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Manual QIR
VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
Editora: Dra. Iliana Perdomo López
Manual QIR. VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA
MOLECULAR Y TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
© Iliana Perdomo López (editora). Depósito legal: DLC 614-2012
Reservado todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito de la editora.
ÍNDICE
UNIDAD I: BIOLOGÍA MOLECULAR
1.- COMPONENTES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1
2.- ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 13
2.1- ESTRUCTURA PRIMARIA 14
2.2- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 14
3.- ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN 17
3.1- REGLAS DE CHARGAFF 17
3.2.- MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL ADN 17
3.3.- VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL ADN 20
3.4.- PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ADN 26
4.- ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DEL ADN. ESTRUCTURAS DE LOS ARNs 31
4.1.- SUPERENROLLAMIENTO DEL ADN. ESTRUCTURA TERCIARIA 31
4.2.- ESTRUCTURA DE LOS ARNs 34
4.3.- LOS RIBOSOMAS 40
5.- CONDENSACIÓN DEL ADN Y CROMOSOMAS 43
5.1.- COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA CROMATINA 43
5.2.- NIVELES DE CONDENSACIÓN DEL ADN NUCLEAR EUCARIÓTICO 45
5.3.- EL CROMOSOMA METAFÁSICO 48
6.- ORGANIZACIÓN DEL GENOMA DE EUCARIOTAS 53
6.1.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GENOMA. DIFERENCIAS ENTRE
PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
53
6.2.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARIÓTICO 54
6.3.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO 55
6.4.- ADN DE COPIA ÚNICA, SIMPLE O NO REPETITIVO 55
6.5.- ADN REPETITIVO 56
7.- LA REPLICACIÓN DEL ADN 61
7.1.- CARACTERÍSTICAS 61
7.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA REPLICACIÓN 64
7.3.- ETAPAS DE LA REPLICACIÓN 68
7.4.- REPLICACIÓN MITOCONDRIAL 75
7.5.- REPLICACIÓN POR CÍRCULOS RODANTES 77
8.- LA TRANSCRIPCIÓN 79
8.1.- CONCEPTO DE GEN 79
8.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA TRANSCRIPCIÓN 81
8.3.- DIFERENCIAS EN LA TRANSCRIPCIÓN DE EUCARIOTAS
CON RESPECTO A LA DE PROCARIOTAS
82
8.4.- ETAPAS DE LA TRANSCRIPCIÓN 85
8.5.- TRANSCRPCIÓN DEL GENOMA MITOCONDRIAL 91
8.6.- INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN 91
9.- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS: CONTROL
PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRIPCIONAL
93
9.1.- CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL 93
9.2.- CONTROL TRANSCRIPCIONAL 96
10.- CONTROL POSTRANSCRIPCIONAL O PROCESAMIENTO DEL ARN 105
10.1.- PROCESAMIENTO DEL ARN MENSAJERO 106
10.2.- PROCESAMIENTO DE LOS ARNs RIBOSÓMICOS Y TRANSFERENTES 113
10.3.- MADURACIÓN DEL ARN MITOCONDRIAL 113
10.4.- REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL Y PRETRADUCCIONAL 114
11.- EL CÓDIGO GENÉTICO 115
11.1.- CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO 115
11.2.- DESCIFRAMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO 117
12.- TRADUCCIÓN O SÍNTESIS DE PROTEÍNAS 119
12.1.- FASE PREVIA: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS 120
12.2.- INICIACIÓN 121
12.3.- ELONGACIÓN 123
12.4.- TERMINACIÓN 126
12.5.- ENÉRGETICA 127
12.6.- INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN 127
12.7.- REGULACIÓN TRADUCCIONAL 127
13.- MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES 129
13.1.- TRÁFICO O DESTINO DE LAS PROTEÍNAS 129
13.2.- MADURACIÓN DEL POLIPÉPTIDO NACIENTE 131
13.3.- DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS 137
14.- MUTACIÓN 141
14.1.- MUTACIONES GÉNICAS 141
14.2.- MECANISMOS DE ORIGEN DE LAS MUTACIONES GÉNICAS 142
15.- REPARACIÓN DEL ADN 147
15.1.- SISTEMAS PREVENTIVOS 147
15.2.- REVERSIÓN DIRECTA DE LA LESIÓN 147
15.3.- REPARACIÓN POR ESCISIÓN 148
15.4.- REPARACIÓN POSREPLICACIÓN 149
15.5.- REPARACIÓN GO 151
16.- MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN 153
16.1.- HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA 154
16.2.- HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO 154
16.3.- HIBRIDACIÓN IN SITU 156
16.4.- MICROARRAY O MICROCHIP DE ADN 158
16.5.- TRANSFERENCIA WESTERN 159
17.- CLONACIÓN ACELULAR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 161
17.1.- OBJETIVO Y APLICACIONES DE LA PCR 161
17.2.- REQUERIMIENTOS 162
17.3.- ETAPAS DEL PROCESO 162
17.4.- CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO 164
17.5.- VARIANTES DEL MÉTODO 164
18.- TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 167
18.1.- NUCLEASAS 167
18.2.- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 167
18.3.- CLONACIÓN CELULAR DE MOLÉCULAS DE ADN 170
18.4.- GENOTECAS 179
19.- SECUENCIACIÓN 181
19.1.- MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT 181
BIBLIOGRAFÍA 187
UNIDAD II: TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
20.- TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS 189
UNIDAD I
BIOLOGÍA MOLECULAR
InspiracleQIR/2012 Biología Molecular
2
Fuente: Figura apartado 2.31 (pag 12) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.,
Barcelona, 1ª ed., 2008”.
Las bases nitrogenadas poseen las siguientes propiedades:
a) Hidrofobicidad. La naturaleza aromática de los anillos hace que las bases tengan un
marcado carácter apolar, sean hidrofóbicas y poco solubles en agua a pH celular. A pH
ácido o alcalino adquieren carga y se hacen más solubles en agua.
b) Existencia de dipolos. Salvo la adenina, todas las bases poseen átomos de nitrógeno y
oxígeno, lo que determina que se formen entre ellas enlaces polares como los puentes de
hidrógeno.
c) Disposición coplanar de los enlaces de cada anillo.
d) Tautomería. Consiste en el desplazamiento de un H desde un átomo de N o de O nuclear
hacia otro extranuclear y viceversa. Hay dos tipos de tautomerías:
d.1. Tautomería ceto-enol. El grupo ceto forma parte de un enlace amida cíclica o lactama.
Al migrar el átomo de H desde el N nuclear al O del grupo ceto, se convierte en el tautómero
lactima (enol). Esta tautomería afecta a T, G, C y U.
Biología Molecular InspiracleQIR/2012
3
d.2. Tautomería imina-amina. Aquí el grupo exocíclico es una imina, que al recibir el H
desde el N nuclear se convierte en un grupo amina primaria. Afecta a A, G y C.
En condiciones fisiológicas normales, los equilibrios de tautomerización están
desplazados hacia las formas ceto y amino, que son más estables. Por lo tanto, en las
bases libres, estas formas son unas 10000 veces más abundantes que las enol e imina.
Fuente: Figura (pag 15) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética., Barcelona, 1ª ed.,
2008”.
e) Carácter básico. Son bases débiles porque con valores de pka entre 9 y 10 pueden captar
protones.
Biología Molecular InspiracleQIR/2012
13
2. ESTRUCTURA PRIMARIA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
(2011) 184; (2010) 167.
Las funciones de los dos tipos de ácidos nucleicos vienen determinadas por su
localización subcelular y su conformación tridimensional.
Diferencias entre el ADN y el ARN
ADN ARN
Función Depositario y transmisor de
la información genética,
organizada en genes que
codifican proteínas o ARNs.
Interviene en la transmisión
de la información desde el
ADN hasta los productos
génicos.
Composición Azúcar: 2´-desoxirribosa.
Bases: A, T, G, C.
Azúcar: Ribosa.
Bases: A, U, G, C.
Localización Eucariotas: en el núcleo
como cromosomas, matriz
mitocondrial y estroma de
cloroplastos.
Procariotas: en la zona
nucleoide del citosol, una
molécula de ADN circular
“cromosoma” y varios
plásmidos.
Virus: en algunos en la
cápside.
Eucariotas: en el núcleo
temporalmente, citosol,
matriz mitocondrial y
estroma.
Procariotas: citosol.
Virus: en algunos en la
cápside.
En los ácidos nucleicos se pueden considerar varios niveles estructurales, al igual
que en las proteínas:
- Estructura primaria: es la unión de los nucleótidos en un polímero lineal. El orden de las
bases define la secuencia.
- Estructura secundaria: corresponde a la conformación local, a la disposición relativa de los
nucleótidos próximos. Está definida por la asociación de dos cadenas polinucleotídicas a
través de las bases nitrogenadas.
- Estructuras de orden superior: para el ADN se incluyen las estructuras resultantes del
superenrollamiento y de la asociación con proteínas básicas para formar la cromatina. No
están determinadas por las estructuras de los niveles inferiores.
InspiracleQIR/2012 Biología Molecular
14
2.1. ESTRUCTURA PRIMARIA
Es común para ADNs y ARNs. Consiste en largas cadenas de carácter
macromolecular de nucleótidos unidos por enlaces covalentes 3´-5´-fosfodiéster. Son
polinucleótidos con un esqueleto lineal formado por unidades alternas de pentosa y fosfato
(parte constante) de la cual sobresalen lateralmente las bases (parte variable). Por
convenio, la secuencia siempre se indica en dirección 5´→ 3´, es decir con el extremo 5´-P a
la izquierda y el 3´-OH a la derecha.
Puede representarse la fórmula completa, esquemáticamente o abreviadamente:
pApGpC → pAGC → AGC
2.2. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
2.2.1. Propiedades en disolución
Las cadenas de ADN y ARN son hidrofílicas ya que sus grupos fosfato y –OH libres
del azúcar (ARN) pueden formar enlaces de hidrógeno con el agua.
A pH fisiológico se comportan como ácidos. Debido a este carácter polianiónico, se
encuentran casi siempre neutralizados por cargas positivas de otras moléculas. El ADN del
genoma nuclear eucariótico se une a histonas, proteínas ricas en Arg y Lys cargadas
positivamente a pH fisiológico. En los espermatozoides se une a protaminas, ricas en Arg.
En otras ocasiones se une a poliaminas (principalmente espermina y espermidina), sobre
todo en algunos virus (fago T4) y bacterias en estado de rápida proliferación. Asimismo si la
carga negativa se compensa con la unión de iones metálicos se facilita la cristalización de
los ácidos nucleicos.
Las soluciones de ADN son muy viscosas debido a la relativa rigidez de la doble
hélice y a su inmensa longitud en relación con su diámetro.
2.2.2. Reactividad
Los ácidos nucleicos son muy estables químicamente, especialmente el ADN ya que
la desoxirribosa carece de grupos reactivos. El ARN es más reactivo debido a sus grupos 2´-
OH libres, lo que se refleja en su hidrólisis en medio alcalino.
Biología Molecular InspiracleQIR/2012
187
BIBLIOGRAFÍA
- FERNÁNDEZ PIQUERAS, J. et al: Genética. Ariel Ciencia, 1ª ed., 2002.
- GRIFFITHS, A., SUZUKI, D., LEWONTIN, R., MILLER, J.: Genética. McGraw-
Hill Interamericana. 7ª ed., 2002.
- KLUG, W.S., CUMMINIGS, M.R. y SPENCER, C.A.: Conceptos de Genética.
Pearson Prentice Hall. Madrid, 8ª ed. 2006.
- LUQUE, J. y HERRÁEZ, A.: Texto ilustrado de Biología Molecular e ingeniería
genética. Barcelona, 1ª ed. 2008.
- MENSUA, J. L.: Genética: Problemas y ejercicios resueltos. Pearson Prentice
Hall. 2002.
- NELSON, D.L. y COX, M.M.: Lehninger. Principios de Bioquímica. Ediciones
Omega, Barcelona, 4ª ed., 2006.
- PANIAGUA GÓMEZ ÁLVAREZ, R.: Citología e histología vegetal y animal.
McGraw-Hill Interamericana.4ª ed., 2007.
- SOLARI, A. J.: Genética humana: fundamentos y aplicaciones en medicina.
Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, 3ª ed., 2004.
- TAMARIN, R. H.: Genética. Editorial Reverté, S. A. España, 4ª ed., 1996.
- BROWN, T.A. “Genomas” Editorial médica Panamericana. 3ª edición. 2008.
Páginas web
- http://www.ucm.es/info/genetica/grupod
- http://www.drscope.com/pac/mg/b1/index.htm
- http://www.es.embnet.org/-Imc/
- http://genmolecular.wordpress.com/ligamiento
UNIDAD II
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
Técnicas Inmunológica InspiracleQIR/2012
189
20. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS.
2011(254), 2009(145), 2008(154,173,231), 2007(16), 2006(208,209), 2005(154,170,190),
2004(77,231), 2003(183).
Elementos de inmunología básica.
En cada organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogéneos, aunque
siempre existe una actuación integrada de todos ellos. Dichos mecanismos de defensa se
suelen clasificar, didácticamente, en: Innatos (inmunidad natural o inespecífica) y
Adaptativos (inmunidad adquirida o específica).
La respuesta inespecífica o innata es la primera barrera defensiva del organismo y no
requiere sensibilización previa. Por lo general a igual estimulo siempre se desarrolla con
igual intensidad (no se amplifica) y su sistema de discriminación de las características
fisicoquímicas del agente agresor es muy primitivo (solo reconoce estructuras muy primitivas
y conservadas filogenéticamente y estímulos físicos o químicos).
La respuesta específica o adquirida se desarrolla solo frente a la sustancia extraña que
indujo (antígeno) su iniciación y en ella participan prioritariamente los linfocitos y las
sustancias liberadas por los mismos (anticuerpos, citoquinas, etc.) Requiere del
reconocimiento antigénico (discriminación fina, especificidad, clonalidad) lo cual le
caracteriza, además de otras propiedades como memoria y autorregulación. Mejora
cuantitativa y cualitativamente con subsiguientes encuentros con el antígeno que le dio
origen.
Los linfocitos B tras interaccionar con su ligando específico (antígeno) secretan
inmunoglobulinas (Ig) denominadas, una vez secretadas, anticuerpos (Ac). Tras salir de
la médula ósea, donde la célula B inmadura sufrió durante diferentes estadios madurativos,
procesos de reordenamiento de genes y de selección (linfopoyesis), los linfocitos B vírgenes
requieren de la unión del antígeno (Ag) con la mIg para entrar en una serie de cambios, que
conducen a su expansión por proliferación celular y a su diferenciación, y que culminan, por
un lado, con la generación de linfocitos B de memoria, y por otro, con su diferenciación a
célula plasmática secretora de anticuerpos.
Los linfocitos B memoria además de haber perdido la mIgD (al menos la mayoría de ellos),
en virtud del mecanismo de recombinación de los genes de la parte constante (genes C) de
las Ig, han cambiado la región constante de su mIg, de forma que en lugar de expresar
mIgM, expresan mIgG o mIgA o mIgE o combinaciones de mIgM/mIgG o mIgM/mIgA. De ahí
que en la respuesta inmune secundaria los Ac que se producen tienen igual especificidad
InspiracleQIR/2012 Técnicas Inmunológicas
192
Estructura de una molécula de anticuerpo. A. Diagrama esquemático de una molécula de IgG
secretada. Los sitios de unión al antígeno están formados por la yuxtaposición de los dominios VL y
VH. En la porción constante de las cadenas pesadas se localizan los sitios de unión del complemento
(C´) y los receptores de Fc. B. Diagrama esquemático de una molécula de IgM en la membrana de
un linfocito B. La molécula de IgM tiene un dominio constante de cadena pesada (CH) más que las
IgG. La forma unida a membrana de los anticuerpos tiene una porción C- terminal transmembranal y
una intracitoplasmática que anclan la inmunoglobulina a la membrana plasmática. Rep. De. Abbas. A,
Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Si se trata con papaína en condiciones controladas, la enzima corta la molécula en la región
de bisagra y la divide en tres fragmentos. Dos de estos fragmentos son idénticos y se
componen de la cadena ligera y los dominios VH-CH1 de la cadena pesada. Se les denomina
Fab (fragmentos de unión al antígeno). El tercer fragmento está compuesto por los
dominios CH2 and CH3 de las cadenas pesadas unidos por los puentes disulfuros. Dada su
capacidad de asociarse entre ellos y cristalizar se les ha denominado fragmento
cristalizable (Fc). Si en lugar de papaína se utiliza pepsina, la proteolisis ocurre un poco
más distalmente a la región de bisagra generando un F(ab')2, o sea se conservan intactos
los puentes disulfuro de la zona bisagra y en el fragmento se conservan los dos sitios de
unión al antígeno. La región Fc queda fragmentada en varios trozos de los cuales el mayor
se denomina pFc.
La mayor parte de la diferencia en la secuencia de aminoácidos existente entre los
diferentes anticuerpos se encuentra confinada a tres zonas cortas en las regiones
variables de las cadenas ligeras y pesadas. Estas zonas de máxima diversidad se
denominan segmentos hipervariables y coinciden con los lazos protruyentes que conectan
las hebras adyacentes de las hojas beta-plegadas que conforman los dominios variables de
Técnicas Inmunológica InspiracleQIR/2012
193
las cadenas pesadas y ligeras. Estas zonas hipervariables, que se extienden
aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, están flanquedas por secuencias mucho
más conservadas denominadas zonas “framework” que le aportan la conformación a los
dominios variables. En la molécula de Ig los tres sitios hipervariables del dominio VL y los
tres del dominio VH conforman la superficie de unión al antígeno, que es estructuralmente
complementaria a la forma del antígeno. Por esta causa a los segmentos hipervariables se
les denomina regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y se denotan, a
partir del extremo amino, CDR1, CDR2, y CDR3. De todos ellos el segmento CDR3 es el
más variable de todos debido a mecanismos genéticos especiales.
Las inmunoglobulinas pueden clasificarse en distintas clases y subclases en base a
las diferencias en la estructura de las regiones constantes de sus cadenas pesadas. A
estas clases se les llama también isotipos y se denominan IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. En los
humanos los isotipos IgA e IgG pueden a su vez ser subdivididos en subclases o subtipos
llamados IgA1 e IgA2; e IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, lo que produce un total de 9 isotipos de
Ig en la especie. La secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de las cadenas
pesadas de un mismo isotipo de anticuerpo son prácticamente iguales y solo se encuentran
diferencias entre los diferentes isotipos. Las cadenas pesadas se denotan por la letra del
alfabeto griego correspondiente al isotipo del anticuerpo: IgA1, cadenas pesadas α1; IgA2,
α2; IgD, δ; IgE, ε IgG1, γ1; IgG2, γ2; IgG3, γ3; IgG4, γ4; e IgM, μ. En los humanos los
anticuerpos IgM e IgE presentan en su región constante cuatro dominios, mientras que IgG,
IgA, e IgD sólo tres. Dichos dominios se denominan CH y se numeran secuencialmente
desde el extremo aminoterminal hacia el carboxiterminal (e.j., CH1, CH2, etc.).
Existen dos clases o isotipos de cadenas ligeras llamados κ y λ, que se distinguen
entre sí por las características de sus regiones constantes. Cada molécula de
inmunoglobulina posee dos cadenas ligeras o dos λ, pero nunca una de cada.
Las formas secretadas de IgG e IgE y todas las formas de membrana,
independientemente del isotipo, son monoméricas (una molécula con la estructura básica
de Ig: dos cadenas pesadas y dos ligeras). En contraste, las formas secretadas de IgM e
IgA forman complejos multiméricos en los cuales dos o más moléculas básicas de cuatro
cadenas están unidas covalentemente. La IgM puede ser secretada como pentámeros o
hexámeros, mientras que la IgA suele ser secretada como dímero. Estos complejos se
conforman por interacciones entre regiones llamadas colas, localizadas en los extremos
carboxiterminales de las formas secretadas de las cadenas μ y α, y un polipéptido adicional
de 15-kD, llamado cadena de unión (J), mediante puentes disulfuro. Esta cadena adicional,
además de estabilizar las formas multiméricas, sirve para facilitar el transporte de estas Ig a
través de los epitelios.
Los diferentes isotipos de inmunoglobulina presentan diferentes funciones efectoras.
Esto se debe a que las funciones efectoras de los anticuerpos son mediadas por la unión de
las regiones constantes de las cadenas pesadas a los receptores Fc de diferentes células
Técnicas Inmunológica InspiracleQIR/2012
215
Rep. De. Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
Radioinmunoensayos (RIAs) y Enzimoinmunoensayos (EIAs).
Se define como inmunoensayo a todos aquellos métodos, empleados para la detección de
cualquier sustancia o compuesto, que están basados en las reacciones inmunológicas. Es
decir, que se fundamentan en el extraordinario poder discriminatorio que presentan los
anticuerpos y su gran afinidad por agentes externos extraños. Con estos métodos pueden
ser detectadas en muestras biológicas sustancias en el orden de picogramos. Son
inmunoensayos en los que alguno de los componentes de la reacción (antígeno o
anticuerpo) está marcado con una enzima (EIA) o con un elemento radioactivo (RIA).
Existen muchas variantes que se han desarrollado a lo largo de muchos años con multitud
de aplicaciones.
Radioinmunoensayos (RIA).
Es un método para detectar algunas sustancias que estaban marcadas con radioisótopos y
que constituían antígenos para determinados anticuerpos. Los RIAs originalmente utilizaban
a las sustancias que se querían determinar marcadas isotópicamente, o sea que lo que
presentaban marcado era el antígeno (Ag). Posteriormnete aparecieron métodos en los que
lo que se marcaba era los anticuerpos (Ac) y a los que se les denominó ensayos
inmunoradiométricos (IRMAs) para diferenciarlos de los RIA. Los IRMA son más fáciles de
InspiracleQIR/2012 Técnicas Inmunológicas
226
espectro de excitación y emisión diferente que permite su identificación mediante filtros
selectivos. Algunos aparatos están equipados para separar las células identificadas (FACS;
separador de células activado por fluoresecencia).
Las células en suspensión se hacen pasar con gran rapidez (50000 células por segundo)
por un colector en forma de flujo laminar de células individuales (en “fila india”). El paso de
cada célula atravesando una fuente de rayos láser dispersa la luz y da señales que son
analizadas por un ordenador mediante detectores específicos. Hay detectores para luz
dispersada que informa del tamaño de la célula (forward light scatter o luz refractada) y de
su morfología o rugosidad ( side Light scatter o complejidad estimada por la luz reflejada a
90º). Para fluorescencia hay detectores precedidos de filtros que seleccionan las longitudes
de onda de los fluorocromos correspondiente cada una a un color diferente. Estos
receptores sólo son activados cuando pasa una célula recubierta por el anticuerpo
monoclonal marcado con el color correspondiente.
Re. De Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica
Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
Técnicas Inmunológica InspiracleQIR/2012
235
Bibiliografía:
1. Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic.
2008.
2. Kindt. T, goldsby. R, Osborne. B. Inmunología de Kuby. Mc Graw Hill, Ed. 6. 2007.
3. Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología
del Sistema Inmune. Editorial médica Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp.
2006.
4. Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
Las ilustraciones del manual han sido tomadas de bibliografías 1, 2.