utilizando siempre como ii) electrodo de referencia el de Ag/AgCl y como iii) electrodo auxiliar el hilo de platino. El sistema de 3 electrodos se coloca en 20.00 mL de buffer fosfato 0.1 M, KCl 0.1 M a pH 7.0.

e) Fijar mediante el software del analizador voltamétrico los parámetros de las medidas. El voltamperograma cíclico se comenzará a un potencial de –0.4 V, y se continuará en el sentido de la oxidación. El barrido de potenciales se seguirá hasta +1.0 V, punto en el cual el barrido se revertirá en el sentido de reducción. El voltamperograma se continuará hasta –0.6 V y se terminará al mismo potencial que el inicial. Como velocidad de barrido se utilizarán los siguientes valores: ν = 50 y 5 mV s-1. Se realizarán 5 voltamperogramas cíclicos por determinación, y se registrarán los datos del último. Antes de adicionar hidroquinona o ferrocianuro, se realizará el correspondiente voltamperograma cíclico del buffer fosfato. Una vez realizado el voltamperograma cíclico del buffer fosfato, se adicionará un volumen de hidroquinona o ferrocianuro de manera de que su concentración en la celda de medida sea 5 mM. Agitar mediante un imán teflonado. Realizar los voltamperogramas cíclicos en la solución estática.

f) Interpretación de los resultados. A partir de los voltamperogramas cíclicos se determinarán los potenciales de reducción//oxidación de la hidroquinona y del ferrocianuro en los distintos transductores a caracterizar. El voltamperograma cíclico se comenzará a un potencial de –0.4 V, y se continuará en el sentido de la oxidación, llegando a un potencial (a determinar) correspondiente a un máximo de oxidación de la especie redox utilizada (hidroquinona o ferrocianuro). El barrido de potenciales se siguirá hasta +1.0 V, punto en el cual el barrido se revertirá en el sentido de reducción. La especie redox que fuera oxidada al potencial de oxidación (a determinar), presentará un pico de reducción a un valor también a determinar. El voltamperograma se continuará hasta –0.6 V y se terminará al mismo potencial que el inicial. Se compararán los voltamperogramas cíclicos de los distintos transductores construídos (GEC y pasta de carbono) y se compararán con el obtenido para el sensor de carbono vitrificado.

g) Elaboración del informe. Importar los datos obtenidos a un programa tipo excel o sigma plot para la realización de los gráficos correspondientes. Superponer los tres voltamperogramas cíclicos obtenidos con los tres electrodos (GEC, pasta de carbono y carbono vitrificado). Obtener conclusiones.

Modificación de partículas magnéticas modificadas con avidina con biotina-HRP y evaluación electroquímica con sensores magnéticos m-GEC Para tal fin, se seguirán protocolos descriptos en la siguiente bibliografía: ● M. I. Pividori, E. Zacco, S. Alegret, S. Hernández, S. Fabiano, V. Mantovani, M.-P. Marco, Francisco Sánchez Baeza. Detección rápida de residuos de antibióticos en leche con biosensores. ILE Industrias lácteas españolas 338, 43-48. 2007 ● E. Zacco, J. Adrian, R. Galve, M.-P. Marco, S. Alegret, M. I. Pividori. Electrochemical magneto immunosensing of antibiotic residues in milk. Biosensors and Bioelectronics 22, 9-10, 2184-2191. 2007 ● Anabel Lermo, Susana Campoy, Jordi Barbé, Santiago Hernández, Salvador Alegret, M. Isabel Pividori. In situ DNA amplification with magnetic primers for the electrochemical detection of food pathogens. Biosensors and Bioelectronics 22, 9-10, 2010-2017. 2007 ● M. Isabel Pividori, Anabel Lermo, Susana Campoy, Santiago Hernández, Jordi Barbé and Salvador Alegret. Rapid Electrochemical DNA Biosensing Strategy for the Detection of Food Pathogens Based on Enzyme-DNA-Magnetic Bead Conjugate. Afinidad , 63 (521), 645-650. 2006. ● E. Zacco, M. I. Pividori, S. Alegret, R. Galve, and M.-P. Marco. Electrochemical Magnetoimmunosensing Strategy for the Detection of Pesticides Residues. Analytical Chemistry 78, 1789-1788. 2006.

Modificación con biotina-HRP de sensores basados en biocompósitos Av-GEB y evaluación electroquímica Para tal fin, se seguirán protocolos descriptos en la siguiente bibliografía: ● A. Bonanni, M. I. Pividori, M. del Valle. Application of the avidin–biotin interaction to immobilize DNA in the development of electrochemical impedance genosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry, in press ● M. I. Pividori, A. Lermo, E. Zacco, S. Hernández, S. Fabiano, S. Alegret. Bioaffinity platforms based on carbon-polymer biocomposites for electrochemical biosensing. Thin Solid Films, in press ● E. Zacco, R. Galve, M.-P. Marco, S. Alegret, M. I. Pividori. Electrochemical biosensing of Pesticides Residues based on affinity biocomposite platforms. Biosensors and Bioelectronics 22, 8, 1707-1715. 2007 ● María Isabel Pividori, Emanuela Zacco, Anabel Lermo y Salvador Alegret, María Pilar Marco, Francisco Sánchez Baeza. Los biosensores en la industria alimentaria, el control medioambiental y la salud humana. Farmaespaña industrial, nov-dic , 68-73 2006 ● E. Zacco, M.I. Pividori, S. Alegret. Electrochemical biosensing based on universal affinity biocomposite platforms. Biosensors and Bioelectronics 21, 1291–1301. 2006. En ambos casos, para conseguir modificar tanto las partículas magnéticas como el biosensor Av-GEB, se utilizará el siguiente reactivo:

Los controles negativos se realizaran con las mismas peroxidasa no biotinilada, con el objeto de evaluar la adsorción inespecífica de la enzima.

For research use only

INDEX1. PRODUCT DESCRIPTION2. PRINCIPLE3. INSTRUCTIONS FOR USE

3.1 Preparation of Dynabeads M-280 Streptavidin3.2 Immobilization Procedures3.3 Release of Immobilized Biotinylated Molecules3.4 Automated Protocols

4. TECHNICAL INFORMATION4.1 Product Characteristics4.2 Binding Capacity4.3 Biotinylation of Molecules4.4 References4.5 Additional Material Needed4.6 Recommended Buffers/Solutions

5. GENERAL INFORMATION5.1 Storage and Stability5.2 Other Steptavidin-Coupled Dynabeads5.3 Warnings & Limitations5.4 Trademarks & Patents5.5 Intellectual Property Disclaimer5.6 Limited Use Label License5.7 Warranty

1. PRODUCT DESCRIPTIONDynabeads® M-280 Streptavidin are uniform, super-paramagnetic, polystyrene beads with a monolayer ofstreptavidin covalently attached to the hydrophobicbead surface. The streptavidin monolayer is covalentlycoupled to the beads. The absence of excess physicallyadsorbed streptavidin also ensures low batch-to-batchvariations and optimal reproducibility for your applica-tion or assay.

2. PRINCIPLEStreptavidin-coupled Dynabeads are designed as a solid-phase matrix for simple and efficient binding ofbiotinylated compounds such as small molecules, pep-tides, proteins, antibodies, sugars, lectins, oligo-nucleotides, DNA/RNA etc. Using a Dynal MPC™(Magnetic Particle Concentrator), the beads allow iso-lation and subsequent handling of target molecules ina highly specific manner. Capture, washing and detec-tion is easily performed and optimised.

3. INSTRUCTIONS FOR USE3.1. Preparation of Dynabeads M-280 StreptavidinThe Dynabeads should be washed before use toremove preservatives. The washing procedure is facili-tated by using a magnet (Dynal MPC).1. Resuspend the Dynabeads by shaking the vial to

obtain a homogeneous suspension.2. Transfer the appropriate amount of beads to a tube

(see section 4.2.).3. Place the tube on the magnet for 1–2 min. Do not

remove the tube from the magnet during the sepa-ration process.

4. Remove the supernatant with a pipette while thetube remains on the magnet. Avoid touching the in-side wall of the tube (where the beads attract tothe magnet) with the pipette tip.

5. Remove the tube from the magnet. Add the appro-priate buffer for your specific application/immobili-zation along the inside of the tube where the beadsare collected. Use the same volume as in step 2above and resuspend gently.

6. Wash the beads once more by repeating steps 3 to5. Then add a suitable volume of buffer to obtainan appropriate working concentration of Dyna-beads.

3.1.A. Preparation for RNA ManipulationsDynabeads M-280 Streptavidin are NOT supplied inRNase free solution. For a description of Solution A

and Solution B, see section 4.6.1. Wash the beads twice with the same volume of

Solution A for 1–3 minutes.2. Wash the beads once with the same volume of

Solution B.3. Resuspend the beads in Solution B.

3.2. Immobilization ProceduresDynabeads M-280 Streptavidin provide an excellentsolid support for a wide range of molecular manipula-tions, affinity isolations and bioassays. Capture of tar-get can be direct or indirect. In an indirect approach,the biotinylated ligand is first added to the sample andwill form a complex by binding to the specific target.This complex is then incubated with the beads for cap-ture. Given the strong affinity and rapid binding kine-tics of biotin-streptavidin, indirect capture can be usedto minimise unspecific binding when the ligand-targetkinetics are slow or the affinity is weak. This alternati-ve approach can also be of benefit if the concentrationof ligand is low or the ligand-target binding requiresoptimal ligand orientation and true liquid-phase kine-tics.

3.2. A. Nucleic Acids:1. Wash the Dynabeads M-280 Streptavidin once in

the B&W Buffer as described (see sections 3.1 and4.6). Ensure B&W Buffer is prepared with RNase-free solutions when working with RNA.

2. Aliquot in microcentrifuge tubes or microtiter wellsand remove the buffer from the last washing step.

3. Resuspend the beads in B&W Buffer to a final con-centration of 5 µg/µl (twice the original volume), or toa concentration suitable for the application of choice.

4. To immobilize, add an equal volume of the biotiny-lated DNA/RNA. The NaCl concentration in theB&W Buffer is 2 M and the final NaCl concentrationin the binding mixture should be 1 M. The amountof DNA/RNA needed is dependent on the application.

5. Incubate at room temperature using gentlerotation or occasional mixing by gently tapping thetubes. The optimal incubation time depends on thelength of the nucleic acid bound: short oligonucleo-tides (less than 30 bases) required at most 10 mi-nutes. DNA fragments up to 1 kb require 15 minutes.

6. Separate the beads, now coated with the bio-tinylated DNA/RNA fragment, using a magnet. Leavethe tube/tray on the magnet for 1 to 2 minutes.

7. Wash 2–3 times with a 1 x B&W Buffer (the buffersuggested in section 4.6. is 2 x concentrated), usinga magnet.

8. Resuspend to the desired concentration. The bin-ding is now complete and the beads with the im-mobilised DNA/RNA fragment can be resuspendedin a buffer with low salt concentration, suitable fordownstream applications.

NOTE:For immobilization of biotinylated DNAfragments above 1 kb we recommend theDynabeads® kilobaseBINDER™ Kit (Cat.no. 601.01). With the unique BindingSolution supplied in this kit, it is possible toimmobilize 70 pmoles of a 4 kb biotinylatedDNA fragment and 80 pmoles of a 10 kbfragment per mg Dynabeads M-280Streptavidin. This enables various applica-tions to be conducted, including pure tem-plate isolation for gene expression and pro-tein – DNA interaction studies, mRNA pro-cessing studies etc. (14)

3.2.B. Antibodies:1. Calculate the required amount of Dynabeads and

biotinylated antibodies. Approx. 5–10 µg anti-bodies per mg Dynabeads M-280 Streptavidin isneeded when saturation of the streptavidin is desi-red, assuming 100% biotinylation of the antibody.

2. Incubate the beads and biotinylated antibodies at

room temperature for 30 minutes with gentle rota-tion of the tube.

3. Separate the beads now coated with biotinylatedantibodies using a magnet for 2–3 minutes.

4. Wash 4–5 times in Phosphate buffered saline (PBS)pH 7.4 containing 0.1% BSA using a magnet.

5. Resuspend to the desired concentration.

3.2.C. Small Biotinylated Molecules:Dynabeads M-280 Streptavidin can also be used for theimmobilization of biotinylated ligands such as smallmolecules, peptides etc. The capacity for biotinylatedligand will depend on steric availability as well as chargeinteraction between bead and ligand and betweenligands. There are 3–4 biotin binding sites available for eachstreptavidin molecule on the surface of the beads. Forsaturation, add about 1,000 pmoles of biotinylatedsmall molecules per mg beads and incubate withmixing for 15 – 30 minutes. The specific concentrationadded will depend on the size of your specific molecule.The bead concentration during binding should be keptat 10–50 mg/ml. Wash the coated beads using a mag-net 3-4 times to remove non-bound material. The salt-concentration and pH (typically 5–9) of the chosenbinding buffer can be varied depending on the type ofmolecule to be immobilized. Similarily, the selectedbuffer used in the downstream application should beoptimised for the specific application. Beads with im-mobilized molecules are stable in common buffers.

3.3. Release of Immobilized Biotinylated MoleculesBreaking the biotin-streptavidin bond requires harshconditions. As an example, 5 minutes incubation at65°C or 2 minutes at 90°C in 10 mM EDTA pH 8.2 with95% formamide will typically dissociate >96% of im-mobilized biotinylated DNA. Alternatively, the Dyna-beads with immobilized target molecules may be boiledfor 5 minutes in 0.1% SDS.

3.4. Automated ProtocolsMagnetic separation and handling using Dynabeadscan easily be automated on a wide variety ofplatforms. Selected protocols are available at‘www.invitrogen.com’.

4. TECHNICAL INFORMATION4.1. Product CharacteristicsThe Dynabeads M-280 Streptavidin are supplied as asuspension containing 10 mg (6-7 x 108) Dynabeadsper ml, dissolved in phosphate buffered saline (PBS)pH 7.4, containing 0.1% BSA and 0.02% NaN3 as pre-servatives. The product is available in three formats, 2 ml (Cat.no. 112.05D), 10 ml (Cat. no. 112.06D) and 100 ml(Cat. no. 602.10).Typical bead-characteristics for any given lot of thisproduct:Diameter: 2.8 µm Specific surface area: 4-8 m2/gDensity: 1.4 g/cm3

The recombinant streptavidin employed is a protein(approx. 52 kDa ) (1) made up of four identical sub-units, each containing a high affinity binding site forbiotin (KD = 10-15 M). It has the same biotin bindingproperties as avidin, but less non-specific binding isobserved (2). The interaction between streptavidinand biotin is formed very rapidly and once formed,unaffected by wide extremes of pH, temperature,organic solvents and other denaturing agents.Certificate of Analysis (CoA) is available upon request.Material Safety Data Sheet (MSDS) is available athttp://www.invitrogen.com.

4.2. Binding CapacityThe Streptavidin-Coupled Dynabeads are coated notwith a multilayer, but a monolayer of recombinantstreptavidin. This leaves the majority of the biotin bin-ding sites sterically available for binding not only offree biotin, but also biotinylated ligands/targets. The binding capacity will depend on the size of thespecific molecule(s) to be immobilized. Ensure thatyour sample does not contain an excess of free biotin,as the free biotin will bind much more rapidly thanlarger molecules. For nucleic acids, the binding capacity is fragmentlength dependent. Quantitative assays of 32P-labelled

PCR product binding to beads show the effect of thelength of the PCR product on binding. Twice as manycopies of a 500 bp DNA fragment bind to the beadsthan a 1,000 bp DNA fragment. Reduced bindingcapacity for large DNA fragments may be due to sterichindrance.The salt concentrations influence the efficiency of thebinding of biotinylated nucleic acids to the beads.Optimal binding conditions for biotinylated DNA frag-ments (up to 1 kb) are achieved at 1M NaCl (final con-centration), 25°C and 15 minutes.Ensure that the solution containing your target PCRfragments does not contain an excess of free biotiny-lated oligonucleotide, i.e. biotinylated primers remai-ning from an upstream PCR step. This can be done byrunning the PCR with limiting concentrations of thebiotinylated primer, or remove the free biotinylatedprimer by ultrafiltration, microdialysis or other clean-up protocols.One milligram of Dynabeads M-280 Streptavidin typi-cally binds: • 700 pmoles of free biotin.• 200 pmoles of biotinylated oligonucleotides. • 5 - 10 µg of biotinylated antibody.• 5 pmoles of a 2-4 kb double stranded DNA frag-

ment.

NOTE:Invitrogen Dynal recommends that a titrati-on is performed to optimise the quantity ofbeads used for each individual application,since both the size of the specific moleculeto be immobilized and the biotinylation pro-cedure will affect the binding capacity.

4.3. Biotinylation of MoleculesBiotinylated ligands easily bind to Streptavidin-coupledDynabeads. Following binding, the biotinylated com-plex is easily manoeuvred due to the unique magneticproperties of the Dynabeads and the strength and sta-bility of the biotin/streptavidin association. Magnetichandling allows for easy change of buffer and otherexperimental procedures.Invitrogen Dynal recommends the use of commercial-ly available biotinylation reagents from companies likePierce or Sigma-Aldrich. A variety of biotinylation rea-gents are available, targeting different functionalgroups (primary amines, sulfhydryls, carboxyls, carbo-hydrates, tyrosine and histidine side chains and guani-dine and cytosine bases). This allows you to choosean optimal biotinylation reagent specific for your appli-cation, avoiding inactivation of the target molecule.Photoreactive biotin compounds that react non-speci-fically upon photoactivation are also available. Severalbiotinylation compounds have different spacer-arms toreduce the steric hindrance in some applications.Reagents may be water-soluble or water in-soluble,the choice depending on the application.

NOTES:• All biotin reagents should contain

a spacer arm, at least 6 C-atoms inlength, to reduce steric hindrance.

• Free biotin in your sample will reducethe binding capacity of the Strepta-vidin-coupled Dynabeads. A dispos-able column packed with Sephadex®

will remove unincorporated biotinfrom your sample.

• Biotinylated oligonucleotide primersshould be purified by reverse phaseHPLC/FPLC® chromatography for op-timal binding efficiency.

• Specific biotinylation at the 5’-end ofoligonucleotide primers is recommen-ded to maintain the 3’-end free for elongation.

4.3.A. Biotinylation of Oligonucleotide PrimersBiotinylated oligonucleotides are commercially avail-able from a number of companies. It is recommendableto directly incorporate biotin at the 5’-end of the oligoduring DNA synthesis using biotin phosphoramidite (3,6). The use of biotin phosphoramidite in the synthesisreaction allows biotinylation at the 5’-end with no ef-fect on the specificity or melting temperature of thelabelled oligonucleotide. Described below is a protocolfor biotinylation by chemical incorporation of 5’- or 3’-aminomodified oligonucleotides.

Dynabeads® M-280 Streptavidin

Rev. no. 012

Cat. no. 112.05D112.06D602.10

1. Dissolve 0.1 µmol of amino-modified nucleic acid in0.7 ml of sterile distilled water (5’-amino modifiedoligonucleotides may be synthesised using the rea-gent Aminolink 2™).

2. Add 0.1 ml of 1.0 M NaHCO3/Na2CO3 buffer, pH 9.0.3. Attach a biotin residue to the aminogroup using the

reagent Biotin-X-NHS-Ester. Freshly prepare a 10mg/ml solution of Biotin-X-NHS-Ester in N,N-dimet-hylformamide. Add 0.2 ml of this solution in thereaction mixture.

4. Leave at room temperature for two hours.5. Remove traces of unincorporated Biotin-X-NHS-

Ester by using a NAP™-10 Spin Column.6. Purify the biotinylated oligonucleotide by reverse

HPLC following the manufacturer’s specifications.

4.3.B. Purification of Biotinylated PrimersIt is of great importance that the biotinylated oligonu-cleotide is pure from unbound biotin, preferably byFPLC (10) or reverse phase HPLC (11), since free bio-tin will occupy binding sites on the beads and reducethe binding capacity of biotinylated PCR products. Thispurification step also ensures full length deoxyoligo-nucleotides with labelling levels close to 100%.When performing the biotinylation of primers usingbiotin phosphoramidite, you can expect to obtain 70–75% biotinylation of your primer. This means that25–30% of your primer may be non-biotinylated.Reverse phase HPLC or FPLC is necessary to recoverthe biotinylated primers in pure form.

4.3.C. Biotinylation of Larger DNA FragmentsI. End-labelling using PCR with a biotinylated primer

(5, 6).II. Enzymatic incorporation of a biotin dUTP label. A

biotin dUTP label can be incorporated enzymaticallyinto a double-stranded DNA fragment throughend-labelling by use of Klenow DNA polymeraseenzyme, nick translation or mixed primer labelling(7, 8).

III.Photobiotinylation. The photoactivated form of bio-tin can be incorporated randomly in the DNA frag-ment with UV-light (4).

4.3.D. Biotinylation Using Cleavable ReagentsI. Enzymatic incorporation of a biotin dUTP analogue

with a cleavable linker. Incorporation of a biotin witha linker arm containing a disulphide bond allowsfor a simple dissociation of the DNA fragment, asthe disulphide links easily become cleaved with dit-hiothreitol (DTT). This reagent is enzymatically in-corporated into a DNA fragment either by end-labelling, nick translation or mixed primer labelling.

II. Chemical incorporation of the guanido analogue ofNHS biotin. Incorporation of iminobiotin allows forthe dissociation of the bound nucleic acid fragmentwith a simple pH change. The streptavidin/imino-biotin complex is dissociated at pH 4.0. At pH 9.5or greater, iminobiotin will bind tightly to Dyna-beads M-280 Streptavidin. The released iminobio-tin can be re-immobilized onto the beads.

4.3.E. Other Nucleic Acid Biotinylation AlternativesAmino-modified nucleic acid fragments can be chemi-cally biotinylated using a biotin-X-NHS Ester (8,9).The Photobiotin® Labelling system makes it possibleto introduce biotin into already synthesised oligos (4).The biotin is randomly incorporated in the oligo-nucleotide.In most cases, the same biotinylation procedure willwork for both DNA and RNA. Already synthesised RNAfragments can be photobiotinylated. As with DNA, thephotoactivated forms of biotin randomly incorporateinto the RNA fragment with UV-light.

4.3.F. Biotinylation of ProteinsProteins can be chemically biotinylated using a biotin-X-NHS Ester (12).NHS-biotin containing a cleavable disulphide bond al-lows for the easy cleavage of the desired protein fromthe biotin/streptavidin complex (13).Example of antibody (Ab) biotinylation:1. Calculate the number of purified Ab molecules per

volume unit.2. Dissolve 10 x molar excess of the biotinylation rea-

gent Biotin-X-NHS Ester (MW = 454.5) in 10 µlDMSO and add this solution to the Ab solution.

3. Add the required amount of a 1.0 M NaHCO3 stock

solution, pH 8.0 to obtain a final concentration of0.1 M. Check pH and adjust to 8.0 if necessary.

4. Incubate overnight at 4°C.5. Filter on a gel, e.g. Biogel® P-30 in PBS with 0.1 M

NaN3 (final conc.)6. Calculate the final concentration of Ab and store at

4°C. A final concentration of 0.1% BSA or similarshould be added.

4.4. References:1. Argaraña CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor

CR. Molecular cloning and nucleotide sequence ofthe streptavidin gene Nucleic Acids Res. 1986;14(4): 1871-82.

2. Pähler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA,Aragaña CE, Cantor CR. characterization and crys-tallization of core streptavidin J Biol Chem 1987:262(29):13933-7.

3. Arnold C, Hodgson IJ. Vectorette PCR: A novelapproach to genomic walking. PCR methods andapplications. 1991;1(1):39-42.

4. Nelson WM, Wojnar WA. The use of photobiotiny-lated PCR primers for magnetic bead-based solidphase sequencing. Human Genome III October21-23, 1991 San Diego, CA. Poster no. T41.

5. Hultman T. Ståhl S. Hornes E, Uhlen M. Direct solidphase sequencing of genomic and plasmid DNAusing magnetic beads as solid support. NucleicAcids Res. 1989;17:4937-46.

6. Hultman T, Bergh S, Moks T, Uhlen M. Bi-directionalsolid phase sequencing of in vitro amplifiedplasmid DNA. BioTechniques 1991; 10(1):84-93.

7. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular clo-ning; A Laboratory Manual. 2nd Edition 1989; ColdSpring Harbor Laboratory Press, NY.

8. Wahlberg J, Hultman T, Uhlén M. Solid phasesequencing of PCR products. In: McPherson MJ,ed. PCR II - A Practical Approach. Oxford: IRLPress, Oxford University Press, 1994.

9. Gibbs RA, Nguyen PN, Edwards A, Civitello AB,Caskey CT. Multiplex DNA deletion detection andexon sequencing of the hypoxanthine phosphori-bosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families.Genomics 1990;7:235-244.

10. Ozyhar A, Gries M, Kiltz H-H, Pongs O. MagneticDNA affinity purification of ecdysteroid receptor. JSteroid Biochem Mol Biol 1992;43(7):629-634.

11. Hultman T, Murby M, Stahl S, Hornes E, Uhlén M.Solid phase in vitro mutagenesis using plasmidDNA template. Nucleic Acids Res 1990;18(17):5107-5112.

12. Coffer A, Smith JS, Rozengurt E. Bombesin recep-tor from Swiss 3T3 cells. Affinity chromatographyand reconstitution into phospholipid vesicles. FEBS1990;275(1):159-164.

13. Ahmed ARH, Olivier GWJ, Adams G, Erskine ME,Kinsman RG, Branch SK, Moss SH, Notarianni LJ,Pouton CW. Isolation and partial purification of amelanocyte-stimulating hormone receptor fromB16 murine melanoma cells. A novel approachusing a cleavable biotinylated photoactivatedligand and streptavidin-coated magnetic beads.Biochem J 1992;286(2):377-382.

14. Sandaltzopoulos R, Blank T, Becker PE. Tran-scriptional repression by nucleosomes but not H1in reconstituted preblastoderm Drosophila chroma-tin. EMBO J 1994;13(2):373-379.

4.5. Additional material needed• Magnetic device (Dynal MPC™, Magnetic Particle

Concentrator) for manual or automated protocols.• Mixing/rotation device (e.g. a roller or Dynal®

Sample Mixer) • Test tubes and pipettes• Buffers/solutions (see section 4.6)• Biotinylated ligand/probe

4.6. Recommended buffers/solutionsAll reagents used should be analytical grade.B&W Buffer:A suggested 2 x concentrated Binding & WashingBuffer is as follows:

10 mM Tris-HCl (pH 7.5)1 mM EDTA2.0 M NaCl

Solution A:DEPC-treated 0.1 M NaOH, DEPC-treated 0.05 M NaClSolution B:DEPC-treated 0.1 M NaCl

5. GENERAL INFORMATIONInvitrogen Dynal AS complies with the QualitySystem Standards ISO 9001:2000 and ISO13485:2003.

5.1. Storage and StabilityIf stored unopened at 2–8°C, the Dynabeads arestable until the expiration date stated on the label. The vial should be stored upright to keep beads inliquid suspension, as drying of the beads will result inreduced performance. Do not freeze the product.Thoroughly resuspend the Dynabeads in the vial priorto use.Dynabeads M-280 Streptavidin are not supplied inRNase free solution.Precautions should be taken to prevent bacterial con-tamination of the beads. The Dynal MPC’s should not be kept in close contactwith magnetic tapes, computer discs or other magne-tic storage systems, as these can be damaged by thestrong magnetic field.

5.2. Other Streptavidin-Coupled DynabeadsCat. no. Product Description653.05/06/07 Dynabeads® M-270 Streptavidin

Based on hydrophilic 2.8 µm beads withnegative charge.

601.01 Dynabeads® kilobaseBINDER™ Kitfor immobilisation of long biotinylatedDNA fragments.

650.01/02/03 Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1Based on hydrophilic 1 µm beads withnegative charge

656.01/02/03 Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1Based on hydrophobic 1 µm beads.

5.3. Warnings & LimitationsThis product is for research use only. Not intendedfor any animal or human therapeutic or diagnosticuse unless otherwise stated.This product contains 0.02% sodium azide (NaN3) asa preservative. Sodium azide is toxic if ingested. Avoidpipetting by mouth. Sodium azide may react with leadand copper plumbing to form highly explosive metalazides. When disposing through plumbing drains, flushwith large volumes of water to prevent azide build-up.

5.4. Trademarks & PatentsDynal®, Dynabeads®, Dynal MPC™, MyOne™ andkilobaseBINDER™ are either registered trademarks ortrademarks of Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway.Any registration or trademark symbols used hereindenote the registration status of trademarks in theUnited States. Trademarks may or may not be regis-tered in other countries.Photobiotin® is a registered trademark of BresatechLtd., Australia.BioGel® is a registered trademark of BioRadLaboratories Inc., CA, USA.Sephadex® is a registered trademark and FPLC™ andNAP™ are trademarks of GE Healthcare Bio-SciencesAB, SwedenAminolink® is a registered trademark of Pierce Bio-technology, IL, USA.

5.5. Intellectual Property DisclaimerInvitrogen Dynal will not be responsible for violati-ons or patent infringements that may occur with theuse of our products.

5.6. Limited Use Label LicenseNo. 5: Invitrogen Technology – The purchase of thisproduct conveys to the buyer the non-transferableright to use the purchased amount of the productand components of the product in research conduc-ted by the buyer (whether the buyer is an academicor for-profit entity). The buyer cannot sell or other-wise transfer (a) this product (b) its components or(c) materials made using this product or its compo-nents to a third party or otherwise use this productor its components or materials made using this pro-duct or its components for Commercial Purposes.The buyer may transfer information or materialsmade through the use of this product to a scientificcollaborator, provided that such transfer is not forany Commercial Purpose, and that such collaborator

agrees in writing (a) not to transfer such materialsto any third party, and (b) to use such transferredmaterials and/or information solely for research andnot for Commercial Purposes. Commercial Purposesmeans any activity by a party for consideration andmay include, but is not limited to: (1) use of the pro-duct or its components in manufacturing; (2) use ofthe product or its components to provide a service,information, or data; (3) use of the product or itscomponents for therapeutic, diagnostic or prophy-lactic purposes; or (4) resale of the product or itscomponents, whether or not such product or itscomponents are resold for use in research.Invitrogen Corporation will not assert a claimagainst the buyer of infringement of patents ownedor controlled by Invitrogen Corporation which coverthis product based upon the manufacture, use orsale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine orprophylactic product developed in research by thebuyer in which this product or its components wasemployed, provided that neither this product norany of its components was used in the manufactureof such product. If the purchaser is not willing to ac-cept the limitations of this limited use statement,Invitrogen is willing to accept return of the productwith a full refund. For information on purchasing a li-cense to this product for purposes other than re-search, contactLicensing Department, Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad,California 92008. Phone (760) 603-7200. Fax (760) 602-6500. Email: outlicensing@invitrogen.comNo. 301: Solid-phase sequencing – The use of mag-netic beads as solid phase for solid-phase sequen-cing is covered by U.S. Patent Nos. 5,405,746 and5,534,424 and foreign equivalents thereoff, exclusi-vely licensed to Invitrogen Dynal AS from CEMUBioteknik AB, a subsidiary of Biotage AB, Sweden.No. 302: Solid-phase sequencing – The use of mag-netic beads as solid phase for solid-phase sequen-cing is covered by European patent No. EP 0371437exclusively licensed to Invitrogen Dynal AS fromSangtec Molecular Diagnostics AB, Sweden.

5.7. WarrantyThe products are warranted to the original purchaseronly to conform to the quantity and contents statedon the vial and outer labels for the duration of thestated shelf life. Invitrogen Dynal's obligation andthe purchaser's exclusive remedy under this warran-ty is limited either to replacement, at InvitrogenDynal's expense, of any products which shall be de-fective in manufacture, and which shall be returned toInvitrogen Dynal, transportation prepaid, or at Invit-rogen Dynal's option, refund of the purchase price.Claims for merchandise damaged in transit must besubmitted to the carrier.This warranty shall not apply to any products whichshall have been altered outside Invitrogen Dynal,nor shall it apply to any products which have beensubjected to misuse or mishandling. ALL OTHERWARRANTIES, EXPRESSED, IMPLIED OR STATUTO-RY, ARE HEREBY SPECIFICALLY EXCLUDED, INCLU-DING BUT NOT LIMITED TO WARRANTIES OF MER-CHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULARPURPOSE. Invitrogen Dynal's maximum liability is li-mited in all events to the price of the products soldby Invitrogen Dynal. IN NO EVENT SHALL INVITRO-GEN DYNAL BE LIABLE FOR ANY SPECIAL, INCI-DENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES. Some sta-tes do not allow limits on warranties, or on remediesfor breach in certain transactions. In such states,the limits set forth above may not apply.

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