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Primera edicin, 1981Primera reimpresin, 1987 EDITORIAL ALHAMBRA MEXICANA. S.A. de C.V.

Amores 202703100 Mxico, D.F.

CNIEM 1031

Reservados todos los derechos. Ni la totalidad, ni parte deesta publicacin pueden reproducirse, registrarse otransmirtirse, por un sistema de recuperacin deinformacin, en ninguna forma ni por ningn medio, seaelectrnico.,mecnico, fotoqumico, magntico oelectroptico. por fotocopia, grabacin o cualquier otro, sinpermiso previo por escrito del editor

ISBN 968 444 017 0

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Representantes:

33006 Oviedo. Librera Lord BookBaldomero Fernndez. 707010 Palma de Mallorca. D. Francisco MolinaFrancisco Suau, 14

Composicin tipogrfica y formacin: Redacta. S.A.Cubierta:

DiseftoiFlora AsnsoloDibujo: Laura Almeida

impreso en Mxico

Printed in Mexico

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Prefacio

La creciente demanda de alimentos, medicinas y otros bienes de consumo hadado origen a nuevas reas de investigacin y docencia, que por su carctermultidisciplinario plantean la necesidad de nuevos enfoques y criterios y, porconsiguiente, la preparacin de textos y material basados en la sntesis de diversas disciplinas. De manera especial, la produccin de alimentos y la utilizacinde los recursos naturales renovables han adquirido gran importancia tanto enel campo de la ciencia como econmica y socialmente, ya que los logros yavances en estas reas tienen un efecto directo y en ocasiones inmediato en losdiferentes grupos de la poblacin.

Desde un punto de vista tecnolgico, para un pas con las condiciones socioeconmicas de Mxico (abundancia de mano de obra y recursos limitados decapital), el problema de produccin de alimentos y de utilizacin de recursosnaturales renovables puede ser atacado empleando tcnicas y mtodos micro-biolgicos. Sin embargo, para realizar lo anterior es necesario preparar al grupocientfico y tcnico que los pueda desarrollar, y en esa preparacin la ingenierabioqumica es un elemento importante que debe difundirse ms y ms en losmbitos acadmico y cientfico.

El presente estudio est basado en las conferencias y notas del curso "Biotecnologa industrial", que se imparti en agosto de 1974 en el Instituto deInvestigaciones Biomdicas (IIB), de la Universidad Nacional Autnoma deMxico, y constituye un panorama general del campo de actividades y de lasaplicaciones de la ingeniera bioqumica, tambin denominada biotecnologa.Por ser sta una disciplina de reciente formacin, producto de la fusin dela bioqumica, la gentica, la ingeniera qumica y la microbiologa aplicadas ala produccin y utilizacin de los microorganismos y de sus productos, no pretende abarcar todos y cada uno de los aspectos importantes de su estudio.

En el mencionado curso se cubrieron los aspectos bsicos de gentica, inge-

mG0374

1niera y microbiologa, haciendo especial hincapi en su aplicacin a la fermentacin industrial. En los captulos que siguen se analizan en particular los elementos que deben intervenir, cualitativa y cuantitativamente, para que los resultados de las fermentaciones sean ptimos y se sealan los problemas prcticos ytericos que hoy en da requieren de investigacin y desarrollo tecnolgico. Auncuando el enfoque es general, se pone nfasis en lo referente a la ingeniera, porlo que, en los casos adecuados, se desarrollan las correlaciones empricas o losmodelos matemticos que describen los sistemas biolgicos y los fenmenosasociados. Se cubren, adems, aspectos tericos, prcticos y econmicos sobreformulacin de medios de cultivo, esterilizacin, diseo de reactores, escalamiento de fermentaciones, procesos de separacin, etc. De manera particular, serevisan los procesos de produccin de protena microbiana y la tecnologaenzimtica.

El material y el mtodo de interpretacin presentados sern de utilidad paraaquellos que estn directamente involucrados en la investigacin bioqumicay microbiolgica, y para quienes realizan la explotacin comercial de los procesos de fermentacin. El conocimiento adecuado de las caractersticas y posibilidades de los sistemas biolgicos que nos brinda la ingeniera bioqumica,ayudar a resolver de una manera ms racional y menos violenta los problemasprimarios que aquejan a nuestra sociedad.

La realizacin de este estudio fue posible gracias a la cooperacin de variaspersonas e instituciones. Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologala ayuda econmica que proporcion, tanto para el desarrollo del curso, comopara la realizacin de mis estudios de posgrado en el rea de fermentacin, yal 1IB por su amplia colaboracin para que el curso se llevara a cabo, y porsu decidido apoyo para integrar un grupo de investigacin en biotecnologa.Especial mencin merece la Organizacin de los Estados Americanos, a travs decuyo Departamento de Asuntos Cientficos se obtuvo el financiamiento para laelaboracin de este trabajo. Gracias al M. en C. Luis Cabello, de la Universidadde Manchester, quien cooper desinteresadamente en el desarrollo de los programas de computadoras utilizados, y cuyas atinadas sugerencias fueron de granvalor. Finalmente, mi agradecimiento a la Ing. Bioqum. Hermelinda Carbajal,por su extraordinaria labor en la revisin tcnica de la obra, durante todo elproceso de edicin.

R.Q.R.

Indice generalBIBLIOTECA

Prefacio 7

1 Introduccin 15Desarrollo histrico 15Proceso de la fermentacin 17Microorganismos en la fermentacin 19Productos de la fermentacin 21Literatura sobre fermentacin 22Referencias 26

2 Crecimiento microbiano 27Medio de cultivo 27Metabolismo microbiano 28Fases del crecimiento 29Ecuacin de Monod 30Concentracin celular 31Nomenclatura 37Referencias 37

3 Cintica de fermentaciones 39Cintica de diversos tipos de fermentaciones 39Modelos cinticos de crecimiento celular 43Modelos para formacin de producto 50Nomenclatura 3Referencias 54

4 Cultivo continuo 57Clasificacin de los sistemas de cultivo continuo 58

m

10 Indice general

Prerrequisitos de operacin y tcnicas 59Teora del quimiostato 60

Velocidad especfica de crecimiento 61Productividad 64Comparacin de productividades entre los sistemas

batch y continuo 65Limitaciones de la teora del quimiostato 67Variacin del rendimiento y energa de mantenimiento 68Efecto de la temperatura en cultivo continuo 72Diferentes expresiones para /x 72Limitacin por oxgeno 72Usos del cultivo continuo 74Quimiostatos en serie 75

Nomenclatura 77Referencias 78

5 Transferencia de oxgeno y diseo de fermentadores 81Teoras de la transferencia de masa 84

Correlaciones para estimar kLa 85Diseo de fermentadores 87

Mezclado y patrones de flujo 87Tipo de reactor 88Configuracin geomtrica 89Transferencia de calor en un fermentador 90Transferencia de oxgeno y consumo de energa 91

Nuevos diseos 93Nomenclatura 95Referencias 95

6 Escalamiento de fermentaciones 97Control ambiental 98Criterios de escalamiento 99

Desarrollo histrico 103Uso del kLa como criterio de escalamiento 105Otros problemas de escalamiento 106Mtodo de traslacin de operacin a la misma escala 106

Ejemplos detallados de escalamiento 109A. Escalamiento de un tanque agitado 110B. Escalamiento de la fermentacin de cido

glutmico 111C. Escalamiento de biomasa producida a partir de

H-parafinas 111Nomenclatura 113Referencias 113

7 Mtodos de esterilizacin del medio de cultivo y del aire 115Esterilizacin del medio 115Mortalidad trmica de los microorganismos 116

Ley logartmica de mortalidad 116Expresiones para la tasa de esterilizacin 117

Indicegeneral 11

Efecto de la temperatura en la constante de velocidadde esterilizacin, k 118

Diseo de esterilizadores batch o de lote 120! Diseo de esterilizadores continuos 121

Efecto combinado de calor y lcali 122Limpieza y esterilizacin del aire 123

Tipos de filtros 125Mecanismos de filtracin 125Mtodos de diseo 128

Nomenclatura 130Referencias 131

8 Procesos de separacin y purificacin 133Separacin mecnica de las clulas e insolubles del caldo

de fermentacin 134Ruptura de las clulas 135Extraccin . 136Procedimientos de fraccionamiento preliminar 136Etapas de alta resolucin 137

Utilizacin de membranas 137Intercambio inico 138Cromatografa 139

Secuencia de operaciones 139Teora y diseo de los principales procesos de separacin

y purificacin 139Centrifugacin 139Filtracin 142Precipitacin con sulfato de amonio 145Ultrafiltracin 147Cromatografa de filtracin por gel 147

Interaccin de los procesos de fermentacin y deseparacin 148

Nomenclatura 149Referencias 150

9 Protena unicelular 153Aspectos generales 153Microorganismos utilizados 156

Contenido proteico de las clulas 156Perfil de aminocidos (aminograma) 157Velocidad de crecimiento para un sustrato

determinado 157Toxicidad 157Valor calorfico 157Eficiencia de conversin del sustrato 157Digestibilidad 158Seguridad del producto 158

Sustratos empleados 159Precio 160

12 Indico genero!

Disponibilidad y abundancia 160Toxicidad 160Eficiencia de conversin 161Pretratamiento del sustrato 161

Condiciones de fermentacin.....; 161Temperatura 162pH 162Productividad 163

Procesos de produccin de protena unicelular 163Anlisis econmico 167

Desarrollo futuro 171Nomenclatura 172Referencias 173

11

10 Produccin de protena microbiana a partir de la caa de azcar ysus subproductos 175

Azcar 176Mieles 176Bagazo 179

Hidrlisis cida 181Hidrlisis enzimtica 186Fermentacin directa 190Anlisis econmico 190

Nomenclatura 192Referencias 192

11 Tecnologa enzimtica 195Enzimas inmovilizadas 195

Mtodos de inmovilizacin 196Nomenclatura 218Referencias 220

Apndices

A Balance de materia y energa en fermentacin 223Rendimiento del sustrato (Ys) 223

Fuente de carbono 224Fuente de nitrgeno 224Fuente de otros nutrientes 225

Rendimiento de oxgeno (Y0) 227Rendimiento calorfico (Ykcaj) 227

Mtodo A 227Mtodo B 228

Nomenclatura 230Referencias 231

B Cintica enzimtica 233Introduccin

.* 233Efecto del tiempo en la actividad enzimtica 233

J.

IndicegeneroI'J

Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica yen la actividad inicial 234

Efecto de la temperatura en la estabilidad de las enzimas 234Efecto del pH en la actividad enzimtica 234Efecto de la concentracin del sustrato en la actividad

enzimtica 236Modelo sin inhibicin 236Inhibicin 240

Otros factores que afectan la actividad enzimtica 246Nomenclatura 246Referencias 246

C Tratamiento de aguas por mtodos biolgicos 247Parmetros de medicin 248Tratamiento preliminar 250Tratamiento primario 250Tratamiento secundario 250

Lagunas de oxidacin 251Filtros biolgicos 251Lodos activados 252

Tratamiento terciario 252Caractersticas generales de la oxidacin biolgica . 252

Modelos matemticos y sistema de diseo 253Otros usos de los lodos activados ....261Tanques y equipo utilizados en lodos activados 263Avances tecnolgicos en el tratamiento secundario 264

Nomenclatura 266Referencias 267

D Consumo de energa por agitacin y aeracin en sistemasde fermentacin 269

Consideraciones tericas 270Potencia absorbida en fluidos sin aeracin 272Potencia absorbida en fluidos con aeracin 274Potencia necesaria para agitar lquidos no newtonianos 276Energa transmitida de la fase gaseosa al lquido . , 277Nomenclatura 279Referencias 279

E Determinacin experimental de la transferencia de oxgeno en unafermentacin 281

Medicin indirecta 282Oxidacin de sulfito 283Tcnica de eliminacin de gas 283

Medicin directa 284Balance de oxgeno en el sistema 284Tcnica dinmica (rgimen no estacionario) 286

Tiempo de respuesta 288NomenclaturaReferencias 292

14 Indicegeneral

F Mtodos de inmovilizacin enzimtica 293Va grupo dia/.onio de grupos amino aromticos 294Va grupo isotiocianato por tratamiento de grupos con tiofosgeno 295Va grupo acil-azida por tratamiento de hidrazina con cido nitroso 296Va grupo imido carbonato por reaccin con bromuro de ciangeno

con grupos hidroxilo 297Va grupo cloruro activo 297Va grupo cido carboxlico activado con N,N,diciclo

hexilcarbodimida......298Va grupo cido carboxlico activado con el reactivo K de

Woodward ....... 299Va copolmero de etileno y anhdrido maleico 299Activacin de soportes por la reaccin de Ugi 300Activacin de soportes por sales de metales de transicin 300Va grupo carbonatos cclicos introducidos por la reaccin de

cloroformato de etilo con grupos hidroxilo 301Va floruro de arilo.......\

-

301Va grupo bromuro de alquil >, 302Va grupo cido carboxlico activado con sulfonato de 1-ciclo-

hexil 3-(2-morfolinoetil)-carboimida meto-p-tolueno 302Referencias 302

G Problemas 305Introduccin 305Crecimiento microbiano 305Cintica de fermentaciones 306Cultivo continuo 307Transferencia de masa 309Escalamiento de fermentaciones 310Mtodos de esterilizacin del medio de cultivo y del aire 311Procesos de separacin y purificacin 313Protena unicelular. Aspectos generales 314Protena microbiana a partir de la caa de azcar y sus

subproductos 315Tecnologa enzimtica 317Balance de materia y energa en fermentacin 318Cintica enzimtica 319Tratamiento de aguas por mtodos biolgicos . . 320Consumo de energa por agitacin y aeracin en sistemas de

fermentacin 323Determinacin experimental de la transferencia de oxgeno en

una fermentacin 324Mtodos de inmovilizacin enzimtica 326

Indice analtico 327

iIntroduccin

El cultivo de microorganismos, tanto en el laboratorio como en la industria,ha sido tratado ms como un arte que como una ciencia, y a menudoempleando la intuicin en lugar de la lgica. Este estudio tiene como finfundamental presentar los principios de operacin y control de la fermentacin, con objeto de que investigadores y estudiantes del campo tengan unmarco comn, necesario para unificar y facilitar el avance cientfico ytecnolgico del cultivo microbiano y de sus aplicaciones.

La ingeniera bioqumica ha surgido como resultado de la interaccin de labioqumica, la gentica, la microbiologa y la ingeniera qumica, y es a ella aquien concierne el estudio y la utilizacin de los microorganismos y susproductos. A Aiba et al. 1 se debe una definicin aceptada de esta disciplina:"Ingeniera bioqumica es la actividad que se ocupa del procesamientoeconmico de materiales de carcter u origen biolgico con propsitos tiles.La funcin del ingeniero bioqumico es aplicar en la prctica los conocimientos del microbilogo y del bioqumico. Para llevar a cabo esta tarea, elingeniero bioqumico debe no solamente tener bases slidas en los principiosbsicos de ingeniera, sino conocer las ciencias biolgicas." Sin embargo, estadefinicin o cualquier otra de las que se han dado, indica nicamente elcontexto general de la ingeniera bioqumica, porque slo a travs de suestudio se logra conocer sus alcances e importancia. A continuacin sepresentan algunos aspectos generales de la fermentacin, que consideramosnecesario mencionar.

DESARROLLO HISTORICODesde hace miles de aos el hombre ha utilizado los mtodos biolgicos paraproducir y conservar sus alimentos y tambin para obtener productos que lehan ayudado a mejorar su salud (por ejemplo, antibiticos y vitaminas) o le

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E. S. Q. BlBUOTJC|

1151

16 Introduccin

lian procurado algn gusto (entre otros, saborizantes y bebidas alcohlicas).Se recomienda revisar los tratados generales de microbiologa y fermentacin1-5 a todos aquellos que estn interesados en ese desarrollo histrico.

Los principios de la microbiologa industrial fueron establecidos cuandoPasteur, a mediados del siglo pasado, demostr indiscutiblemente que lafermentacin alcohlica era producida por levaduras. Desde ese momentohasta la segunda guerra mundial se desarrollaron muchos procesos industrialesde fermentacin, fundamentalmente las diferentes fermentaciones alcohlicas yla produccin de cidos actico, lctico y ctrico, as como la de glicerol,acetona y butanol. Los procesos tpicos utilizados durante ese perodo fueron:el cultivo sumergido anaerbico y el cultivo en superficie aerbico. Sinembargo, debido a la necesidad apremiante de producir antibiticos durante laguerra,6 hubo que utilizar un proceso industrial ms rpido y eficiente que loscomnmente utilizados; ste fue el cultivo sumergido aerbico en tanquesagitados. No cabe duda de que lo anterior produjo el estmulo necesario paraque surgiera la ingeniera bioqumica, pues se hizo evidente la necesidad y lasposibilidades de aplicar los principios tecnolgicos de ingeniera a la fermentacin, y de combinarlos con el conocimiento biolgico.

Entr los decenios cuarenta y cincuenta se lograron grandes avancestecnolgicos en el cultivo microbiano, y se desarroll el fermentador agitadocon controles automticos para preservar las condiciones adecuadas de lafermentacin. La mayora de los procesos utilizados en esa poca sonaerbicos y operan de manera discontinua (en forma de lote, o procesobatch).

El ltimo decenio ha visto el desarrollo y establecimiento de los procesosaerbicos continuos. Dos han sido las reas que en estos aos han tenidoavances importantes: la produccin de protena microbiana* y la tecnologaenzimtica. La primera surgi como respuesta a la gran demanda y necesidadde producir alimentos baratos y a gran escala, y al encontrarse que lascaractersticas microbianas (corto tiempo de duplicacin, alto contenidoproteico y no dependencia de las- condiciones climatolgicas), presentangrandes ventajas respecto a otras fuentes de protena.

La tecnologa enzimtica ha recibido un gran impulso debido a que susposibilidades de aplicacin en el rea mdica y de alimentos son muyprometedoras. En ambas reas se han registrado importantes avances debido algran nmero de investigadores que han dedicado su esfuerzo a resolver losproblemas interdisciplinarios surgidos durante su desarrollo, haciendo de ellascampos interesantes e intelectualmente atractivas.

Pero la ingeniera bioqumica no slo ha avanzado y tenido xito enprocesos industriales, sino que ha contribuido al mejor entendimiento delmetabolismo microbiano al utilizar la tcnica de cultivo continuo que sometea un microorganismo a diferentes condiciones ambientales constantes porlargos periodos y estudia los cambios que a nivel celular ocurren cuando elmedio ambiente vara. Los aspectos cinticos han adquirido importancia y, en

* Se denomina indistintamente protena microbiana, protena unicelular o biomasa alproducto que se obtiene del crecimiento de microorganismos (y que son ellos mismos).Pueden ser bacterias, levaduras u hongos que utilizan para crecer diversos sustratos en uncultivo aerbico, con fines de alimentacin.

Proceso de la fermentacin 17

particular la cintica enzimtica, que considera los efectos de difusin y dediseo de reactores, ha permitido un conocimiento ms extenso y profundodel problema general de la catlisis. Estos son slo dos ejemplos de los logroscientficos alcanzados; la mejor muestra de la importancia presente y futuraque tiene la fermentacin es la proliferacin de la literatura relacionada y elestablecimiento de grupos de investigacin cientfica e industrial dedicados atrabajar en el rea. Es muy difcil indicar qu reas se seguirn desarrollandoo surgirn en los prximos aos, pero entre las que parecen ms probables estn:la aplicacin de la tcnica de cultivo continuo a diferentes tipos de fermentaciones, el diseo de mejores procesos de separacin y purificacin (utilizacinde la protena unicelular por humanos), la fermentacin anaerbica (principalmente produccin de metano), el desarrollo del cultivo de tejido celular animal yvegetal (hormonas) a nivel industrial, la aplicacin en la prctica de la ingenieragentica, la utilizacin de desperdicios agrcolas e industriales como sustratos defermentacin, y la disminucin y control de la contaminacin ambiental.

PROCESO DE LA FERMENTACION mLas industrias de procesos bioqumicos se encargan del aprovechamiento, bajocondiciones controladas, de materiales biolgicos tales como microorganismos,tejido celular animal, productos microbianos y enzimas. Los procesos asociados con la produccin de microorganismos y de algunos productos especficosson importantes comercialmente.

Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen ysegregan algunos compuestos bioqumicos de importancia para el hombre.Estas son las caractersticas en que se ha basado la utilizacin de losmicroorganismos como productores de fermentacin, la que de una maneraesquemtica se puede representar as:

MICROORGANISMOSrbacterias

levaduras,hongos,tejido celular,

L-etc.

ELEMENTOS NUTRIENTESC, H,O, N, S, P,metales,vitaminas,etc.

CONDICIONESAMBIENTALESADECUADAS

pH, temperatura,viscosidad,oxgeno disuelto,etc.

Fermentacin* Microorganismos + CO, * + Productos (intra y extracelulares)

* Cuando se provee de oxgeno molecular al sistema, la fermentacin se denominaaerbica y hay desprendimiento de C03 ;cuando el oxgeno molecular est ausente, se denomina anaerbica.

Es decir, que para que una fermentacin se realice son necesarios lossiguientes requisitos: tener un microorganismo de caractersticas idneas parael proceso y/o producto particular, proveer un medio de cultivo adecuado(que contenga todos los nutrientes esenciales en las proporciones y cantidadesptimas de produccin) y, finalmente, establecer y controlar las condiciones

18 Introduccin

fisicoqumicas necesarias para el desarrollo de la fermentacin. Como resultadose obtendr una cantidad de microorganismos mayor que la inicial y diversosproductos (antibiticos, esteroides, enzimas, cidos orgnicos, etc.). Todasestas variables son las que interaccionan y deben optimizarse para lograr unproceso adecuado. En el caso de la protena microbiana, por ejemplo, lo quese pretende es obtener la cantidad mxima de clulas y minimizar laproduccin de C02 o de cualquier otro producto extracelular; en la produccin de antibiticos, por el contrario, se trata de obtener el mximo deproductos especficos extracelulares.

No debe olvidarse, sin embargo, que un proceso de fermentacin comprende, en un sentido ms amplio, no slo las reacciones bioqumicas efectuadaspor microorganismos y/o por enzimas sino que adems considera las caractersticas fsicas y de operacin del recipiente en donde se lleva a cabo -elfermentador y las operaciones que se efectan antes y despus de lafermentacin. La figura 1.1 presenta el diagrama de flujo de una fermentacintpica. Se pueden distinguir tres reas principales: laboratorio, fermentacin yextraccin. Cada una de estas reas ser explicada detalladamente en lossiguientes captulos, pero debe hacerse hincapi en que todas ellas funcionan

1 ~ 2 3laboratorio C +~

(300-3 000 gal)

Planta de fermentacin.Planta de extraccin-

'

(10,000-50,000 gal)

A Entrada de aire estril 1B Salida de aire 2C Entrada agua de enfriamiento 3D Salida de agua 4E Adicin de cido, lcali y 5

antiespumante 6F Biomasa (micelio) 7G Destilacin 8H Solvente 9I Solucin 10

-(a)-[j]

Cepa productora congeladaCrecimiento slantMatraz agitado de cultivoFermentador de semillaFermentador principalFiltro rotatorio (vaco)Centrfuga de extraccinCristalizadorSecadorEmpaque de producto

Figura 1.1. Diagrama de flujo de un proceso tpico de fermentacin.

Microorganismos on lo formtntmUn 19

como un todo y aunque para su estudio se dividan, al evaluarse unafermentacin siempre deber tenerse en mente la totalidad del proceso.

Los captulos de este estudio han sido preparados de acuerdo con lasnecesidades y los problemas que se presentan en el desarrollo de unafermentacin a escala de laboratorio e industrial. El captulo dos se refiere a lapreparacin del medio de cultivo y a las condiciones fisicoqumicas necesariaspara obtener un producto deseado con un rendimiento elevado. Los captulostres y cuatro analizan la cintica de la fermentacin y de sus productos en susformas de operacin ms comunes: batch y continua. Los captulos cinco yseis presentan el problema de diseo de fermentadores, de transferencia demasa y cmo se emplean los resultados de laboratorio cuando se pasa a escalaindustrial. El captulo siete trata del problema de la esterilidad del medio decultivo y del aire, la cintica de sta y sus efectos en la fermentacin. En elcaptulo ocho se estudia la separacin y extraccin de productos y se indicanlos diferentes mtodos empleados y cul es el criterio de seleccin. En loscaptulos nueve y diez se analiza el problema de la protena unicelular y susdiversas soluciones posibles: bacterias, levaduras, hongos, etc., as como losdiferentes sustratos utilizados: n-parafinas, metanol, melazas, celulosa, etc.Finalmente, el captulo once constituye una introduccin a la tecnologaenzimtica en sus diversos aspectos.

Debido al enfoque de este trabajo no se hace especial referencia a tresaspectos importantes de la fermentacin que han sido ampliamente tratados enotras publicaciones:7-11 microorganismos utilizados, productos obtenidos yliteratura especializada en fermentacin

MICROORGANISMOS EN LA FERMENTACIONLos microorganismos utilizados en la fermentacin son generalmente bacterias,levaduras, hongos, algas y tejido celular animal y vegetal. La figura 1.2 indica laclasificacin general y la subdivisin de los protistas; debido a sus caractersticas particulares, los virus no entran en esta clasificacin. Entre los protistassuperiores los hongos tienen una importancia industrial mayor.

Organismos pluricelulares Organismos unicelulares

i i metazoarios metafitas protistas

protistas superiores (eucariotes) protistas inferiores (procariotes)

f 1-i f 1protozoarios hongos algas (eucariotes) cianofceas bacterias

Figura 1.2. Clasificacin general y subdivisin de los protistas.12

20 Introduccin

El nombre y la vuricdud de los hongos {Fungi) hace que su clasificacin seadifcil. La figura 1.3 sita las principales especies que se utilizan en laindustria bioqumica; los hongos imperfectos (Fungi imperfecti) son utilizadosen la transformacin de esteroides y en la produccin de ciertos antibiticos.Debe indicarse que en la gran mayora de las fermentaciones se empleancultivos puros (o sea el uso de una cepa de una especie dada de microorganismos y se evita la contaminacin microbiana proveniente de fuentes externas) yslo en casos muy particulares se usan dos o ms especies (denominado cultivomixto) y en condiciones spticas; tal es el caso del tratamiento de aguas porprocedimientos biolgicos (vase apndice C).

En varios pases existen amplias colecciones de microorganismos, quepueden obtenerse generalmente en forma gratuita y rpida. Se pueden emplearcuando se desea partir de un microorganismo cuyas caractersticas y condiciones son conocidas, para efectuar, por ejemplo, estudios de utilizacin dediversos tipos de sustrato o para hacer experimentos cinticos. La tabla 1.1presenta las principales colecciones microbianas; Hesseltine y Haynes13 dan lalista completa de las colecciones mundiales.

Cabe sealar que en la mayora de los estudios experimentales se empleanmicroorganismos de alguna de las colecciones indicadas, pero no debe olvidarseque en la naturaleza existen miles de especies que an no han sido exploradasni en cultivo puro ni mixto, y es muy probable que, por ser resultado de laseleccin natural, tenga caractersticas genticas superiores a algunas de lasespecies utilizadas o produzcan compuestos bioqumicos de valor e importancia superiores.

Los microorganismos utilizados en procesos industriales se han obtenidogeneralmente, aislndolos del medio ambiente mediante diferentes tcnicas. Latcnica de aislamiento por cultivo de enriquecimiento (se inicia la fermentacin con un cultivo mixto en un medio especial en el cual slo sobreviven losmicroorganismos que se adaptan mejor; con los sobrevivientes se inicia otra

Hongos [Fung)

-

*Hongos verdaderos (eumicctos)

Ficomicetos Ascomicelos Basidiomicetos

\ iMucorales Discomicetos l'irenomicelos Plectomicelos

RhtzapusAbsidtaMucorHlakesleaChoanophoraCunninghumeHaZygorhymhus

SacaromcelalesI

Saccharomyces:hansenulactrtvltiatfragilisaclisCandla milisCandida tmpicalsRliodulonil

TAspergiles

Aspergillus.

ntgerterreusflatusoryzoc

Feniallium,clirysagenunnotationgrfteofiilvum

1Esferales

Cephalosporium

*Fung imperfectiAlternaraliotrytuCladosporiumCurrulariaFusariumCtotriehumNturosporaTrichodermaTrichothtcium

Agaricales Uredinales

Ustilaginales

Figura 1.3. Clasificacin de los hongos (Ffcng).l2

Productos do la fermentacin 21

TABLA l.l

Principales colecciones microbianas14Nombre Direccin Tipo de microorganismos

American Type CultureCollection (ATCC)

RockvilleMaryland 20852

EUA Bacterias, actinomicetos,hongos, algas, protozoarios

Central Bureau voorSchimmelculture (CBS)

Baarn Holanda Hongos y actinomicetos

Commonwealth Mycolo-gical Institute

Kew Inglaterra Hongos

Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)

PeoriaIllinois 61604

EUA Bacterias, actinomicetoshongos

National Collection of Industrial bacteria (NCIB)

Aberdeen Escocia Bacterias

Centre de collection destypes microbiens

Lausana Suiza Bacterias

Culture Collection Universidad deCambridge

Inglaterra Algas y protozoarios

NationalCollectionofTypeCulture (NCTC)

Londres Inglaterra Bacterias, actinomicetosy hongos

Culture Collection of Indiana University

BloomingtonIndiana47405

EUA Algas

fermentacin en el mismo medio y as se contina hasta que se obtiene o uncultivo puro o un cultivo mixto capaz de crecer ptimamente en lascondiciones especificadas) variando temperatura, pH, concentracin de diferentes sustratos, etc., ha rendido resultados satisfactorios en muchos casos.15"17Una vez aislado, el microorganismo es sometido a procedimientos de mejoramiento y seleccin gentica hasta obtenerse una cepa altamente productora,estable y cuyos requerimientos nutricionales son conocidos.18 A travs de losejemplos y de la literatura citada se espera que el lector adquiera una visin decules son los microorganismos que se usan en diferentes reas de lafermentacin.

PRODUCTOS DE LA FERMENTACION

Tratar de enumerar y analizar todos y cada uno de los productos de lafermentacin es una tarea que varios autores han intentado, y a ellos convienerecufrir para un estudio detallado.19"25

La tabla 1.2 indica los principales productos de la fermentacin industrial;la agrupacin presentada se basa en la estructura qumica de los productos y,fundamentalmente, en el uso prctico.

Como se puede apreciar, los .productos de la fermentacin se relacionandirectamente con las reas siguientes:

a) Alimentaria (protena, saborizantes, aminocidos, etc.)

22 Introduccin

TABLA 1.2Principalesproductos obtenidos por fermentacinAcidos orgnicos

A. acticoA. ctricoA. fumricoA. glucnicoA. itacnicoA. lcticoA ntibiticosBacitracinaestreptomicinaNeomicinaPenicilinaTctraciclina

Vitaminas

Acido ascrbicoCianocobalaminal- carotenoRiboflavina

A minocidos

Glutamato de sodioL-lisinaDL-metioninaL-triptoCanoL-valina

Esteroides

CortisonaHidrocortisonaPrednisolonaTestosteronaTriamcinolona

Otros

AlcaloidesEnzimasInsecticidas biolgicosMetano

Nucletidos (saborizantes)Polisacridos

Alcoholes y solventes

AcetonaButanol2,3 ButanodiolEtanolGlicerol

Proteina unicelular

AlgaBacteriaLevaduraHongos

Promotoresdel crecimiento

Recuperacin de minerales(Fe, Cu, Pb, Zn, etc.)

b) Farmacutica (antibiticos, vitaminas, esteroides, etc.)c) Qumica (solventes, cidos orgnicos, enzimas, etc.)d) Contaminacin ambiental (tratamiento de aguas y de residuos slidos,

recuperacin de minerales, etc.)e) Otras en que interaccionan indirectamente: agricultura y ganadera;

promotores del crecimiento e insecticidas biolgicos; energa; produccin demetano; medicina; uso de enzimas inmovilizadas para diagnstico mdico, etc.

Debido a su importancia, en la tabla 1.3 aparecen algunas de las posiblesaplicaciones que puede tener el uso de enzimas en alimentos.

Ciertos avances recientes de la tecnologa de la fermentacin industrial hanhecho posible la preparacin de soluciones enzimticas libres de clulas, y enlas tcnicas de separacin bioqumica se han logrado, mediante avancessimilares, varios grados de pureza, lo que ha permitido que se extienda elempleo de las soluciones enzimticas.

Los principios generales de la formacin de productos sern mencionadosen los captulos dos y tres, pero cuando se trate de un producto especfico seaconseja recurrir a la literatura especializada.

LITERATURA SOBRE FERMENTACIONDebido a la necesidad de acudir a la literatura con objeto de obtener lainl'ornjacin bioqumica, microbiolgica y gentica para llevar a cabo unafermentacin, a continuacin se indican cules son, a juicio del autor, laspublicaciones y tcnicas ms relevantes. Adems se da la lista de libros sobre

Literatura sobre fermentacin 23

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24 Introduccin

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20 Introduccin

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2Crecimiento microbiano

El estudio del crecimiento y desarrollo microbianos comprende varias disciplinas pues, a pesar de ser un fenmeno natural, su descripcin en trminoscualitativos y cuantitativos es compleja.

Para poder tener crecimiento microbiano, desde el punto de vista de lafermentacin, es necesario que se cumplan varios requisitos tanto de tipobiolgico como fisicoqumico. En primer lugar es necesario tener un cultivo encondiciones adecuadas, es decir, clulas en estado vegetativo o esporas susceptibles de reproducirse. Para ello es menester conservar adecuadamente las cepasen el laboratorio y es recomendable que cada 3 o 4 meses las cepasalmacenadas sean transferidas a nuevos medios.

MEDIO DECULTIVO

El microorganismo requiere para su crecimiento de una fuente de energa y defuentes de materia. En la mayora de las fermentaciones industriales la fuentede energa -y la de materia son la misma (i>. gr. azcar), pero es necesario qu

"la fuente de materia contenga todos los elementos constitutivos de la masacelular en las proporciones requeridas por la composicin interna del organismo. En la tabla 2.1 se presentan los compuestos orgnicos de los principaleselementos de la masa celular y su porcentaje en peso seco; las cifras son decarcter general, pero se considera que son representativas de la composicinmicrobiana. La formulacin del medio de cultivo debe considerar todos loselementos de la tabla 2.1, as como otros necesarios para la produccin demetabolitos especiales.2-3 Un problema prctico que se presenta con el usode medios que no estn definidos qumicamente, por ejemplo melazas, es quela composicin vara con el tiempo, el lugar y la forma de almacenamiento.Para la formulacin del medio se deben emplear composiciones similares a las

1271

28 Crecimiento microbiano

TABLA 2.1

Compuestos orgnicos de losprincipales elementos constituyentesde las clulas microbianas1

%delElemento Compuestos orgnicos peso seco

H Compuestos orgnicos y agua 8O Compuestos orgnicos y agua 20C Compuestos orgnicos 50N Protenas, cidos nucleicos y coenzimas 14S Protenas y algunas coenzimas 1

Acidos nucleicos, fosfolpidos y coenzimas 3Mg Cofactor de reacciones enzimticas 0.5Mn Cofactor de algunas enzimas 0.1Ca Cofactor de enzimas (proteasas) 0.5''o Citocromos, protenas y cofactor de enzimas 0.2Co Constituyente de la vitamina B,2 \ZnCu } 0.03Mo Constituyente de ciertas enzimas I

indicadas en la tabla 2.1; aplicando el concepto de rendimiento (vaseapndice A) se puede elaborar un balance estequiomtrico para definir lascantidades necesarias de cada elemento. La tabla 2.2 es un ejemplo de unmedio definido que se utiliza en investigacin en el laboratorio; la literaturasobre este aspecto es muy abundante4'7 y debe ser revisada cuando se quiereiniciar una fermentacin y se tienen dudas de la composicin inicial delmedio. Conviene advertir que las unidades de los rendimientos varan y es fcilcometer errores; en ocasiones se expresan como gramos del sustrato y en otrascomo gramos del elemento.

METABOLISMO MICROBIANOUna vez que se proveen los nutrientes necesarios y el microorganismo, lasclulas empiezan a crecer y/o a producir algunos metabolitos de inters. Latransformacin de nutrientes en clulas y/o productos se denomina metabolismo y en la figura 2.1 se presentan las principales reacciones que ocurrendurante ste. La glucosa tiene el doble papel de generador de energa ymaterial de construccin celular (la bioqumica se encarga del estudio detallado ilc cada una de las reacciones y caminos metablicos). Est fuera de losobjetivos de este trabajo el intentar revisar el metabolismo microbiano; sinembargo, es necesario aclarar que es importante su estudio pues slo as secomprender que se debe enfocar la fermentacin desde un punto de vistaiiiterdiseiplinario. La conversin del sustrato a clulas ha sido motivo demuchas investigaciones**-0 ya que es un factor muy importante puescontrola, adems del rendimiento, la demanda de oxgeno y la produccin decalor, l'or lo general, cuanto ms oxidado est el sustrato menor es elrendimiento; otro problema es que los rendimientos dependen tambin de lasi ondiclories ambientales.8 La figura 2.1 indica la importancia de las reaccionesmetahlicas, sobre todo en lo que se refiere a la produccin de metabolitos

Fses doIcrecimiento 29

Temperatura, pH

Oxgeno-

Glucosa, N. Mg, PO;' .SO' ,vitaminas, otros(transporte activo)

glucosaprecursoresbiosintticosenerga(ATP NADH)

Acet CoA

ciclo deKrebs

energa

precursoresbiosintticos

producto(aminocidos, penicilina, etc.)-1-

Producto extracelular(antibiticos, enzimas, etc.)

protenasenzimascidosnucleicos

(RNA. DNA).polisacridos

-w lpidos

energa

Figura 2.1. Metabolismo microbiano.

especficos; Bolvar y Quintero11 han revisado recientemente los mecanismosde control microbiano tanto para metabolitos primarios como secundarios. Losaspectos energticos son de gran importancia tanto en lo que se refiere a lageneracin como a la utilizacin de la energa,13 pues de acuerdo con ello seclasifica a los microorganismos y porque representan la eficiencia de conversin.

FASES DEL CRECIMIENTO

En un cultivo microbiano todas las partes estn sujetas a las mismas condiciones

TABLA 2.2

Composicin de un medio definido paraproducir Klebsiellaaerogenes hasta 10g/l (peso seco) en cultivo aerbico4

Rendimiento supuesto Masa de componentesComponentes fg de biomasa/g de elemento) (g)Agua destilada - 1 000Glucosa 1.10NH4C1 8.75 4-37KH,P04 39.1 para P 1.1359.5 para KMgSO.7H,O 333 paraS 0.232

430 para MgCaCl,.2H,0 3.33x 10' 0.011FeS04.7H,0 6.7 X 10' 0.007MnS04-4H50 2.0 X 10' 0.002ZnS04.7H,0 2.0 x 104 0.002CuS04.5H30 1.0 X 10' 0.0004CoCl,.6H,b LO X 10 0.0004EDTA 0.394

30 Crecimiento microbiano

de temperatura, pH, concentracin de nutrientes, etc. En la figura 2.2 se indicanlas diferentes fases que ocurren en un cultivo en las condiciones anteriores; estasfases reflejan cambios en la biomasa y en el medio ambiente. Despus de unperiodo lag (vase captulo 3), el crecimiento ocurre a la mxima rapidez yfinalmente cesa, ya sea por carencia de un nutriente o por acumulacin de unproducto inhibitorio o algn cambio en el ambiente fisicoqumico. Despus deque la biomasa alcanza el mximo, aparece generalmente una fase estacionariadurante la cual la biomasa permanece constante; ms adelante sta disminuyecomo consecuencia del metabolismo de mantenimiento o por autolisis.

oV)oEo

Tiempo

I lag IV desaceleracinII aceleracin del crecimiento V estacionarioIII crecimiento exponencial VI declinacin

Figura 2.2. Curva de crecimiento batch con seis fases.

La duracin de la fase exponencial de crecimiento depende parcialmente dela concentracin inicial del sustrato limitante; lo anterior implica que elcultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro decarencia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores que lamxima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar suestructura interna a las nuevas condiciones.

Ecuacin de MonodCuando el crecimiento de un cultivo de lote slo est limitado por la cantidadinicial de sustrato, la curva de crecimiento puede expresarse en trminos de losparmetros de crecimiento. La bien conocida ecuacin de Monod14 describe larelacin entre la velocidad especfica de crecimiento, i,y la concentracin delnutriente limitante, S, en un cultivo microbiano.

El modelo de Monod expresa:

'f, .y 1 "r K.s + S

[1]

12]It, A JC _/"v. V I

_

Fases deIcrecimiento 31/>* , *.

.

-

x-x0=Y(So-S) [3]

donde x0 y S0 son los valores iniciales de la concentracin de biomasa y delsustrato limitante, respectivamente. Sustituyendo n y S en la ecuacin [1] seobtiene:

dx _ mx (YSp + x0 x)xdi ~ KsY + S0Y + x0 -x

La ecuacin [2] est representada en la figura 2.3 en donde n se graficacomo funcin de la concentracin del sustrato. El valor K.s se obtiene cuando/i =0.5/imx. La tabla 2.3 es una recopilacin de las constantes de saturacinpara diversos sustratos. La tabla muestra que los valores de Ks para las fuentesde carbono y de energa son del orden de 10~5 M. Los valores para el oxgenoson de 10~6 a 10~SA, y para los iones potasio y magnesio, 10~s M. Engeneral, la relacin de Monod se cumple aunque hay desviaciones cuando lavelocidad de crecimiento es alta.15

Concentracin celularLa determinacin de la concentracin celular, x, se hace de diversas maneras,dependiendo de las caractersticas fsicas de los microorganismos (vasecaptulo 8), principalmente su tamao. El crecimiento celular se determinamidiendo el nmero de clulas o la masa celular. El nmero de clulas sepuede medir en organismos unicelulares (bacterias, levaduras) utilizando unmicroscopio; se considera que es ste un mtodo barato y rpido, para ciertostamaos de clulas pero con la desventaja de que no se obtiene informacinacerca del estado de las clulas (vivas o muertas). Otro procedimiento es"platear" o sea colocar un volumen pequeo del cultivo en una caja de Petricon agar (medio nutriente) e incubarlo a una determinada temperatura duranteun tiempo fijo; el resultado que es el nmero total de clulas vivas se obtienecontando el nmero de colonias y multiplicando por la dilucin que se hayahecho. El mtodo ms empleado para medir el crecimiento en bacteria y

mx

0.8

0.6

-5. 0.4

0.2

40 60 80 100S

32

TABLA 2.3

Constantes de saturacin (KJpara diferentes sustratosy microorganismosOrganismo Sustrato s(genero) (limitante) (mg/l) (IO'sM) ReferenciaEscherichia Glucosa 6.8X10"3 3.8xl0"J 15Escherichia Glucosa 4 2.2 14Escherichia Manitol 2 1.1 14Candida Glicerol 4.5 4.9 16Candida Oxgeno 4.5X10"' 1.4 16Candida Oxgeno 4.2X10"1 1.3x10"' 17Saccharomyces Glucosa 25 14 4Aspergillus Glucosa 5 2.8 4Klebsiella Iones magnesio 5.6X10"' 2.3 18Klebsiella Iones potasio 3.9x10"' 1.0 18

levadura es por nefelometra (dispersin de la luz) o mediante un medidorCoulter-counter. Ambos mtodos dan buenos resultados y permiten trabajarcon soluciones diluidas.

Para microorganismos miceliales la masa celular se determina midiendo elpeso seco. La tcnica es la siguiente: se centrifuga o filtra con un filtromillipore una muestra, se lava sta cuidadosamente con agua o buffer y sepone a secar a 105C y al vaco, de 6 a 18 h hasta alcanzar peso constante.Otro mtodo consiste en centrifugar la muestra en condiciones fijas de tiempoy revoluciones por minuto y en medir el volumen del slido; esta es unatcnica: de uso y prctica industrial. Pirt4 hace un anlisis de cada una de lastcnicas anteriores as como de otras usadas en investigacin.

Tiempo de duplicacinSi se integra la ecuacin [1] entre los lmites siguientes:

C dx _ftd ,J,* i*dtdonde:

x2 =2xi J/i

34

permite una mejor transferencia de calor, velocidades de reaccin mayores ymenor posibilidad de contaminacin. La mayor parte de los microorganismosque se usan actualmente pertenecen al grupo de los mesfilos.

La dependencia de la velocidad especfica de crecimiento respecto a latemperatura puede expresarse como una ecuacin del tipo Arrhenius:4

H = Ae" Ea/RT [6]donde a es la energa de activacin (cal/mol) y A es una constante. Si segrafic log n versus T"1 se debe obtener una lnea recta cuya pendiente es

Y..J23 R. De esa forma se han obtenido energas de activacin para diferentesOrganismos (no debe olvidarse que la ecuacin [6'J slo es vlida en el rango defmperaturas indicado). La tabla 2.4 da algunos valores de Ea; ntese que paralos mesfilos es de alrededor de 13 000 cal/mol.

La temperatura tambin afecta el rendimiento (Y); en el caso, por ejemplo,de Fusarium (M4) en cultivo batch a pH constante se aprecia claramente unaumento de rendimiento dentro de su rango de temperatura, mientras que lavelocidad de crecimiento disminuye drsticamente cuando la temperatura esmayor de 34C. La curva de T versus n es tpica y aparece representada enla figura 2.5.

Otra forma de expresar la dependencia de respecto a la temperatura es lasiguiente:20, 22

/dx

=

Atmx(rQS 1dt Ks(T) + S X 1 J

donde

dsdt

ln

Y(T)[KS(T) + S]

Ks(2)Ks(1)

AH [" 1R |_T(2) 1T(l)

18]

f9]

TABLA 2.4

Valores de la energa de activacin(Ea) para crecimiento microbianoRango de

temperaturaOrganismo C cal/mol ReferenciaAspergillus niger 20 - 37 14 000 4l-scherichia coll 23 - 37 13 100 14Candida ulitis 15 - 35 13 000 19Arrobador aerogenes 25 40 10 800 19A Irbsirllapirogenes 20 40 14 230 20l'scudomonas (psicrofilien) 2 12 23 800 4

/ fistts do! enteimiunto 36

u

30 35 40Temperatura C

Figura 2.5. Efecto de la temperatura en la velocidad especfica de crecimiento 0j) () yen el rendimiento (Y) () en cultivo batch de Fusarium sp. (M4).21 Carbohidrato-sacarosa.40 g/1; pH =40.

Las ecuaciones anteriores explican la variacin encontrada en la figura 2.5.A medida que se empleen microorganismos termfilos, mayor informacin iraapareciendo y se podr encontrar las constantes cinticas indicadas en lasecuaciones [7], [8] y [9].

Efectos del pHEl pH, medida de concentracin de iones hidrgeno, tiene tambin unmarcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pllpara una especie presenta generalmente un mximo denominado pll ptimo.En bacterias el pH ptimo vara entre 6.0 y 8.0; en levaduras entre 4.0 y 6.0y en mohos entre 3.0 y 7.0. La ecuacin de Monod ha sido modificada paraindicar el efecto del pH en /i:23

A* = H, [10]Kj(1 + h7 +iT+ s

donde H, es la concentracin de iones hidrgeno, y Ka y Kb son las constantesde disociacin:pH ptimo = \/K Ki. 1 1

sin embargo, las ecuaciones [10] y [I 1] slo son vlidas en cierto rango de plly no necesariamente se cumplen en la prctica. La figura 2.6 indica quecuando el pH oscila entre 5 y 6, /j es casi independiente, pero a un pll menordisminuye considerablemente. Se cree que el gradiente de concentracin deiones hidrgeno intracelular junto con el potencial elctrico de la membrana

L.

36

2 3 4 5 6 7PH

Figura 2.6. Efecto del pH en la velocidad especfica de crecimiento (jz) (o) y en el rendimiento (Y) () en cultivo batch de Fusarium sp. (M4).21 Carbohidrato-sacarosa, 40 g/1;temperatura, 30C.

determina la fuerza motora de protones que dirige las reacciones de lamembrana. Un cambio en el valor del pH del medio puede afectar sucomposicin y la naturaleza de la superficie microbiana al disociarse cidos ybases. Este ltimo efecto puede afectar la floculacin de la biomasa o suadhesin al vidrio. El pH tiene una gran influencia en los productos finales delmetabolismo anaerbico. En el caso de produccin de cido ctrico, Kris-tiansen2* ha demostrado que el pH es el factor de mayor importancia tantoen cultivo batch como continuo.

Efecto de nutrientesSe mencion que un medio de cultivo debe tener todos los elementos

TABLA 2.5

Carbn asimilado y desasimilado como fuente de energa4

Carbono de glucosa Glucosa desasimiladaOrganismo Condiciones asimilada % paraproveer energa %

Streptococcus faecalis Medio rico,anaerbico

2 98

Saccharomyces cerevisiae Medio rico,anaerbico

2 98

Saccharomyces cerevisiae Medio rico,aerbico

10 90

A erobacter cloacae Medio rico,aerbico

55 45

Roforenc/os

necesarios para el crecimiento microbiano, pero conviene sealar que lasrelaciones entre ciertos elementos son de particular importancia.13.25 (ver figura2.4c)Nyiri encontr en un cultivo de Candida en melazas que la relacin carbononitrgeno debe ser 1 para que la productividad celular sea mxima. Tambin larelacin fsforo/oxgeno es relevante en lo que se refiere a la eficiencia deconversin energtica y a la respiracin.26

El oxgeno merece mencin especial pues su ausencia o abundancia26permite una seleccin tanto de microorganismos como de productos delmetabolismo. (Cuando el cultivo se produce en presencia de oxgeno molecular,la fermentacin se denomina aerbica y cuando ste carece de oxgeno,anaerbica.jSi la fermentacin es anaerbica la mayor parte del carbono seemplea como energa y slo 2% se asimila como material celular. La tabla 2.5presenta algunos datos que dan una idea general de lo que sucede.

El crecimiento microbiano es funcin de muchas variables y todava no seestablecen relaciones matemticas que cubran los rangos de operacin ointerrelaciones con ellas. Sin embargo, con el conocimiento actual es posibleiniciar una fermentacin y poco a poco, a travs de la experimentacin, irlamejorando y dirigiendo el crecimiento y el metabolismo microbiano en elsentido que se desee: aumentando el rendimiento, disminuyendo el consumode nutrientes o excluyendo selectivamente ciertos productos.

NOMENCLATURA

A = constanteEa = energa de activacin (cal/mol)Hi = concentracin de iones hidrgenoAH = cambio de entalpia (cal/gmol)

= constante de disociacinb = constante de disociacinKs = constante de saturacin, que se obtiene cuando n = 0.5nmx (g/0R = constante de los gases (1 atm/gmol K)S = concentracin de sustrato (g/I)S0 = concentracin de sustrato inicial (g/1)T = temperatura (K,C)t = tiempo (seg, min)ld = tiempo de duplicacin (seg, min)X = concentracin celular (g/1)Xo = concentracin inicial de clulas (g/1, mg/ml)Y = rendimiento celular por unidades de sustrato (g/g)A* = velocidad especfica de crecimiento (h_1)mx = velocidad especfica mxima de crecimiento (h-1)

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de Microbiologa, Chicago, Illinois, mayo de 1974.26. S.N. Mukhopadhyay y T.K. Chose, Process Biochem. ,6,19 (1976).

'

3Cintica de fermentaciones

Los estudios cinticos son necesarios para entender el comportamiento decualquier fermentacin y, en general, consisten en la medicin o estimacin delas velocidades de sntesis celulares, ae~Tormacn de productos y de losefectos del medio ambiente sobre estas velocidades..

Este captulo se refiere exclusivamente al estudio de sistemas celulares, surepresentacin y modelos a nivel celular, no molecular. Adems abarcasolamente procesos de lote o batch ya que stos son los que tienen mayorimportancia comercial. En el apndice B se presenta una introduccin a lacintica de enzimas y se aconseja revisarlo al estudiar este captulo paracomparar similitudes y diferencias en cuestin cintica. El captulo 4 trataaspectos del cultivo continuo.

CINETICA DE DIVERSOS TIPOS DE FERMENTACIONESLos procesos batch de fermentacin han sido clasificados por varios autoressegn diferentes criterios. Gaden1 sugiri que se relacionase la formacin delproducto con la utilizacin del sustrato; en la tabla 3.1 se dan algunosejemplos del tipo de proceso de fermentacin clasificados desde ese punto devista.

Las figuras 3.1, 3.2 y 3.3 representan los tres tipos de la tabla 3.1.En la figura 3.1 se ve que la fermentacin alcohlica est directamenterelacionada con la utilizacin de carbohidrato. Las curvas A, B y C de lafigura 3.1.a son muy similares en forma y su pendiente parece la misma. La figura 3.1b presenta la productividad y muestra que la sntesis de alcohol y lautilizacin de azcar, siguen curvas muy semejantes cuyos mximos causanun lag (periodo de retraso) respecto ;i la curva de productividad para creci-

139 1

40 Cintica de fermentacionesT

TABLA 3.1

Tipos de procesos defermentacin de acuerdo con Gaden2Tipo Relaciones especficas de velocidad Ejemplo

1 Formacin del producto directamente relacionadocon la utilizacin de carbohidrato

Etanol

IIFormacin del producto indirectamente relacionado con la utilizacin de carbohidrato

Acido ctrico

111 Formacin del producto aparentemente no relacionado con la utilizacin de carbohidrato

Penicilina

miento. La productividad especfica muestra la misma tendencia y por ello esclaro que la fermentacin se considere de tipo I.

La figura 3.2 representa el tipo II; en este caso la produccin de cidoc trico est asociada a la utilizacin de azcar aunque en forma indirecta. Lacurva de productividad y productividad especfica indican un desfasamientoentre la sntesis del cido y el consumo de carbohidrato. Los mximos nocoinciden en su posicin relativa respecto al tiempo.

Del tipo III es ejemplo la fermentacin productora de penicilina (figura3.3) en la que la formacin del producto ocurre en la llamada faseestacionaria. A este tipo de productos que aparecen en la fase que sigue a ladel crecimiento se les denomina generalmente metabolitos secundarios. En lafigura 3.3 se incluye el consumo de oxgeno porque desempea un papel muyimportante en la fermentacin y porque se ha demostrado que el consumo deoxgeno puede asociarse a la produccin de penicilina.

Otra clasificacin propuesta por Deindoerfer se basa en el proceso defermentacin (vase tabla 3.2), y se considera que es til, particularmente enel estudio de fermentaciones de proceso batch. El tipo simple se refiere a lacintica de fermentaciones de dos tipos: asociadas al crecimiento y no

TABLA 3.2

Clasificacin de fermentaciones por tipo de reaccin,segn Deindoerfer2Tipo DescripcinSimple

Simultneo

Consecutiva

l'or pasos

Nutrientes convertidos en productos con una estequio-metra tija, sin acumulacin de intermediarios.Nutrientes convertidos en productos con una proporcin de la estequiometra variable, sin acumulacinde intermediarios.

Nutrientes convertidos en producto, con acumulacinde un intermediario.

Nutrientes convertidos en un intermediario antes deconversin en producto, oNutrientes selectivamente convertidos en productoen un orden preferencial.

Cintico do divttrsos tipos do formontacfonos 41

0-25

0-20

-c 015o>u>

< 010

0 05

0'0 2 4 6 8 10 12 0"

(C)Tiempo de fermentacin (unidades)

A micelio (peso seco)B alcoholC azcar consumida

crecimientosntesis alcohlicautilizacin de azcar

crecimientosntesis alcohlicautilizacin de azcar

Figura 3.1. Fermentacin alcohlica, (a) Curvas tiempo-concentracin; (b) tasas volumtricas; (c) tasas especficas.3

asociadas a ste. La reaccin simultnea se refiere a las fermentacionescon ms de un producto, a las velocidades relativas y a su variacin conrespecto a la concentracin de nutriente. Las reacciones de tipo consecutivoson aquellas en las que un intermediario se acumula hasta cierta concentracinantes de que se forme el producto. En las reacciones por pasos se efectan dosreacciones simples, que pueden ser reguladas por induccin enzimtica.

Una gran mayora de fermentaciones son procesos que envuelven unacombinacin de las reacciones mencionadas y su complejidad puede ser muygrande. Para el proceso de produccin de penicilina, por ejemplo, en la figura3.4 se presentan esquemticamente los datos de Hosier y Johnson.5 La curva de

42 Ciiithlca (In formontaciones

a micelioB cido ctrico

o acidez titulableo

o cido ctricoC azcar consumida

010 -

008 -JZ

0 06 - enO) O< 0 04 - CO

002 _ A crecimientoB sntesis del cidoC utilizacin de azcar

012

0-10-c 0-08

m 0 06< 0 04

0-2

0

A crecimientoB sntesis del cidoC utilizacin de azcar

Tiempo de fermentacin (h)1'inura 3.2. Produccin de cido ctrico por fermentacin, (a) Curvas tiempo-concentracin;(b) tasas volumtricas; (c) tasas especficas.3

crecimiento representada por el nitrgeno micelial es de tipo difsico y la curva de produccin exhibe tambin un carcter difsico y un lag respecto a la curvailc crecimiento. Se considera que en algn momento entre la desaparicin delazcar y la aparicin de la penicilina se produce la acumulacin de unintermediario. En este caso se aade un precursor durante el proceso paramejorar la produccin.

Otro caso diferente ocurre en la produccin de alcaloides, que sigue unacintica compleja debida posiblemente a que el micelio no se encuentra en unestado morfolgicamente diferenciado aunque s lo est fisiolgicamente. Esteaspecto, que se refiere a cultivos miceliales, ha sido poco explorado debido ala dificultad que supone determinar la diferencia entre los diversos estados

Modulas cinticos do crocimlonto celular 43

fisiolgicos, pues se han dedicado muy pocos esfuerzos a relacionarlos conalgn modelo cintico6 (ver figura 3.5).

MODELOS CINETICOS DE CRECIMIENTO CELULAR

El crecimiento unicelular en cultivo batch limitado por la cantidad de sustratosuministrado inicialmente, puede ser expresado en trminos de la concentracin celular x, la del sustrato limitante S y la de un inhibidor I. Ntese queexisten casos en que la limitacin por sustrato se debe a ms de un tipo denutriente. Tambin debe considerarse que las condiciones de temperatura,fuerza inica y pH se establecen al principio de la fermentacin y es muyprobable que varen durante el transcurso de la misma, a no ser que se

20

-_ 0-75en

-m050en

CJ

O)

tin 0 0008enm 0 0006

15

100040 0004

A crecimientoB sntesis de penicilinaC utilizacin de azcarD consumo de oxgeno

0 05 0 020 0002

0 20 40 60 80 100 1 20 140I iempo de fermentacin (h)

Finura 3.3. Produccin de penirilinu por fermentacin, (a) Curvas tiempo-concentracin;(b) tunos volumtricas; (e) tusas i-speciflcus 1

44 Cintico do formontadones

nitrgeno micelial

penicilina

azcar aadida

"8

Tiempo

'iura 3.4. Produccin de penicilina en medio sinttico con alimentacin continua deglucosa (concentraciones en diferente escala).5

controlen externamente; lo anterior puede tener un efecto notable en elcrecimiento celular. Una expresin general es:

H\ = f (x, S, l,T,pH, ... etc.) [1]En 1942 Monod estableci un modelo de crecimiento celular

Smax Ks+S

de'manera que dx =/JX [2]

donde = velocidad de crecimiento celular.dt

H = velocidad especfica de crecimiento. El valor de p se considera constante en la fase exponencial del crecimiento, cuando ste es proporcional a lamasa de clulas presentes. La velocidad especfica de crecirriento est enrelacin con el tiempo de duplicacin, td, y la ecuacin [2) se integra entre loslmites x y 2x:

_ ln 2 _ 0.693 p p [3]

Si- han propuesto otros modelos para crecimiento, tal es el modelo del

Minalos cinticos do crocimionto colilla/ 45

crecimiento lineal, que ocurre cuando existen limitaciones debidas a velocidades de difusin o de transferencia de masa.

En el caso de organismos filamentosos y dependiendo de si crecen comomicelio o en forma de pellet los modelos son diferentes. Righelato8 proponepara crecimiento en pellet lo siguiente:

x,/3 = x/3 +kt (4)

La ecuacin [4] se ajusta mejor que el crecimiento exponencial, ya queconsidera que la capa perifrica del pellet crece exponencialmente cuandoexcede cierto dimetro, y cuando esto sucede el sustrato no se difundirdentro del pellet con la velocidad suficiente para mantener un crecimientoexponencial en toda su masa. Esto se debe a que la masa del pellet esproporcional al radio elevado a la tercera potencia y la superficie a travs de lacual se difunde el sustrato aumenta con el cuadrado del radio. Una aproximacin es suponer que dentro de la capa perifrica, el pellet no crece enabsoluto, en cuyo caso:

dx rcIdr = "xp l5)

donde xp = masa de la capa perifrica, y

= Mw |6]

Alcaloide X 1000Peso seco X 5Galactosa en el medioAmonio (como nitrgeno)en el medio X 10

Das

Figura 3.5. Produccin de alcaloide, crecimiento micelial y cambios on la composicindel medio durante la fermentacin tic Claviceps purpurea.6

40 Citica do fermentaciones

donder = radio del pellet,

w : espesor de la capa perifrica (constante para cada concentracin desustrato limitante)

Integrando [6] e introduciendo la densidad del pellet, pm, se tiene:

r = /iwt + r0 [7]

M = |r3rpm [8]sustituyendo [7] en [8] entonces:

= 0*wt + r0) [9]

(V4ir Pm)~,/3 es una constante numrica igual a 0.74 sipm =0.1 g/cm3. Puedeconsiderarse, por lo tanto, que el crecimiento de un pellet o de un grupo depellets del mismo tamao sigue un modelo de crecimiento de tipo raz cbica,cuando r es mayor que w. Siempre que r sea menor que w tendr lugar elcrecimiento exponencial.

Sin embargo, la expresin emprica ms utilizada para describir la velocidadespecfica de crecimiento es:

SK~+Sv = ni

dondemx = velocidad especfica mxima de crecimientoKs = constante de saturacin

ASi a lo anterior agregamos la definicin de rendimiento, Y (vase apndiceA), como:

AxY = l"!

x

x0 = Y(S0 S) [12]

dicho rendimiento es constante cuando las condiciones de cultivo permanecenenlistantes, aunque dependiendo del sustrato, sobre todo cuando es utilizadoprincipalmente como fuente de energa, parte de l se emplea en elmiento ile la clula. Una clula puede utilizar glucosa para llevar a cabo unarespiracin endgena sin crecimiento. A bajas concentraciones, la ecuacin de

Minilos cinticos do crocimlo/ito cttluler 47

rendimiento debe incluir un factor que tome en consideracin la utilizacindel sustrato para mantenimiento (vase captulo 4).

dS dx . ds dx 1~ dt" ~ dt" +mx"r= "5T 7 + mx 113]

Y.donde

Yg = = rendimiento para crecimientom = velocidad especfica de consumo de sustrato para mantenimiento

celular (g de sustrato/g de clula-h).

La figura 3.6 presenta diferentes casos de la ecuacin [10] para diversosvalores de Ks. La ecuacin [10] es anloga a la ecuacin de Michaelis-Mentcnpero su derivacin fue emprica y no terica. En general se considera que laexpresin de Monod [10] es una sobresimplificacin del problema, peroadecuada como una primera aproximacin. A medida que el valor de K|: esmayor la_m.-se..-aplana" mqsj tambin cuando S es menor que Ks existeuna relacin lineal entre la velocidad de crecimiento y la concentracin desustrato. Cundo S>Ks se alcanza la velocidad especfica de crecimientomxima. En muchos casos, cuando la concentracin de sustrato es muy grandesuele producirse una inhibicin y la velocidad especfica de crecimientodisminuye.

La integracin de la ecuacin [2] lleva a:

o i i-1t

i-1-1i0.00 12.50 25.00 37.50 50.00

ConcHiiti;u:in dol sustrato (gl)Finura J.6, Kl'ecto de K_ cu la ecuacin de Monod (ecuacin 1 1()|).

48

para /j = constante

x, = Xoe"' [15]

la ecuacin [15] es la expresin del crecimiento exponencial.Combinando las ecuaciones [2], [10] y [12] y sustituyendo una en otra, es

posible expresar el cultivo batch como:

/* mxxdx __dt = So++Ks

integrando entre lmites:

/ xp -x\ Mmxx(YS0 + xp - x)\ Y / YS0 + YK, + x0 -x 1 1

Mm f' dt r- fe ) unJ Jx X YSo+Xo-x /se puede resolver la ecuacin [17] analticamente por conversin por partes:

mx r-r

Jx Jx.*' Bdx

YS0 + x0 - x

[18]p- (YSp +YKs + x0) dx fX' Y*sdx_YSo+Xo x | (YS0 +x0)(YS0 +x0 -x)Jx

YSp + YKS + xp /xA YKs / YSo \ , t [19|YSo+Xo

n \xo/ YSq+Xo \YS0+x0-x,/ max

La ecuacin [19] da la figura de una curva con forma de S y representa elcultivo batch. El valor asinttico a que llega est dado por el caso lmitecuando S = 0 (todo el sustrato ha sido consumido) de la ecuacin [12],x = x0 + YS0.

La diferencia entre las ecuaciones [ 14] y [19] es que en la primera seconsidera m constante y en la segunda es funcin de la concentracin desustrato.

Al modelo representado por la ecuacin [19] debe agregrsele un ciertotiempo de adaptacin al medio antes de empezar a crecer exponencialmente;dicho tiempo se conoce como periodo lag o simplemente lag. En la figura 3.7

49

13

0}TJO)

XO)O_J

Tiempo (h)Figura 3.7. Efecto del tamao de inoculo en cultivo batch de acuerdo con la ecuacin|191. Parmetros: u. = 0.5 h"1,S0 = 10 g/1, K = 0.1 g/1, Y = 0.5 (

---

) X0 = 0.1 g/1,(-

) X0 = 0.5 g/1. s

se expresan grficamente la ecuacin [19] con y sin lag y tambin se indicandos niveles de inoculo (x0); se aprecia claramente que el tamao del inoculoes muy importante en lo que se refiere a crecimiento celular. Si el lag es muygrande tambin tiene relevancia, sobre todo en lo que concierne a laproductividad. La segunda parte de la ecuacin slo tiene efecto cuando X] esmucho mayor que x0 , lo que hace que la curva se vuelva asintnica.

La productividad celular P, para un cultivo batch se define como:

siendo P los gramos de clulas producidas por volumen de fermentadordurante el tiempo total de fermentacin. Para el caso ideal de crecimientoexponencial la productividad es:

Xmx x0p =-t-r l21lta +te+7i- x0

donde ta = tiempo muerto y de preparacin de la fermentacin (limpieza,esterilizacin, inoculacin, etc.)

tc = tiempo de crecimiento logartmicote = tiempo lag

xmx = concentracin celular mxima*tot ~ + te + tc

Este caso se compara con la productividad del cultivo continuo en el captulosiguiente.

60 Cintico do fermentaciones

La tasa de consumo especfico de un sustrato es otro factor que a menudose mide y que se define como:

dsdT = l22l

donde q =velocidad especfica del metabolismo o cociente metablico =g sustrato/g clulas-h; sustituyendo [11] en [13] y considerando que Y es constante, se tiene (sin considerar la energa de mantenimiento):

5=i* [23]

dt Y

y por lo tanto:

q = /i/Y [24]

es necesario indicar que si n se expresa como f (S) Y no fuese constante, laexpresin del cociente metablico vara.

MODELOS PARA FORMACION DE PRODUCTO

Para el desarrollo de procesos microbianos para la formacin de productos esnecesario optimizar 3 elementos: el rendimiento del producto por gramo desustrato, la concentracin del producto y la velocidad de formacin delmismo. Los pasos principales para el desarrollo de un proceso de fermentacinson:9

1. Seleccin de una cepa microbiana.2. Determinacin de los valores ptimos de temperaturas, pH, concentra

cin de oxgeno, etc.3. Determinacin de los requisitos ptimos nutricionales y la concentracin

celular.4. Modificacin de la estructura gentica del microorganismo para aumentar

la formacin de producto.Los cuatro aspectos se refieren bsicamente a la regulacin metablica del

microorganismo. Normalmente el metabolismo est ajustado para producirsolamente el mnimo necesario de metabolitos. El xito de una fermentacinconsiste en interferir en la regulacin metablica y provocar una sobreproduccin del compuesto deseado. DemainlO y Bolvar y Quintero11 han discutidoampliamente las posibilidades de aplicar la modificacin de los mecanismos decontrol.

Se han propuesto muchos modelos para la produccin de diferentesmetabolitos. Tres de ellos han servido razonablemente para explicar elcomportamiento de sistemas simples:

a) modelo asociado con crecimientob) modelo no asociado con crecimientoc) modelo combinado

Modo!os poro formacin do producto 61

Cuando un sustrato se convierte estequiomtricamente en un solo producto(B), la tasa de formacin est en relacin con la velocidad de crecimientopor:

[25]dt dt

donde a =constante estequiomtrica. Este es el llamado modelo asociado concrecimiento.

Para los casos en que la formacin del producto es independiente de lavelocidad de crecimiento.

f - flx 126]donde j3 =constante de proporcionalidad. La constante 0 es similar a laactividad enzimtica (la clula tiene un sistema enzimtico constitutivo quecontrola la tasa de formacin del producto) y representa la unidad deactividad formadora del producto por masa de clulas.

El modelo combinado propone expresar la produccin como la suma deambas ecuaciones:

dB dx .dT"adF+*1 dB

" x dta/i + P

[27|

[28 1

donde y = tasa especfica de formacin de producto. Luedeking12 y Ko-no13,14 ilan aplicado este modelo a diversas fermentaciones con resultadosbastante buenos. Tambin se han elaborado modelos ms complicados, en loscuales a y (3 son variables o adquieren valores discretos en las cuatro fases delcrecimiento en batch. 14 Se considera que los modelos ms tiles sern aquellosque envuelvan factores ambientales (temperatura, pH, oxgeno disuelto, concentracin de inductor, tasa de alimentacin de sustrato, etc.), pues adems derepresentar mejor el sistema pueden usarse para controlar la fermentacin concomputadora.

Pirt,9 empleando un mtodo diferente, considera que el producto formadodurante el crecimiento en un cultivo batch con un tiempo infinitamentepequeo, dt, est dado por

dB = qgxdt [29]

donde qB = Yb/

52

qfl m tasa especfica de formacin del productoY

_ dBY8-drYb = rendimiento del producto referido a la biomasa formada; si qB es

constante, la concentracin del producto despus de tiempo, t, es:

esto es:rw;dB = qB I xdt [30]B - B0 + qB f xdt [31]

El valor de la integral en la ecuacin [31] puede evaluarse grficamente delrea bajo la curva de x contra t. Tambin es posible integrar dicha expresin,suponiendo una expresin para x. Si se supone crecimiento exponencial,ecuacin [15], se encuentra que

B = B0 + qBx0(eMt-l)/M [32]

El aumento de biomasa puede ser lineal si el sustrato limitante se alimentapor una cpsula de difusin a una velocidad constante.9

Cuando el crecimiento termina, la velocidad de sntesis del productotambin disminuye; esta disminucin empieza cuando la velocidad de crecimiento alcanza un valor crtico cercano a cero. Si se supone que qB esconstante hasta que el crecimiento cesa en el tiempo, t, y que subsecuentemente qB disminuye, durante esta fase de disminucin de la actividad sintticala produccin estar dada por:

dB = xmx

64 Cintica da formontaclontm

m

MPqIb%mr

STt

lu

*dteltotw

X

Xmx

VBYa

P

fornixv

Pm

= velocidad especfica de consumo de sustrato para mantenimientocelular (g sustrato/g clulas h)

= masa (g)= productividad (g/l-h)= velocidad especfica del metabolismo o cociente metablico (g/gh)= tasa especfica de formacin de producto (h 1 )= tasa especfica mxima de formacin de producto (h 1)= radio del pellet (cm)= concentracin de sustrato (g/1)= temperatura (K,C)= tiempo (seg, min, h)= tiempo muerto y de preparacin para la fermentacin (seg, min, h)= tiempo de crecimiento logartmico (seg, min)= tiempo de duplicacin (seg, min, h)= tiempo lag (seg, min, h)= la + le + lc= espesor de la capa perifrica (cm)= concentracin celular (g/1, mg/1)= concentracin celular mxima (g/1, mg/ml)= masa de la capa perifrica (g)= rendimiento celular

= rendimiento del producto [ ]Ax

= rendimiento para crecimiento [ ]g

= constante estequiomtrica= constante de proporcionalidad= velocidad especfica de crecimiento (h_l )= velocidad especfica mxima de crecimiento (h_1)= tasa especfica de formacin del producto (h-1)= densidad delpellet (g/1)

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